專(zhuān)利名稱(chēng)：鹽生杜氏藻udp－葡萄糖脫氫酶及其編碼序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物學(xué)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及新的編碼鹽生杜氏藻(Dunaliella salina)耐鹽相關(guān)蛋白-UDP-葡萄糖脫氫酶的多核苷酸，以及此多核苷酸編碼的多肽。本發(fā)明還涉及此多核苷酸和多肽的用途和制備。具體地說(shuō)，本發(fā)明的多肽是一種新的耐鹽相關(guān)蛋白。
背景技術(shù)：
目前，世界人口不斷增加，而可耕種土地卻不斷減少。然而，地球上還有許多因鹽堿化而無(wú)法有效利用的土地資源。為了有效地利用這些鹽堿化的土地資源，人們一直在尋找既適應(yīng)生長(zhǎng)而具有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的植物品種。然而，迄今為止沒(méi)有十分合適的植物品種。
另一種開(kāi)發(fā)耐鹽堿植物的方法是對(duì)已有的植物品種，尤其是具有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的植物品種進(jìn)行改良。然而，傳統(tǒng)的植物改良方法費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、并且缺乏針對(duì)性。
為了有效地、針對(duì)性地改善植物品種的耐鹽性，本領(lǐng)域迫切需要開(kāi)發(fā)與耐鹽性有關(guān)的基因和蛋白。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種新的鹽生杜氏藻耐鹽相關(guān)蛋白UDP-葡萄糖脫氫酶以及其片段、類(lèi)似物和衍生物。
本發(fā)明的另一目的是提供編碼這些多肽的多核苷酸。
本發(fā)明的另一目的是提供生產(chǎn)這些多肽的方法以及該多肽和編碼序列的用途，尤其是在提高植物耐鹽性方面的用途。
鹽生杜氏藻(Dunaliella salina)屬綠藻門(mén)、綠藻綱、團(tuán)藻目、多毛藻科、杜氏藻屬，主要生長(zhǎng)于高鹽度水體中。細(xì)胞形態(tài)通常為卵圓形，當(dāng)外界滲透壓發(fā)生變化時(shí)，其形態(tài)可變?yōu)榍蛐沃良忓N形。它具有兩條等長(zhǎng)的鞭毛和一個(gè)杯狀葉綠體，在葉綠體的外緣可積累大量的β-胡蘿卜素小滴，是細(xì)胞呈橙紅色。細(xì)胞無(wú)細(xì)胞壁，具有由糖蛋白形成的包被。鹽生杜氏藻與衣藻(Chlamydomonas)具有較近的親緣關(guān)系。本發(fā)明通過(guò)多年對(duì)鹽生杜氏藻的研究，發(fā)現(xiàn)了鹽生杜氏藻中與耐鹽性有關(guān)的蛋白-UDP-葡萄糖脫氫酶，在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
在本發(fā)明的第一方面，提供新穎的分離出的UDP-葡萄糖脫氫酶多肽，該多肽源自鹽生杜氏藻的，它包含具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQ IDNO2氨基酸序列的多肽。
在本發(fā)明的第二方面，提供編碼分離的這些多肽的多核苷酸，該多核苷酸包含一核苷酸序列，該核苷酸序列與選自下組的一種核苷酸序列有至少70％相同性(a)編碼上述鹽生杜氏藻UDP-葡萄糖脫氫酶多肽的多核苷酸；和(b)與多核苷酸(a)互補(bǔ)的多核苷酸。較佳地，該多核苷酸編碼具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽。更佳地，該多核苷酸的序列是選自下組的一種(a)具有SEQ IDNO1中83-1360位的序列；(b)具有SEQ ID NO1中1-1962位的序列。
在本發(fā)明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的載體，以及被該載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞或者被上述多核苷酸直接轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞。
在本發(fā)明的第四方面，提供了制備具有鹽生杜氏藻UDP-葡萄糖脫氫酶活性的多肽的方法，該方法包含(a)在適合表達(dá)鹽生杜氏藻UDP-葡萄糖脫氫酶的條件下，培養(yǎng)上述被轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出具有鹽生杜氏藻UDP-葡萄糖脫氫酶活性的多肽。
在本發(fā)明的第五方面，提供了與上述的鹽生杜氏藻UDP-葡萄糖脫氫酶多肽特異性結(jié)合的抗體。還提供了可用于檢測(cè)的核酸分子，它含有上述的多核苷酸中連續(xù)的10-1962個(gè)核苷酸。
在本發(fā)明的第六方面，提供了模擬、促進(jìn)、拮抗鹽生杜氏藻UDP-葡萄糖脫氫酶多肽活性的化合物，以及抑制鹽生杜氏藻UDP-葡萄糖脫氫酶多肽的表達(dá)的化合物。還提供了篩選和/或制備這些化合物的方法。
在本發(fā)明的第七方面，提供了檢測(cè)樣品中是否存在UDP-葡萄糖脫氫酶的方法，它包括將樣品與UDP-葡萄糖脫氫酶的特異性抗體接觸，觀(guān)察是否形成抗體復(fù)合物，形成了抗體復(fù)合物就表示樣品中存在UDP-葡萄糖脫氫酶。
在本發(fā)明的第八方面，提供了本發(fā)明多肽和編碼序列的用途。例如本發(fā)明多肽可被用于篩選促進(jìn)鹽生杜氏藻UDP-葡萄糖脫氫酶多肽活性的激動(dòng)劑，或者篩選抑制鹽生杜氏藻UDP-葡萄糖脫氫酶多肽活性的拮抗劑、或者被用于肽指紋圖譜鑒定。本發(fā)明的鹽生杜氏藻UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼序列或其片段，可被作為引物用于PCR擴(kuò)增反應(yīng)，或者作為探針用于雜交反應(yīng)，或者用于制造基因芯片或微陣列。
在本發(fā)明的第九方面，提供了一種改善植物耐鹽性的方法，它包括步驟(1)提供攜帶表達(dá)載體的農(nóng)桿菌，所述的表達(dá)載體含有UDP-葡萄糖脫氫酶多肽DNA編碼序列，所述的UDP-葡萄糖脫氫酶多肽具有SEQ ID NO2氨基酸序列；(2)將植物細(xì)胞或組織或器官與步驟(1)中的農(nóng)桿菌接觸，從而使UDP-葡萄糖脫氫酶多肽DNA編碼序列轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞，并且整合到植物細(xì)胞的染色體上；(3)選擇出轉(zhuǎn)入U(xiǎn)DP-葡萄糖脫氫酶多肽DNA編碼序列的植物細(xì)胞或組織或器官；(4)將步驟(3)中的植物細(xì)胞或組織或器官再生成植株。
本發(fā)明的其它方面由于本文的技術(shù)的公開(kāi)，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。
具體實(shí)施例方式
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“UDP-葡萄糖脫氫酶”、“UDP-葡萄糖脫氫酶多肽”或“耐鹽相關(guān)蛋白UDP-葡萄糖脫氫酶”可互換使用，都指具有鹽生杜氏藻耐鹽相關(guān)蛋白UDP-葡萄糖脫氫酶氨基酸序列(SEQ ID NO2)的蛋白或多肽。它們包括含有或不含起始甲硫氨酸的耐鹽相關(guān)蛋白UDP-葡萄糖脫氫酶。
如本文所用，“分離的”是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(lái)(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細(xì)胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒(méi)有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開(kāi)，則為分離純化的。
如本文所用，“分離的UDP-葡萄糖脫氫酶或多肽”是指UDP-葡萄糖脫氫酶多肽基本上不含天然與其相關(guān)的其它蛋白、脂類(lèi)、糖類(lèi)或其它物質(zhì)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能用標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)純化技術(shù)純化UDP-葡萄糖脫氫酶?；旧霞兊亩嚯脑诜沁€原聚丙烯酰胺凝膠上能產(chǎn)生單一的主帶。
本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優(yōu)選重組多肽。本發(fā)明的多肽可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學(xué)合成的產(chǎn)物，或使用重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如，細(xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲(chóng)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞)中產(chǎn)生。根據(jù)重組生產(chǎn)方案所用的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發(fā)明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。
本發(fā)明還包括鹽生杜氏藻UDP-葡萄糖脫氫酶的片段、衍生物和類(lèi)似物。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“片段”、“衍生物”和“類(lèi)似物”是指基本上保持本發(fā)明的天然鹽生杜氏藻UDP-葡萄糖脫氫酶相同的生物學(xué)功能或活性的多肽。本發(fā)明的多肽片段、衍生物或類(lèi)似物可以是(i)有一個(gè)或多個(gè)保守或非保守性氨基酸殘基(優(yōu)選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基中具有取代基團(tuán)的多肽，或(iii)成熟多肽與另一個(gè)化合物(比如延長(zhǎng)多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導(dǎo)序列或分泌序列或用來(lái)純化此多肽的序列或蛋白原序列，或與抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根據(jù)本文的教導(dǎo)，這些片段、衍生物和類(lèi)似物屬于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的范圍。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“鹽生杜氏藻UDP-葡萄糖脫氫酶多肽”指具有鹽生杜氏藻UDP-葡萄糖脫氫酶活性的SEQ ID NO.2序列的多肽。該術(shù)語(yǔ)還包括具有與鹽生杜氏藻UDP-葡萄糖脫氫酶相同功能的、SEQ ID NO.2序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1-50個(gè)，較佳地1-30個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)(通常為20個(gè)以?xún)?nèi)，較佳地為10個(gè)以?xún)?nèi)，更佳地為5個(gè)以?xún)?nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語(yǔ)還包括鹽生杜氏藻UDP-葡萄糖脫氫酶的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)緊度條件下能與鹽生杜氏藻UDP-葡萄糖脫氫酶DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗鹽生杜氏藻UDP-葡萄糖脫氫酶多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含鹽生杜氏藻UDP-葡萄糖脫氫酶多肽或其片段的融合蛋白(如SEQ ID NO3所示的融合蛋白)。除了幾乎全長(zhǎng)的多肽外，本發(fā)明還包括了鹽生杜氏藻UDP-葡萄糖脫氫酶多肽的可溶性片段。通常，該片段具有鹽生杜氏藻UDP-葡萄糖脫氫酶多肽序列的至少約10個(gè)連續(xù)氨基酸，通常至少約30個(gè)連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個(gè)連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個(gè)連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個(gè)連續(xù)氨基酸。
發(fā)明還提供鹽生杜氏藻UDP-葡萄糖脫氫酶或多肽的類(lèi)似物。這些類(lèi)似物與天然鹽生杜氏藻UDP-葡萄糖脫氫酶多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過(guò)各種技術(shù)得到，如通過(guò)輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過(guò)定點(diǎn)誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類(lèi)似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類(lèi)似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類(lèi)似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級(jí)結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙?；螋然Ｐ揎椷€包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過(guò)將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動(dòng)物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
在本發(fā)明中，“鹽生杜氏藻UDP-葡萄糖脫氫酶保守性變異多肽”指與SEQID N02的氨基酸序列相比，有至多10個(gè)，較佳地至多8個(gè)，更佳地至多5個(gè)，最佳地至多3個(gè)氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進(jìn)行氨基酸替換而產(chǎn)生。
表1

本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區(qū)序列可以與SEQ ID NO1所示的編碼區(qū)序列相同或者是簡(jiǎn)并的變異體。如本文所用，“簡(jiǎn)并的變異體”在本發(fā)明中是指編碼具有SEQ ID NO2的蛋白質(zhì)，但與SEQ ID NO1所示的編碼區(qū)序列有差別的核酸序列。
編碼SEQ ID NO2的成熟多肽的多核苷酸包括只編碼成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。
術(shù)語(yǔ)“編碼多肽的多核苷酸”可以是包括編碼此多肽的多核苷酸，也可以是還包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發(fā)明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發(fā)明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、類(lèi)似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或非天然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領(lǐng)域所知的，等位變異體是一個(gè)多核苷酸的替換形式，它可能是一個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代、缺失或插入，但不會(huì)從實(shí)質(zhì)上改變其編碼的多肽的功能。
本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交且兩個(gè)序列之間具有至少50％，較佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本發(fā)明特別涉及在嚴(yán)格條件下與本發(fā)明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發(fā)明中，“嚴(yán)格條件”是指(1)在較低離子強(qiáng)度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)雜交時(shí)加有變性劑，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在90％以上，更好是95％以上時(shí)才發(fā)生雜交。并且，可雜交的多核苷酸編碼的多肽與SEQ ID NO2所示的成熟多肽有相同的生物學(xué)功能和活性。
本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的長(zhǎng)度至少含15個(gè)核苷酸，較好是至少30個(gè)核苷酸，更好是至少50個(gè)核苷酸，最好是至少100個(gè)核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的擴(kuò)增技術(shù)(如PCR)以確定和/或分離編碼UDP-葡萄糖脫氫酶的多聚核苷酸。
本發(fā)明中的多肽和多核苷酸優(yōu)選以分離的形式提供，更佳地被純化至均質(zhì)。
本發(fā)明的鹽生杜氏藻UDP-葡萄糖脫氫酶核苷酸全長(zhǎng)序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對(duì)于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開(kāi)的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開(kāi)放閱讀框序列來(lái)設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫(kù)或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫(kù)作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長(zhǎng)時(shí)，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來(lái)大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過(guò)常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
此外，還可用人工合成的方法來(lái)合成有關(guān)序列，尤其是片段長(zhǎng)度較短時(shí)。通常，通過(guò)先合成多個(gè)小片段，然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長(zhǎng)的片段。
目前，已經(jīng)可以完全通過(guò)化學(xué)合成來(lái)得到編碼本發(fā)明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領(lǐng)域中已知的各種現(xiàn)有的DNA分子(或如載體)和細(xì)胞中。此外，還可通過(guò)化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。
本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的載體，以及用本發(fā)明的載體或UDP-葡萄糖脫氫酶編碼序列經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細(xì)胞，以及經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明所述多肽的方法。
通過(guò)常規(guī)的重組DNA技術(shù)(Science，1984；2241431)，可利用本發(fā)明的多聚核苷酸序列可用來(lái)表達(dá)或生產(chǎn)重組的UDP-葡萄糖脫氫酶多肽。一般來(lái)說(shuō)有以下步驟(1).用本發(fā)明的編碼鹽生杜氏藻UDP-葡萄糖脫氫酶多肽的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)合適的宿主細(xì)胞；(2).在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的宿主細(xì)胞；(3).從培養(yǎng)基或細(xì)胞中分離、純化蛋白質(zhì)。
本發(fā)明中，鹽生杜氏藻UDP-葡萄糖脫氫酶多核苷酸序列可插入到重組表達(dá)載體中。術(shù)語(yǔ)“重組表達(dá)載體”指本領(lǐng)域熟知的細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細(xì)胞病毒、哺乳動(dòng)物細(xì)胞病毒或其他載體?？傊?，只要能在宿主體內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以用。表達(dá)載體的一個(gè)重要特征是通常含有復(fù)制起點(diǎn)、啟動(dòng)子、標(biāo)記基因和翻譯控制元件。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含鹽生杜氏藻UDP-葡萄糖脫氫酶編碼DNA序列和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號(hào)的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等。所述的DNA序列可有效連接到表達(dá)載體中的適當(dāng)啟動(dòng)子上，以指導(dǎo)mRNA合成。表達(dá)載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子。
此外，表達(dá)載體優(yōu)選地包含一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表型性狀，如真核細(xì)胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)，或用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。
包含上述的適當(dāng)DNA序列以及適當(dāng)啟動(dòng)子或者控制序列的載體，可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以使其能夠表達(dá)蛋白質(zhì)。
宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高等真核細(xì)胞，如植物細(xì)胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬、農(nóng)桿菌；真菌細(xì)胞如酵母；植物細(xì)胞；昆蟲(chóng)細(xì)胞等。
本發(fā)明的多核苷酸在高等真核細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，如果在載體中插入增強(qiáng)子序列時(shí)將會(huì)使轉(zhuǎn)錄得到增強(qiáng)。增強(qiáng)子是DNA的順式作用因子，通常大約有10到300個(gè)堿基對(duì)，作用于啟動(dòng)子以增強(qiáng)基因的轉(zhuǎn)錄。
本領(lǐng)域一般技術(shù)人員都清楚如何選擇適當(dāng)?shù)妮d體、啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和宿主細(xì)胞。
用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。當(dāng)宿主為原核生物如大腸桿菌時(shí)，能吸收DNA的感受態(tài)細(xì)胞可在指數(shù)生長(zhǎng)期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機(jī)械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。轉(zhuǎn)化植物也可使用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化或基因槍轉(zhuǎn)化等方法，例如葉盤(pán)法。對(duì)于轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞、組織或器官可以用常規(guī)方法再生成植株，從而獲得耐鹽性提高的植物。
獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達(dá)本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據(jù)所用的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細(xì)胞生長(zhǎng)的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)宿主細(xì)胞生長(zhǎng)到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后，用合適的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)選擇的啟動(dòng)子，將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時(shí)間。
在上面的方法中的重組多肽可在細(xì)胞內(nèi)、或在細(xì)胞膜上表達(dá)、或分泌到細(xì)胞外。如果需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過(guò)各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規(guī)的復(fù)性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過(guò)濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)合。
重組的鹽生杜氏藻UDP-葡萄糖脫氫酶或多肽有多方面的用途。例如用于篩選促進(jìn)或?qū)筓DP-葡萄糖脫氫酶功能的抗體、多肽或其它配體。用表達(dá)的重組鹽生杜氏藻UDP-葡萄糖脫氫酶篩選多肽庫(kù)可用于尋找有價(jià)值的能抑制或刺激鹽生杜氏藻UDP-葡萄糖脫氫酶功能的多肽分子。
另一方面，本發(fā)明還包括對(duì)鹽生杜氏藻UDP-葡萄糖脫氫酶DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。較佳地，指那些能與鹽生杜氏藻UDP-葡萄糖脫氫酶基因產(chǎn)物或片段結(jié)合但不識(shí)別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結(jié)合并抑制鹽生杜氏藻UDP-葡萄糖脫氫酶的分子，也包括那些并不影響鹽生杜氏藻UDP-葡萄糖脫氫酶功能的抗體。本發(fā)明還包括那些能與修飾或未經(jīng)修飾形式的鹽生杜氏藻UDP-葡萄糖脫氫酶基因產(chǎn)物結(jié)合的抗體。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段、或嵌合抗體。
本發(fā)明的抗體可以通過(guò)本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。例如，純化的鹽生杜氏藻UDP-葡萄糖脫氫酶基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動(dòng)物以誘導(dǎo)多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的，表達(dá)鹽生杜氏藻UDP-葡萄糖脫氫酶或其具有抗原性的片段的細(xì)胞可用來(lái)免疫動(dòng)物來(lái)生產(chǎn)抗體。此類(lèi)單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來(lái)制備。本發(fā)明的各類(lèi)抗體可以利用鹽生杜氏藻UDP-葡萄糖脫氫酶基因產(chǎn)物的片段或功能區(qū)，通過(guò)常規(guī)免疫技術(shù)獲得。這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與鹽生杜氏藻UDP-葡萄糖脫氫酶基因產(chǎn)物的未修飾形式結(jié)合的抗體可以用原核細(xì)胞(例如E.Coli)中生產(chǎn)的基因產(chǎn)物來(lái)免疫動(dòng)物而產(chǎn)生；與翻譯后修飾形式結(jié)合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細(xì)胞(例如酵母或昆蟲(chóng)細(xì)胞)中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來(lái)免疫動(dòng)物而獲得。
抗鹽生杜氏藻UDP-葡萄糖脫氫酶的抗體可用于檢測(cè)樣品中的鹽生杜氏藻UDP-葡萄糖脫氫酶。例如通過(guò)定量檢測(cè)鹽生杜氏藻UDP-葡萄糖脫氫酶，并利用UDP-葡萄糖脫氫酶與鹽濃度的相關(guān)性，可以確定鹽生杜氏藻生產(chǎn)環(huán)境中鹽濃度。
多克隆抗體的生產(chǎn)可用鹽生杜氏藻UDP-葡萄糖脫氫酶或多肽免疫動(dòng)物，如家兔，小鼠，大鼠等。多種佐劑可用于增強(qiáng)免疫反應(yīng)，包括但不限于弗氏佐劑等。
本發(fā)明還涉及定量和定位檢測(cè)鹽生杜氏藻UDP-葡萄糖脫氫酶水平的測(cè)試方法。這些試驗(yàn)是本領(lǐng)域所熟知的，且包括FISH測(cè)定和放射免疫測(cè)定。試驗(yàn)中所檢測(cè)的鹽生杜氏藻UDP-葡萄糖脫氫酶水平，可用于解釋鹽生杜氏藻UDP-葡萄糖脫氫酶在耐鹽性方面重要性。
一種檢測(cè)檢測(cè)樣品中是否存在UDP-葡萄糖脫氫酶的方法是利用UDP-葡萄糖脫氫酶的特異性抗體進(jìn)行檢測(cè)，它包括將樣品與UDP-葡萄糖脫氫酶特異性抗體接觸；觀(guān)察是否形成抗體復(fù)合物，形成了抗體復(fù)合物就表示樣品中存在UDP-葡萄糖脫氫酶。
本發(fā)明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列(microarray)或DNA芯片(又稱(chēng)為“基因芯片”)上，用于分析組織中基因的差異表達(dá)分析。用UDP-葡萄糖脫氫酶特異的引物進(jìn)行RNA-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)體外擴(kuò)增也可檢測(cè)UDP-葡萄糖脫氫酶的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)例中，提供了一種分離的多核苷酸，它編碼具有SEQ IDNO2所示氨基酸序列的多肽。本發(fā)明的多核苷酸是從鹽生杜氏藻cDNA文庫(kù)中分離出的。其序列如SEQ ID N01所示，它包含的多核苷酸序列全長(zhǎng)為1962個(gè)堿基，其開(kāi)放讀框位于83-1360位，編碼全長(zhǎng)為425個(gè)氨基酸的鹽生杜氏藻UDP-葡萄糖脫氫酶(SEQ ID NO2)。UDP-葡萄糖脫氫酶為改善植物的耐鹽性提供了新的途徑，因而具有巨大的應(yīng)用前景。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠(chǎng)商所建議的條件。
實(shí)施例1鹽生杜氏藻UDP-葡萄糖脫氫酶基因的克隆1.鹽生杜氏藻的采集(Collection)鹽生杜氏藻(Dunaliella salina)購(gòu)自武漢水生生物研究所藻種庫(kù)。
2.Poly A+RNA的分離(Poly A+RNA isolation)用Trizol試劑(Gibco，NY，USA)提取鹽生杜氏藻的總RNA。用甲醛變性膠電泳鑒定總RNA質(zhì)量。使用Oligotex mRNA Kits(Qiagen)提供的試劑盒操作說(shuō)明書(shū)抽取鹽生杜氏藻的mRNA。
3.鹽生杜氏藻cDNA文庫(kù)的構(gòu)建(Cloning of Full-length cDNA)使用Smart cDNA Library Construction Kit(ClonTech)提供的試劑盒說(shuō)明書(shū)，以λTriplEX2為載體，構(gòu)建鹽生杜氏藻的cDNA噬菌體文庫(kù)。
4.基因的全長(zhǎng)克隆(Cloning of Full-length cDNA)根據(jù)鹽生杜氏藻及衣藻等UDP-葡萄糖脫氫酶氨基酸保守序列，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，利用同源性基因克隆原理，采用RACE方法(Gibco試劑盒，NY，USA)進(jìn)行cDNA全長(zhǎng)克隆，分三個(gè)階段進(jìn)行(1)使用簡(jiǎn)并引物，以Poly A+RNA為模板，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增以寡核苷酸GACACTTCTGGTGCTTTCGGT(SEQ ID NO3)為正向引物；寡核苷酸GACCTCGCCGGAGGAGGACAC(SEQ ID NO4)為反向引物，以PolyA+RNA為模板，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為94℃5分鐘，隨后94℃30秒、55℃30秒、72℃1分鐘進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后以72℃延伸5分鐘。電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，獲得片段的長(zhǎng)度為0.44kb，回收，連接到T-Easy載體上，用SP6或T7作為通用引物，采用終止物熒光標(biāo)記(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在A(yíng)BI 377測(cè)序儀(Perkin-Elmer，USA)上進(jìn)行測(cè)序，測(cè)得序列為443bp。將該序列及其編碼蛋白質(zhì)用BLAST程序在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundantGenBank CDS translations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行核苷酸和蛋白質(zhì)同源性檢索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它與衣藻的UDP-葡萄糖脫氫酶存在較高的同源性。證實(shí)了簡(jiǎn)并引物設(shè)計(jì)正確。
(2).RACE根據(jù)以上序列分別設(shè)計(jì)5′RACE引物GTGGAGCATTTGGGGACTCGTCTGG(SEQ ID NO5)；3′RACE引物CCCGTGGTCTTTGTGGGCGTATTCA(SEQ ID NO6)，使用Smart RACE cDNAAmplification Kit(Clontech)，按操作手冊(cè)操作，得到鹽生杜氏藻UDP-葡萄糖脫氫酶基因的5′及3′端序列。
(3).PCR擴(kuò)增得到UDP-葡萄糖脫氫酶基因編碼區(qū)(過(guò)程同(1))。
在拼接得到全長(zhǎng)(至少包含完整的開(kāi)放讀框)(如SEQ ID NO1所示)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步設(shè)計(jì)引物GACACAAGTGGAGCATTTGG(SEQ ID NO7)為正向引物，寡核苷酸TTCTGCAGGAAGGGATCCAG(SEQ ID NO8)為反向引物，以總RNA為模板，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。然后按常規(guī)方法以PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行克隆、測(cè)序。結(jié)果驗(yàn)證了鹽生杜氏藻UDP-葡萄糖脫氫酶蛋白的全長(zhǎng)編碼序列的正確性。
鹽生杜氏藻UDP-葡萄糖脫氫酶基因的全長(zhǎng)序列如SEQ ID NO1所示，其中其中讀框位置是83bp-1360bp。
1 ggggcattta ttattttagt aatctcagac acaagtggag catttgggga ctcgtctggc61 tttccccccc taaattaaca caatggccac cccccccgtg aagaaaattg cctgcattgg121 tgctggctat gtgggtggtc ctaccatggc cgtgattgcg ctgaacagtc cggacattga181 ggtcgtggtg gtggacatca acgaggagcg catcaaggcg tggaacagcg agacactgcc241 catctatgag cctgggctgg acgaggtcgt caaggcagcg aggggtcgca atctgttctt301 cagcaccgac accaagaagc acgtcgggga ggcagacatt gtgtttgtga gtgtgaatac361 gcccacaaag accacgggca tcggcgcagg gaaagctgca gatttgacat actgggaggg421 ggccgcccgc ctcattgcct ccgtgtccac ctccagcaag atcgttgtgg agaagtccac481 agtccctgtg aagacggcag aggccatcgg caaggtcctc aagcgcaact gctccgaccc541 gtctgtcaac tttgagatcc tgtccaaccc ggagttcctg gccgagggca ctgccatcga601 ggacctgcag aagcctgacc gggtgttgat tggtggtgtg gacacgccca gcggccaggc661 tgctgtggct gccctcaagt gggtgtacaa ccactggatc cccgttgagc gcatcctgac721 cgccaacctg tggtccgctg agctggccaa gctcacggcc aatgccttcc tagcacagcg781 catctcctcc atcaactcca tcagcgccct ttgcgaggcc tccggtgcca acgtgcagca841 ggtagcgcac gccattggca ctgacacccg catcggcaac aagttcctgt ctgccagcgt901 cggctttggc ggctcctgct tccaaaagga cattctcaac ctgtgctacg tgtgcgagac961 gctgggcctg agggaggtgg ccgactactg gcatgccgtg gtgaccatga acgactacca1021 gaagcagagg ttcgtggagc gcgtgattgg ctccatgttc aacaccgtgt ccaacaagaa1081 gattgccatc tttggctttg ccttcaagaa ggacacaggg gacacccgcg agacgcctgc1141 catcgacgtg tgcaagggcc ttgtgcgaga caatgccaag gttgctgtgt acgaccccaa1201 ggtcacctcg gagcagatat tccgggacat gtccaccccc aagtttgagt gggaccgccc1261 tgactactcc cgtagccaca cggctgctgg acaacgtcca ggtgtgcgcc acccccgagt1321 ctgctgcaga gggtgcgcat gccatctgcg tcctgactga gtgggactgc ttcaagcact1381 acgactatgc cgccatttat gagaagatga ccaaacccgc cttcatcttt gacggccgca1441 acgtgctaga ccatgacaag ctgcgcgaga tcggcttcat cacatacgcg ctgggcaagc1501 ccctggatcc cttcctgcag aaggtctact gagctccccg ggcttgcctc aaggcctgga1561 gggctgctgg cagatttatt ttgcctaact ttcatactgc ctcaggttta ctggacacct1621 aggcttgcca aaggcctgga gggctgcctg aaactctgct tgccgacttt gcccaaagcg1681 ggattagctg aatgataaac gtagattgtg tgccgtggca tgccacgccg ttgcgttttg1741 ggaggggaga aaataataat aactcgtttt gcgtgcttgc ctttaatgta agggaggctt1801 tcagagggat gaacttgagg gggggcggct gttgtttgtt ttgtttgttt gtgctgtatt1861 ctctcttcat tcagaataat cttccatctc atgtaagaca acatgaacta aaaaaaaaaa1921 aaaaaaaaaa aaaaaaaaac atgtcggccg cctcggccta tg (SEQ ID NO1)鹽生杜氏藻UDP-葡萄糖脫氫酶基因編碼一個(gè)由425個(gè)氨基酸構(gòu)成UDP-葡萄糖脫氫酶，其序列如SEQ ID NO2所示。
1 MATPPVKKIA CIGAGYVGGP TMAVIALNSP DIEVVVVDIN EERIKAWNSE TLPIYEPGLD61 EVVKAARGRN LFFSTDTKKH VGEADIVFVS VNTPTKTTGI GAGKAADLTY WEGAARLIAS121 VSTSSKIVVE KSTVPVKTAE AIGKVLKRNC SDPSVNFEIL SNPEFLAEGT AIEDLQKPDR181 VLIGGVDTPS GQAAVAALKW VYNHWIPVER ILTANLWSAE LAKLTANAFL AQRISSINSI241 SALCEASGAN VQQVAHAIGT DTRIGNKFLS ASVGFGGSCF QKDILNLCYV CETLGLREVA301 DYWHAVVTMN DYQKQRFVER VIGSMFNTVS NKKIAIFGFA FKKDTGDTRE TPAIDVCKGL361 VRDNAKVAVY DPKVTSEQIF RDMSTPKFEW DRPDYSRSHT AAGQRPGVRH PRVCCRGCAC421 HLRPD (SEQ ID NO2)實(shí)施例2鹽生杜氏藻UDP-葡萄糖脫氫酶蛋白的結(jié)構(gòu)和功能將鹽生杜氏藻UDP-葡萄糖脫氫酶全長(zhǎng)序列及其編碼蛋白質(zhì)用BLAST程序在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDStranslations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行核苷酸和蛋白質(zhì)同源性檢索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它與大豆(G/ycine max)的UDP-葡萄糖脫氫酶mRNA全編碼序列(GenBank Accession No.U53418)有89％的相同性，在氨基酸水平上，它與大青豆(G/ycine max)的UDP-葡萄糖脫氫酶蛋白(GenPept Accession No.P31683)有70％的相同性和80％的相似性。
將鹽生杜氏藻UDP-葡萄糖脫氫酶蛋白的氨基酸在blocks數(shù)據(jù)庫(kù)(http//www.blocks.fhcrc.org)中檢索結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)在氨基酸序列中存在UDP-葡萄糖脫氫酶蛋白的以下結(jié)構(gòu)域區(qū)IPB001732A 08-20aaIPB001732B 034-61aaIPB001732C 084-94aaIPB001732D 0127-137aaIPB001732E 0159-184aaIPB001732F 0211-265aaIPB001732G 0274-283aaIPB001732H 0332-372aa在該氨基酸序列中存在UDP-葡萄糖脫氫酶蛋白功能模塊，因此可預(yù)見(jiàn)其具有UDP-葡萄糖脫氫酶蛋白的相應(yīng)功能。
實(shí)施例3鹽生杜氏藻cDNA文庫(kù)大規(guī)模測(cè)序和表達(dá)譜芯片的構(gòu)建(High ThroughputSequencing of cDNA Library and Construction of Expression Microarray)對(duì)所得的鹽生杜氏藻cDNA文庫(kù)中的克隆進(jìn)行序列測(cè)定，用所測(cè)得的靶序列構(gòu)建表達(dá)譜芯片。將測(cè)序所得的克隆子溶解于3×SSC溶液中，使用Cartesian公司的Cartesian 7500點(diǎn)樣儀及TeleChem公司的硅烷化玻片，按公司提供的使用說(shuō)明書(shū)操作。點(diǎn)樣后玻片經(jīng)水合、干燥、UV交連，再分別用SDS、水處理10分鐘，晾干備用。
實(shí)施例4鹽生杜氏藻表達(dá)譜芯片的篩選(Screening of the Expression Microarry)使用0.5mol/l、1.5mol/l、4.5mol/l濃度的NaCl溶液分別處理鹽生杜氏藻2小時(shí)后，提取不同鹽濃度處理后的鹽生杜氏藻mRNA，分別用Cy3-dUTP和Cy5-dUTP標(biāo)記，與表達(dá)譜芯片雜交，用General Scanning公司的ScanArray 3000掃描芯片，用Axon公司的Genepix3.01軟件分析熒光信號(hào)強(qiáng)度。
表達(dá)譜芯片雜交結(jié)果顯示，有若干基因的表達(dá)量與鹽生杜氏藻的生長(zhǎng)鹽濃度呈高度相關(guān)。其中，UDP-葡萄糖脫氫酶基因?yàn)槠渲幸粭l。其具體數(shù)據(jù)為其具體數(shù)據(jù)分為三組第一組為cy5(4M)、cy3(1.5M)標(biāo)記的；第二組為cy5(4M)、cy3(0.5M)標(biāo)記的；第三組為cy5(1.5M)、cy3(0.5M)標(biāo)記的。三組標(biāo)記熒光信號(hào)強(qiáng)度的自然對(duì)數(shù)ln(cy5/cy3)的平均值為0.347，這說(shuō)明隨著鹽濃度的變化，該基因的表達(dá)差異在3倍左右。
綜上所述，UDP-葡萄糖脫氫酶為一未見(jiàn)報(bào)道的新型耐鹽相關(guān)蛋白。
實(shí)施例5鹽生杜氏藻UDP-葡萄糖脫氫酶基因表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)鹽生杜氏藻UDP-葡萄糖脫氫酶基因的全長(zhǎng)編碼序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增出完整編碼閱讀框的引物，并在正反引物上分別引入限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)(這視選用的載體而定)，從而構(gòu)建表達(dá)載體。經(jīng)PCR擴(kuò)增后，將鹽生杜氏藻UDP-葡萄糖脫氫酶基因cDNA克隆至中間載體(pBluescript)，進(jìn)一步克隆到雙元表達(dá)載體(pBI 121)，在保證閱讀框的前提下鑒定好的表達(dá)載體，在將其轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中，用于轉(zhuǎn)化模式植物煙草。
實(shí)施例6利用葉盤(pán)法轉(zhuǎn)化煙草按如下步驟轉(zhuǎn)化煙草(1)用無(wú)菌牙簽挑取YEB選擇平板上的實(shí)施例5中制備的陽(yáng)性克隆，接種于2M LYEB液體(Sm+，Kan+)，28℃，200rpm振蕩培養(yǎng)24-36小時(shí)；(2)室溫下4，000g離心10分鐘；(3)棄上清，菌體用1/2MS液體培養(yǎng)基懸浮，稀釋到原體積的5-20倍，使菌液的OD600在0.5左右；(4)取生長(zhǎng)兩周左右的煙草的無(wú)菌葉片，去掉其主葉脈，將其剪成約1cm2見(jiàn)方的小葉片；(5)將葉片放入制備好的菌液中，浸泡2-5分鐘，在無(wú)菌濾紙上吸干菌液；(6)把經(jīng)侵染的葉片放于MS培養(yǎng)基上，28℃暗培養(yǎng)48小時(shí)；(7)將葉片轉(zhuǎn)到愈傷培養(yǎng)基(MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L+Kan 50mg/L+羧卞青霉素250mg/L)上，25-28℃光照下培養(yǎng)，7-15天可見(jiàn)愈傷組織的形成；(8)約20天后可見(jiàn)分化芽長(zhǎng)出，帶芽長(zhǎng)大后，切下，置于生根培養(yǎng)基(1/2MS+NAA 0.5mg/L+Kan 25mg/L)上進(jìn)行生根培養(yǎng)，2-7天左右生根；待根系發(fā)達(dá)后，將植株取出，用無(wú)菌水洗凈附著的固體培養(yǎng)基，移入土壤中，剛開(kāi)始用玻璃罩罩幾天，待植株健壯后再取下玻璃罩，溫室中培養(yǎng)。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。
序列表<110>四川川大光耀生物工程有限公司<120>鹽生杜氏藻UDP-葡萄糖脫氫酶及其編碼序列<130>015470<160>8<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>1962<212>DNA<213>Dunaliella salina<220><221>CDS<222>(83)..(1360)<400>1ggggcattta ttattttagt aatctcagac acaagtggag catttgggga ctcgtctggc 60tttccccccc taaattaaca ca atg gcc acc ccc ccc gtg aag aaa att gcc 112Met Ala Thr Pro Pro Val Lys Lys Ile Ala15 10tgc att ggt gct ggc tat gtg ggt ggt cct acc atg gcc gtg att gcg160Cys Ile Gly Ala Gly Tyr Val Gly Gly Pro Thr Met Ala Val Ile Ala15 20 25ctg aac agt ccg gac att gag gtc gtg gtg gtg gac atc aac gag gag208Leu Asn Set Pro Asp Ile Glu Val Val Val Val Asp Ile Asn Glu Glu30 35 40cgc atc aag gcg tgg aac agc gag aca ctg ccc atc tat gag cct ggg256Arg Ile Lys Ala Trp Asn Ser Glu Thr Leu Pro Ile Tyr Glu Pro Gly45 50 55ctg gac gag gtc gtc aag gca gcg agg ggt cgc aat ctg ttc ttc agc304Leu Asp Glu Val Val Lys Ala Ala Arg Gly Arg Asn Leu Phe Phe Ser60 65 70acc gac acc aag aag cac gtc ggg gag gca gac att gtg ttt gtg agt352Thr Asp Thr Lys Lys His Val Gly Glu Ala Asp Ile Val Phe Val Ser75 80 85 90gtg aat acg ccc aca aag acc acg ggc atc ggc gca ggg aaa gct gca400Val Asn Thr Pro Thr Lys Thr Thr Gly Ile Gly Ala Gly Lys Ala Ala95 100 105gat ttg aca tac tgg gag ggg gcc gcc cgc ctc att gcc tcc gtg tcc448Asp Leu Thr Tyr Trp Glu Gly Ala Ala Arg Leu Ile Ala Ser Val Ser110 115 120acc tcc agc aag atc gtt gtg gag aag tcc aca gtc cct gtg aag acg496Thr Ser Ser Lys Ile Val Val Glu Lys Ser Thr Val Pro Val Lys Thr125 130 135gca gag gcc atc ggc aag gtc ctc aag cgc aac tgc tcc gac ccg tct544Ala Glu Ala Ile Gly Lys Val Leu Lys Arg Asn Cys Ser Asp Pro Ser140 145150gtc aac ttt gag atc ctg tcc aac ccg gag ttc ctg gcc gag ggc act592Val Asn Phe Glu Ile Leu Ser Asn Pro Glu Phe Leu Ala Glu Gly Thr155 160 165 170gcc atc gag gac ctg cag aag cct gac cgg gtg ttg att ggt ggt gtg640Ala Ile Glu Asp Leu Gln Lys Pro Asp Arg Val Leu Ile Gly Gly Val175 180 185gac acg ccc agc ggc cag gct gct gtg gct gcc ctc aag tgg gtg tac688Asp Thr Pro Ser Gly Gln Ala Ala Val Ala Ala Leu Lys Trp Val Tyr190 195 200aac cac tgg atc ccc gtt gag cgc atc ctg acc gcc aac ctg tgg tcc736Asn His Trp Ile Pro Val Glu Arg Ile Leu Thr Ala Asn Leu Trp Ser205 210 215gct gag ctg gcc aag ctc acg gcc aat gcc ttc cta gca cag cgc atc784Ala Glu Leu Ala Lys Leu Thr Ala Asn Ala Phe Leu Ala Gln Arg Ile220 225 230tcc tcc atc aac tcc atc agc gcc ctt tgc gag gcc tcc ggt gcc aac832Ser Ser Ile Asn Ser Ile Ser Ala Leu Cys Glu Ala Ser Gly Ala Asn235 240 245 250gtg cag cag gta gcg cac gcc att ggc act gac acc cgc atc ggc aac880Val Gln Gln Val Ala His Ala Ile Gly Thr Asp Thr Arg Ile Gly Asn255 260265aag ttc ctg tct gcc agc gtc ggc ttt ggc ggc tcc tgc ttc caa aag928Lys Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly Phe Gly Gly Ser Cys Phe Gln Lys270 275 280gac att ctc aac ctg tgc tac gtg tgc gag acg ctg ggc ctg agg gag976Asp Ile Leu Asn Leu Cys Tyr Val Cys Glu Thr Leu Gly Leu Arg Glu285 290 295gtg gcc gac tac tgg cat gcc gtg gtg acc atg aac gac tac cag aag1024Val Ala Asp Tyr Trp His Ala Val Val Thr Met Asn Asp Tyr Gln Lys
300 305 310cag agg ttc gtg gag cgc gtg att ggc tcc atg ttc aac acc gtg tcc1072Gln Arg Phe Val Glu Arg Val Ile Gly Ser Met Phe Asn Thr Val Ser315 320 325 330aac aag aag att gcc atc ttt ggc ttt gcc ttc aag aag gac aca ggg1120Asn Lys Lys Ile Ala Ile Phe Gly Phe Ala Phe Lys Lys Asp Thr Gly335 340 345gac acc cgc gag acg cct gcc atc gac gtg tgc aag ggc ctt gtg cga1168Asp Thr Arg Glu Thr Pro Ala Ile Asp Val Cys Lys Gly Leu Val Arg350 355 360gac aat gcc aag gtt gct gtg tac gac ccc aag gtc acc tcg gag cag1216Asp Asn Ala Lys Val Ala Val Tyr Asp Pro Lys Val Thr Ser Glu Gln365 370 375ata ttc cgg gac atg tcc acc ccc aag ttt gag tgg gac cgc cct gac1264Ile Phe Arg Asp Met Ser Thr Pro Lys Phe Glu Trp Asp Arg Pro Asp380 385 390tac tcc cgt agc cac acg gct gct gga caa cgt cca ggt gtg cgc cac1312Tyr Ser Arg Ser His Thr Ala Ala Gly Gln Arg Pro Gly Val Arg His395 400 405 410ccc cga gtc tgc tgc aga ggg tgc gca tgc cat ctg cgt cct gac tga1360Pro Arg Val Cys Cys Arg Gly Cys Ala Cys His Leu Arg Pro Asp415 420425gtgggactgc ttcaagcact acgactatgc cgccatttat gagaagatga ccaaacccgc 1420cttcatcttt gacggccgca acgtgctaga ccatgacaag ctgcgcgaga tcggcttcat 1480cacatacgcg ctgggcaagc ccctggatcc cttcctgcag aaggtctact gagctccccg 1540ggcttgcctc aaggcctgga gggctgctgg cagatttatt ttgcctaact ttcatactgc 1600ctcaggttta ctggacacct aggcttgcca aaggcctgga gggctgcctg aaactctgct 1660tgccgacttt gcccaaagcg ggattagctg aatgataaac gtagattgtg tgccgtggca 1720tgccacgccg ttgcgttttg ggaggggaga aaataataat aactcgtttt gcgtgcttgc 1780ctttaatgta agggaggctt tcagagggat gaacttgagg gggggcggct gttgtttgtt 1840ttgtttgttt gtgctgtatt ctctcttcat tcagaataat cttccatctc atgtaagaca 1900acatgaacta aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaac atgtcggccg cctcggccta 1960tg 1962<210>2<211>425<212>PRT<213>Dunaliella salina<400>2Met Ala Thr Pro Pro Val Lys Lys Ile Ala Cys Ile Gly Ala Gly Tyr1 5 10 15Val Gly Gly Pro Thr Met Ala Val Ile Ala Leu Asn Ser Pro Asp Ile20 25 30Glu Val Val Val Val Asp Ile Asn Glu Glu Arg Ile Lys Ala Trp Asn35 40 45Ser Glu Thr Leu Pro Ile Tyr Glu Pro Gly Leu Asp Glu Val Val Lys50 55 60Ala Ala Arg Gly Arg Asn Leu Phe Phe Ser Thr Asp Thr Lys Lys His65 70 75 80Val Gly Glu Ala Asp Ile Val Phe Val Ser Val Asn Thr Pro Thr Lys85 90 95Thr Thr Gly Ile Gly Ala Gly Lys Ala Ala Asp Leu Thr Tyr Trp Glu100 105 I10Gly Ala Ala Arg Leu Ile Ala Ser Val Ser Thr Ser Ser Lys Ile Val115 120 125Val Glu Lys Ser Thr Val Pro Val Lys Thr Ala Glu Ala Ile Gly Lys130 135 140Val Leu Lys Arg Asn Cys Ser Asp Pro Ser Val Asn Phe Glu Ile Leu145 150 155 160Ser Asn Pro Glu Phe Leu Ala Glu Gly Thr Ala Ile Glu Asp Leu Gln165 170 175Lys Pro Asp Arg Val Leu Ile Gly Gly Val Asp Thr Pro Ser Gly Gln180 185 190Ala Ala Val Ala Ala Leu Lys Trp Val Tyr Asn His Trp Ile Pro Val195 200 205Glu Arg Ile Leu Thr Ala Asn Leu Trp Ser Ala Glu Leu Ala Lys Leu210 215 220Thr Ala Asn Ala Phe Leu Ala Gln Arg Ile Ser Ser Ile Asn Ser Ile225 230 235 240Ser Ala Leu Cys Glu Ala Ser Gly Ala Asn Val Gln Gln Val Ala His245 250 255Ala Ile Gly Thr Asp Thr Arg Ile Gly Asn Lys Phe Leu Ser Ala Ser260 265 270Val Gly Phe Gly Gly Ser Cys Phe Gln Lys Asp Ile Leu Asn Leu Cys275 280 285Tyr Val Cys Glu Thr Leu Gly Leu Arg Glu Val Ala Asp Tyr Trp His290 295 300Ala Val Val Thr Met Asn Asp Tyr Gln Lys Gln Arg Phe Val Glu Arg305 310 315 320Val Ile Gly Ser Met Phe Asn Thr Val Ser Asn Lys Lys Ile Ala Ile325 330 335Phe Gly Phe Ala Phe Lys Lys Asp Thr Gly Asp Thr Arg Glu Thr Pro340 345 350Ala Ile Asp Val Cys Lys Gly Leu Val Arg Asp Asn Ala Lys Val Ala355 360 365Val Tyr Asp Pro Lys Val Thr Ser Glu Gln Ile Phe Arg Asp Met Ser370 375 380Thr Pro Lys Phe Glu Trp Asp Arg Pro Asp Tyr Ser Arg Ser His Thr385 390 395 400Ala Ala Gly Gln Arg Pro Gly Val Arg His Pro Arg Val Cys Cys Arg405 410 415Gly Cys Ala Cys His Leu Arg Pro Asp420 425<210>3<211>21<212>DNA<213>引物<400>3gacacttctg gtgctttcgg t 21<210>4<211>21<212>DNA<213>引物<400>4gacctcgccg gaggaggaca c 21<210>5<211>25<212>DNA<213>引物<400>5gtggagcatt tggggactcg tctgg 25<210>6<211>25<212>DNA<213>引物<400>6cccgtggtct ttgtgggcgt attca 25<210>7<211>20<212>DNA<213>引物<400>7gacacaagtg gagcatttgg20<210>8<211>20<212>DNA<213>引物<400>8ttctgcagga agggatccag20
權(quán)利要求
1.一種分離的鹽生杜氏藻UDP-葡萄糖脫氫酶多肽，其特征在于，它包含具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
2.如權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于，該多肽是具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽。
3.一種分離的多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，該核苷酸序列與選自下組的一種核苷酸序列有至少70％相同性(a)編碼如權(quán)利要求1和2所述多肽的多核苷酸；(b)與多核苷酸(a)互補(bǔ)的多核苷酸。
4.如權(quán)利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸編碼具有SEQ IDNO2所示氨基酸序列的多肽。
5.如權(quán)利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸的序列選自下組的一種(a)具有SEQ ID NO1中83-1360位的序列；(b)具有SEQ ID NO1中1-1962位的序列。
6.一種載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求3所述的多核苷酸。
7.一種遺傳工程化的宿主細(xì)胞，其特征在于，它含有權(quán)利要求6所述的載體。
8.一種具有鹽生杜氏藻UDP-葡萄糖脫氫酶活性的多肽的制備方法，其特征在于，該方法包含(a)在適合表達(dá)鹽生杜氏藻UDP-葡萄糖脫氫酶的條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出具有鹽生杜氏藻UDP-葡萄糖脫氫酶活性的多肽。
9.一種能與權(quán)利要求1所述的鹽生杜氏藻UDP-葡萄糖脫氫酶特異性結(jié)合的抗體。
10.一種改善植物耐鹽性的方法，其特征在于，它包括步驟(1)提供攜帶表達(dá)載體的農(nóng)桿菌，所述的表達(dá)載體含有UDP-葡萄糖脫氫酶多肽DNA編碼序列，所述的UDP-葡萄糖脫氫酶多肽具有SEQ ID NO2氨基酸序列；(2)將植物細(xì)胞或組織或器官與步驟(1)中的農(nóng)桿菌接觸，從而使UDP-葡萄糖脫氫酶多肽DNA編碼序列轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞，并且整合到植物細(xì)胞的染色體上；(3)選擇出轉(zhuǎn)入U(xiǎn)DP-葡萄糖脫氫酶多肽DNA編碼序列的植物細(xì)胞或組織或器官；(4)將步驟(3)中的植物細(xì)胞或組織或器官再生成植株。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新的耐鹽相關(guān)蛋白－鹽生杜氏藻UDP－葡萄糖脫氫酶，編碼UDP－葡萄糖脫氫酶的多核苷酸和經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生這種UDP－葡萄糖脫氫酶的方法。本發(fā)明還公開(kāi)了編碼這種UDP－葡萄糖脫氫酶的多核苷酸的用途。本發(fā)明還公開(kāi)了此UDP－葡萄糖脫氫酶用于改善植物耐鹽性的方法。
文檔編號(hào)C12N9/02GK1408853SQ0112692
公開(kāi)日2003年4月9日 申請(qǐng)日期2001年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月29日
發(fā)明者唐克軒, 曹毅, 蔣彥, 楊滔, 曾昌耀 申請(qǐng)人:四川川大光耀生物工程有限公司