專利名稱：一種使用高濃度甘油的pcr方法及其反應(yīng)液和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)技術(shù)，特別是涉及一種聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的方法及其反應(yīng)液和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
已有不少文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)甘油能降低高G+C區(qū)域的二級(jí)結(jié)構(gòu)，能促進(jìn)長(zhǎng)距離PCR和提高標(biāo)準(zhǔn)PCR方法的反應(yīng)專一性。此外，有報(bào)導(dǎo)在多重PCR(O.Henegariu等，Biotechniques，1997，23504)和等位專一PCR(R.S.Cha等，PCR Methods and Applications，1992，214)反應(yīng)液中添加甘油。上述研究有二個(gè)共同特點(diǎn)，第一，甘油濃度較低通常為5-10％(V/V，下文中未指明的均指體積百分比)，文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)的最高濃度為20％(Y.H.Liu等，Trends in Gentics，1993和S.Vilcek，Journal Virological Methods，1993，41245) 第二，添加甘油后變性溫度包括首次和循環(huán)變性均仍采用常規(guī)的94或95℃。尚未有文獻(xiàn)或?qū)＠麑⒏视蜐舛葦U(kuò)展至20-45％，并且將含5-45％甘油的PCR反應(yīng)的首次變性溫度提高到大于95℃至98℃，循環(huán)變性溫度降低到小于94℃至60℃的報(bào)道。
在一管法RT-PC方面，至今僅有一篇文獻(xiàn)(T.W.Myers等，PCR Strategies，p.58-68，Ed.M.A.Innis等，1995)在反應(yīng)液中添加3％甘油，加上原來(lái)由DNA聚合酶和反轉(zhuǎn)錄酶試劑帶進(jìn)的2％甘油，使PCR能在含5％甘油反應(yīng)液中進(jìn)行。未有將一管法RT-PCR反應(yīng)液的甘油濃度擴(kuò)展至5-25％的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
所要解決的技術(shù)問(wèn)題本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種含高濃度甘油的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的方法及其反應(yīng)液和應(yīng)用，以突破現(xiàn)有PCR方法中甘油濃度的常規(guī)，克服經(jīng)典PCR反應(yīng)容易出現(xiàn)非專一性擴(kuò)增產(chǎn)物的缺陷，減少了模板順序突變而導(dǎo)致的假陰性。
發(fā)明構(gòu)思應(yīng)用高濃度甘油的思路是在文獻(xiàn)檢索和對(duì)PCR反應(yīng)機(jī)制及甘油作用進(jìn)行分析的基礎(chǔ)上發(fā)展形成的。
1.現(xiàn)有的PCR技術(shù)觀點(diǎn)通常認(rèn)為當(dāng)擴(kuò)增產(chǎn)物區(qū)域含有高比例G+C時(shí)，添加甘油或其他變性劑能降低核酸的二級(jí)結(jié)構(gòu)，促進(jìn)目標(biāo)產(chǎn)物的擴(kuò)增。我們認(rèn)為，除上述機(jī)制外，甘油的關(guān)鍵作用是它能促進(jìn)半擴(kuò)增鏈和最初擴(kuò)增產(chǎn)物的形成，從而對(duì)目標(biāo)擴(kuò)增的形成和擴(kuò)增的專一性起重要作用。根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的形成機(jī)制，從基因組DNA形成半擴(kuò)增鏈和從半擴(kuò)增鏈形成最初的擴(kuò)增產(chǎn)物對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在數(shù)量上的貢獻(xiàn)可以忽略。但是，半擴(kuò)增鏈和最初擴(kuò)增產(chǎn)物的形成對(duì)完成目標(biāo)產(chǎn)物擴(kuò)增的關(guān)鍵性作用卻不容忽略。目前各種教科書和專著在描述PCR原理的圖解中，都將基因組變性后的大分子單鏈DNA標(biāo)示為一條直線型分子，按照這種模式圖解，引物與目標(biāo)順序和非目標(biāo)順序的結(jié)合并得到延伸的機(jī)會(huì)在空間效應(yīng)上是等同的。根據(jù)此模式，如果引物有良好的嚴(yán)謹(jǐn)性，那么在嚴(yán)謹(jǐn)?shù)耐嘶饻囟认鲁霈F(xiàn)非專一產(chǎn)物的可能性應(yīng)很小，只出現(xiàn)非專一產(chǎn)物而無(wú)目標(biāo)產(chǎn)物幾乎不可能。對(duì)于一個(gè)20堿基長(zhǎng)的引物，在目標(biāo)順序以外出現(xiàn)與之完全匹配的順序的機(jī)會(huì)約一萬(wàn)億分之一(1/420)，此數(shù)值比人基因組的總堿基數(shù)高幾個(gè)數(shù)量級(jí)。另外，一段核酸順序必須分別具有與正反引物匹配的位點(diǎn)才可能能被擴(kuò)增。概率計(jì)算表明，在基因組DNA中幾乎不可能存在一段目標(biāo)順序以外的幾百至幾千堿基長(zhǎng)的核酸片段，其上下游順序會(huì)分別與正反引物完全匹配。但事實(shí)上，在較低退火溫度下非專一產(chǎn)物形成相當(dāng)普遍，即使在引物的最高允許退火溫度也常會(huì)有非專一產(chǎn)物出現(xiàn)。這是因?yàn)橐锍四芘c完全匹配的目標(biāo)順序結(jié)合外，也能與有若干錯(cuò)配甚至較嚴(yán)重錯(cuò)配的非目標(biāo)順序結(jié)合而引發(fā)擴(kuò)增。但是，無(wú)論退火溫度高還是低，非目標(biāo)順序與引物的結(jié)合強(qiáng)度總是要比目標(biāo)順序與引物的結(jié)合強(qiáng)度低，按上述線性分子模式就不能解釋為何會(huì)出現(xiàn)只有非專一產(chǎn)物而無(wú)目標(biāo)產(chǎn)物形成的現(xiàn)象?？臻g位阻可能為這種現(xiàn)象提供一種可能的解釋。變性后大分子單鏈DNA需要一定的溫度和時(shí)間才能完成自身的完全退火，完成退火之前單鏈大分子DNA不是呈線性或僅有一些小發(fā)夾，而是有非常復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu)。如果目標(biāo)順序處在具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)大分子的內(nèi)部，則雖然它與引物完全匹配但也可能因位阻現(xiàn)象而不能完成目標(biāo)半擴(kuò)增鏈和最初的目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物的形成。反之，處在單鏈模板DNA大分子表面的不存在位阻現(xiàn)象的非目標(biāo)順序，雖然它與引物有不同程度的錯(cuò)配，但只要在試驗(yàn)條件下能完成退火就能形成半擴(kuò)增鏈和最初的擴(kuò)增產(chǎn)物。最初的非專一擴(kuò)增產(chǎn)物的順序已與引物完全匹配就很容易繼續(xù)完成以后步驟的擴(kuò)增。所以，非目標(biāo)順序在空間位置上比目標(biāo)順序可能占有先機(jī)是只形成非擴(kuò)增產(chǎn)物，以及形成目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物同時(shí)出現(xiàn)非專一條帶的主要原因之一。我們?cè)貌磺懈钅繕?biāo)順序的識(shí)別順序?yàn)?個(gè)堿基的幾種限制性內(nèi)切酶來(lái)切割基因組DNA，以被切割成小分子的基因組DNA作模板能得到目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物，在同樣反應(yīng)條件下直接用基因組DNA作模板，卻只得到非專一擴(kuò)增產(chǎn)物而無(wú)目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物，間接證明了我們的推斷。在高的退火溫度下，模板單鏈DNA的空間結(jié)構(gòu)比較松散，目標(biāo)順序有更多的機(jī)會(huì)暴露在分子的表面，使目標(biāo)順序和引物物順序完全匹配的優(yōu)勢(shì)得到發(fā)揮。同樣，我們?cè)O(shè)想高濃度的甘油可以使單鏈模板DNA的空間結(jié)構(gòu)變得松散，從而促進(jìn)目標(biāo)半擴(kuò)增鏈和最初的目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物的形成。由于至今尚未能建立一項(xiàng)技術(shù)來(lái)預(yù)測(cè)大分子單鏈DNA在不同溫度下的空間結(jié)構(gòu)，而引物軟件雖能自動(dòng)選擇出具有高嚴(yán)謹(jǐn)性的引物，卻不能預(yù)測(cè)與引物匹配的模板順序是否會(huì)受到位阻的影響。所以，克服位阻的簡(jiǎn)單方法是在比引物最高允許退火溫度略低的溫度下退火，因?yàn)闇囟仍礁邌捂淒NA分子的結(jié)構(gòu)越松散。同樣使用比臨界允許甘油濃度稍低的甘油濃度，會(huì)對(duì)促進(jìn)目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物形成提高PCR專一性有普遍的意義。
2.含50％甘油的緩沖液在-20℃或更低溫度下不結(jié)冰，商品酶制劑包括TaqDNA聚合酶通常加50％甘油避免反復(fù)使用時(shí)因凍融而造成酶的失活。甘油也能提高TaqDNA聚合酶的熱穩(wěn)定性。
Landre(PCR Strategies，p.1-16，Ed.M.A.Innis等，1995)指出Taq酶在97.5℃時(shí)的半衰期為9-11分鐘，添加1，10和20％的甘油能使半衰期分別提高至13，33和60分鐘以上。可以推測(cè)，高于20％的甘油會(huì)使Taq酶仍具有類似的、同樣的或更好的熱穩(wěn)定性。所以在眾多能降低DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)、促進(jìn)PCR擴(kuò)增的變性劑中我們首選甘油。標(biāo)準(zhǔn)PCR的變性溫度為94-95℃，這一溫度下并非所有基因組DNA都能得到充分的完全的變性，但如使用更高的變性溫度可能對(duì)酶的穩(wěn)定性帶來(lái)消極影響。使用高濃度甘油使酶在高溫下的熱失活顯著降低，所以可以在95-98℃進(jìn)行首次變性使所有模板DNA得到充分的變性。
3.Landre等的研究表明10％甘油使Lamda噬菌體DNA的解鏈溫度降低3℃，10％甘油和5％甲酰胺聯(lián)用使Lamda噬菌體DNA的解鏈溫度降低6.2℃，使其他4種基因組DNA的解鏈溫度降低4.5-6.5℃。顯然，擴(kuò)增產(chǎn)物的解鏈溫度也因?qū)敫邼舛雀视投@著降低(見實(shí)施例)。所以根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的解鏈溫度和甘油的加量，將循環(huán)變性溫度降至93-60℃是可行的選擇。
4.同樣，高濃度甘油會(huì)使引物與目標(biāo)順序的最高允許退火溫度降低(見實(shí)施例)，使用較低的退火溫度會(huì)部分抵銷甘油降低核酸二級(jí)結(jié)構(gòu)的作用。為了充分發(fā)揮高濃度甘油的有益作用，可設(shè)計(jì)解鏈溫度高的引物，長(zhǎng)度為30-50堿基的引物或在原有引物的5’端延伸若干堿基，使得引物能在原有的退火溫度下與目標(biāo)順序結(jié)合。
5.有研究表明，10％和20％甘油會(huì)使TaqDNA聚合酶在60-74℃時(shí)活力比對(duì)照降低約20-25％左右。更高濃度的甘油有可能使活力繼續(xù)下降，由于TaqDNA聚合酶在最適條件下每秒鐘能合成70個(gè)以上的核苷酸，PCR產(chǎn)物通常長(zhǎng)度為幾百堿基而延伸時(shí)間通常為1分鐘，所以即使酶的活力有所下降仍能在原來(lái)的或稍長(zhǎng)的的延伸時(shí)間內(nèi)完成擴(kuò)增。
技術(shù)方案本發(fā)明的一種含高濃度甘油的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的反應(yīng)液，其組分包括dNTPs、DNA聚合酶、甘油和水，其中甘油含量為5-45％(V/V)，優(yōu)選為20-35％(V/V)。
本發(fā)明同時(shí)提供應(yīng)用上述的反應(yīng)液的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法，依次包括如下步驟(1)模板變性；(2)引物退火；(3)DNA聚合酶催化下合成互補(bǔ)鏈；(4)按步驟(1)-(3)循環(huán)進(jìn)行合成反應(yīng)；其中，當(dāng)反應(yīng)液含5-20％(V/V)甘油時(shí)，PCR的首次變性溫度范圍為95℃至97℃；反應(yīng)液含20-45％(V/V)甘油時(shí)首次變性溫度范圍為95℃至98℃。
上述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法，它的一個(gè)優(yōu)選方案為應(yīng)用5-20％(V/V)甘油時(shí)，除反應(yīng)啟動(dòng)時(shí)的首次變性外，在其余各PCR循環(huán)中的變性溫度為94℃至60℃；應(yīng)用20-45％(V/V)甘油時(shí)，則其余各PCR循環(huán)中的變性溫度為93℃至60℃。
上述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法，它的另一個(gè)優(yōu)選方案為應(yīng)用5-20％(V/V)甘油時(shí)，從第三個(gè)循環(huán)開始，最低變性溫度的下限比擴(kuò)增產(chǎn)物的解鏈溫度低1-4℃；應(yīng)用20-45％(V/V)甘油時(shí)，從第三個(gè)循環(huán)開始，最低變性溫度比擴(kuò)增產(chǎn)物的解鏈溫度低1-8℃。
本發(fā)明同時(shí)提供上述的反應(yīng)液在減少PCR檢測(cè)結(jié)果非專一性擴(kuò)增產(chǎn)物中的應(yīng)用方法，即通過(guò)應(yīng)用高濃度的甘油使模板與引物專一性的識(shí)別獲得提高，相應(yīng)地減少非專一性識(shí)別。
本發(fā)明也提供上述的反應(yīng)液在減少PCR檢測(cè)結(jié)果假陰性中的應(yīng)用方法，即通過(guò)提高甘油濃度使模板DNA鏈變性充分以減少假陰性。
本發(fā)明提供上述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法在檢測(cè)變異DNA序列中的應(yīng)用，即通過(guò)降低循環(huán)中的變性溫度，使有錯(cuò)配堿基的變異的目標(biāo)DNA序列與引物結(jié)合的機(jī)會(huì)增加，減少了因模板順序突變而導(dǎo)致的假陰性。
本發(fā)明同時(shí)提供應(yīng)用上述反應(yīng)液的反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法，依次包括如下步驟(1)反轉(zhuǎn)錄酶催化下以RNA為模板合成DNA鏈；(2)DNA鏈模板變性；(3)引物退火；(4)DNA聚合酶催化下合成互補(bǔ)鏈；(5)按步驟(2)-(4)循環(huán)進(jìn)行合成反應(yīng)；
其中，當(dāng)反應(yīng)液含5-20％(V/V)甘油時(shí)PCR的首次變性溫度范圍為95℃至97℃；反應(yīng)液含20-45％(V/V)甘油時(shí)首次變性溫度范圍為95℃至98℃。
上述的反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法的一個(gè)優(yōu)選方案為，在應(yīng)用5-20％(V/V)甘油時(shí)PCR循環(huán)中變性溫度為94℃至60℃；應(yīng)用20-45％(V/V)甘油時(shí)PCR循環(huán)中變性溫度為93℃至60℃。
有益效果1.高濃度甘油使呈單鏈的模板DNA分子的空間結(jié)構(gòu)比同樣溫度下不加甘油時(shí)松散，使目標(biāo)順序最初擴(kuò)增時(shí)受到空間位阻的可能性減少，可充分法揮引物與目標(biāo)順序完全匹配的優(yōu)勢(shì)，專一地得到目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物。
2.高濃度甘油增強(qiáng)TaqDNA聚合酶等對(duì)高溫度的耐熱性，可提高首次變性溫度，使所有模板得到充分變性。
3.高濃度甘油使擴(kuò)增產(chǎn)物變性溫度降低，從而可降低后續(xù)循環(huán)的變性溫度。
4.高濃度甘油使模板空間結(jié)構(gòu)松散，引物與目標(biāo)順序結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)力增強(qiáng)，能在較低溫度下仍然專一地?cái)U(kuò)增目標(biāo)產(chǎn)物。有錯(cuò)配堿基的目標(biāo)順序變種與引物專一結(jié)合、得到專一擴(kuò)增的機(jī)會(huì)增加，減少了模板順序突變而導(dǎo)致的假陰性。
5.為能在低溫保存含高濃度甘油的全預(yù)混試劑盒的應(yīng)用開創(chuàng)了條件。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1.
從人甘油醛-3-磷酸-脫氫酶基因(基因庫(kù)編號(hào)XM006959)設(shè)計(jì)一對(duì)引物，其順序和特性示于表1和2。
表1.實(shí)施例1引物順序

表2.實(shí)施例1引物特性

PCR采用ClonTech公司的Advantage-2試劑盒，但PCR反應(yīng)液添加不同濃度甘油。每管反應(yīng)體積5微升，引物濃度0.5μM。每100微升反應(yīng)液加cDNA10微升，cDNA由人組織總RNA用ClonTech公司cDNA合成試劑盒，以試劑盒提供的Oligo(dT)作反轉(zhuǎn)錄引物合成。PCR首次變性97℃1分鐘。試驗(yàn)退火和延伸溫度條件時(shí)，循環(huán)變性溫度88℃持續(xù)10秒，試驗(yàn)退火和延伸溫度范圍為66-76℃持續(xù)10秒；試驗(yàn)變性溫度條件時(shí)，退火溫度64℃持續(xù)10秒，變性溫度試驗(yàn)范圍80-88℃持續(xù)10秒。循環(huán)數(shù)32。試驗(yàn)結(jié)果示于表3。
表3.實(shí)施例1試驗(yàn)結(jié)果

表3結(jié)果說(shuō)明在首次變性97℃，循環(huán)變性88℃和退火延伸溫度64℃的條件下，添加0-30％的甘油都能得到目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物。循環(huán)的最低允許變性溫度從88℃降低至80℃，循環(huán)的最高允許退火溫度從76℃降低至64℃。由于設(shè)計(jì)的正反引物長(zhǎng)度分別為30和34堿基解鏈溫度均超過(guò)87℃，即使反應(yīng)液含有30％甘油仍能在64℃下退火完成擴(kuò)增。
實(shí)施例2.
實(shí)施例2為一管法RT-PCR，引物順序?yàn)镚CCCAGCGGGTGACGATGCC，它與人肌動(dòng)球蛋白基因(基因庫(kù)編號(hào)BC016045)的134-153及314-299位順序分別高度互補(bǔ)，能得到長(zhǎng)181鹼基的擴(kuò)增產(chǎn)物。正反引物之間跨越一個(gè)內(nèi)涵子RT-PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物能與基因組DNA擴(kuò)增產(chǎn)物區(qū)別。實(shí)施例2采用ClonTech公司的TITIUM一管法RT-PCR試劑盒提供的緩沖液，反轉(zhuǎn)錄酶和TaqDNA聚合酶混合液等，但只使用部分的或不使用試劑盒提供的熱穩(wěn)定劑，不使用試劑盒提供的GC-Melting試劑。每管反應(yīng)體積5微升，每100微升反應(yīng)液加0.5微克人組織總RNA作為原始模板，引物濃度為1μM。試驗(yàn)的甘油濃度范圍為0-30％。在35-55℃反轉(zhuǎn)錄60分鐘然后立即轉(zhuǎn)入PCR程序。首次變性96℃2分鐘，循環(huán)變性92℃10秒鐘，退火50℃1分鐘，延伸70℃2分鐘，循環(huán)數(shù)30。結(jié)果見表4。
表4.實(shí)施例2試驗(yàn)結(jié)果

#不使用試劑盒提供的熱穩(wěn)定劑，其他均使用試劑盒規(guī)定量50％的熱穩(wěn)定劑。
試驗(yàn)結(jié)果表明應(yīng)用10或20％甘油反轉(zhuǎn)錄溫度35-55℃均能專一地得到擴(kuò)增產(chǎn)物而無(wú)非專一產(chǎn)物干擾。相反如不加甘油無(wú)論在哪一溫度反轉(zhuǎn)錄在50℃下退火均有大量非專一產(chǎn)物。
實(shí)施例3.
實(shí)施例3以人基因組DNA為原始模板比較PCR反應(yīng)液中添加不同濃度甘油對(duì)擴(kuò)增人Beta腎臟腺素受體基因(3451堿基，基因庫(kù)編號(hào)M15169)的作用。引物選自文獻(xiàn)(H.G.Xie等，Clin.Pharmacol.Ther，2000，67670-675)，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度252堿基，引物對(duì)順序見表5。
表5.實(shí)施例3引物順序

擴(kuò)增用試劑和方法與實(shí)施例1基本相同。不同處為每100微升反應(yīng)液加10微升商品人基因組DNA(Roche公司，0.2微克/微升)。循環(huán)變性92℃10秒，退火45-65℃1分鐘，延伸65℃2分鐘，循環(huán)數(shù)32。試驗(yàn)結(jié)果示于表6。
表6.實(shí)施例3試驗(yàn)結(jié)果


-表示無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物+多少代表目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物強(qiáng)度***表示有非專一產(chǎn)物但不成條帶×阿拉伯?dāng)?shù)字為非專一條帶數(shù)量結(jié)果表明不添加甘油時(shí)，僅當(dāng)退火溫度控制在63-65℃之間才得到擴(kuò)增產(chǎn)物，擴(kuò)增產(chǎn)物微弱而且有大量非專一擴(kuò)增產(chǎn)物。隨甘油濃度增高非專一產(chǎn)物不斷減少，當(dāng)甘油濃度為35％、控制退火溫度為45-53℃時(shí)目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物強(qiáng)而無(wú)非專一條帶。甘油濃度高至40-45％時(shí)，在所試退火溫度范圍內(nèi)均無(wú)非專一產(chǎn)物，但在適當(dāng)退火溫度下仍有目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物形成。本實(shí)施例反引物的解鏈溫度為62.8℃，引物設(shè)計(jì)軟件預(yù)測(cè)其最高允許退火溫度為65.8C，試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了軟件的計(jì)算結(jié)果。隨甘油濃度增加最高允許退火溫度也隨之降低。
實(shí)施例4實(shí)施例4仍以人基因組DNA為原始模板比較PCR反應(yīng)液中添加不同濃度甘油對(duì)擴(kuò)增人Beta腎臟腺素受體基因的作用。將文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)(見實(shí)施例3)的引物在5’端增長(zhǎng)使其解鏈溫度和結(jié)合效率增加而其他特性基本未變。引延伸后的引物順序示于表6，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度262堿基，引物對(duì)順序見表7。
表7.實(shí)施例4引物順序

*粗黑體順序表示為從文文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)引物(實(shí)施例3)延伸的部分。
擴(kuò)增用試劑和方法與實(shí)施例3相同。甘油濃度為35％，結(jié)果在所試的45-65℃退火溫度范圍內(nèi)均得到強(qiáng)的擴(kuò)增產(chǎn)物而無(wú)非專一產(chǎn)物干擾。
權(quán)利要求
1.一種含高濃度甘油的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的反應(yīng)液，其組分包括dNTPs、DNA聚合酶、甘油和水，其特征在于甘油含量為5-45％(V/V)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的反應(yīng)液，其特征在于甘油含量為20-35％(V/V)。
3.應(yīng)用權(quán)利要求1所述的反應(yīng)液的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法，依次包括如下步驟(1)模板變性；(2)引物退火；(3)DNA聚合酶催化下合成互補(bǔ)鏈；(4)按步驟(1)-(3)循環(huán)進(jìn)行合成反應(yīng)；其特征在于當(dāng)反應(yīng)液含5-20％(V/V)甘油時(shí)PCR的首次變性溫度范圍為95℃至97℃；反應(yīng)液含20-45％(V/V)甘油時(shí)首次變性溫度范圍為95℃至98℃。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法，其特征在于應(yīng)用5-20％(V/V)甘油時(shí)PCR循環(huán)中變性溫度為94℃至60℃；應(yīng)用20-45％(V/V)甘油時(shí)PCR循環(huán)中變性溫度為93℃至60℃。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法，其特征在于應(yīng)用5-20％(V/V)甘油時(shí)第三個(gè)循環(huán)開始的最低變性溫度比擴(kuò)增產(chǎn)物的解鏈溫度低1-4℃；應(yīng)用20-45％(V/V)甘油時(shí)第三個(gè)循環(huán)開始的最低變性溫度比擴(kuò)增產(chǎn)物的解鏈溫度低1-8℃。
6.權(quán)利要求1所述的反應(yīng)液在減少PCR檢測(cè)結(jié)果非專一性擴(kuò)增產(chǎn)物中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求1所述的反應(yīng)液在減少PCR檢測(cè)結(jié)果假陰性中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求3所述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法在檢測(cè)變異DNA序列中的應(yīng)用。
9.應(yīng)用權(quán)利要求1所述的反應(yīng)液的反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法，依次包括如下步驟(1)在反轉(zhuǎn)錄酶催化下以RNA為模板合成DNA鏈；(2)DNA鏈模板變性；(3)引物退火；(4)DNA聚合酶催化下合成互補(bǔ)鏈；(5)按步驟(2)-(4)循環(huán)進(jìn)行合成反應(yīng)；其特征在于當(dāng)反應(yīng)液含5-20％(V/V)甘油時(shí)PCR的首次變性溫度范圍為95℃至97℃；反應(yīng)液含20-45％(V/V)甘油時(shí)首次變性溫度范圍為95℃至98℃。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法，其特征在于應(yīng)用5-20％(VN)甘油時(shí)PCR循環(huán)中變性溫度為94℃至60℃；應(yīng)用20-45％(V/V)甘油時(shí)PCR循環(huán)中變性溫度為93℃至60℃。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種含高濃度甘油的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的方法及其反應(yīng)液和應(yīng)用，特別地，采用在原有的PCR反應(yīng)液中添加5－45％(V/V)甘油的高甘油配方，大大突破了現(xiàn)有的反應(yīng)液甘油濃度，并且提供相應(yīng)的提高首次變性溫度至95℃－98℃、降低循環(huán)中變性溫度至94℃－60℃的反應(yīng)方法，使非專一性擴(kuò)增產(chǎn)物顯著下降，PCR結(jié)果中的假陰性減少，對(duì)于目標(biāo)DNA序列的變異，其檢出率亦獲得提高。本發(fā)明的反應(yīng)液和反應(yīng)方法適用于分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室高效的常規(guī)PCR擴(kuò)增和快速而特異的臨床醫(yī)學(xué)核酸檢測(cè)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1548544SQ0311701
公開日2004年11月24日 申請(qǐng)日期2003年5月20日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月20日
發(fā)明者徐定邦, 朱德芬, 孫崇榮, 徐文慧 申請(qǐng)人:徐定邦, 徐文慧