專利名稱：用于培養(yǎng)鰻弧菌的培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于培養(yǎng)鰻弧菌的培養(yǎng)基，尤其是適合鰻弧菌鐵攝取系統(tǒng)缺陷株的培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
鰻弧菌是嚴(yán)重危害海洋漁業(yè)生產(chǎn)一類重要病原菌。國際上利用野生型鰻弧菌制作滅活疫苗防止病原菌感染已取得成功，商品化滅活疫苗已應(yīng)用多年。相比傳統(tǒng)全復(fù)合培養(yǎng)基，本培養(yǎng)基更有利于野生型鰻弧菌的生長，從而有利于鰻弧菌滅活疫苗的大規(guī)模生產(chǎn)。另外，利用國際上成熟的方法誘變篩選得到的鰻弧菌鐵攝取系統(tǒng)缺陷株，具有潛在的減毒活疫苗的價(jià)值。本培養(yǎng)基尤其適合此缺陷株的生長，從而為鰻弧菌減毒活疫苗的商業(yè)化推廣打下了基礎(chǔ)。鰻弧菌鐵攝取系統(tǒng)缺陷株為無質(zhì)粒株，攝鐵能力低下，同野生鰻弧菌相比具有獨(dú)特的生長和代謝特性。在大規(guī)模培養(yǎng)鐵攝取系統(tǒng)缺陷株的過程中必需采用專門的培養(yǎng)基，保證三價(jià)鐵離子的有效攝取，各種營養(yǎng)成分的均衡是其培養(yǎng)的關(guān)鍵。
目前尚沒有對鰻弧菌鐵攝取系統(tǒng)缺陷株培養(yǎng)的相關(guān)報(bào)道，野生型鰻弧菌的培養(yǎng)主要以TGY培養(yǎng)基補(bǔ)充適量NaCl，在30L反應(yīng)器上以批培養(yǎng)方式大規(guī)模培養(yǎng)。在28℃下，經(jīng)培養(yǎng)24小時(shí)，最終菌產(chǎn)量為18g(菌體濕重)/L(美國專利U.S.P 3,862,313)。
但是，用上述報(bào)道的培養(yǎng)基培養(yǎng)鐵攝取系統(tǒng)缺陷株，具有以下不足培養(yǎng)基中的C、N、P等成分沒有達(dá)到最佳濃度和配比，缺陷株不能達(dá)到最佳的生長狀態(tài)，底物利用效率低。沒有確定最佳的三價(jià)鐵源，并對其濃度及其存在環(huán)境進(jìn)行優(yōu)化。利用蛋白胨培養(yǎng)，成本高，從商業(yè)角度上，不利于缺陷株作為活疫苗的大規(guī)模推廣。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本發(fā)明旨在克服以上所述已知培養(yǎng)基不適合鰻弧菌鐵攝取系統(tǒng)缺陷株的缺陷，建立一種既可改善鰻弧菌野生型大規(guī)模培養(yǎng)，又能夠?qū)崿F(xiàn)鰻弧菌缺陷株大規(guī)模培養(yǎng)的高效培養(yǎng)基。
技術(shù)方案為了解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種培養(yǎng)基，其中包含碳源，按C6H12O6單體計(jì)，0.08-0.12mol/L；無機(jī)氮源，按N計(jì)，15-75mmol/L；無機(jī)磷源，按PO43-計(jì)，5-100mmol/L；Mg2+0.05-4mmol/L；有機(jī)氮源，0.5-10g/L；氯化鈉，18-30g/L；Fe3+，100-1000μmol/L；pH6.8-8.0。
本發(fā)明所述的碳源可選自各種已知常規(guī)碳源，例如蔗糖、葡萄糖、麥芽糖，或其組合。所述無機(jī)氮源選自常規(guī)無機(jī)氮源，例如氯化銨、硫酸銨、硝酸銨，或其組合。所述無機(jī)磷源選自常規(guī)無機(jī)磷源，例如磷酸二氫鉀、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉，或其組合。所述有機(jī)氮源選自常用的酵母浸出物、蛋白胨、水解干酪素等，或其組合。
本發(fā)明實(shí)施方式之一中，所述培養(yǎng)基還含有微量元素0-80μmol/L。所述微量元素選自鉍(Bi3+)、鋅(Zn2+)、鐵(Fe3+)、錳(Mn2+)、鈣(Ca2+)、銅(Cu2+)、鋁(Al3+)、鎳(Ni2+)、鈷(Co2+)，或它們的組合。
本發(fā)明實(shí)施方式之一中，所述培養(yǎng)基還包含Tricine，0-2g/L。
本發(fā)明實(shí)施方式之一中，所述培養(yǎng)基包含蔗糖20g/L；氯化銨1.5g/L；Na2HPO4·12H2O 9g/L，KH2PO40.8g/L；MgSO4·6H2O 0.2g/L；酵母浸出物3g/L；氯化鈉25g/L；檸檬酸鐵銨400μmol/L；微量元素濃縮液10ml/L；Tricine 0.7g/L；pH7.6；所述微量元素濃縮液包含H3BO30.2g/L，ZnSO4·7H2O 0.5g/L，MnSO40.8g/L，CoCl2·6H2O 0.4g/L，CaCl20.5g/L，CuSO4·5H2O 0.5g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.4g/L，AlCl3·6H2O 0.2g/L，NiCl2·6H2O 0.2g/L。
本發(fā)明實(shí)施方式之一中，所培養(yǎng)的是鰻弧菌鐵攝取系統(tǒng)缺陷株。有益效果本發(fā)明培養(yǎng)基就C、N、P濃度及配比，最佳的三價(jià)鐵源及其濃度進(jìn)行了優(yōu)化，能夠改善鰻弧菌的培養(yǎng)。而且，出人意料的是，本發(fā)明培養(yǎng)基尤其適合鐵攝取系統(tǒng)缺陷株的高密度培養(yǎng)，為開發(fā)適合該缺陷株的全合成培養(yǎng)基的打下了基礎(chǔ)。此外，與例如TGY的普通復(fù)合培養(yǎng)基相比，本發(fā)明培養(yǎng)基采用簡單的無機(jī)鹽、碳源和酵母浸出物等原料，主要化學(xué)成分清楚，品質(zhì)穩(wěn)定，有利于生產(chǎn)的穩(wěn)定和標(biāo)準(zhǔn)化，而且，單位產(chǎn)量的成本更低，有利于鰻弧菌鐵攝取系統(tǒng)缺陷株作為活疫苗的大規(guī)模推廣。


圖1鰻弧菌野生株在本發(fā)明培養(yǎng)基與已知復(fù)合培養(yǎng)基(美國專利3862313中的TGY+0.25％NaCl)的生長情況比較。
圖2鰻弧菌鐵攝取系統(tǒng)缺陷株在本發(fā)明培養(yǎng)基與普通復(fù)合培養(yǎng)基(美國專利3862313中的TGY+0.25％NaCl)上生長情況的比較。
具體實(shí)施例方式
以下將通過實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的描述。但需要指出的是，以下說明僅為舉例，對本發(fā)明的范圍沒有限定意義。
實(shí)施例1培養(yǎng)基的配制根據(jù)表1配方配制培養(yǎng)基A，B，C和D。其中，D為美國專利3862313中的TGY+0.25％NaCl。
表1

表2


所有培養(yǎng)基滅菌前，pH值調(diào)整至預(yù)定值。為防止沉淀和營養(yǎng)因子之間的破壞性反應(yīng)，分成有機(jī)營養(yǎng)物、無機(jī)鹽、微量元素和碳源四個(gè)部分，分別高壓滅菌，三價(jià)鐵鹽溶液專門過濾滅菌。
實(shí)施例2鰻弧菌野生株的培養(yǎng)本實(shí)施例培養(yǎng)的鰻弧菌野生株為Vibrio anguillarum(W-1，O1血清型)，是從山東黃海海域高密度養(yǎng)殖鱸魚(Lateolabrax japonicus)爆發(fā)弧菌病的病魚體內(nèi)分離得到的，具有強(qiáng)弧菌病致病力。
按照表1中的組分及含量，配制培養(yǎng)基A和培養(yǎng)基D。培養(yǎng)基滅菌前，pH值調(diào)整至7.5。250ml搖瓶中培養(yǎng)基裝液量為40ml。然后接入經(jīng)12小時(shí)培養(yǎng)的新鮮種子(LB培養(yǎng)基培養(yǎng))，接種密度為7.5％。28℃下經(jīng)過24小時(shí)培養(yǎng)，生長曲線如圖1所示。鰻弧菌野生株在本發(fā)明培養(yǎng)基中的生長情況優(yōu)于普通復(fù)合培養(yǎng)基(USP3862313中所述的TGY+0.25％NaCl)中的生長。
實(shí)施例3鰻弧菌鐵攝取系統(tǒng)缺陷株的制備按照已知方法，用變溫培養(yǎng)法對實(shí)施例2中的鰻弧菌野生株進(jìn)行誘變(Crosa，J.D.，L.Hedges和M.Schiewe.1980.Infect.Immun.27897-902；Tolmasky，M.，L.Actis，A.Toranzo，J.Barja，和J.Crosa.1985.J.Gen.Microbiol.1311987-1997.)。簡而言之，取鰻弧菌野生株斜面種子接種于LB培養(yǎng)基，在27℃下試管培養(yǎng)。取12小時(shí)的生長旺盛菌液接種于新鮮LB培養(yǎng)基(補(bǔ)充Fe3+至200μM)，37℃培養(yǎng)12小時(shí)。以此菌液為菌種，接種于新鮮補(bǔ)鐵培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)。如上所述，在37℃?zhèn)鞔?代以上為一個(gè)誘變周期。
按照已知方法，用CAS瓊脂平板(Bemhard Schwyn，J.B.Neilands.1986..Analytical Biochemistry.16047-56.)法篩選。簡而言之，代完成以上誘變周期后，取所得菌液，以3％NaCl溶液稀釋為不同倍數(shù)，分別涂LB平板，待單菌落長出。將每個(gè)單菌落分別點(diǎn)種于篩子平板和Fe3+豐富平板。在篩子板上無法生長而在豐富平板正常生長的為潛在的質(zhì)粒缺失株(鐵攝取系統(tǒng)缺陷株)，可進(jìn)一步變溫誘變。
用瓊脂糖電泳法及PCR擴(kuò)增法對上述潛在的質(zhì)粒缺失株進(jìn)行鑒定。簡而言之，用堿裂解法提取誘變菌株的質(zhì)粒DNA，提取規(guī)模50ml菌液(OD5500.4)。將產(chǎn)物溶解在50μl TE緩沖液中，取10μl做電泳驗(yàn)證。以相同體積的野生型菌株培養(yǎng)液作為陽性對照。對電泳陰性株，做PCR驗(yàn)證。取pJM1質(zhì)粒上fatDCBA基因?yàn)槟繕?biāo)片段，長度約3kb，設(shè)計(jì)引物。反應(yīng)條件94℃變性1分鐘，62.5℃復(fù)性1.5分鐘，72℃延伸3分鐘，30次循環(huán)。取10μl做電泳驗(yàn)證所得為鰻弧菌鐵攝取系統(tǒng)缺陷株。
實(shí)施例4鰻弧菌鐵攝取系統(tǒng)缺陷株的培養(yǎng)按照實(shí)施例1所述，將實(shí)施例3制得的鰻弧菌鐵攝取系統(tǒng)缺陷株培養(yǎng)于A、B、C和D培養(yǎng)基中。28℃下經(jīng)過24小時(shí)搖瓶培養(yǎng)，生長曲線如圖2所示。如圖所示，鰻弧菌鐵攝取系統(tǒng)缺陷株在本發(fā)明培養(yǎng)基A-C中的生長情況要明顯優(yōu)于普通復(fù)合培養(yǎng)基(D)中的生長，尤以培養(yǎng)基A為最佳。
權(quán)利要求
1.一種用于培養(yǎng)鰻弧菌的培養(yǎng)基，其中包含碳源，按C6H12O6單體計(jì)，0.08-0.12mol/L；無機(jī)氮源，按N計(jì)，15-75mmol/L；無機(jī)磷源，按PO43-計(jì)，5-100mmol/L；Mg2+0.05-4mmol/L；有機(jī)氮源，0.5-10g/L；氯化鈉，18-30g/L；Fe3+，100-1000μmol/L；pH6.8-8.0。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基，還含有微量元素0-80μmol/L，所述微量元素選自Bi3+、Zn2+、Fe3+、Mn2+、Ca2+、Cu2+、Al3+、Ni2+、Co2+，或它們的組合。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的培養(yǎng)基，還包含Tricine，0-2g/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的培養(yǎng)基，其中，所述碳源為蔗糖20g/L；所述無機(jī)氮源為氯化銨1.5g/L；所述無機(jī)磷源為Na2HPO4·12H2O 9g/L，KH2PO40.8g/L；所述的Mg2+為MgSO4·6H2O 0.2g/L；所述有機(jī)氮源為酵母浸出物3g/L；氯化鈉25g/L；所述Fe3+為檸檬酸鐵銨400μmol/L；所述微量元素為微量元素濃縮液10ml/L；Tricine 0.7g/L；pH7.6；所述微量元素濃縮液包含H3BO30.2g/L，ZnSO4·7H2O0.5g/L，MnSO40.8g/L，CoCl2·6H2O 0.4g/L，CaCl20.5g/L，CuSO4·5H2O 0.5g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.4g/L，AlCl3·6H2O 0.2g/L，NiCl2·6H2O 0.2g/L。
5.權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基用于培養(yǎng)鰻弧菌鐵攝取系統(tǒng)缺陷株的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于培養(yǎng)鰻弧菌的培養(yǎng)基，它尤其適合培養(yǎng)鰻弧菌鐵攝取系統(tǒng)缺陷株，其中包含碳源，按C
文檔編號(hào)C12N1/20GK1511946SQ02160588
公開日2004年7月14日 申請日期2002年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月30日
發(fā)明者張?jiān)d, 馬悅, 朱貽華 申請人:華東理工大學(xué)