專利名稱：一種熒光分子信標(biāo)探針在聚合酶鏈反應(yīng)中檢測(cè)核酸的方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
體外生物醫(yī)學(xué)診斷技術(shù)技術(shù)背景本發(fā)明提供了一種用分子信標(biāo)探針在聚合酶鏈反應(yīng)中體外定性或定量檢測(cè)核酸的方法。該方法包括了分子信標(biāo)探針檢測(cè)技術(shù)和聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)等兩種技術(shù)。
分子信標(biāo)(molecular beacon)又譯作分子燈塔，是一種特殊的熒光標(biāo)記寡核苷酸探針，可用于檢測(cè)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)產(chǎn)物數(shù)量和效率，具有靈敏度高、特異性好、能定性定量的優(yōu)點(diǎn)?？蛇M(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)或終點(diǎn)檢測(cè)聚合酶鏈反應(yīng)中結(jié)合的靶核酸量。分子信標(biāo)探針用于基因診斷的原理是在寡核苷酸探針的5′和3′端分別標(biāo)記報(bào)告熒光基團(tuán)(reporter，R)和淬滅基團(tuán)(quencher，Q)，并使R和Q兩個(gè)基團(tuán)臨近的幾個(gè)堿基(4-6個(gè))互補(bǔ)，而中間的序列則是能與靶DNA特異性互補(bǔ)的堿基序列。這樣在游離情況下，熒光探針的兩端互補(bǔ)折疊成莖環(huán)結(jié)構(gòu)(stem-loop structure)。R基團(tuán)與Q基團(tuán)空間上非常接近，R基團(tuán)經(jīng)激發(fā)后射出的熒光能量能被Q基團(tuán)吸收淬滅，不產(chǎn)生熒光信號(hào)。而當(dāng)探針與靶DNA形成雜交鏈后，探針的中間環(huán)狀部分堿基與靶DNA互補(bǔ)結(jié)合，迫使探針莖部的自身互補(bǔ)雙鏈打開，R基團(tuán)Q基團(tuán)空間距離拉大，被激發(fā)后能發(fā)射出熒光信號(hào)，信號(hào)檢測(cè)特異性好。
多聚酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)技術(shù)是一種選擇性體外擴(kuò)增DNA或RNA片段的方法通過(guò)不同溫度和時(shí)間段循環(huán)，使得靶核酸進(jìn)行變性-復(fù)性-延伸的循環(huán)過(guò)程，靶核酸分子完成快速?gòu)?fù)制，使靶核酸產(chǎn)量呈指數(shù)上升，從而將靶核酸成百萬(wàn)倍地?cái)U(kuò)增到足夠檢測(cè)水平，因此PCR技術(shù)的敏感性非常高。

發(fā)明內(nèi)容
本技術(shù)將分子信標(biāo)探針和PCR技術(shù)結(jié)合，在加入陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品和陰性對(duì)照品以及空白對(duì)照管同時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的情況下，利用熒光檢測(cè)儀檢測(cè)PCR反應(yīng)后的熒光值，通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，首先判斷被檢測(cè)樣品的陰陽(yáng)性以及計(jì)算出被檢測(cè)物靶核酸的含量。
具體實(shí)施方法為在PCR反應(yīng)后測(cè)得檢測(cè)管或陰性對(duì)照管以及空白對(duì)照管的熒光值，計(jì)算出檢測(cè)管或陰性對(duì)照管與空白對(duì)照管的熒光差值，從而得出被檢測(cè)物的熒光增加量(Ax)。陰陽(yáng)性結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)將檢測(cè)物熒光值增量≤陰性對(duì)照物Ax值的2.1倍作為陰性標(biāo)準(zhǔn)；將檢測(cè)物Ax值≥陰性對(duì)照物Ax值的2.5倍作為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)；若檢測(cè)物介于陰陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)之間，稱為灰區(qū)，要求在相同條件下重復(fù)實(shí)驗(yàn)，如檢測(cè)物Ax值仍≥陰性對(duì)照物Ax值的2.1倍，則可判為陽(yáng)性，否則判為陰性。在計(jì)算過(guò)程中若陰性對(duì)照的Ax值＜10時(shí)，需將Ax值＝10來(lái)計(jì)算(經(jīng)過(guò)大量正常人標(biāo)本及臨床病例標(biāo)本的反復(fù)實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果)。
在同樣條件下同時(shí)用已知不同水平的靶核酸標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行PCR擴(kuò)增及熒光檢測(cè)，測(cè)得同樣反應(yīng)條件下的靶核酸標(biāo)準(zhǔn)品的熒光值，將所測(cè)熒光值減去同樣條件下測(cè)得的空白對(duì)照管熒光值，得到相應(yīng)的熒光增量(Ax)值，將所得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線，將未知被檢測(cè)物的熒光增量輸入統(tǒng)計(jì)計(jì)算軟件或利用相應(yīng)的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法計(jì)算得出未知被檢測(cè)物的核酸濃度。
權(quán)利要求
1.將檢測(cè)管PCR反應(yīng)后所測(cè)熒光量減去空白對(duì)照管PCR反應(yīng)后熒光量作為檢測(cè)物的熒光增量。
2.將陰性對(duì)照管熒光增量的2.1和2.5倍作為陰陽(yáng)性結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)確定當(dāng)陰性對(duì)照的熒光增量＜10時(shí)仍按10計(jì)算。
3.將熒光分子信標(biāo)探針用于PCR反應(yīng)后檢測(cè)，通過(guò)計(jì)算檢測(cè)管熒光值的增量，確定被檢測(cè)物的陰陽(yáng)性。
4.在同樣實(shí)驗(yàn)條件下加入已知不同水平的靶核酸標(biāo)準(zhǔn)品，通過(guò)熒光增值并經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)算出未知被檢測(cè)物的靶核酸量。
全文摘要
本發(fā)明技術(shù)領(lǐng)域體外生物醫(yī)學(xué)診斷技術(shù)。本技術(shù)將熒光分子信標(biāo)探針和PCR技術(shù)結(jié)合，在加入標(biāo)準(zhǔn)品和陰性對(duì)照管以及空白對(duì)照管同時(shí)檢測(cè)的情況下，利用熒光檢測(cè)儀檢測(cè)PCR反應(yīng)后的熒光值，并將檢測(cè)管或陰性對(duì)照管與空白對(duì)照管的熒光差值作為檢測(cè)管或陰性對(duì)照管的熒光增加量(Ax)。通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，首先判斷被檢測(cè)管的陰陽(yáng)性；同時(shí)用已知不同水平的靶核酸標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行同樣的擴(kuò)增檢測(cè)，得出同樣條件下標(biāo)準(zhǔn)品相應(yīng)的熒光增量(Ax)，將所得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線，將未知被檢測(cè)物的熒光增量輸入統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)算出被檢測(cè)物的核酸含量。本發(fā)明還提供了當(dāng)陰性對(duì)照管的熒光增值不足10時(shí)需按10計(jì)算以及判斷陰陽(yáng)性結(jié)果的方法。
文檔編號(hào)C12P19/34GK1530448SQ03121728
公開日2004年9月22日 申請(qǐng)日期2003年3月13日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月13日
發(fā)明者王虹, 王 虹 申請(qǐng)人:王虹, 王 虹