專利名稱：象鼻蘭的種苗試管繁殖方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物的種苗繁殖方法，具體地說，涉及象鼻蘭的種苗試管繁殖方法。
背景技術(shù)：
象鼻蘭(;Vof力oc/on'"s z/7e力'ay7《e/7sj's Z. H. Tsi)屬于蘭科象鼻蘭屬，本屬中僅此1 種，主要分布于我國浙江臨安天目山和寧波等地，生于海拔350—900米的山地林中或林緣樹 枝上，形態(tài)上與五唇蘭("on'"s)和與蝴蝶蘭(州373e/7opw's)相似，但其萼片和花瓣白色， 內(nèi)具紫色橫紋，非常艷麗和獨(dú)特。也是國內(nèi)少數(shù)沒有流失到國外的珍貴蘭科種質(zhì)資源之一。
由于生態(tài)環(huán)境的破壞，象鼻蘭的野生資源越來越少，而由于象鼻蘭種子胚發(fā)育不完全， 自然狀態(tài)下極難萌發(fā)，目前，國內(nèi)外也還沒有象鼻蘭種苗繁殖方法的報(bào)道，因此，研究和開 發(fā)能培育大量象鼻蘭種苗的試管繁殖方法，對于減少對野生資源的進(jìn)一步挖掘，滿足市場的 需要，進(jìn)行回歸自然的生態(tài)重建，具有重大意義和廣闊的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種能在短期內(nèi)獲得大量的試管苗的高效率的象鼻蘭的種苗試管繁 殖方法。
本發(fā)明所提出的象鼻蘭的種苗試管繁殖方法，包括以下的步驟
(1) 材料選取生長健壯的象鼻蘭母株，于開花時(shí)進(jìn)行人工授粉，將授粉后發(fā)育至基本 成熟而未開裂時(shí)的果實(shí)做為外植體用于播種；
(2) 無菌播種或原球莖的增殖并分化培養(yǎng)
a、 無菌播種將所述外植體用70%—80%的酒精浸泡30—60秒后置于0.1%—0.2%的 升汞溶液中消毒10—20分鐘，再用無菌水漂洗4 5次后切開果實(shí)，將其粉末狀胚接種培養(yǎng) 到種子萌發(fā)培養(yǎng)基上，所述的種子萌發(fā)培養(yǎng)基為改良的Knudson C培養(yǎng)基附加體積百分比5 % —10%的椰子汁，其中改良的Knudson C培養(yǎng)基每升含硫酸銨400—600 mg，磷酸二氫鉀 200—300 mg，硫酸鎂200—300 mg，硝酸鈣500—1500 mg，硫酸錳5—10mg，硫酸亞鐵20 —40 mg，蔗糖15 30g，瓊脂6 7g，活性炭0. 5 2 g，肌醇80—120毫克，甘氨酸1. 5 — 2.5毫克，鹽酸硫胺素(VB1) 0.05—0.2毫克，鹽酸吡哆醇(VB6) 0.4—0.8毫克，煙酸0.4 —0.8毫克，余量為水，pH 5.4-5.6;
b、 原球莖的增殖并分化培養(yǎng)將原球莖培養(yǎng)在所述的改良KnudsoiiC培養(yǎng)基附加體積 百分比5% — 10%的椰子汁再附加TDZ0.01—0.2毫克/升的培養(yǎng)基上，在原球莖上獲得大量的 類原球莖或/和愈傷組織，再將這些類原球莖或/和愈傷組織培養(yǎng)在改良的KnudsonC培養(yǎng) 基附加體積百分比5% — 10%的椰子汁再附加活性炭0. 5 2 g/升的培養(yǎng)基上，分化出小苗，
3所述的改良的KnudsonC培養(yǎng)基的組分如步驟(2) a中所述；
(3) 壯苗培養(yǎng)將在上述無菌播種培養(yǎng)所得的小植株或通過原球莖增殖并分化而得的小 苗接種培養(yǎng)到壯苗培養(yǎng)基上，所述的壯苗培養(yǎng)基每升含花寶1號(hào)1 3g，蛋白胨0.5~3g， 萘乙酸0.5—3 mg、香蕉勻漿50—100 g、活性炭0. 5 2 g，蔗糖15 30g,瓊脂6 7g，肌 醇80—120毫克/升，甘氨酸1.5—2.5毫克/升，鹽酸硫胺素(VB1) 0.05—0.2毫克/升，鹽 酸吡眵醇(VB6) 0.4—0.8毫克/升,煙酸0.4—0.8毫克/升，pH 5.4-5.6;
(4) 試管苗移栽當(dāng)植株約3-5厘米高時(shí)，將培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移到自然光下煉苗10—15天， 然后將其從培養(yǎng)瓶中取出，洗凈根部的培養(yǎng)基，移入蘭石蕨根泥炭為1: 0.5~2: 0.5~2 的混合基質(zhì)中；
上述步驟(2) (3)中培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度24—28°C，光照度1500 20001x，光照 12— 16小時(shí)/天。
步驟(1)所述的果實(shí)成熟期通常為90—120天。
在原球莖的增殖并分化培養(yǎng)步驟[即步驟(2) b]中，當(dāng)用于培養(yǎng)原球莖的培養(yǎng)基所附 加的TDZ的濃度小于0.05毫克/升時(shí)，在原球莖上能增殖形成大量的類原球莖(即主要增殖 類原球莖)；當(dāng)用于培養(yǎng)原球莖的培養(yǎng)基所附加的TDZ的濃度大于0.05毫克/升時(shí)，在原球莖 上能形成大量的愈傷組織(即主要形成愈傷組織)。
步驟(3)所述的花寶1號(hào)可以從市場上購得。
本發(fā)明具有種子的萌發(fā)率高、成苗快、種苗品質(zhì)好、成本低廉等特點(diǎn)，能在短期內(nèi)獲得 大量的試管苗，成苗的移栽成活率90%以上。能為象鼻蘭的種苗生產(chǎn)提供一條有效的途徑。
具體實(shí)施例方式
以下實(shí)施例是對本發(fā)明的進(jìn)一步說明，不是對本發(fā)明的限制。實(shí)施例中使用的花寶l號(hào) (HYPONeX 1)為美國生產(chǎn)臺(tái)灣臺(tái)和園藝企業(yè)股份有限股份有限公司分裝產(chǎn)品。
實(shí)施例一
(1) 材料開花時(shí)選取生長健壯的象鼻蘭母株進(jìn)行人工授粉，授粉后果實(shí)90天時(shí)做為 外植體用于播種。
(2) a、無菌播種用70%的酒精浸泡30秒后0.1%的升汞溶液中消毒10分鐘，無菌水 漂洗4次后切開果實(shí)，將粉末狀胚接種到由改良的Knudson C培養(yǎng)基附加體積百分比5%的 椰子汁的種子萌發(fā)培養(yǎng)基上，30天左右胚萌發(fā)，80天左右形成小植株；種子萌發(fā)率60%， 成苗率50%;所述的改良的KnudsonC培養(yǎng)基每升含硫酸銨[(NH4)2S04] 500 mg，磷酸二氫 鉀(KH2PCU250 mg，硫酸鎂(MgS04. 7H20 ) 250 mg，硝酸鈣[Ca3(P04)2]1000 mg,硫酸錳(MnS04. 4H20) 7.5 mg,硫酸亞鐵(FeS04.7H20) 25 mg，蔗糖15g，瓊脂7g，活性炭2 g,肌醇100毫克， 甘氨酸2毫克，鹽酸硫胺素(VB1) 0.1毫克，鹽酸吡哆醇(VB6) 0.5毫克，煙酸0.5毫克， 余量為水，pH 5. 5。(2)b、原球莖的增殖并分化培養(yǎng)將原球莖培養(yǎng)在改良的Knudson C培養(yǎng)基附加體積 百分比5%的椰子汁，再附加噻重氮苯基脲(TDZ) 0.1毫克/升的培養(yǎng)基上，會(huì)形成大量的愈 傷組織；再將這些愈傷組織培養(yǎng)在改良的Knudson C培養(yǎng)基附加體積百分比5X的椰子汁、 活性炭2g/升的培養(yǎng)基上，能分化出小苗；所述的改良的KnudsonC培養(yǎng)基的組分如上述步 驟(2) a中所述。
(3) 壯苗培養(yǎng)將無菌播種和繼代增殖獲得的小苗接種培養(yǎng)到壯苗培養(yǎng)基上，45天時(shí) 能形成健壯的植株。所述的壯苗培養(yǎng)基每升含花寶1號(hào)2g，蛋白胨3g，萘乙酸2mg、香蕉 勻漿50g、活性炭2g上，蔗糖30g，瓊脂7g，肌醇100毫克，甘氨酸2毫克，鹽酸硫胺素
(VB1) 0.1毫克，鹽酸吡眵醇(VB6) 0.5毫克，煙酸0.5毫克，余量為水，pH 5.5。
(4) 試管苗移栽當(dāng)植株約3-5厘米高時(shí)，將培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移到自然光下煉苗15天，然后 將其從玻璃瓶中取出，洗凈根部的培養(yǎng)基，移入蘭石蕨根:.泥炭為l: 1: l的混合基質(zhì)中， 保持適當(dāng)通風(fēng)和足夠的濕度，移栽的成活率均可達(dá)90%以上。
在上述步驟(2) — (3)中，所用的培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度25'C，光照度1800 lx,光照 12小時(shí)/天。
實(shí)施例二
(1) 材料開花時(shí)選取生長健壯的象鼻蘭母株進(jìn)行人工授粉，授粉后IOO天做為外植體 用于播種。
(2) a、無菌播種用75%的酒精浸泡45秒后0.15%的升汞溶液中消毒15分鐘，無菌 水漂洗4次后切開果實(shí)，將粉末狀胚接種到由改良的KnudsonC培養(yǎng)基附加體積百分比7.5% 的椰子汁的種子萌發(fā)培養(yǎng)基丄，消毒成功率95%， 25天左右胚萌發(fā)，70天左右形成小植株； 種子萌發(fā)率70%，成苗率60%;所述的所述的改良的Knudson C培養(yǎng)基每升含硫酸銨
〔(NH4)2S04] 400 mg;磷酸二氫鉀(KH線)200 mg;硫酸鎂(MgS04. 7H20) 200 mg;硝酸鈣 [Ca3(P04)2] 800 mg;硫酸錳(MnS04.4H20) 6 mg;硫酸亞鐵(FeS04.7H20 ) 22 mg;蔗糖20g
瓊脂6.5g，活性炭lg，肌醇80毫克，甘氨酸1.5毫克，鹽酸硫胺素(VB1) 0.08毫克，鹽
酸吡眵醇(VB6) 0.4毫克，煙酸0.4毫克，余量為水；pH 5.4。
(2) b、原球莖的增殖并分化培養(yǎng)將原球莖培養(yǎng)在由改良的KnudsonC培養(yǎng)基附加體 積百分比7.5%的椰子汁，再附加噻重氮苯基脲(TDZ) 0.03毫克/升的培養(yǎng)基上，原球莖增殖 形成大量的類原球莖，將這些類原球莖培養(yǎng)在由改良的Knudson C培養(yǎng)基附加體積百分比 7.5%的椰子汁、活性炭1 g/升的培養(yǎng)基上，使之分化出小苗；所述的改良的KnudsonC培養(yǎng) 基的組分如上述步驟(2) a中所述。
(3) 壯苗培養(yǎng)將無菌播種和繼代增殖獲得的小苗接種培養(yǎng)到壯苗培養(yǎng)基上，40天時(shí) 能形成健壯的植株。所述的壯苗培養(yǎng)基每升含花寶1號(hào)3 g，蛋白胨lg,萘乙酸2.5mg、香蕉勻漿100g、活性炭l g上，蔗糖20g，瓊脂6.5g，肌醇80毫克，甘氨酸1.5毫克，鹽酸 硫胺素(VB1) 0.08毫克，鹽酸吡哆醇(VB6) 0.4毫克，煙酸0.4毫克，余量為水；pH5.4。 (4)試管苗移栽當(dāng)植株約3-5厘米高時(shí)，將培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移到自然光下煉苗12天，然后 將其從玻璃瓶中取出，洗凈根部的培養(yǎng)基，移入蘭石蕨根泥炭為h 2: 0.5的混合基質(zhì) 中，保持適當(dāng)通風(fēng)和足夠的濕度，移栽的成活率均可達(dá)90%以上。
在步驟(2) — (3)中，所用的培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度28。C，光照度2000 lx,光照10 小時(shí)/天。
實(shí)施例三
(1) 材料開花時(shí)選取生長健壯的象鼻蘭母株進(jìn)行人工授粉，授粉后120天的果實(shí)做為 外植體用于播種。
(2) a、無菌播種用80%的酒精浸泡60秒后0.2%的升汞溶液中消毒20分鐘，無菌 水漂洗5次后切開果實(shí)，將粉末狀胚接種到由改良的Knudson C培養(yǎng)基附加10%的椰子汁的 種子萌發(fā)培養(yǎng)基上，消毒成瑪率100%， 25天左右胚萌發(fā)，60天左右形成小植株；種子萌 發(fā)率80%，成苗率70%;所述的改良的KnudsonC培養(yǎng)基每升含硫酸銨[(NH4)2S04] 600 mg; 磷酸二氫鉀(KH2P04) 300 mg;硫酸鎂(MgS04. 7H20) 300 mg;硝酸鈣[Ca3(P04)2] 1400 mg; 硫酸錳(MnS04.4H20) 10 mg;硫酸亞鐵(FeS04. 7H20 ) 35 mg;蔗糖30g，瓊脂6g，活性炭0. 5 g，肌醇120毫克，甘氨酸2.5毫克，鹽酸硫胺素(VB1) 0.2毫克，鹽酸吡哆醇(VB6) 0.8 毫克，煙酸0.8毫克，余量為水；pH 5.6。
(2) b、原球莖的增殖并分化培養(yǎng)將原球莖培養(yǎng)在改良的Knudson C培養(yǎng)基附加體積 百分比10%的椰子汁，再附加噻重氮苯基脲(TDZ) 0.05毫克/升的培養(yǎng)基上，使原球莖增殖 形成大量的類原球莖；將這些類原球莖培養(yǎng)在改良的Knudson C培養(yǎng)基附加體積百分比10% 的椰子汁、活性炭0.5g/升的培養(yǎng)基上，使之分化出小苗；所述的改良的Knudson C培養(yǎng)基 的組分如上述步驟(2) a中所述。
(3) 壯苗培養(yǎng)將無菌插種獲得的小苗和繼代增殖接種培養(yǎng)到壯苗培養(yǎng)基上，30天時(shí) 能形成健壯的植株。所述的壯苗培養(yǎng)基每升含花寶l號(hào)1.5g,蛋白胨2g，萘乙酸lmg、香 蕉勻漿75 g、活性炭0.5g上，蔗糖15g，瓊脂6g，肌醇120毫克，甘氨酸2.5毫克，鹽酸 硫胺素(VB1) 0.2毫克，鹽酸吡哆醇(VB6) 0.8毫克，煙酸0.8毫克，余量為水；pH 5.6。
(4) 試管苗移栽當(dāng)植株約3-5厘米高時(shí)，將培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移到自然光下煉苗15天，然后 將其從玻璃瓶中取出，洗凈根部的培養(yǎng)基，移入蘭石蕨根泥炭為1: 0.5: 2的混合基質(zhì)
中，保持適當(dāng)通風(fēng)和足夠的濕度，移栽的成活率均可達(dá)95%以上。
在步驟(2)— (3)中。所用的培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度24'C,光照度1500 1x，光照15小 時(shí)/天。
權(quán)利要求
1、象鼻蘭的種苗試管繁殖方法，其特征在于包括以下步驟(1)材料選取生長健壯的象鼻蘭母株，于開花時(shí)進(jìn)行人工授粉，將授粉后發(fā)育至基本成熟而未開裂時(shí)的果實(shí)做為外植體用于播種；(2)無菌播種或原球莖的增殖并分化培養(yǎng)a、無菌播種將所述外植體用70％-80％的酒精浸泡30-60秒后置于0.1％-0.2％的升汞溶液中消毒10-20分鐘，再用無菌水漂洗4～5次后切開果實(shí)，將其粉末狀胚接種培養(yǎng)到種子萌發(fā)培養(yǎng)基上，所述的種子萌發(fā)培養(yǎng)基為改良的Knudson C培養(yǎng)基附加體積百分比5％-10％的椰子汁，其中改良的Knudson C培養(yǎng)基每升含硫酸銨400-600mg，磷酸二氫鉀200-300mg，硫酸鎂200-300mg，硝酸鈣500-1500mg，硫酸錳5-10mg，硫酸亞鐵20-40mg，蔗糖15～30g，瓊脂6～7g，活性炭0.5～2g，肌醇80-120毫克/升，甘氨酸1.5-2.5毫克/升，鹽酸硫胺素(VB1)0.05-0.2毫克/升，鹽酸吡哆醇(VB6)0.4-0.8毫克/升，煙酸0.4-0.8毫克/升，pH 5.4-5.6；b、原球莖的增殖并分化培養(yǎng)將原球莖培養(yǎng)在所述的改良Knudson C培養(yǎng)基附加體積百分比5％-10％的椰子汁再附加TDZ 0.01-0.2毫克/升的培養(yǎng)基上，在原球莖上獲得大量的類原球莖或/和愈傷組織，再將這些類原球莖或/和愈傷組織培養(yǎng)在改良的Knudson C培養(yǎng)基附加體積百分比5％-10％的椰子汁再附加活性炭0.5～2g/L的培養(yǎng)基上，所述的改良的Knudson C培養(yǎng)基的組分如步驟(2)a中所述；(3)壯苗培養(yǎng)將在上述無菌播種培養(yǎng)所得的小植株或通過原球莖增殖并分化而得的小苗接種培養(yǎng)到壯苗培養(yǎng)基上，所述的壯苗培養(yǎng)基每升含花寶1號(hào)1～3g，蛋白胨0.5～3g，萘乙酸0.5-3mg、香蕉勻漿50-100g、活性炭0.5～2g，蔗糖15～30g，瓊脂6～7g，肌醇80-120毫克/升，甘氨酸1.5-2.5毫克/升，鹽酸硫胺素(VB1)0.05-0.2毫克/升，鹽酸吡哆醇(VB6)0.4-0.8毫克/升，煙酸0.4-0.8毫克/升，pH 5.4-5.6；(4)試管苗移栽當(dāng)植株約3-5厘米高時(shí)，將培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移到自然光下煉苗10-15天，然后將其從培養(yǎng)瓶中取出，洗凈根部的培養(yǎng)基，移入蘭石∶蕨根∶泥炭為1∶0.5～2∶0.5～2的混合基質(zhì)中；上述步驟(2)～(3)中培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度24-28℃，光照度1500～2000l x，光照12-16小時(shí)/天。
全文摘要
本發(fā)明提供一種象鼻蘭的種苗試管繁殖方法，本方法選取生長健壯的象鼻蘭母株，于開花時(shí)進(jìn)行人工授粉，將授粉后發(fā)育至基本成熟而未開裂時(shí)的果實(shí)做為外植體，并經(jīng)過無菌播種或原球莖的增殖并分化培養(yǎng)、壯苗培養(yǎng)和試管苗移栽等繁殖步驟。分別采用專門配制的培養(yǎng)基進(jìn)行無菌播種和原球莖的繼代增殖，獲得小植株，再將小植株經(jīng)在專門配制的壯苗培養(yǎng)基上培養(yǎng)后移栽。本發(fā)明具有種子的萌發(fā)率高、成苗快、種苗品質(zhì)好、成本低廉等特點(diǎn)，能在短期內(nèi)獲得大量的試管苗，成苗的移栽成活率90％以上。能為象鼻蘭的種苗生產(chǎn)提供一條有效的途徑。
文檔編號(hào)A01G31/00GK101584298SQ200910039929
公開日2009年11月25日 申請日期2009年6月2日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月2日
發(fā)明者吳坤林, 曾宋君, 俊 段, 陳之林 申請人:中國科學(xué)院華南植物園