專利名稱：含高濃度甘油的pcr和rt－pcr全預(yù)混試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)技術(shù)，特別是涉及用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的試劑。
背景技術(shù)：
聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)是一種簡單、專一、快速、靈敏地?cái)U(kuò)增特定DNA的方法，其反應(yīng)液由十幾種試劑組成(見表1的試劑欄)。反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)是則是在PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來的以RNA為原始模板的擴(kuò)增方法，除了PCR所需的各種試劑外又增加了反轉(zhuǎn)錄酶、反轉(zhuǎn)錄用引物和RNase抑制劑等。在PCR技術(shù)建立之初，各種PCR試劑盒均將每一種試劑分別制備成幾至幾十倍濃度的儲(chǔ)液，使用時(shí)按需要進(jìn)行配制。這種試劑盒可隨意改變反應(yīng)液組成成份的配比，適合用于探索PCR反應(yīng)液的最佳配比。但是其缺點(diǎn)也很明顯第一，加液操作多達(dá)十次以上費(fèi)時(shí)又麻煩。第二，多次使用移液管增加了污染的機(jī)會(huì)。第三，每一次加樣操作都可能有誤差從而影響了擴(kuò)增的重復(fù)性、穩(wěn)定性和定量準(zhǔn)確性，使管與管之間的誤差較大。第四，有些試劑如DNA聚合酶、反轉(zhuǎn)錄酶等往往制備成50或100倍濃的儲(chǔ)液，各種試劑分開操作使單管測(cè)定時(shí)縮小反應(yīng)液的總體積受到限制。為了克服這些缺點(diǎn)將部分試劑預(yù)混的各種PCR試劑盒應(yīng)運(yùn)而生(表1)，被預(yù)混的試劑成份越來越多，但大多數(shù)預(yù)混試劑不包括DNA聚合酶和反轉(zhuǎn)錄酶。
表1.各種PCR試劑盒試劑預(yù)混方式

近年來Roche(PCR Master)和Promega(PCR Masler Mix)等公司分別推出了包括DNA聚合酶的全預(yù)混液體試劑，但這種試劑只能在4℃左右儲(chǔ)存保存期僅3個(gè)月，而通常DNA聚合酶能在-20℃或更低溫度下保存有效期一年以上。為了能達(dá)到長期保存國外(P．A．Klaster等Jornal Clinical Microbiology，1998，36(6)1978)和國內(nèi)研究者(中國專利申請(qǐng)?zhí)?0112540)將含DNA聚合酶的全預(yù)混溶液制備成冷凍干燥制劑。這種方法雖然延長了保存期，但卻增加了冷凍干燥制備步驟，并造成酶在冷干過程中的損失。冷凍干燥制劑很難制備成單管用制劑，分裝不方便，一旦解凍就不能久存。在反轉(zhuǎn)錄PCR方面Clontech公司推出了一種含反轉(zhuǎn)錄酶的預(yù)混試劑(BD SprintPowerScript Single Shots)，但也是冷凍干燥制劑，而且與PCR試劑完全分開。Promega公司推出一種將PCR試劑包括DNA聚合酶與反轉(zhuǎn)錄試劑共同預(yù)混的試劑(AccessQuick RT PCR System)，但也只能保存于4℃，而且將AMV反轉(zhuǎn)錄酶單獨(dú)制備成50倍儲(chǔ)液分開供應(yīng)。

發(fā)明內(nèi)容
所要解決的技術(shù)問題本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供用于PCR和RT-PCR的全預(yù)混試劑組合物，包括研究用全預(yù)混PCR和一管法RT-PCR試劑，以及臨床核酸檢測(cè)用全預(yù)混PCR和一管法RT-PCR試劑，以克服現(xiàn)有預(yù)混試劑預(yù)混成分不全、不能在-20℃或更低的溫度下保存而有效期達(dá)到一年以上、以及最終反應(yīng)體積不能達(dá)到2微升的缺陷。
發(fā)明構(gòu)思含高濃度甘油全預(yù)混PCR試劑和RT-PCR試劑的開發(fā)基于下述事實(shí)和試驗(yàn)
1.分子生物學(xué)研究用酶制劑包括各種DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶，如Taq和PfuDNA聚合酶，以及各種RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶，如AMV和M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶，均保存于含50％甘油的溶液中。本發(fā)明在全預(yù)混試劑中添加高濃度甘油，對(duì)酶有同樣的保護(hù)和穩(wěn)定作用而無副作用。
2.高濃度甘油與PCR或RT-PCR反應(yīng)的其他試劑包括dNTPs、鎂離子、鈉離子、鉀離子、寡聚核苷酸等在-20℃低溫下不發(fā)生任何物理化學(xué)反應(yīng)，或其他影響PCR和RT-PCR的物理化學(xué)反應(yīng)。
3.甘油對(duì)PCR和RT-PCR反應(yīng)有促進(jìn)作用。其一，甘油顯著降低DNA和RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)，對(duì)PCR和反轉(zhuǎn)錄有利。其二，甘油顯著增強(qiáng)TaqDNA聚合酶等和AMV反轉(zhuǎn)錄酶等對(duì)高溫的耐受。雖然甘油對(duì)TaqDNA聚合酶等和AMV反轉(zhuǎn)錄酶的活力有一定程度的抑制作用，但抑制作用比較微弱。按目前RT-PCR的常規(guī)操作反轉(zhuǎn)錄酶和DNA聚合酶的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過實(shí)際需要，所以微弱的抑制作用實(shí)際上對(duì)反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增沒有影響。試驗(yàn)表明在PCR反應(yīng)體系中添加5-40％(v/v)甘油，在RT-PCR反應(yīng)體系中添加5-25％(v/v)甘油并調(diào)整反應(yīng)條件能提高擴(kuò)增的專一性和其他特性而無負(fù)面影響。
本發(fā)明的全預(yù)混試劑有二大類。第一類為研究用全預(yù)混PCR試劑和全預(yù)混RT-PCR試劑，包括了引物以外完成PCR和一管法RT-PCR所需的全部試劑。全預(yù)混試劑能在-20℃或更低的溫度下保存有效期一年以上。第二類為臨床核酸檢測(cè)用PCR和一管法RT-PCR試劑盒，含包括引物在內(nèi)的完成PCR和一管法RT-PCR所需的全部試劑。兩類全預(yù)混試劑都含有高濃度甘油，能在-20℃或更低的溫度下保存有效期一年以上。臨床核酸檢測(cè)用全預(yù)混試劑制備成不同倍數(shù)，配制反應(yīng)液時(shí)只需將試劑和樣品以一定的比例混合即可，非常方便準(zhǔn)確。研究用全預(yù)混試劑也制備成不同倍數(shù)，配制反應(yīng)液時(shí)只需將試劑、樣品和引物以一定的比例混合即可，同樣非常方便準(zhǔn)確。
技術(shù)方案本發(fā)明的一種用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的全預(yù)混試劑組合物，其組分包括dNTPs、DNA聚合酶、甘油和水，其中甘油含量為30-65％(v/v)，且使用時(shí)所述組合物與待測(cè)樣品溶液混合的體積比為9∶1至1∶9；優(yōu)選方案為甘油含量40-55％(v/v)，且使用時(shí)所述組合物與樣品溶液混合的體積比為3∶1至1∶3。
本發(fā)明的全預(yù)混試劑組合物所配制的PCR反應(yīng)液的最終反應(yīng)液體積為2-100微升，優(yōu)選為2-10微升。
本發(fā)明的另一方案為，上述的全預(yù)混試劑組合物中，除所述的dNTPs、DNA聚合酶、甘油和水之外，還含有PCR引物。
本發(fā)明的另一方案為，上述的全預(yù)混試劑組合物中，除所述的dNTPs、DNA聚合酶、甘油和水之外，還含有反轉(zhuǎn)錄酶。
本發(fā)明的另一方案為，上述的全預(yù)混試劑組合物中，除所述的dNTPs、DNA聚合酶、甘油、水和反轉(zhuǎn)錄酶之外，還含有RT-PCR反應(yīng)所需的反轉(zhuǎn)錄引物和PCR引物。
本發(fā)明的上述技術(shù)方案根據(jù)其應(yīng)用方向不同，事實(shí)上包括(1)研究用全預(yù)混PCR試劑；(2)研究用全預(yù)混一管法RT-PCR試劑；(3)臨床核酸檢測(cè)用全預(yù)混PCR試劑；和(4)臨床核酸檢測(cè)用全預(yù)混一管法RT-PCR試劑。研究和臨床核酸檢測(cè)用PCR/RT-PCR全預(yù)混試劑均包括完成反應(yīng)所需要DNA聚合酶或反轉(zhuǎn)錄酶，區(qū)別在于研究用全預(yù)混試劑不包括引物，可根據(jù)研究需要加入引物，而臨床核酸檢測(cè)用全預(yù)混試劑包括了該項(xiàng)檢測(cè)的引物。
全預(yù)混試劑設(shè)計(jì)成10/9倍濃至10倍濃，應(yīng)用時(shí)試劑與樣品的加量之比相應(yīng)為9∶1至1∶9。全預(yù)混試劑設(shè)計(jì)成4/3倍濃至4倍濃，則用時(shí)試劑與樣品的加量之比相應(yīng)為3∶1至1∶3。每管PCR反應(yīng)液體積可采用通用的50或100微升也可縮小。假定認(rèn)為用通常的微量移管操作達(dá)到準(zhǔn)確加樣的限度為1微升，則本發(fā)明設(shè)計(jì)的全預(yù)混試劑最小PCR反應(yīng)體積僅為2微升。
具體實(shí)施例方式
表2列出使用不同倍數(shù)預(yù)混試劑時(shí)樣品和試劑加量，及全預(yù)混試劑甘油濃度為40、50或60％(v/v)時(shí)PCR反應(yīng)液中的甘油濃度。
表2.應(yīng)用不同倍數(shù)預(yù)混試劑時(shí)樣品和試劑的加量及反應(yīng)液的甘油終濃度

*假定反應(yīng)體積為20微升，可據(jù)此表放大或縮小體積**空白表示反應(yīng)液甘油終濃度超過40％配制1毫升不同倍數(shù)臨床核酸檢測(cè)用全預(yù)混PCR試劑盒的方法示于表3。表中假定PCR反應(yīng)液引物和四種脫氧核糖核苷酸的終濃度分別為0.5μM和0.2mM；DNA聚合酶儲(chǔ)液、緩沖液儲(chǔ)液、dNTPs和引物儲(chǔ)液分別為50、50、100和200倍濃。改變儲(chǔ)液濃度或加量可調(diào)節(jié)引物、dNTPs和其他各種成份達(dá)到所需要的濃度。
表3.不同倍數(shù)全預(yù)混臨床核酸檢測(cè)用PCR試劑的配制*

*空白表示反應(yīng)液甘油終濃度超過40％配制1毫升全預(yù)混臨床核酸檢測(cè)用一管法RT-PCR試劑盒的方法示于表4，表中假定反轉(zhuǎn)錄酶和RNase抑制劑儲(chǔ)液分別為50和100倍濃。
表4.不同倍數(shù)全預(yù)混臨床核酸檢測(cè)用一管法RT-PCR試劑的配制

*空白表示反應(yīng)液甘油終濃度超過25％(v/v)配制1毫升研究用全預(yù)混PCR試劑盒和研究用全預(yù)混一管法RT-PCR試劑盒的方法分別與表2和表3相仿但不需要加引物相應(yīng)增加無離子水加量。為了給引物儲(chǔ)液的濃度和加量留有更大的空間無離子水的用量可再調(diào)節(jié)。
有益效果1.使用方便，只需將全預(yù)混試劑與含模板樣品按一定比例混合即可。
2.可長期低溫保存，其儲(chǔ)存期與商品DNA聚合酶和反轉(zhuǎn)錄酶保存期相同。
3.PCR或RT-PCR反應(yīng)液配制操作僅一步，大大增強(qiáng)了檢測(cè)的準(zhǔn)確性、重復(fù)性和穩(wěn)定性。
4.PCR或RT-PCR反應(yīng)液配制操作僅一步，大大減少了各種污染的機(jī)會(huì)。
5.PCR或RT-PCR反應(yīng)液配制操作僅一步，也為高通量和自動(dòng)化檢測(cè)創(chuàng)造了條件。
6.PCR或RT-PCR反應(yīng)液含有4-40％(v/v)或4-25％(v/v)的甘油，增強(qiáng)了PCR反應(yīng)的專一性和其他有益特性。
實(shí)施例實(shí)施例1.
全預(yù)混乙型肝炎(HBV)PCR診斷試劑盒。
HBV是一種DNA病毒根據(jù)其基因組順序(基因庫編號(hào)E00010)在其保守區(qū)設(shè)計(jì)了一對(duì)引物，其順序和特性示于表5和表6。
表5.實(shí)施例1引物順序

表6.實(shí)施例1引物特性

配制1毫升3倍濃含50％甘油的全預(yù)混HBV診斷試劑盒的方法示于表7，全預(yù)混試劑的主要試劑原料取自ClonTech公司的Advantage2 PCR試劑盒。
表7.3倍濃全預(yù)混HBV PCR診斷試劑盒配制

*含400mM tricine-KOH，pH8.7，150mM KOAc，35mM Mg(OAc)2，37.5μg/ml BSA，0.05％Tween-20和0.05％Nonidet-P40。
**含TaqDNA聚合酶，Taq酶抗體，具校讀功能DNA聚合酶，50％甘油(v/v)，15mM Tris-HCl，pH8.0，75mM KCl和50μM EDTA。
測(cè)定時(shí)每管取1微升全預(yù)混試劑并與2微升從乙肝病人血清制備的DNA樣品混合，置于擴(kuò)增儀開始反應(yīng)。首次變性95℃1分鐘，循環(huán)變性95℃10秒鐘，退火60℃30秒鐘，延伸72℃1分鐘，循環(huán)數(shù)30。收尾延伸72℃3分鐘。經(jīng)5％聚丙烯酰胺凝膠電泳后染色，呈現(xiàn)359堿基條帶表示為陽性。試劑盒保存-20℃于3個(gè)月、半年和一年后對(duì)同一DNA樣品進(jìn)行測(cè)定，得到同樣清晰條帶，表明試劑保持原有活性。
實(shí)施例2.
全預(yù)混甲狀腺球蛋白基因表達(dá)一管法RT-PCR診斷試劑盒。
甲狀腺球蛋白是一種組織專一表達(dá)基因(基因庫編號(hào)NM_003235)，各種組織含基因但僅在甲狀腺組織細(xì)胞中表達(dá)。如果在血液或其他體液中出現(xiàn)甲狀腺球蛋白基因的mRNA，提示可能為因甲狀腺腫瘤或其他甲狀腺疾病而導(dǎo)致甲狀腺細(xì)胞脫落所造成的。測(cè)定時(shí)從血液制備總RNA，以甲狀腺組織總RNA作為檢測(cè)的陽對(duì)照。根據(jù)甲狀腺球蛋白基因順序設(shè)計(jì)一對(duì)引物，其順序和特性示于表8和表9。
表8.實(shí)施例2引物順序

表9.實(shí)施例2引物特性

配制1毫升2倍濃含40％甘油的全預(yù)混甲狀腺球蛋白R(shí)T-PCR診斷試劑盒的方法示于表10，全預(yù)混試劑的主要試劑原料取自ClonTech公司的TITANIUM一管法RT-PCR試劑盒。
表10.全預(yù)混甲狀腺球蛋白基因RT-PCR診斷試劑盒配制

測(cè)定時(shí)每管取5微升試劑，與5微升濃度分別為10ng/μL，1ng/μL，100pg/μL和10pg/μL的人甲狀腺組織總RNA混合后置于擴(kuò)增儀。60℃保溫10分鐘完成cDNA合成后，立即轉(zhuǎn)入PCR程序。首次變性95℃5分鐘，循環(huán)變性95℃10秒鐘，退火60℃30秒鐘，延伸72℃1分鐘，循環(huán)數(shù)30。收尾延伸72℃3分鐘。經(jīng)5％聚丙烯酰胺凝膠電泳后染色，呈現(xiàn)200堿基條帶表示為陽性。試劑盒保存于-20℃，間隔3個(gè)月、半年和1年后，對(duì)不同樣稀釋度的樣品測(cè)定得到同樣清晰的條帶表明試劑保持原有活性。
實(shí)施例3.
全預(yù)混PCR試劑盒。
配制1毫升4倍濃含40％甘油(v/v)PCR試劑盒的方法示于表11，全預(yù)混試劑的主要試劑原料取自ClonTech公司的Advantage2PCR試劑盒。
表11.4倍濃40％甘油全預(yù)混PCR劑盒配制

*含400mM tricine-KOH，pH8.7，150mM KOAc，35mM Mg(OAc)2，37.5μg/ml BSA，0.05％Tween-20和0.05％Nonidet-P40。
**含TaqDNA聚合酶，Taq酶抗體，具校讀功能DNA聚合酶，50％(v/v)甘油，15mM Tris-HCl，pH8.0，75mM KCl和50μMEDTA。
根據(jù)引物儲(chǔ)液濃度和設(shè)定的終濃度按表12配制PCR反應(yīng)液，其中X為每一個(gè)引物的加量，最高加量可為3.75微升。
表12.從全預(yù)混PCR試劑配制PCR反應(yīng)液

實(shí)施例4.
全預(yù)混RT-PCR試劑盒。
配制1毫升3/2倍濃含30％(v/v)甘油RT-PCR試劑盒的方法同表10所示，全預(yù)混試劑的主要試劑原料取自，全預(yù)混試劑的主要試劑原料取自ClonTech公司的TITANIUM一管法RT-PCR試劑盒。
表13.3/2倍濃30％甘油全預(yù)混RT-PCR試劑盒配制


根據(jù)引物儲(chǔ)液濃度和設(shè)定的終濃度按表14配制PCR反應(yīng)液，其中X為每一個(gè)引物的加量，X最高可為1微升。用試劑盒擴(kuò)增實(shí)施例1所示的HBV基因和其他基因得到實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的預(yù)期結(jié)果。
表14.從全預(yù)混RT-PCR試劑配制RT-PCR反應(yīng)液

用試劑盒擴(kuò)增實(shí)施例2所示TG基因和其他基因得到實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的預(yù)期結(jié)果。
權(quán)利要求
1.一種用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的全預(yù)混試劑組合物，其組分包括dNTPs、DNA聚合酶、甘油和水，其特征在于甘油體積百分含量為30-65％，且使用時(shí)所述組合物與待測(cè)樣品溶液混合的體積比為9∶1至1∶9。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑組合物，其特征在于甘油體積百分含量為40-55％，且使用時(shí)所述組合物與樣品溶液混合的體積比為3∶1至1∶3。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑組合物，其特征在于最終反應(yīng)液體積為2-100微升。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3中任一項(xiàng)所述的試劑組合物，其特征在于還含有PCR引物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3中任一項(xiàng)所述的試劑組合物，其特征在于還含有反轉(zhuǎn)錄酶。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑組合物，其特征在于還含有RT-PCR反應(yīng)所需的反轉(zhuǎn)錄引物和PCR引物。
7.權(quán)利要求1所述的試劑組合物在分子生物學(xué)試劑中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求4所述的試劑組合物在臨床核酸檢測(cè)試劑中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求5所述的試劑組合物在分子生物學(xué)試劑中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求6所述的試劑組合物在臨床核酸檢測(cè)試劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供用于PCR和RT－PCR全預(yù)混試劑組合物，包括研究用全預(yù)混PCR和一管法RT－PCR試劑，以及臨床核酸檢測(cè)用全預(yù)混PCR和一管法RT－PCR試劑。特別地，全預(yù)混試劑含30－65％(v/v)的甘油，優(yōu)選40－55％(v/v)。研究和臨床核酸檢測(cè)用兩類全預(yù)混試劑包括完成反應(yīng)所需要DNA聚合酶和反轉(zhuǎn)錄酶，但研究用全預(yù)混試劑不包括引物而臨床核酸檢測(cè)用全預(yù)混試劑還包括引物。全預(yù)混試劑設(shè)計(jì)成10/9倍濃至10倍濃，試劑與樣品的加量之比相應(yīng)為9∶1至1∶9。本發(fā)明設(shè)計(jì)的全預(yù)混試劑最小PCR反應(yīng)體積僅為2微升，在－20℃或更低的溫度下保存，有效期一年以上，且能提高擴(kuò)增的專一性。適用于分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室和臨床實(shí)驗(yàn)室快速配制PCR反應(yīng)液，實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)的目的。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1548548SQ0311701
公開日2004年11月24日 申請(qǐng)日期2003年5月20日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月20日
發(fā)明者徐定邦, 朱德芬, 陳有容, 徐文慧 申請(qǐng)人:徐定邦, 徐文慧