專利名稱：作為人體陰道中的益生微生物的乳酸產(chǎn)生細(xì)菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及乳酸產(chǎn)生細(xì)菌及其用途。
背景技術(shù)：
人體陰道中的正常微生物菌群包括乳酸產(chǎn)生細(xì)菌，該細(xì)菌的傳統(tǒng)命名是Dderlein菌。
這種乳酸產(chǎn)生細(xì)菌是無(wú)孢子形成的革蘭氏陽(yáng)性菌，通過(guò)對(duì)多種糖如糖原和/或葡萄糖進(jìn)行發(fā)酵而產(chǎn)生乳酸。
乳酸產(chǎn)生細(xì)菌包括例如乳桿菌屬(Lactobacillus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、片球菌屬(Pediococcus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、乳球菌屬(Lactococcus)和腸球菌屬(Enterococcus)。
根據(jù)其代謝途徑可將乳酸產(chǎn)生細(xì)菌分成同型發(fā)酵菌和異型發(fā)酵菌。同型發(fā)酵菌(例如嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus))只產(chǎn)生乳酸，而異型發(fā)酵菌還產(chǎn)生例如氧化碳、乙醇或乙酸。
乳桿菌屬是兼性厭氧的、過(guò)氧化氫酶陰性、棒狀乳酸產(chǎn)生細(xì)菌的表型異源群。已經(jīng)識(shí)別出50多個(gè)不同的菌種，并且這些菌種的DNA通常含有低含量的鳥(niǎo)嘌呤(G)和胞嘧啶(C)，約為33-53％。同一種菌種的GC-含量是恒定的。在人體內(nèi)，例如在口腔、腸道和陰道內(nèi)發(fā)現(xiàn)了幾個(gè)乳桿菌菌種。陰道中的乳桿菌菌種是例如嗜酸乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum)、加氏乳桿菌(Lactobacillusgasseri)、卷曲乳桿菌(Lactobacillus crispatus)、干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)(鼠李糖亞種)和詹氏乳桿菌(Lactobacillusjensenii)。
片球菌屬是革蘭氏陽(yáng)性、過(guò)氧化氫酶陽(yáng)性、兼性厭氧、耐氧、圓形(直徑約為0.6-1.0um)、非致病性的乳酸產(chǎn)生細(xì)菌的表型群。
健康的育齡婦女(約15-60歲)在月經(jīng)間期，陰道中的pH約為3.8-4.2，這主要是由于乳酸產(chǎn)生所致。酸性環(huán)境防止例如結(jié)腸中存在的細(xì)菌如陰道加德納氏菌(Gardnerella vaginalis)、動(dòng)彎桿菌屬(Mobiluncus)、擬桿菌屬(Bacteroides)、普雷沃氏菌屬(Prevotella)和大腸桿菌(Eschericha coli)出現(xiàn)在陰道中。
健康婦女的泌尿生殖道的表皮以及泌尿生殖器粘膜寄宿了特定的益生和/或共生的微生物菌群，諸如乳桿菌屬的多個(gè)菌種。然而，泌尿生殖道還定居了致病微生物。不希望有的微生物的定居可能是由性交引起的，它可能自然發(fā)生或可能是由正常菌群失調(diào)引起的。已知后一種情況例如發(fā)生在某種抗生素治療之后。
因此，女性泌尿生殖道如陰道中的微生物菌群由于感染了微生物、抗生素治療或其它復(fù)雜原因而可能發(fā)生失調(diào)和變化，其中所述微生物感染諸如是酵母菌(白色假絲酵母(Candida albinancs))、陰道毛滴蟲(chóng)(Trichomonas vaginalis)、淋病奈瑟氏球菌(Neisseriagonorrhoeae)、沙眼衣原體(chlamydia trachomatis)和細(xì)菌性陰道病(特點(diǎn)是陰道加德納氏菌和動(dòng)彎桿菌的流行性增強(qiáng))。
在月經(jīng)和性交期間，陰道中的pH分別由于血液和精液的流入而升高。這兩種液體含有大量可被細(xì)菌(例如陰道加德納氏菌和動(dòng)彎桿菌)消化的蛋白，如前述，該細(xì)菌可能在高pH條件下定居在陰道中。而后產(chǎn)生了降解產(chǎn)物如胺(例如腐胺和尸胺)。在高pH下，這些胺開(kāi)始揮發(fā)并帶有腥臭味。而且這些婦女常常抱怨陰道排出液增多和有痛感。這種病癥被稱作細(xì)菌性陰道病(BV)，該病癥是伴有疼痛感和有氣味的陰道排出液增多的常見(jiàn)病(參見(jiàn)Morris，M；Nicoll，A；Simms，I；Wilson，J；Catchpole M，Bacterial vaginosisA public healthreview，British Journal of Obstetrics and Gynaecology，108(5)439-450，May 2001)。
細(xì)菌性陰道病被確認(rèn)為是由于陰道乳酸產(chǎn)生細(xì)菌被一系列有害菌如陰道加德納氏菌、擬桿菌、動(dòng)彎桿菌、雙路普雷沃氏菌(Prevotellabivia)和人型枝原體(Mycoplasma hominis)所取代而引起的。
由Amsel Criteria記載了診斷細(xì)菌性陰道病(BV)的方法。首先，測(cè)定陰道排出液的pH。約90％的患BV的婦女的pH高于4.5。其次，如果向陰道排出液中加入10％的KOH，約70％的患BV的婦女的陰道排出液散發(fā)出″腥臭″味。第三，在濕扁平上皮細(xì)胞表面觀察到覆蓋著微小球桿菌(“索細(xì)胞”)。檢測(cè)BV的另一個(gè)可靠方法是對(duì)陰道液體進(jìn)行直接革蘭氏染色。對(duì)BV革蘭氏染色進(jìn)行釋義的標(biāo)準(zhǔn)方法由Nugent等提供(參見(jiàn)實(shí)施例1)。
已知乳酸產(chǎn)生細(xì)菌能夠抑制多種泌尿生殖器感染相關(guān)病原體的生長(zhǎng)和/或降低其致病力(例如參見(jiàn)Redondo-Lopez，V；Cook，RL；Sobel，J D，Emerging role of lactobacillus in the control andmaintenance of the vaginal bacterial microflora，Reviews ofinfectious diseases，第12卷第5期，1990年9-10月，和Boris，S；Barbes，C，Role played by lactobacilli in controlling thepopulation of vaginal pathogens，Microbes and infection，第2卷，543-546頁(yè)，2000)。
而且還得知乳酸產(chǎn)生細(xì)菌對(duì)所述病原體的拮抗特性至少部分表示為其產(chǎn)生不同拮抗物如乳酸、過(guò)氧化氫、細(xì)菌素等的能力。
據(jù)估計(jì)健康陰道擁有108-109cfu(＝菌落形成單位)的乳酸產(chǎn)生細(xì)菌。該菌群的形成是由于婦女具有的這種特定菌株是由母親遺傳得到的和/或這種菌株是由她的消化道轉(zhuǎn)移到了泌尿生殖道。
現(xiàn)有技術(shù)記載了含乳酸產(chǎn)生細(xì)菌的制劑如混懸液、栓劑和明膠膠囊。這種制劑例如被公開(kāi)在US 5466463和WO 9309793中。
而且，已知帶有乳酸產(chǎn)生細(xì)菌的浸漬吸收用品如棉條(tampon)和衛(wèi)生巾被用于保持婦女泌尿生殖道中的正常菌群，因而防止泌尿生殖道的感染或者在婦女泌尿生殖道中重新建立正常菌群。這種產(chǎn)品被公開(kāi)在EP 0594628和瑞典專利申請(qǐng)0003544-4中。
然而，為了達(dá)到上述效果，關(guān)鍵是抑制尿路病原體的乳酸產(chǎn)生細(xì)菌真正在體內(nèi)定居并繁殖，并且通過(guò)施用于陰道而在陰道中實(shí)際保留一個(gè)月經(jīng)周期以上。
細(xì)菌菌株是否定居在陰道中取決于特定細(xì)菌菌株的粘附特性以及陰道的激素、營(yíng)養(yǎng)和酸性程度。持續(xù)的生殖器感染或采用抗生素進(jìn)行的治療還會(huì)影響引進(jìn)菌株在陰道中的定居能力。
月經(jīng)周期還會(huì)影響粘附力，并且在排卵前以及月經(jīng)流注(discharge)前粘附力最大(US 6180100和Chan等，Journal ofUrology，March 1984)。因此，被施用的乳酸產(chǎn)生細(xì)菌最難在陰道中定居并繁殖的時(shí)間是在月經(jīng)流注期間。
在乳酸產(chǎn)生細(xì)菌于體內(nèi)的定居和繁殖方面，臨床結(jié)果與由體外分析結(jié)果推測(cè)出的細(xì)菌性狀之間存在著較大的差異。常見(jiàn)的是陰道中的不同細(xì)菌菌種間發(fā)生相互作用，并且很難在實(shí)驗(yàn)室中再建這種相互作用的模式。因此，即使體外結(jié)果顯示細(xì)菌菌種很有希望，也可能在體內(nèi)不能繁殖生長(zhǎng)而由此不能提供理想的療效，即不能預(yù)防、減輕和/或治療泌尿生殖道的微生物感染。
而且，非常重要的是通過(guò)重復(fù)性的大規(guī)模生產(chǎn)培養(yǎng)和長(zhǎng)期存在于體內(nèi)，所述細(xì)菌表現(xiàn)出遺傳特征的穩(wěn)定性。
生產(chǎn)提供具有理想療效的公認(rèn)消費(fèi)產(chǎn)品需要滿足的另一個(gè)條件是通過(guò)對(duì)細(xì)菌進(jìn)行冷凍干燥和保存被冷凍干燥的細(xì)菌(即保存期限)來(lái)保持細(xì)菌的存活力。
本發(fā)明的概述本發(fā)明公開(kāi)了分離的乳桿菌屬和片球菌屬的新型菌株，甚至在月經(jīng)流注期間陰道施用其中至少一種菌株，該菌株也能夠在人陰道內(nèi)定居并繁殖。從開(kāi)始施用計(jì)算至少兩個(gè)月經(jīng)周期后，如果陰道中仍有所述細(xì)菌存在，就認(rèn)為所述細(xì)菌定殖(established)起來(lái)了。
有利地是本發(fā)明的細(xì)菌菌株能夠在月經(jīng)流注期間定殖，由此能夠利用例如浸漬了所述細(xì)菌的棉條來(lái)方便地施用該細(xì)菌。
定殖的乳酸產(chǎn)生細(xì)菌的所述菌株能夠預(yù)防、減輕和/或治療泌尿生殖道的微生物感染，尤其是陰道細(xì)菌病。為了獲得這些療效，必須通過(guò)施用來(lái)真正定殖所述細(xì)菌，甚至該細(xì)菌在經(jīng)歷了幾輪月經(jīng)流注后仍然存在于陰道中。
按照布達(dá)佩斯條約的規(guī)定將所述細(xì)菌菌株于2001年6月14日保藏在比利時(shí)的BCCM/LMG(Belgian Coordinated Collections ofMicroorganisms/Laboratorium voorMicrobioligie-Bacteriёnverzammeling，Universiteit Gent)，所述被保藏的菌株包括被申請(qǐng)人命名為L(zhǎng)N40的加氏乳桿菌菌株，其保藏號(hào)為L(zhǎng)MG P-20560、被申請(qǐng)人命名為L(zhǎng)N113的干酪乳桿菌鼠李糖亞種菌株，其保藏號(hào)為L(zhǎng)MG P-20562、被申請(qǐng)人命名為L(zhǎng)N99的發(fā)酵乳桿菌菌株，其保藏號(hào)為L(zhǎng)MG P-20561、被申請(qǐng)人命名為L(zhǎng)N01的卷曲乳桿菌菌株，其保藏號(hào)為L(zhǎng)MG P-20558和被申請(qǐng)人命名為L(zhǎng)N23的乳酸片球菌，其保藏號(hào)為L(zhǎng)MG P-20559，或與其表型和/或基因型特性基本相應(yīng)的變異體。
而且，本發(fā)明記載了一種用于從乳桿菌屬或片球菌屬中分離能夠在人陰道中定居并繁殖的菌株的方法，其中a)從具有正常、健康陰道微生物菌群的婦女陰道中收集細(xì)菌樣品如陰道液體，b)從步驟a)的陰道樣品中篩選出乳酸產(chǎn)生細(xì)菌，c)利用適當(dāng)?shù)臓I(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基對(duì)步驟b)的乳酸產(chǎn)生細(xì)菌進(jìn)行體外純培養(yǎng)從而提供至少一種分離菌株，d)就在月經(jīng)流注期間對(duì)婦女陰道施用所述菌株在陰道中進(jìn)行定居和繁殖的能力來(lái)評(píng)價(jià)步驟c)的至少一種純培養(yǎng)菌株和/或步驟c)的至少兩種純培養(yǎng)菌株的混合菌，所述婦女的陰道微生物菌群發(fā)生紊亂，其中如果從開(kāi)始施用起計(jì)算至少兩個(gè)月經(jīng)周期后所述細(xì)菌菌株仍然存在于陰道中，就認(rèn)為該細(xì)菌菌株或菌株已經(jīng)定殖，和e)篩選出至少一種能夠在陰道中定居并繁殖的步驟d)細(xì)菌菌株。
優(yōu)選地，對(duì)步驟c)的至少一種純培養(yǎng)細(xì)菌菌株和/或步驟c)的至少兩種細(xì)菌菌株的混合菌進(jìn)行凍干。
而且，優(yōu)選地對(duì)該/這些菌株經(jīng)凍干后的細(xì)菌存活力的穩(wěn)定性和被凍干細(xì)菌經(jīng)長(zhǎng)期保存后的存活力進(jìn)行評(píng)價(jià)和篩選，其中如果經(jīng)過(guò)凍干并將凍干細(xì)菌在約-18℃保存至少12個(gè)月后至少40％的細(xì)菌保持存活力，就認(rèn)為所述細(xì)菌的存活力是穩(wěn)定的。
另外，優(yōu)選地對(duì)該/這些菌株經(jīng)反復(fù)培養(yǎng)和陰道體內(nèi)施用后的遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)價(jià)和篩選，其中如果其遺傳特性在體內(nèi)保持了至少12個(gè)月，所述細(xì)菌就被認(rèn)為遺傳穩(wěn)定。
本發(fā)明還公開(kāi)了乳桿菌屬或片球菌屬的能夠在月經(jīng)來(lái)朝期間在人陰道中定居并繁殖的細(xì)菌菌株，其中能夠利用上述方法分離出該菌株。該菌株優(yōu)選地是被申請(qǐng)人命名為L(zhǎng)N40的加氏乳桿菌菌株，其保藏號(hào)為L(zhǎng)MG P-20560、被申請(qǐng)人命名為L(zhǎng)N113的干酪乳桿菌鼠李糖亞種菌株，其保藏號(hào)為L(zhǎng)MG P-20562、被申請(qǐng)人命名為L(zhǎng)N99的發(fā)酵乳桿菌菌株，其保藏號(hào)為L(zhǎng)MG P-20561、被申請(qǐng)人命名為L(zhǎng)N01的卷曲乳桿菌菌株，其保藏號(hào)為L(zhǎng)MG P-20558和被申請(qǐng)人命名為L(zhǎng)N23的乳酸片球菌，其保藏號(hào)為L(zhǎng)MG P-20559，或與其表型和/或基因型特性基本相應(yīng)的變異體。
另外，本發(fā)明記載了一種用于預(yù)防和/或治療泌尿生殖道感染的組合物，該組合物含有至少一種所述菌株(LN40，LN113，LN99，LN01和LN23)。
優(yōu)選地，所述組合物含有所述的全部菌株，即菌株 LN40、菌株LN113、菌株LN 99、菌株LN01和菌株LN23。
在本技術(shù)領(lǐng)域中已知不同細(xì)菌的混合物縮短了細(xì)菌的傳代時(shí)間，結(jié)果使得細(xì)菌的生長(zhǎng)速度更快。而且，由于不同種的乳酸產(chǎn)生細(xì)菌具有不同的發(fā)酵模式和特性，所以優(yōu)選地是利用不同菌種的混合物。
與單獨(dú)使用每種所述菌株相比，本發(fā)明的所述菌株的組合物，即LN 40，LN 113，LN 99，LN01，和LN 23的組合物，能夠更好地抑制泌尿病原體。
所述組合物優(yōu)選地被配制成適于陰道施用的劑型，如栓劑、膠囊、丸劑、片劑、混懸液、噴霧劑、凝膠劑、乳劑、粉劑或任何其它形式的陰道插入物。
另外，本發(fā)明記載了一種用于預(yù)防和/或治療泌尿生殖道感染的衛(wèi)生用品，諸如女性用吸收用品(例如棉條、衛(wèi)生巾、襯褲墊)、尿布和失禁防護(hù)用品，所述衛(wèi)生品含有至少一種所述菌株LN 40，LN 113，LN99，LN01和LN 23)。
優(yōu)選地，出于與上述組合物相同的目的，所述衛(wèi)生品含有所有所述菌株，即菌株LN 40、菌株LN 113、菌株LN 99、菌株LN01和菌株LN 23。
所述衛(wèi)生用品優(yōu)選地是棉條。
而且，本發(fā)明還記載了至少一種所述細(xì)菌菌株(LN 40，LN 113，LN99，LN01和LN 23)用于生產(chǎn)預(yù)防和/或治療泌尿生殖道感染，優(yōu)選地是細(xì)菌性陰道病或任何其它陰道細(xì)菌性病癥的組合物或衛(wèi)生用品的用途。
并且，本發(fā)明還記載了一種用于預(yù)防和/或治療泌尿生殖道感染，優(yōu)選地是細(xì)菌性陰道病或任何其它陰道細(xì)菌性病癥的方法，其中為了預(yù)防、治療微生物感染和/或減緩微生物感染的效應(yīng)，以治療有效量對(duì)陰道至少施用了一種所述細(xì)菌菌株(LN 40，LN 113，LN 99，LN01和LN 23)。
本發(fā)明的其它特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)通過(guò)以下對(duì)本發(fā)明進(jìn)行的詳細(xì)描述而變得一目了然。
附圖的簡(jiǎn)要描述

圖1a和1b分別表示細(xì)菌菌株LN 40，LN 99，LN 113和LN 23的生長(zhǎng)過(guò)程。
圖2表示利用RAPD和凝膠電泳得到的帶有菌株特定產(chǎn)物的凝膠照片。菌株LN 40，LN 99，LN 113，LN 01和LN 23分別與各個(gè)細(xì)菌菌種的典型菌株進(jìn)行比較。
圖3和4表示實(shí)施例6中使用的實(shí)驗(yàn)裝置。
本發(fā)明的詳細(xì)描述本文使用的術(shù)語(yǔ)“乳酸產(chǎn)生細(xì)菌”是指通過(guò)發(fā)酵產(chǎn)生乳酸的細(xì)菌。本文使用的術(shù)語(yǔ)“治療有效量”是指能夠產(chǎn)生理想治療效果的量。所述理想治療效果是指預(yù)防和/或治療泌尿生殖道感染，諸如細(xì)菌性陰道病或任何其它陰道細(xì)菌性病癥。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“分離的細(xì)菌菌株”是指利用含有所述菌株的培養(yǎng)物可以進(jìn)行體外培養(yǎng)的菌株。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“細(xì)菌樣品”是指含有細(xì)菌的樣品。該樣品可以，例如是陰道液體/排出液。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“正常、健康的陰道微生物菌群”是指未患陰道疾病并且根據(jù)Nugent等提供的方法(參見(jiàn)實(shí)施例1)，陰道樣品中的革蘭氏菌株達(dá)到0-3的總級(jí)數(shù)的婦女。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“陰道微生物菌群失調(diào)”是指患有某些陰道疾病如陰道排出液增多和/或陰道散發(fā)“腥臭”味的婦女。而且，根據(jù)Nugent等提供的方法(參見(jiàn)實(shí)施例1)，陰道樣品中的革蘭氏菌株達(dá)到至少4，特別是＞7的總級(jí)數(shù)的婦女。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“合適的培養(yǎng)基”是指培養(yǎng)基，諸如可以用來(lái)培養(yǎng)細(xì)菌的LAB肉湯或MRS肉湯。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“衛(wèi)生用品”是指棉條(指狀棉條和帶有施用器的棉條)、衛(wèi)生巾、襯褲墊、尿布、失禁防護(hù)用品等。
本發(fā)明公開(kāi)了乳桿菌屬和片球菌屬的分離的乳酸產(chǎn)生細(xì)菌的新菌株，該菌株通過(guò)陰道施用至少一種細(xì)菌菌株后能夠在人陰道中定居并繁殖，即使在月經(jīng)流注期間。如果從施用起計(jì)算至少兩個(gè)月經(jīng)周期后所述細(xì)菌仍存在于陰道中，那么就認(rèn)為該細(xì)菌定殖了。
根據(jù)布達(dá)佩斯條約的規(guī)定將所述細(xì)菌菌株于2001年6月14日保藏在比利時(shí)的BCCM/LMG(Belgian Coordinated Collections ofMicroorganisms)，所述被保藏的菌株包括被申請(qǐng)人命名為L(zhǎng)N40的加氏乳桿菌菌株，其保藏號(hào)為L(zhǎng)MG P-20560、被申請(qǐng)人命名為L(zhǎng)N113的干酪乳桿菌鼠李糖亞種菌株，其保藏號(hào)為L(zhǎng)MG P-20562、被申請(qǐng)人命名為L(zhǎng)N99的發(fā)酵乳桿菌菌株，其保藏號(hào)為L(zhǎng)MG P-20561、被申請(qǐng)人命名為L(zhǎng)N01的卷曲乳桿菌菌株，其保藏號(hào)為L(zhǎng)MG P-20558和被申請(qǐng)人命名為L(zhǎng)N23的乳酸片球菌菌株，其保藏號(hào)為L(zhǎng)MG P-20559，或與其表型和/或基因型特性基本相應(yīng)的變異體。
而且，本發(fā)明記載了一種用于分離乳桿菌屬或片球菌屬的能夠在人陰道中定居并繁殖的菌株的方法，其中a)從具有正常、健康陰道微生物菌群的婦女陰道中收集細(xì)菌樣品如陰道液體，b)從步驟a)的陰道樣品中篩選出乳酸產(chǎn)生細(xì)菌，c)利用適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基對(duì)步驟b)的乳酸產(chǎn)生細(xì)菌進(jìn)行體外純培養(yǎng)從而提供至少一種分離的細(xì)菌菌株，d)就在月經(jīng)流注期間對(duì)婦女陰道施用所述細(xì)菌菌株在陰道中進(jìn)行定居和繁殖的能力來(lái)評(píng)價(jià)步驟c)的至少一種純培養(yǎng)細(xì)菌菌株和/或步驟c)的至少兩種純培養(yǎng)細(xì)菌菌株的混合菌，所述婦女的陰道微生物菌群發(fā)生紊亂，其中如果從開(kāi)始施用起計(jì)算至少兩個(gè)月經(jīng)周期后所述細(xì)菌菌株仍然存在于陰道中，就認(rèn)為該細(xì)菌菌株已經(jīng)定殖了，和e)篩選出至少一種能夠在陰道中定居并繁殖的步驟d)的細(xì)菌菌株。
優(yōu)選地，對(duì)步驟c)的至少一種純培養(yǎng)細(xì)菌菌株和/或步驟c)的至少兩種細(xì)菌菌株的組合進(jìn)行凍干。
凍干后應(yīng)當(dāng)具有必需量的細(xì)菌，然后通過(guò)保存來(lái)保持存活力。而且，室溫下保存能夠使被配制于例如用于商業(yè)銷售目的的組合物和/或衛(wèi)生用品中的必需量的凍干細(xì)菌保持存活力。
因此，優(yōu)選地對(duì)所述菌株進(jìn)行凍干后細(xì)菌存活穩(wěn)定性和長(zhǎng)期保存后凍干細(xì)菌存活力方面的評(píng)價(jià)和選擇，其中如果經(jīng)過(guò)凍干并將凍干細(xì)菌在-18℃下保存至少12個(gè)月后至少40％的細(xì)菌保持了存活力，就認(rèn)為所述細(xì)菌的存活力是穩(wěn)定的。
而且，被配制于某種保護(hù)劑如油中的以及被包含在一種組合物和/或衛(wèi)生用品中的至少1％的凍干細(xì)菌在室溫下應(yīng)當(dāng)保持至少12個(gè)月的存活力。
而且，一個(gè)重要的特性是以大規(guī)模生產(chǎn)的形式重復(fù)培養(yǎng)后以及在生產(chǎn)例如組合物和衛(wèi)生用品的過(guò)程中細(xì)菌遺傳特征的穩(wěn)定性。優(yōu)選地是經(jīng)過(guò)至少10次重復(fù)培養(yǎng)后，所述細(xì)菌應(yīng)當(dāng)保持其遺傳特性。而且，所述細(xì)菌在施用后的較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)，諸如至少12個(gè)月，仍具有體內(nèi)遺傳穩(wěn)定性。因此，優(yōu)選地通過(guò)陰道施用對(duì)所述菌株進(jìn)行體內(nèi)遺傳穩(wěn)定性的評(píng)價(jià)和選擇，其中如果所述細(xì)菌的遺傳特性能被體內(nèi)保持至少12個(gè)月，就認(rèn)為其遺傳穩(wěn)定。而且，所述細(xì)菌的生長(zhǎng)和傳代時(shí)間也是重要的。進(jìn)行陰道施用的凍干細(xì)菌在施用后的至少4個(gè)小時(shí)內(nèi)應(yīng)當(dāng)開(kāi)始生長(zhǎng)。其傳代時(shí)間應(yīng)當(dāng)少于2小時(shí)。
本發(fā)明還公開(kāi)了一種在月經(jīng)流注期間能夠在人陰道中定居并繁殖的乳桿菌屬或片球菌屬的細(xì)菌菌株，其中該菌株可以通過(guò)上述方法分離得到。這種細(xì)菌優(yōu)選地是被申請(qǐng)人命名為L(zhǎng)N40的加氏乳桿菌菌株，其保藏號(hào)為L(zhǎng)MG P-20560、被申請(qǐng)人命名為L(zhǎng)N113的干酪乳桿菌鼠李糖亞種菌株，其保藏號(hào)為L(zhǎng)MG P-20562、被申請(qǐng)人命名為L(zhǎng)N99的發(fā)酵乳桿菌菌株，其保藏號(hào)為L(zhǎng)MG P-20561、被申請(qǐng)人命名為L(zhǎng)N01的卷曲乳桿菌菌株，其保藏號(hào)為L(zhǎng)MG P-20558和被申請(qǐng)人命名為L(zhǎng)N23的乳酸片球菌，其保藏號(hào)為L(zhǎng)MG P-20559，或與其表型和/或基因型特性基本對(duì)應(yīng)的變異體。
乳桿菌菌株和片球菌菌株的分離和評(píng)價(jià)按照以下步驟分離能夠在人陰道中定居并繁殖的乳桿菌屬或片球菌屬的細(xì)菌菌株-從具有正常、健康陰道微生物菌群的婦女的陰道中收集陰道液體，-通過(guò)將所述液體涂到用于篩選如酸產(chǎn)生菌的MRS瓊脂上來(lái)選擇乳酸產(chǎn)生細(xì)菌(約25個(gè)不同的菌株)(挑出單菌落并平鋪到新鮮的MRS瓊脂上以便控制純度)，-然后用適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基，在適當(dāng)?shù)臈l件(pH、溫度等)下對(duì)乳酸產(chǎn)生細(xì)菌進(jìn)行體外純培養(yǎng)從而提供出分離的細(xì)菌菌株，和-然后通過(guò)在月經(jīng)流注期間對(duì)陰道微生物菌群紊亂的婦女陰道施用純培養(yǎng)的細(xì)菌菌株來(lái)評(píng)價(jià)所述細(xì)菌菌株在陰道中的定居和繁殖能力。
在約37℃和微需氧的條件下，于LAB肉湯(約pH6.5)中對(duì)LN 40進(jìn)行純培養(yǎng)。
在約37℃和微需氧的條件下，于MRS肉湯(約pH6.5)中對(duì)LN 113進(jìn)行純培養(yǎng)。
在約37℃和微需氧的條件下，于LAB肉湯(約pH6.5)中對(duì)LN 99進(jìn)行純培養(yǎng)。
在約37℃和厭氧的條件下，于MRS肉湯(約pH6.5)中對(duì)LN 01進(jìn)行純培養(yǎng)。
在約37℃和微需氧的條件下，于MRS肉湯(約pH6.5)中對(duì)LN 23進(jìn)行純培養(yǎng)。
首先評(píng)價(jià)所述純培養(yǎng)的細(xì)菌菌株的傳代時(shí)間。選出那些傳代時(shí)間＜30分鐘的細(xì)菌菌株(約15個(gè)不同菌株)。根據(jù)其體外抑制某些微生物生長(zhǎng)的能力來(lái)篩選這些被選菌株(沒(méi)有顯示數(shù)據(jù))。首先評(píng)價(jià)抑制表皮葡萄球菌(Staphilococcus epidemidis)(兩個(gè)不同菌株)、Enterococcus cloace、大腸桿菌、粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratiamarcesus)、溶壁微球菌(Micrococcus lysodeicticus)和白色念珠菌(Candida albicains)生長(zhǎng)的能力。8個(gè)不同菌株(乳桿菌屬的7個(gè)菌株和片球菌的1個(gè)菌株)顯示出這種能力，因而被選出來(lái)。進(jìn)一步評(píng)價(jià)這8個(gè)菌株抑制泌尿病原菌陰道加德納氏菌生長(zhǎng)的能力。最好的菌株(即在紊亂微生物菌群中定居能力最強(qiáng)的菌株)是LN 40，LN 113，LN 99，LN01和LN 23。
借助臨床研究手段對(duì)這些菌株進(jìn)一步進(jìn)行評(píng)價(jià)，其中如果從施用(在第一個(gè)月經(jīng)流注期間開(kāi)始施用所述細(xì)菌)起計(jì)算至少兩個(gè)月經(jīng)周期后細(xì)菌仍存在于陰道中，那么就認(rèn)為所述細(xì)菌在陰道中定殖。篩選出那些能夠在陰道中定居并繁殖的細(xì)菌菌株(LN 40，LN 113，LN 99，LN01和LN 23)。
另外，評(píng)價(jià)細(xì)菌凍干后的存活穩(wěn)定性和凍干細(xì)菌經(jīng)長(zhǎng)期保存后的存活力(保存期)，經(jīng)重復(fù)培養(yǎng)后和體內(nèi)的遺傳特性的保持情況以及細(xì)菌的生長(zhǎng)過(guò)程。
實(shí)施例1經(jīng)陰道施用后的乳酸產(chǎn)生細(xì)菌的定居和繁殖對(duì)15名BV-患者(被診斷患有細(xì)菌性陰道病的婦女)進(jìn)行研究。采用克林霉素膠囊(clindamycin ovules)對(duì)全部15名患者進(jìn)行3天的治療(Dalacin2％膠囊，購(gòu)自Pharmacia)。此后，繼續(xù)對(duì)雙盲法安慰對(duì)照組進(jìn)行治療，其中在抗生素治療后的第一個(gè)月經(jīng)周期期間，6名患者使用了含約103cfu的凍干細(xì)菌菌株LN 01，LN 23，LN 99，LN 113和LN 40的棉條，其它9名患者使用了不合乳酸產(chǎn)生細(xì)菌的常規(guī)棉條。在第二個(gè)月經(jīng)周期期間，所有15名患者使用了不含乳酸產(chǎn)生細(xì)菌的常規(guī)棉條，并在該月經(jīng)結(jié)束幾天后采集陰道樣品。
對(duì)陰道樣品進(jìn)行革蘭氏染色。采用Nugent等提供的標(biāo)準(zhǔn)革蘭氏染色方法分析特定細(xì)菌形態(tài)型存在與否。形態(tài)型大的是革蘭氏陽(yáng)性乳桿菌屬的桿菌形態(tài)型；較小的革蘭氏變異桿菌被稱作加德納氏菌形態(tài)型；和彎曲桿菌。對(duì)陰道液體中存在的微生物進(jìn)行定量并轉(zhuǎn)化為級(jí)數(shù)(見(jiàn)表1)。
表1編碼乳桿菌形態(tài)型 加德納氏菌屬和彎曲革蘭氏級(jí)數(shù)擬桿菌屬形態(tài)型變異桿菌4+0 0 03+1+1+或2+12+2+3+或4+21+3+ 30 4+ 4編碼0至4+基于具有每個(gè)油浸法視野中的形態(tài)型的微生物的平均數(shù)；1+，＜1存在；2+，1-4存在；3+，5-30存在；4+，≥30存在。總級(jí)數(shù)通過(guò)將全部三種形態(tài)型的級(jí)數(shù)相加而得到?？偧?jí)數(shù)的含義如下0-3，正常；4-6，中等；以及≥7，BV。
表2

在6名使用了帶有乳酸產(chǎn)生細(xì)菌的棉條的患者體內(nèi)沒(méi)有檢測(cè)出細(xì)菌性陰道病。而且，所述結(jié)果表明第二個(gè)月經(jīng)周期后乳酸產(chǎn)生細(xì)菌仍然存在于陰道內(nèi)。
而且，這些結(jié)果表明施用較少數(shù)量的細(xì)菌(大約103cfu)就足以使本發(fā)明的細(xì)菌菌株在月經(jīng)來(lái)朝期間實(shí)現(xiàn)在陰道中的定居和繁殖。
另外，本發(fā)明的細(xì)菌菌株對(duì)陰道粘膜具有很好的粘附性。
實(shí)施例2經(jīng)陰道施用后的乳酸產(chǎn)生細(xì)菌的定居與繁殖在12-18個(gè)月內(nèi)，四名未患陰道病癥的健康婦女在其每月月經(jīng)流注期間使用了約含103cfu的凍干細(xì)菌菌株LN01，LN 23，LN 99，LN113和LN 40的棉條。
過(guò)了所述試驗(yàn)期后分析上述婦女的陰道樣品。利用實(shí)施例10中記載的RAPD(隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA)鑒定在所述樣品中發(fā)現(xiàn)的乳桿菌和片球菌。
在所述婦女的兩個(gè)陰道樣品中鑒定出LN 01和LN 113。
在所述婦女的一個(gè)陰道樣品中鑒定出LN 40。
在所述婦女陰道樣品中未鑒定出LN 23和LN 99。
對(duì)這三種結(jié)果的解釋如下當(dāng)所述細(xì)菌混合物被施用于具有健康陰道菌群且pH正常的婦女時(shí)，LN 23基本上不生長(zhǎng)。然而，當(dāng)所述細(xì)菌混合物被施用于陰道微生物菌群紊亂的婦女時(shí)，LN 23開(kāi)始定殖并將為其它細(xì)菌菌株(LN01，LN 113，LN 40和LN 99)提供了一個(gè)良好的生長(zhǎng)環(huán)境。
應(yīng)當(dāng)注意由于特定菌株和/或菌株的特定組合物的適應(yīng)性，在婦女陰道中進(jìn)行定居和生長(zhǎng)方面存在著個(gè)體差異。
在每一陰道樣品中鑒定出了至少一個(gè)本發(fā)明的菌株。
實(shí)施例3細(xì)菌菌株LN 40，LN 113，LN 99和LN 23經(jīng)凍干并長(zhǎng)期保存(保存期)后的存活穩(wěn)定性凍干細(xì)菌菌株LN 40，LN 113，LN 99和LN 23在約-18℃下經(jīng)長(zhǎng)期保存(即保存期)后，對(duì)其存活穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)價(jià)。
表3

表3中提供的結(jié)果表明至少40％的細(xì)菌于-18℃下保存12個(gè)月后仍然存活。而且，-18℃下78個(gè)月以后至少10-20％的細(xì)菌仍然存活。
而且，還按照API 50CH對(duì)所述細(xì)菌進(jìn)行分析，分析結(jié)果表明菌株LN 40，LN 113，LN 99，LN 23和LN 01以凍干形式于-18℃下保存至少78個(gè)月仍能保持其遺傳特性。
將凍干細(xì)菌(LN 40，LN 113，LN 99和LN 23)分散在Akosoft36(得自Karlshamns AB)中并對(duì)其分別于8℃和22℃下保存較長(zhǎng)時(shí)間(即保存期)后的存活穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)價(jià)。
表4制備后的時(shí)間 活菌[cfu/g](周/月)+8℃ +22℃0 3.5×10103.5×10101周2.7×10101.9×1010(～75％) (～53％)1 2.5×10101.3×1010(～71％) (～37％)3.52.0×10106×109(～55％) (～17％)6 2.4×10103.9×109(～68％) (～11％)9 1.8×10101.0×109(～50％) (～2.8％)12 1.×10101.3×109(～49％) (～3.7％)表4中提供的結(jié)果表明約45-50％的細(xì)菌于8℃保存12個(gè)月后仍然存活。而且，約4％的細(xì)菌在室溫(即22℃)保存12個(gè)月后仍然存活。
對(duì)于含有本發(fā)明所有菌株的凍干細(xì)菌混合物也獲得了類似的結(jié)果，其中所述凍干細(xì)菌包括LN01。
實(shí)施例4細(xì)菌菌株LN 40，LN 113，LN99，LN01和LN 23經(jīng)重復(fù)培養(yǎng)后遺傳特性的保持對(duì)細(xì)菌菌株(LN 40，LN 113，LN 99，LN01和LN 23)進(jìn)行10次重復(fù)培養(yǎng)，然后采用API 50CH進(jìn)行評(píng)估。重復(fù)培養(yǎng)后，每一細(xì)菌菌株(實(shí)施例9)的發(fā)酵模式都得到了保持。因此，所述結(jié)果表明所述細(xì)菌菌株經(jīng)重復(fù)培養(yǎng)后保持了其遺傳特性。
實(shí)施例5細(xì)菌菌株LN 40，LN 99，LN 113，LN 23和LN 01的生長(zhǎng)過(guò)程為了提供所述的療效，陰道施用的凍干細(xì)菌應(yīng)當(dāng)在施用后的至少4個(gè)小時(shí)內(nèi)開(kāi)始生長(zhǎng)。
測(cè)定被加入到滅菌MRS肉湯中的凍干細(xì)菌(LN 40，LN 113，LN 99，LN 23和LN01)在620nm下的吸光度(光密度，OD)。進(jìn)行了兩種實(shí)驗(yàn)(參見(jiàn)圖1a和1b)a)將0.01g的凍干細(xì)菌加到3ml MRS肉湯中，并將100ul的這種分散液用另外3ml MRS肉湯稀釋，和b)以能夠產(chǎn)生約0.100吸光度的量將凍干細(xì)菌加到MRS肉湯中。
將裝有上述細(xì)菌分散液的比色杯放置在37℃下并且每15分鐘測(cè)定一次吸光度一直持續(xù)10.5小時(shí)。
正如圖1a和1b所示，每一細(xì)菌菌株(LN 40，LN 113，LN 99，LN23和LN01分別)的生長(zhǎng)速度都很快，并且所有細(xì)菌菌株在至少2小時(shí)內(nèi)開(kāi)始生長(zhǎng)。
而且，每一細(xì)菌菌株的傳代時(shí)間約為20-25分鐘。因此，所述細(xì)菌比泌尿病原體的生長(zhǎng)速度快，因此利用本文記載的細(xì)菌是有利的。
除此之外，在本技術(shù)領(lǐng)域中已知不同細(xì)菌的組合物可以縮短細(xì)菌的傳代時(shí)間，結(jié)果使得細(xì)菌的生長(zhǎng)更快。而且。由于不同種的乳酸產(chǎn)生細(xì)菌具有不同的發(fā)酵模式和特性，所以優(yōu)選地是采用不同菌種的組合物。
應(yīng)當(dāng)提示的是凍干的LN 40，LN 99，LN 113，LN 23和LN 01的組合物在1.5小時(shí)內(nèi)開(kāi)始生長(zhǎng)，因此比每個(gè)細(xì)菌菌株所需的時(shí)間至少快了25％。
實(shí)施例6抑制泌尿病原體(uropathogen)生長(zhǎng)的能力該實(shí)施例的目的在于顯示LN 40，LN 113，LN 99，LN 23和LN 01的細(xì)菌混合物能夠比單獨(dú)使用每個(gè)細(xì)菌菌株更有效地抑制泌尿病原體的生長(zhǎng)。
將被測(cè)試的乳酸產(chǎn)生細(xì)菌均勻地加入到融化的無(wú)菌緩沖瓊脂培養(yǎng)基如MRS瓊脂中。將得到的混合物倒入培養(yǎng)皿(90mm)1中并如圖3所示將該培養(yǎng)皿傾斜放置以使瓊脂混合物2在該培養(yǎng)皿的一側(cè)高度達(dá)到約1mm而在另一側(cè)的高度達(dá)到約11mm。
將泌尿病原體均勻地加入到融化的無(wú)菌緩沖瓊脂培養(yǎng)基如VRB(Violet Red Bile)瓊脂中。如圖3所示，將該混合物倒在上述含有乳酸產(chǎn)生細(xì)菌的固化瓊脂上，并也使該瓊脂混合物3固化。
然后在37℃下將乳酸產(chǎn)生細(xì)菌和泌尿病原體培養(yǎng)約24小時(shí)。如圖4所示，從培養(yǎng)皿1的上面可以看到4和5兩條不同的帶。在第一條帶4中，泌尿病原體能夠生長(zhǎng)。在第二條帶5中，乳酸菌抑制了泌尿病原體的生長(zhǎng)。
乳酸菌抑制泌尿病原體的能力可以通過(guò)測(cè)定第二條帶5，即被抑制生長(zhǎng)的帶5的長(zhǎng)度L來(lái)進(jìn)行定量分析。
一個(gè)腸病原體Ecoli(EPEC)菌株被用于該實(shí)驗(yàn)中。
LN 40，LN 113，LN 99，LN01和LN 23中的每個(gè)細(xì)菌菌株的被抑制生長(zhǎng)的帶長(zhǎng)度L為8至22mm。
然而，含有LN 40，LN 113，LN 99，LN 01和LN 23的細(xì)菌混合物的被抑制生長(zhǎng)的帶長(zhǎng)度為32-34mm。
因此，含有LN 40，LN 113，LN 99，LN01和LN 23所有細(xì)菌菌株的細(xì)菌混合物比單獨(dú)使用的每一個(gè)細(xì)菌菌株能夠更有效地抑制泌尿病原體如Ecoli的生長(zhǎng)。因此，優(yōu)選地是利用本發(fā)明的所述細(xì)菌菌株的組合物。細(xì)菌菌株LN 40，LN 113，LN 99，LN01和LN 23的性質(zhì)通過(guò)表型和遺傳型方法對(duì)所述細(xì)菌進(jìn)行性質(zhì)鑒定。
實(shí)施例7細(xì)菌菌株LN 40，LN 113，LN99，LN01和LN 23微生物學(xué)特性菌株(LN 40，LN 113，LN 99，LN 23和LN 01)在細(xì)胞形態(tài)學(xué)、革蘭氏染色、氧化酶和過(guò)氧化氫酶反應(yīng)方面的性質(zhì)鑒定。
菌株LN 40為革蘭氏陽(yáng)性、過(guò)氧化氫酶陰性、氧化酶陰性、無(wú)芽孢形成、棒狀(約0.9um×3-10um)細(xì)菌，以單細(xì)胞形式或雙細(xì)胞的形式存在。
菌株LN 99為革蘭氏陽(yáng)性、過(guò)氧化氫酶陰性、氧化酶陰性、無(wú)芽孢形成、棒狀(約0.9um×1.5-2.0um)細(xì)菌，以單細(xì)胞形式存在。
菌株LN 113為革蘭氏陽(yáng)性、過(guò)氧化氫酶陰性、氧化酶陰性、無(wú)芽孢形成、棒狀(約0.9um×2um)細(xì)菌，以單細(xì)胞形式或雙細(xì)胞的形式存在。
菌株LN 01為革蘭氏陽(yáng)性、過(guò)氧化氫酶陰性、氧化酶陰性、無(wú)芽孢形成、直線或略彎曲的棒狀(約8.6-1.6um×2.3-11um)細(xì)菌，以單細(xì)胞形式或鏈狀的形式存在。
菌株LN 23為革蘭氏陽(yáng)性、過(guò)氧化氫酶陰性、氧化酶陰性、無(wú)芽孢形成、圓形(約1um)細(xì)菌，以單細(xì)胞形式或雙細(xì)胞的形式存在。
實(shí)施例8細(xì)菌菌株LN 40，LN 113，LN99，LN01和LN 23的SDS-PAGE和群分析在37℃和厭氧條件下利用MRS瓊脂(Oxoid CM361)將培養(yǎng)物培養(yǎng)24小時(shí)。按照由根特大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室的研究小組建立的實(shí)驗(yàn)方案制備細(xì)胞提取物并在BCCMTM/LMG下進(jìn)行蛋白凝膠電泳(SDS-PAGE)(Pot，B，Vandamme，P，Kersters，K，Analysis.of elctrophoreticwhole-organism protein fingerprints，Chemical Methods inProkaryotic Systematics，M，Goodfellow和A G，O’Donell(編輯)，J Wiley & Sons，Chichester(1994))。
利用BCCM數(shù)據(jù)庫(kù)(1999年12月)中的參照特性對(duì)LN 40，LN 113，LN 99和LN 23進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化和數(shù)字化蛋白模型的數(shù)字化分析和聚類。利用CCUG數(shù)據(jù)庫(kù)(2001年1月)中的參照特性對(duì)LN 01進(jìn)行分析和聚類。
發(fā)現(xiàn)菌株LN 40屬于約氏乳桿菌菌種或加氏乳桿菌菌種。
發(fā)現(xiàn)菌株LN 99屬于發(fā)酵乳桿菌菌種。
發(fā)現(xiàn)菌株LN 113屬于干酪乳桿菌鼠李糖亞種菌種。
發(fā)現(xiàn)菌株LN 23屬于乳酸片球菌菌種。
發(fā)現(xiàn)菌株LN 01屬于卷曲乳桿菌菌種。
實(shí)施例9利用API 50CH和快速ID32strep對(duì)細(xì)菌菌株LN 40，LN 113，LN99，LN 23和LN01進(jìn)行性質(zhì)鑒定菌株(LN 40，LN 113，LN 99，LN 23和LN 01)對(duì)不同碳水化合物進(jìn)行發(fā)酵的能力如表5所示。利用API 50CH API和快速ID32strep在37℃下按照廠家說(shuō)明書(shū)進(jìn)行測(cè)試。從結(jié)果上來(lái)看，API 50CH API與快速ID32strep之間的存在著差異，而API 50CH的結(jié)果被認(rèn)為更可靠。
在CCUG數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索最終發(fā)酵型。每個(gè)菌株獲得的最高數(shù)據(jù)庫(kù)積分證實(shí)了由上述分析(SDS-PAGE/群分析)得到的結(jié)果與所述菌株所屬的各個(gè)菌種有關(guān)。
而且，與鼠李糖的反應(yīng)證實(shí)了菌株LN 113屬于干酪乳桿菌鼠李糖亞種。
然而，LN 40，LN 99，LN 113，LN 23和LN01之間的比較，以及每個(gè)菌種的典型菌株(分別是CCUG 31451T，CCUG30138T，CCUG21452T，CCUG 32235T和CCUG 44117T)之間的比較表明所有菌株(LN 40，LN 113，LN 99，LN 23和LN01)的發(fā)酵型具有顯著的差異。
在表5中，1表示未發(fā)生反應(yīng)，2表示反應(yīng)微弱，3表示發(fā)生了反應(yīng)，4表示反應(yīng)強(qiáng)烈，5表示反應(yīng)非常強(qiáng)烈。
表5


實(shí)施例10利用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA對(duì)細(xì)菌菌株LN 40，LN 113，LN99，LN 23和LN 01性質(zhì)鑒定采用RAPD(隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA)進(jìn)一步對(duì)細(xì)菌菌株進(jìn)行分析。該技術(shù)被例如Willians，JG等記載在Nucl Acids Res，186531(1990)中，并且以前不僅被用來(lái)檢測(cè)菌株的多樣性，而且還被用于基因繪圖、種群分析、流行病學(xué)研究而且被用于進(jìn)行分類學(xué)和系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系的分析(Welsh，J等，PCR2A Practical Approach，McPherson，MJ，Hames，BD和Taylor，GR，編輯，第11章，IRL出版社(1995))。
在低嚴(yán)緊度條件下利用短寡聚核苷酸引物(5’ACGCGCAAC3’)通過(guò)PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))來(lái)制備菌株特定產(chǎn)物的可再生(reproducible)序列。然后通過(guò)凝膠電泳對(duì)所得到的序列進(jìn)行分析并與每種細(xì)菌菌種的典型菌株進(jìn)行比較，所述菌株經(jīng)過(guò)了同樣的處理。
該分析結(jié)果被概括在圖2當(dāng)中。
泳道1是發(fā)酵乳桿菌ATCC 14931T，泳道2是LN 99，泳道3是卷曲乳桿菌CCUG 44117T，泳道4是LN01，泳道5是100 bp摩爾重量標(biāo)準(zhǔn)品泳道6是LN 23，泳道7是LN 40，泳道8是加氏乳桿菌ATCC19992T，泳道9是LN 113，以及泳道10是干酪乳桿菌ATCC4646T。
從圖2可以看出本發(fā)明的細(xì)菌菌株(LN 40，LN 113，LN 99，LN 23和LN01)之間的主要差別并且可以看到各個(gè)典型菌株。
本發(fā)明還涉及一種用于預(yù)防和/或治療泌尿生殖道感染的組合物，該組合物至少含有一種所述的細(xì)菌菌株(LN 40，LN 113，LN 99，LN01和LN 23)。
優(yōu)選地，所述組合物含有所述的全部菌株，即菌株LN 40、菌株LN 113、菌株LN 99、菌株LN01和菌株LN 23。
所述組合物優(yōu)選地被配制成適于陰道施用，諸如栓劑、膠囊、丸劑、片劑、混懸液、噴霧劑、凝膠體、乳劑、粉劑或其它任何形式的陰道插入物，該組合物可以含有本技術(shù)領(lǐng)域中的常規(guī)藥用賦形劑。另外，本發(fā)明記載了一種被用于預(yù)防和/或治療泌尿生殖道感染的衛(wèi)生用品，諸如婦女吸收用品(例如棉條、衛(wèi)生巾、襯褲墊等)、尿布和失禁防護(hù)用品，所述衛(wèi)生用品至少含有一種所述細(xì)菌菌株(LN 40，LN 113，LN 99，LN01和LN 23)。
優(yōu)選地，所述衛(wèi)生用品含有所有所述菌株，即菌株LN 40、菌株LN 113、菌株LN 99、菌株LN01和菌株LN 23。
所述衛(wèi)生用品優(yōu)選地是棉條。
而且本發(fā)明記載了至少一種所述細(xì)菌菌株(LN 40，LN 113，LN 99，LN01和LN 23)用于生產(chǎn)預(yù)防和/或治療泌尿生殖道感染、優(yōu)選地是細(xì)菌陰道病或任何其它陰道細(xì)菌性病癥的組合物或衛(wèi)生用品的用途。
并且，本發(fā)明記載了一種用于預(yù)防和/或治療泌尿生殖道感染、優(yōu)選地是細(xì)菌陰道病或任何其它陰道細(xì)菌性病癥的方法，其中以治療有效量陰道施用至少一種所述細(xì)菌菌株(LN 40，LN 113，LN 99，LN01和LN 23)以便預(yù)防、治療微生物感染和/或減緩微生物感染的效應(yīng)。優(yōu)選地是利用陰道制劑和/或衛(wèi)生用品、最優(yōu)選地是棉條來(lái)施用所述細(xì)菌菌株。
總之，細(xì)菌菌株LN 40，LN 113，LN 99，LN01和LN 23由于以下原因而顯示出優(yōu)良的特性-能夠抑制泌尿病原體(包括快速的細(xì)菌生長(zhǎng))生長(zhǎng)，-經(jīng)陰道施用，甚至在月經(jīng)流注期間能夠在體內(nèi)定居和繁殖，-細(xì)菌經(jīng)凍干和長(zhǎng)期保存(保存期)后的存活力仍然穩(wěn)定，和-通過(guò)重復(fù)培養(yǎng)以及在體內(nèi)能夠保持遺傳特性。
而且，從經(jīng)濟(jì)角度出發(fā)，這些細(xì)菌菌株也是有利的。
總之，這些特性意味著本發(fā)明的細(xì)菌菌株非常適于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)用于預(yù)防、治療泌尿生殖道感染和/或減緩其效應(yīng)的消費(fèi)品(諸如組合物或衛(wèi)生用品)，該消費(fèi)品含有所述細(xì)菌菌株。
當(dāng)借助具體的實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述時(shí)，在不脫離本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和其保護(hù)范圍的條件下對(duì)其進(jìn)行的各種改變和改進(jìn)對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)都將是顯而易見(jiàn)的。
PCT/R0/134表關(guān)于保藏的微生物的說(shuō)明(PCT實(shí)施細(xì)則第13條之二)
關(guān)于保藏的微生物的說(shuō)明(PCT實(shí)施細(xì)則第13條之二)
關(guān)于保藏的微生物的說(shuō)明(PCT實(shí)施細(xì)則第13條之二)
關(guān)于保藏的微生物的說(shuō)明(PCT實(shí)施細(xì)則第13條之二)
關(guān)于保藏的微生物的說(shuō)明(PCT實(shí)施細(xì)則第13條之二)
權(quán)利要求
1.乳桿菌屬或片球菌屬的分離菌株，其特征在于所述菌株選自以下一組菌株加氏乳桿菌菌株LN40，其保藏號(hào)為L(zhǎng)MG P-20560、干酪乳桿菌鼠李糖亞種菌株LN113，其保藏號(hào)為L(zhǎng)MG P-20562、發(fā)酵乳桿菌菌株LN99，其保藏號(hào)為L(zhǎng)MG P-20561、卷曲乳桿菌菌株LN01，其保藏號(hào)為L(zhǎng)MG P-20558和乳酸片球菌菌株LN23，其保藏號(hào)為L(zhǎng)MG P-20559，或其表型和/或基因型特性基本相應(yīng)的變異體，所述菌株于2001年6月14日被保藏在比利時(shí)微生物協(xié)調(diào)保藏中心。
2.乳桿菌屬或片球菌屬的分離菌株，其具有以下鑒定特性a)在月經(jīng)流注期間經(jīng)陰道施用能夠在人陰道內(nèi)定居并繁殖，其中從開(kāi)始施用計(jì)算至少兩個(gè)月經(jīng)周期后，如果陰道中仍有所述細(xì)菌存在，就認(rèn)為所述細(xì)菌定殖了，b)經(jīng)重復(fù)培養(yǎng)后保持了遺傳特性，c)經(jīng)凍干和保存被凍干細(xì)菌保持了細(xì)菌的存活力，其中在-18℃下保存至少12個(gè)月后至少有40％的凍干細(xì)菌仍然存活。
3.如權(quán)利要求2所述的分離細(xì)菌菌株，其中所述細(xì)菌菌株選自以下一組菌株加氏乳桿菌菌株LN40，其保藏號(hào)為L(zhǎng)MG P-20560、干酪乳桿菌鼠李糖亞種菌株LN113，其保藏號(hào)為L(zhǎng)MG P-20562、發(fā)酵乳桿菌菌株LN99，其保藏號(hào)為L(zhǎng)MG P-20561、卷曲乳桿菌菌株LN01，其保藏號(hào)為L(zhǎng)MG P-20558和乳酸片球菌菌株LN23，其保藏號(hào)為L(zhǎng)MG P-20559，或其表型和/或基因型特性基本相應(yīng)的變異體，所述菌株于2001年6月14日被保藏在比利時(shí)微生物協(xié)調(diào)保藏中心。
4.分離乳桿菌屬或片球菌屬的細(xì)菌菌株的方法，其中所述細(xì)菌菌株能夠在人體陰道中定居和繁殖，該方法包括以下步驟a)從具有正常、健康陰道微生物菌群的婦女陰道中收集細(xì)菌樣品，b)從步驟a)的陰道樣品中篩選出乳酸產(chǎn)生細(xì)菌，c)利用適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基對(duì)步驟b)的乳酸產(chǎn)生細(xì)菌進(jìn)行體外純培養(yǎng)從而提供至少一種分離細(xì)菌菌株，d)就在月經(jīng)流注期間對(duì)婦女陰道施用所述菌株在陰道中進(jìn)行定居和繁殖的能力，來(lái)評(píng)價(jià)步驟c)的至少一種純培養(yǎng)細(xì)菌菌株和/或步驟c)的至少兩種細(xì)菌菌株的組合，所述婦女的陰道微生物菌群發(fā)生紊亂，其中如果從開(kāi)始施用起計(jì)算至少兩個(gè)月經(jīng)周期后所述細(xì)菌菌株仍然存在于陰道中，就認(rèn)為該細(xì)菌菌株或菌株已經(jīng)定殖，和e)篩選出至少一種步驟d)的細(xì)菌菌株，其能夠在陰道中定居并繁殖。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，還包括另一個(gè)步驟，其中步驟c)的至少一種純培養(yǎng)細(xì)菌菌株和/或步驟c)的至少兩種細(xì)菌菌株的組合被凍干。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，還包括另一個(gè)步驟，其中就經(jīng)凍干后細(xì)菌存活力的穩(wěn)定性和經(jīng)長(zhǎng)期保存后凍于細(xì)菌的存活力方面對(duì)步驟c)的至少一種被凍干的純培養(yǎng)細(xì)菌菌株和/或步驟c)的至少兩種被凍干的細(xì)菌菌株的組合進(jìn)行評(píng)價(jià)和選擇，其中如果經(jīng)過(guò)凍干和在-18℃下凍干細(xì)菌保存至少12個(gè)月后至少有40％的細(xì)菌保持存活就認(rèn)為所述細(xì)菌的存活力是穩(wěn)定的。
7.如權(quán)利要求5或6所述的方法，還包括另一個(gè)步驟，其中就經(jīng)過(guò)重復(fù)培養(yǎng)后的遺傳穩(wěn)定性方面對(duì)步驟c)的至少一種被凍干的純培養(yǎng)細(xì)菌菌株和/或步驟c)的至少兩種被凍干的細(xì)菌菌株的組合進(jìn)行評(píng)價(jià)和選擇。
8.乳桿菌屬或片球菌屬的細(xì)菌菌株，其能夠在月經(jīng)流注期間于人體陰道中進(jìn)行定居和繁殖，其中所述菌株由權(quán)利要求4-7的任一項(xiàng)所述的方法獲得。
9.如權(quán)利要求8所述的細(xì)菌菌株，其中所述菌株選自以下一組菌株加氏乳桿菌菌株LN40，其保藏號(hào)為L(zhǎng)MG P-20560、干酪乳桿菌鼠李糖亞種菌株LN113，其保藏號(hào)為L(zhǎng)MG P-20562、發(fā)酵乳桿菌菌株LN99，其保藏號(hào)為L(zhǎng)MG P-20561、卷曲乳桿菌菌株LN01，其保藏號(hào)為L(zhǎng)MGP-20558和乳酸片球菌菌株LN23，其保藏號(hào)為L(zhǎng)MG P-20559，或其表型和/或基因型特性基本相應(yīng)的變異體，所述菌株于2001年6月14日被保藏在比利時(shí)微生物協(xié)調(diào)保藏中心。
10.用于預(yù)防和/或治療泌尿生殖道感染的組合物，其含有至少一種如權(quán)利要求1-3、8或9的任一項(xiàng)所述的細(xì)菌菌株。
11.如權(quán)利要求10所述的組合物，其被配制成適于陰道施用。
12.用于預(yù)防和/或治療泌尿生殖道感染的衛(wèi)生用品，其含有至少一種如權(quán)利要求1-3、8或9的任一項(xiàng)所述的細(xì)菌菌株。
13.如權(quán)利要求12所述的衛(wèi)生用品，其是棉條形式。
14.至少一種權(quán)利要求1-3、8或9的任一項(xiàng)所述的細(xì)菌菌株用于生產(chǎn)預(yù)防和/或治療泌尿生殖道感染的組合物或衛(wèi)生用品的用途。
15.如權(quán)利要求14所述的用途，其用于預(yù)防和/或治療細(xì)菌性陰道病或任何其它陰道細(xì)菌性病癥。
16.用于預(yù)防和/或治療泌尿生殖道感染的方法，其中至少一種權(quán)利要求1-3、8或9的任一項(xiàng)所述的細(xì)菌菌株被以治療有效量陰道施用以預(yù)防、治療微生物感染和/或減緩微生物感染的效應(yīng)。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其用于預(yù)防和/或治療細(xì)菌性陰道病或任何其它陰道細(xì)菌性病癥。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了乳桿菌屬和片球菌屬的乳酸產(chǎn)生菌的新型分離菌株和分離該細(xì)菌菌株的方法，該細(xì)菌菌株甚至在月經(jīng)流注期間也能夠在人陰道內(nèi)定居并繁殖。而且還記載了用于預(yù)防和/或治療泌尿生殖道感染的且含有所述細(xì)菌菌株的組合物和衛(wèi)生用品如棉條。本發(fā)明還記載了一種用于預(yù)防和/或治療泌尿生殖道感染的方法，其中陰道施用了至少一種所述細(xì)菌菌株。
文檔編號(hào)C12R1/225GK1556852SQ02818376
公開(kāi)日2004年12月22日 申請(qǐng)日期2002年9月19日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月20日
發(fā)明者C·薩繆爾森, C 薩繆爾森, E·克萬(wàn)塔, 蛩, A·吉菲爾韋內(nèi), 貧 つ 申請(qǐng)人:艾倫股份公司