專利名稱：一種基因型測定的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物技術(shù)，更具體地說涉及一種基因型測定的方法。
所有生物物種的遺傳物質(zhì)是核酸，包括核糖核酸(RNA)和脫氧核糖核酸(DNA)，決定核酸功能特征的基本組成是四種堿基，在DNA中它們分別由A、C、G、T代表，在RNA中它們分別由A、C、G、U代表。這些在自然界可以找到并存在于核酸中的核苷酸或堿基稱為自然核苷酸或自然堿基，此外通過化學(xué)合成方法可把非自然核苷酸或非自然堿基或其它非正常核酸組分加入到核酸鏈中，因此核酸的非自然性結(jié)構(gòu)定義為不存在于自然界的結(jié)構(gòu)(只能人工合成)或除正常的四種核苷酸(或四種堿基)外的其它結(jié)構(gòu)(如U在DNA中也屬非自然結(jié)構(gòu))。堿基在核酸中以串連方式組成鏈狀結(jié)構(gòu)，RNA一般為單鏈結(jié)構(gòu)，DNA一般為雙鏈結(jié)構(gòu)，在雙鏈結(jié)構(gòu)中堿基A與另一鏈的T(U)通過氫鍵相配，同理G與另一鏈的C相配，自然界(生物中)的整個(gè)雙鏈DNA都是完全相配的，當(dāng)有不完全相配的情況出現(xiàn)時(shí)雙鏈結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性就會降低，兩條在序列上相配的核酸鏈稱為互補(bǔ)鏈。核酸序列在進(jìn)化過程中和外界條件的影響下會發(fā)生變化，最常見的變化為一堿基被另一堿基所取代，在同一物種中，同一核酸序列的同一位置(單堿基位置)在不同的個(gè)體之間如有不同的堿基成分，則這一種現(xiàn)象稱為單堿基(核苷酸)多態(tài)性(SNP)。在特定個(gè)體中，多態(tài)性位點(diǎn)的一種堿基組成為這一位點(diǎn)的一種基因型(基因?yàn)楹怂岬墓δ苄詤^(qū)域)，一個(gè)單倍體生物個(gè)體在一個(gè)多態(tài)點(diǎn)上只能有一個(gè)基因型，在雙倍體的生物個(gè)體中如二同源基因具有相同的基因型，這一個(gè)體為純合子，如有不同的基因型，則這一個(gè)體為雜合子?；蛐蜏y定對遺傳診斷、物種鑒定、藥物篩選等具有重大意義。DNA可以在聚合酶等的作用下被復(fù)制，即由模板鏈復(fù)制出互補(bǔ)鏈，DNA的復(fù)制需要有一引物，引物一般為一含有幾個(gè)或幾十個(gè)堿基的核酸鏈，核酸鏈具有方向性分別用5’端和3’端表示，接近5’端的序列稱為5’端部分，接近3’端的稱為3’端部分，核酸復(fù)制前引物與模板在3’端有特異性地根據(jù)堿基配對原理結(jié)合成雙鏈結(jié)構(gòu)(這一過程稱為分子雜交)，此后聚合酶可從引物的3’端開始沿5’→3’方向合成與模板相互補(bǔ)的新鏈，新形成的雙鏈可在高溫下(＞90℃)分離成獨(dú)立的單鏈，當(dāng)溫度下降時(shí)余下的引物分子可再與相應(yīng)的模板核酸分子雜交，并可在聚合酶的作用下復(fù)制出新的核酸鏈，反復(fù)如上過程，一個(gè)核酸片段可被擴(kuò)增出千萬個(gè)同樣的分子片段，如上過程即為聚合酶鏈反應(yīng)過程(PCR)。一核酸樣品需擴(kuò)增的部分為靶片段，進(jìn)行PCR反應(yīng)一般在靶片段兩端要有相應(yīng)的引物，對一多態(tài)位點(diǎn)附近的序列專一的引物為多態(tài)性引物，對一多態(tài)性位點(diǎn)的特定基因型有專一性的為基因型引物，多態(tài)性引物可和基因型引物結(jié)合使用對靶片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并測定基因型。用化學(xué)的方法可以人工合成核酸片段作為引物，引物的堿基序列與靶片段序列相互補(bǔ)，另外引物序列中可具有與核酸樣品中的序列非互補(bǔ)的序列，這種與樣品不具互補(bǔ)性的序列稱為外源序列，外源序列可作為引物的部分結(jié)構(gòu)?；蛐酒且环N把不同核酸分子分別排列于特定位置，并用于核酸分子雜交的裝置，固定于基因芯片上的核酸分子為探針分子，與探針分子進(jìn)行特異性雜交的為靶分子，探針分子可通過在芯片的位置或所帶的標(biāo)記進(jìn)行靶分子識別，標(biāo)記可有多種形式，如放射性標(biāo)記、熒光標(biāo)記、納米顆粒標(biāo)記、酶標(biāo)記、色素標(biāo)記等，用以區(qū)別不同基因型的具標(biāo)記的核酸探針分子為基因型探針。常用的基因型測定方法有核酸測序法、基因芯片雜交法等，核酸測序法速度慢成本高不適合大規(guī)模的基因型測定；基因芯片雜交法的使用效果決定于樣品的制備過程，一般的樣品制備過程包括多步酶反應(yīng)、PCR反應(yīng)、標(biāo)記反應(yīng)等，使用多步酶反應(yīng)會使成本增高，基因型測定時(shí)間增長等。
本發(fā)明的目的是提供一種基因型測定的方法，它能克服現(xiàn)有技術(shù)的上述不足。
一種基因型測定的方法，包括使用多態(tài)性引物和基因型引物對含有多態(tài)性位點(diǎn)的核酸靶片段進(jìn)行擴(kuò)增，使擴(kuò)增產(chǎn)物與基因芯片的探針分子以及和通用的基因型探針進(jìn)行雜交，根據(jù)基因型探針在基因芯片上的信號判斷多態(tài)性位點(diǎn)的基因型，其特征是多態(tài)性引物和基因型引物的5’端部分分別具有專一的外源序列，多態(tài)性引物和基因型引物的3’端部分分別具有與靶序列相互補(bǔ)的序列，外源序列和互補(bǔ)序列之間有非自然性結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是可用通用的基因芯片，無需在PCR后進(jìn)行標(biāo)記等反應(yīng)，利用通用的基因型探針可省時(shí)、省料、減低消耗降低成本，并能降低檢測中出現(xiàn)的假陽性提高檢測質(zhì)量。本方法可用于測定動(dòng)物、植物、微生物及病毒的基因型或其核酸量的多少，應(yīng)用本方法也可以制造有商業(yè)價(jià)值的試劑盒或從事分子診斷服務(wù)。
下面通過實(shí)施例說明本發(fā)明。
制作診斷遺傳病的基因芯片，所診斷的遺傳病可以是高血壓、糖尿病等。基因芯片上的分子探針是與多態(tài)性引物的外源序列相互補(bǔ)的核酸分子，其長度由10-50個(gè)核苷酸組成，每一種探針分別用已知的方法固定于芯片的表面，配制一個(gè)試劑盒，試劑盒包括用于對多態(tài)性靶片段進(jìn)行擴(kuò)增的引物，擴(kuò)增一多態(tài)性靶片段的引物包括專一的多態(tài)性引物和二個(gè)專一的基因型引物，試劑盒還包括核酸提純的試劑PCR反應(yīng)的酶、緩沖液等，此外試劑盒包括二個(gè)或多個(gè)分別有不同標(biāo)記的基因型探針，標(biāo)記為熒光色素或其它的可用化學(xué)或物理方法識別的納米范圍的結(jié)構(gòu)，試劑盒還包括用于分子雜交的緩沖液。在進(jìn)行基因型測定時(shí)采用如下操作程序①從一病人的血液中提取DNA，一般一滴血的樣品可提取數(shù)十或數(shù)百納克的DNA，提取的DNA溶于水或適當(dāng)?shù)木彌_液；②用PCR反應(yīng)試劑對提取的DNA核酸進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用一多態(tài)性引物和二個(gè)專一的基因型引物對一多態(tài)性靶片段進(jìn)行擴(kuò)增，多組引物可以在同一試管中使用(復(fù)合PCR反應(yīng))，復(fù)合的程度可為二組或二組以上的引物，擴(kuò)增后的產(chǎn)物具有單鏈的多態(tài)性外源序列和單鏈的基因型外源序列，反應(yīng)的體積一般在10-100微升；③多個(gè)PCR的反應(yīng)產(chǎn)物可合并，并進(jìn)行適當(dāng)?shù)募兓?、濃縮等處理(必要時(shí)可除去未反應(yīng)的引物)，然后與雜交用的緩沖液結(jié)合，最終體積在0.1-1毫升范圍內(nèi)。雜交液中包含具不同標(biāo)記的基因型探針；④用已知的方法和儀器進(jìn)行芯片雜交和清洗，并用激光掃描儀或其它相應(yīng)的儀器采集芯片上的信號；⑤根據(jù)信號在芯片上的位置、特征和信號的強(qiáng)度的比例，可測定多態(tài)性位點(diǎn)的基因型。醫(yī)院大夫可根據(jù)病人的基因型做出診斷并進(jìn)行適當(dāng)?shù)闹委煛?br> 根據(jù)此方法可制成①試劑盒，試劑盒包括相關(guān)的反應(yīng)引物和生物化學(xué)試劑；②基因芯片；③相關(guān)的電腦軟件(使用說明和數(shù)據(jù)分析方法)。
此方法用于與核酸相關(guān)的測定，主要包括①人類遺傳病的診斷；②人類或動(dòng)植物的基因型測定；③生物物種鑒定。還可用于藥物篩選(不同人群對藥物的反應(yīng)；公安刑偵(查找罪犯)；生物物種改良等領(lǐng)域。
權(quán)利要求
一種基因型測定的方法，包括使用多態(tài)性引物和基因型引物對含有多態(tài)性位點(diǎn)的核酸靶片段進(jìn)行擴(kuò)增，使擴(kuò)增產(chǎn)物與基因芯片的探針分子以及和通用的基因型探針進(jìn)行雜交，根據(jù)基因型探針在基因芯片上的信號判斷多態(tài)性位點(diǎn)的基因型，其特征是多態(tài)性引物和基因型引物的5’端部分分別具有專一的外源序列，多態(tài)性引物和基因型引物的3’端部分分別具有與靶序列相互補(bǔ)的序列，外源序列和互補(bǔ)序列之間有非自然性結(jié)構(gòu)。
全文摘要
一種基因型測定的方法，其特征是多態(tài)性引物和基因型引物的5’端部分分別具有專一的外源序列，多態(tài)性引物和基因型引物的3’端部分分別具有與靶序列相互補(bǔ)的序列，外源序列和互補(bǔ)序列之間有非自然性結(jié)構(gòu)。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是可用通用的基因芯片，無需在PCR后進(jìn)行標(biāo)記等反應(yīng)，利用通用的基因型探針可省時(shí)、省料、減低消耗、降低成本，并能降低檢測中出現(xiàn)的假陽性提高檢測質(zhì)量。
文檔編號C12Q1/68GK1514016SQ03111990
公開日2004年7月21日 申請日期2003年3月18日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月18日
發(fā)明者吳昌, 吳 昌 申請人:吳昌, 吳 昌