酵母cup1基因在動物飼養(yǎng)領(lǐng)域的用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，特別是涉及酵母CUP1基因在動物飼養(yǎng)領(lǐng)域的用途，并進(jìn)一步提供相關(guān)CUP1基因的表達(dá)載體及其制備方法。本發(fā)明提供酵母CUP1基因在動物飼養(yǎng)領(lǐng)域的用途，所述動物飼養(yǎng)領(lǐng)域具體指促進(jìn)動物對于飼料中銅的吸收率，促進(jìn)動物的體重增加，并減少動物的銅排放，由此降低銅排放對土壤、水體等生態(tài)環(huán)境的污染。本發(fā)明發(fā)明人對酵母中的CUP1基因進(jìn)行載體的構(gòu)建，在建立的轉(zhuǎn)CUP1基因的小鼠模型中，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)CUP1基因促進(jìn)了小鼠的體重增加，并在促進(jìn)了小鼠對飼料中銅的吸收率的同時，也減少了銅的排放，減少了銅排放對土壤、水體等生態(tài)環(huán)境的污染。
【專利說明】酵母CUP1基因在動物飼養(yǎng)領(lǐng)域的用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，特別是涉及酵母CUPl基因在動物飼養(yǎng)領(lǐng)域的用途，并進(jìn)一步提供相關(guān)CUPl基因的表達(dá)載體及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]規(guī)?；?、集約化的養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)對生態(tài)環(huán)境的污染越來越嚴(yán)重，而在豬排泄中的銅是重要的因素之一。銅作為一種高效、廉價、方便的促生長添加劑在養(yǎng)豬業(yè)中被廣泛應(yīng)用。畜禽的日糧中銅的添加量大大超出其適宜需要量時，被吸收利用的銅很少，絕大多數(shù)銅會隨糞便排出體外。土壤中高濃度的銅對微生物產(chǎn)生毒害作用，使得微生物的種類和數(shù)量大大降低，土壤出現(xiàn)了結(jié)板鹽堿化，對土壤的呼吸有很大的抑制作用。高銅會造成動物中毒，在動物的內(nèi)臟和肌肉中的殘留量增加，銅可以通過食物鏈進(jìn)行富集，對整個生態(tài)鏈的安全帶來潛在的危害，甚至?xí)＜暗饺祟惖慕】怠?br> [0003]課題組已經(jīng)通過文獻(xiàn)挖掘和生物信息學(xué)方法確定了酵母CUPl作為我們研究的基因。通過生物信息學(xué)的預(yù)測，發(fā)現(xiàn)酵母CUPl與哺乳動物的MT基因是同源基因，基因的序列及表達(dá)的蛋白氨基酸上相差很遠(yuǎn)，只是含有相同的結(jié)合金屬離子的保守氨基酸序列，所以該基因的轉(zhuǎn)入不會對轉(zhuǎn)基因動物自身的代謝造成影響。而隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，培育有效利用飼料中的添加銅、減少銅排放的轉(zhuǎn)基因豬成為可能，這可以從根本上緩解養(yǎng)豬業(yè)對環(huán)境的污染問題。而酵母CUPl基因編碼的蛋白屬于金屬硫蛋白，酵母對銅的鰲合是由CUPl蛋白來控制的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]鑒于以上所述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，本發(fā)明的目的在于提供酵母CUPl基因(登錄號:NM_001179185或NM_001179183)在哺乳動物飼養(yǎng)領(lǐng)域的用途，用于解決現(xiàn)有技術(shù)中的問題。
[0005]為實現(xiàn)上述目的及其他相關(guān)目的，本發(fā)明第一方面提供酵母CUPl基因在動物飼養(yǎng)領(lǐng)域的用途。
[0006]所述動物飼養(yǎng)領(lǐng)域具體指促進(jìn)動物對于飼料中銅的吸收率，促進(jìn)動物的體重增加，并減少動物的銅排放，由此降低銅排放對土壤、水體等生態(tài)環(huán)境的污染。
[0007]所述動物優(yōu)選為哺乳動物。
[0008]本發(fā)明第二方面提供一種酵母CUPl基因的構(gòu)建體，所述表達(dá)載體由酵母CUPl基因的編碼序列插入到表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)構(gòu)建而成。
[0009]所述構(gòu)建體能夠表達(dá)酵母CUPl基因。
[0010]優(yōu)選的，所述的表達(dá)載體為真核的表達(dá)載體pEGFP-Nl。
[0011]本發(fā)明第三方面提供所述酵母CUPl基因的構(gòu)建體所表述的CUPl基因在制備轉(zhuǎn)基因動物領(lǐng)域的用途。
[0012]所述動物優(yōu)選為哺乳動物。[0013]本發(fā)明第四方面提供一種酵母CUPl基因的表達(dá)系統(tǒng)，由所述酵母CUPl基因的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞構(gòu)建而成。
[0014]本發(fā)明發(fā)明人對酵母中的CUPl基因進(jìn)行載體的構(gòu)建，在建立的轉(zhuǎn)CUPl基因的小鼠模型中，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)CUPl基因促進(jìn)了小鼠的體重增加，并在促進(jìn)了小鼠對飼料中銅的吸收率的同時，也減少了銅的排放，減少了銅排放對土壤、水體等生態(tài)環(huán)境的污染。以培育環(huán)境友好型動物新品種的角度為出發(fā)點(diǎn)，為轉(zhuǎn)基因豬的制備奠定基礎(chǔ)，以期從轉(zhuǎn)基因全新的角度降低在畜牧養(yǎng)殖業(yè)中的微量元素銅的排放，從根本上解決了養(yǎng)豬業(yè)中的環(huán)境污染問題。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015] 圖1.酵母CUPl基因PCR擴(kuò)增的結(jié)果，其中1、2 =CUPl基因；M:DNA分子量Marker, DL2000。
[0016]圖2.重組質(zhì)粒 pEGFP-CUPl 的菌液鑒定，M:DNA 分子量 Marker, DL2000 ；1-10:PCR擴(kuò)增重組質(zhì)粒PEGFP-CUP1的菌液；11:用水做模板進(jìn)行擴(kuò)增的結(jié)果(空白對照)。
[0017]圖3.重組質(zhì)粒 pEGFP-CUPl 的酶切及 PCR 驗證，M =DNA 分子量 Marker, DL2000 ；1:質(zhì)粒酶切圖，2:沒有酶切的質(zhì)粒；3:PCR擴(kuò)增質(zhì)粒。
[0018]圖4.流式細(xì)胞儀分選的陽性克隆細(xì)胞，圖為在藍(lán)色光的激發(fā)下的綠色熒光，a:攜帶空載體的細(xì)胞(對照組細(xì)胞)，b:攜帶CUPl基因的細(xì)胞(實驗組細(xì)胞)。
[0019]圖5.陽性克隆細(xì)胞CUPl的PCR擴(kuò)增，M:DNA分子量Marker, DL2000 ；1:空白對照，
2:陰性對照，3:以實驗組細(xì)胞的DNA為模板進(jìn)行的擴(kuò)增。
[0020]圖6.陽性克隆細(xì)胞CUPl的PCR擴(kuò)增，M:DNA分子量Marker, DL2000 ；1:空白對照，
2:陰性對照，3:以實驗組細(xì)胞的cDNA為模板進(jìn)行的擴(kuò)增。
[0021]圖7.CUPl真核表達(dá)產(chǎn)物的Western blot驗證,HeLa:為空白對照，control:對照組細(xì)胞的Western blot結(jié)果，test:實驗組細(xì)胞的Western blot結(jié)果。
[0022]圖8.對照組及實驗組細(xì)胞經(jīng)銅(100 μ M)孵育不同的時間(6，24，48，96h)后，酵母CUPl (yeast CUPl)及細(xì)胞本底MT基因(human MT) mRNA表達(dá)量的檢測。
[0023]圖9.對照組及實驗組細(xì)胞經(jīng)不同濃度的銅(200，400，600，800，1000 μ M)孵育不同時間(6，24，48，72，96h )后，用MTT法檢測細(xì)胞的增殖速率的結(jié)果。Contro1:對照組細(xì)胞，Test實驗組細(xì)胞。
[0024]圖10.對照組及實驗組細(xì)胞經(jīng)銅(100 μ M)誘導(dǎo)不同的時間(4，8，16，24h)后，細(xì)胞周期的Gl期、S期隨時間變化的檢測。Control:對照組細(xì)胞，Test實驗組細(xì)胞。
[0025]圖1L 重組質(zhì)粒 pPSP-CUPl 的菌液鑒定，M:DNA 分子量 Marker, DL2000 ；1-10:PCR擴(kuò)增重組質(zhì)粒pPSP-CUPl的菌液；11:空白對照。CUPl:鑒定CUPl在菌液中表達(dá)，neo:鑒定neo基因在菌液中的表達(dá)。
[0026]圖12.重組質(zhì)粒 pPSP-CUPl 的 PCR 鑒定，M =DNA 分子量 Marker, DL2000 ；1:空質(zhì)粒的凝膠電泳，2:CUP1特異擴(kuò)增的結(jié)果，3，neo特異擴(kuò)增的結(jié)果。
[0027]圖13.重組質(zhì)粒pPSP-CUPl雙酶切(Xho I和Not I)的結(jié)果，M =DNA分子量Marker, DL10000 ；1:沒有酶切的空質(zhì)粒，2_7:質(zhì)粒經(jīng)雙酶切的結(jié)果。
[0028]圖14.重組質(zhì)粒 pPSP-CUPl 酶切(Bgl II)的結(jié)果，M:DNA分子量Marker, DL10000 ；1:質(zhì)粒經(jīng)酶切的結(jié)果。
[0029]圖 15.Southern blot 探針特異性的 PCR檢測，M:DNA 分子量Marker, DL2000 ；1~2:擴(kuò)增的特異探針。
[0030]圖 16.Southern blot 中 DNA 的凝膠電泳檢測，M:DNA 分子量 Marker, DL10000 ；1-6:DNA的凝膠電泳結(jié)果。
[0031]圖17.DNA 酶切(Bgl II)后的凝膠電泳檢測，M:DNA 分子量 Marker, DL10000 ；1~7:DNA酶切后的凝膠電泳結(jié)果。
[0032]圖18.轉(zhuǎn)CUPl基因小鼠的Southern blot的結(jié)果，1:以質(zhì)粒pPSP-CUPl雜交的陽性對照，2:陰性對照；3-4:陽性小鼠雜交的結(jié)果，3為兩個拷貝，4為一個拷貝。
[0033]圖19.CUPl基因在轉(zhuǎn)基因小鼠不同組織中的表達(dá)檢測，1-9分別為心、肝、脾、胃、腎、腸、腦、腮腺、頜下腺；10:陽性對照；11:空白對照。
[0034]圖20.CUPl基因在野生型小鼠不同組織中的表達(dá)檢測，1-9分別為心、肝、脾、胃、腎、腸、腦、腮腺、頜下腺；10:陽性對照；11:空白對照。
[0035]圖21.CUPl基因在轉(zhuǎn)基因小鼠腮腺及頜下腺中表達(dá)的Western blot檢測，PG1-4:轉(zhuǎn)基因陽性小鼠的腮腺組織；SGl-4:轉(zhuǎn)基因陽性小鼠的頜下腺組織。
[0036]圖22.小鼠第一周和前兩周的體重增加的檢測，control為對照組小鼠的體重增加；test為轉(zhuǎn)基因的陽性小鼠體重的增加。
[0037]圖23.小鼠第一周和第二周糞便中銅含量的檢測，control為對照組小鼠的糞便中銅的含量；test為轉(zhuǎn)基因的`陽性小鼠的糞便中銅的含量。
【具體實施方式】
[0038]以下通過特定的具體實例說明本發(fā)明的實施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可由本說明書所揭露的內(nèi)容輕易地了解本發(fā)明的其他優(yōu)點(diǎn)與功效。本發(fā)明還可以通過另外不同的【具體實施方式】加以實施或應(yīng)用，本說明書中的各項細(xì)節(jié)也可以基于不同觀點(diǎn)與應(yīng)用，在沒有背離本發(fā)明的精神下進(jìn)行各種修飾或改變。
[0039]在進(jìn)一步描述本發(fā)明【具體實施方式】之前，應(yīng)理解，本發(fā)明的保護(hù)范圍不局限于下述特定的具體實施方案；還應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明實施例中使用的術(shù)語是為了描述特定的具體實施方案，而不是為了限制本發(fā)明的保護(hù)范圍；在本發(fā)明說明書和權(quán)利要求書中，除非文中另外明確指出，單數(shù)形式“一個”、“一”和“這個”包括復(fù)數(shù)形式。
[0040]當(dāng)實施例給出數(shù)值范圍時，應(yīng)理解，除非本發(fā)明另有說明，每個數(shù)值范圍的兩個端點(diǎn)以及兩個端點(diǎn)之間任何一個數(shù)值均可選用。除非另外定義，本發(fā)明中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本【技術(shù)領(lǐng)域】技術(shù)人員通常理解的意義相同。除實施例中使用的具體方法、設(shè)備、材料外，根據(jù)本【技術(shù)領(lǐng)域】的技術(shù)人員對現(xiàn)有技術(shù)的掌握及本發(fā)明的記載，還可以使用與本發(fā)明實施例中所述的方法、設(shè)備、材料相似或等同的現(xiàn)有技術(shù)的任何方法、設(shè)備和材料來實現(xiàn)本發(fā)明。
[0041]除非另外說明，本發(fā)明中所公開的實驗方法、檢測方法、制備方法均采用本【技術(shù)領(lǐng)域】常規(guī)的分子生物學(xué)、生物化學(xué)、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和分析、分析化學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)、重組DNA技術(shù)及相關(guān)領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。這些技術(shù)在現(xiàn)有文獻(xiàn)中已有完善說明，具體可參見SambiOOk等 MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL, Second edition, Cold Spring HarborLaboratory Press,1989and Third edition, 2001 ；Ausubel 等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY,John ffiley&Sons, New York,1987and periodic updates ；the seriesMETHODS IN ENZYMOLOGY,Academic Press,San Diego ;WoIffe，CHROMATIN STRUCTURE ANDFUNCTION, Third edition, Academic Press, San Diego, 1998 ；METH0DS IN ENZYMOLOGY,Vol.304,Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.ffolffe,eds.),Academic Press,San Diego,1999 ;和 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol.119，Chromatin Protocols (P.B.Becker,ed.)Humana Press, Totowa, 1999 等。
[0042]本發(fā)明實施例中所用生物材料來源如下:
[0043]pMD18-T vector、DH5a感受態(tài)細(xì)胞、Xho I等限制性內(nèi)切酶均購自Takara公司。
[0044]真核表達(dá)載體pEGFP-Nl購自廣州英偉創(chuàng)津公司。
[0045]實驗所用的FVB和ICR品種的小鼠購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司。
[0046]實施例1
[0047]1.載體的構(gòu)建:
[0048]含有酵母CUPl序列由Invitrogen合成,并克隆到pMD18_T上,合成的序列如下:
[0049]TTGGCGCGCCATGTTTCAACTTTGGAAACTTGTTTTCTTGTGCGGTCTGCTCATTGGGACCTCAGCGTCTTTCAGCGAATTAATTAACTTCCAAAATGAAGGTCATGAGTGCCAATGCCAATGTGGTAGCTGCAAAAATAATGAACAATGCCAAAAATCATGTAGCTGCCCAACGGGGTGTAACAGCGACGACAAATGCCCCTGCGGTAACAAGTCTGAAGAAACCAAGAAGTCATGCTGCTCTGGGAAATGAGGCGCGCCGA (Seq ID N0.1 ；Asc I,劃線部分；大小263bp)設(shè)計含有Hind III和Sac II粘性末端序列的引物P1，序列如下:`[0050]CUP-CFl: 5，CCCAAGCTTATGTTCAGCGAATTAATTAACTTCC3，
[0051](Seq ID N0.2 ；Hind III,劃線部分)
[0052]CUP-CRl: 5，TCCCCGCGGTTTCCCAGAGCAGCATGACTTCTTG3，
[0053](Seq ID N0.3 ；Sac II ,劃線部分)
[0054]用引物Pl擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物(見圖1)純化后，連接到pMD18-T的載體上(酶切位點(diǎn)Hind III和Sac II)。再經(jīng)轉(zhuǎn)化(DH5a感受態(tài)細(xì)胞)、菌落的篩選、PCR的鑒定后，經(jīng)酶切和測序的鑒定等獲得陽性的克隆菌液，再抽質(zhì)粒。經(jīng)Hind III和Sac II雙酶切后回收純化。把攜帶空載體PEGFP-Nl和基因CUPl的純化產(chǎn)物用T4DNase進(jìn)行連接。按照上面的步驟獲得陽性克隆的菌液，經(jīng)陽性克隆菌液的鑒定(見圖2)，再進(jìn)行菌液的擴(kuò)大培養(yǎng)，經(jīng)無內(nèi)毒素抽提后，獲得高質(zhì)量的轉(zhuǎn)染質(zhì)粒。質(zhì)粒經(jīng)雙酶切(Hind III和Sac II )、測序及PCR的驗證(見圖3)，在相應(yīng)的位置出現(xiàn)正確的條帶，測序及PCR驗證正確，證明構(gòu)建的表達(dá)載體是正確的。
[0055]2.陽性細(xì)胞系的篩選及CUPl表達(dá)的驗證
[0056]陽性細(xì)胞的篩選采用分級分選的方法，首先用300 μ g/mL G418進(jìn)行初步的篩選，獲得一定純度的陽性克隆細(xì)胞，再基于細(xì)胞所攜帶的綠色熒光蛋白用MoFlo XDP流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter公司，美國)的分選系統(tǒng)對細(xì)胞進(jìn)行分選，獲得純的陽性克隆細(xì)胞系(見圖4，a:攜帶空載體的細(xì)胞(對照組細(xì)胞)，b:攜帶CUPl基因的細(xì)胞(實驗組細(xì)胞))。
[0057]酵母CUPl表達(dá)的驗證:抽提HeLa細(xì)胞(空白對照)、對照組細(xì)胞及實驗組細(xì)胞的DNA和RNA，并將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。分別以DNA及cDNA作為模板，用P2引物在60°C時進(jìn)行擴(kuò)增。P2引物為:
[0058]F:5/ TAACTTCCAAAATGAAGGTCATGAG3' (Seq ID N0.4),[0059]R:5/ TTCCCAGAGCAGCATGACTT3' (Seq ID N0.5)。
[0060]在實驗組細(xì)胞中，以DNA及cDNA做模板都能擴(kuò)增出單一的條帶，而在空白對照、對照組的細(xì)胞中都沒有擴(kuò)增出條帶(見圖5、6)。對空白對照、對照組及實驗組細(xì)胞進(jìn)行蛋白的抽提，以小鼠的β-actin蛋白作為內(nèi)參，通過CUPl特異性的抗體(Santa CruzBiotechnology,美國)檢測CUPl在細(xì)胞中的表達(dá)情況。Western blot結(jié)果表明，在實驗組細(xì)胞中有CUPl的表達(dá)，而在空白對照、對照組的細(xì)胞中都沒有檢測到CUPl的表達(dá)(見圖7)。綜上結(jié)果表明，CUPl在實驗組細(xì)胞中在mRNA、蛋白水平上成功表達(dá)。
[0061]3.細(xì)胞銅吸收的ICP-MS檢測
[0062]把對照組和實驗組細(xì)胞以2 X IO5個/瓶接種T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)24h后，用含有終濃度為10μ mol/L和100 μ mol/L的His-Cu細(xì)胞培養(yǎng)液分別對對兩種細(xì)胞進(jìn)行孵育培養(yǎng)48h。每個實驗做3個重復(fù)，孵育培養(yǎng)完后立即去除細(xì)胞培養(yǎng)液，并用PBS洗去殘留的培養(yǎng)液。再做檢測前的預(yù)處理，定容到5mL，用ICP-MS進(jìn)行細(xì)胞中銅含量的檢測。結(jié)果表明(見表1)，實驗組細(xì)胞銅的吸收顯著的高于對照組細(xì)胞銅的吸收，銅濃度提高的情況下，這種差異增大。銅濃度為lOOumol/L的時候，細(xì)胞的銅吸收實驗組是對照組的2倍以上。
【權(quán)利要求】
1.酵母CUPl基因在動物飼養(yǎng)領(lǐng)域的用途。
2.—種酵母CUPl基因的構(gòu)建體，所述構(gòu)建體由酵母CUPl基因的編碼序列插入到表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)構(gòu)建而成。
3.如權(quán)利要求2所述的一種酵母CUPl基因的構(gòu)建體，所述的表達(dá)載體為真核的表達(dá)載體 pEGFP-Nl。
4.如權(quán)利要求2-3任一權(quán)利要求所述的酵母CUPl基因的構(gòu)建體所表述的CUPl基因在制備轉(zhuǎn)基因動物領(lǐng)域的用途。
5.一種酵母CUPl基因的表達(dá)系統(tǒng)，由權(quán)利要求2-3任一權(quán)利要求所述的酵母CUPl基因的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞 構(gòu)建而成。
【文檔編號】A01K67/027GK103525865SQ201310462147
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年9月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月30日
【發(fā)明者】潘玉春, 頡孝賢, 馬育芳, 王起山, 張向喆, 楊玉梅, 陳強(qiáng), 廖榮榮, 陳振亮, 王振, 賀鵬飛, 張哲 , 涂盈盈 申請人:上海交通大學(xué)