專利名稱：用蠶表達人表皮生長因子生產藥物的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用蠶表達人表皮生長因子(Epidermal growth Factor，EGF)生產藥物的方法。
本發(fā)明提供了用化學合成人EGF基因以及質粒pSK-EGF的構建。根據已知人EGF基因序列(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1983，VOL80，7462)，用DNA合成儀及亞磷酸三酯法合成4條編碼EGF的寡聚核苷酸鏈，用聚丙烯酰胺-7mol/L尿素變性膠電泳分離純化，寡聚核苷酸鏈的5’末端磷酸化、復性、鏈的延伸、連接、EcoRI內切酶酶切，并克隆入pBluscript SK的EcoRI位點，構建重組質粒pSK-EGF，經測序證明其核苷酸序列完全正確。
本發(fā)明還提供了含人EGF基因的桿狀病毒轉移質粒pBacEGF。將含有人EGF基因片段的質粒pSK-EGF經BamHI和EcoRV酶切后，低熔點膠回收基因片段與經BamHI和SmaI雙酶切的轉移載體pBacPAK-8(CLONTECH公司)連接，獲得重組轉移載體質粒pBacEGF(

圖1)，經酶切分析鑒定基因正確。
本發(fā)明還提供了含人EGF基因的重組昆蟲桿狀病毒BmBacEGF。將重組轉移載體pBacEGF DNA與已線性化的病毒BmBacPAK6(申請人自行構建)DNA經AocI酶切線性化由脂質體介導共轉染家蠶培養(yǎng)細胞，二者在細胞內可發(fā)生同源重組，待共轉染5～7天后出現(xiàn)明顯的病毒感染癥狀后，取上清進行噬斑篩選。再通過2輪的噬斑篩選和DNA點雜交篩選出含hEGF基因的重組病毒BmBacEGF(圖2)，該病毒已提交中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保存，地址在北京中關村，保藏日期為2001年7月2日，保藏編號CGMCC NO0593。
本發(fā)明還提供了人EGF基因在家蠶五齡幼蟲和蛹中的表達產物。將重組桿狀病毒BmBacEGF感染家蠶細胞進行病毒擴增，然后將擴增后的重組桿狀病毒BmBacEGF注射至五齡家蠶幼蟲和蛹體內，分別取24、48、72、96和120小時的家蠶和蛹血淋巴，經5000rpm 5分鐘離心后取上清，稀釋10倍后加等體積的2×蛋白上樣緩沖液，取20ul進行20％的SDS-PAGE分析，Western雜交表明能與EGF抗體結合，分子量約為6KD。ELASA檢測表明感染后第120小時每條蠶平均表達量為0.42mg，感染后第120小時每個蛹平均表達量為0.5mg(圖3)。
本發(fā)明還對人EGF基因的表達產物進行了生物活性的鑒定。EGF的生物活性應用Balb/c3T3細胞，采用MTT結合酶聯(lián)儀進行檢測，用BmBacEGF穿刺接種五齡家蠶幼蟲和蛹體，于感染后不同時間收集蠶血和蛹體血淋巴，高速離心后測血淋巴中的EGF的活性，在感染的第120小時后蠶血和蛹體血淋巴中的EGF ED50(Effective dose 50使細胞生長量達到最大值一半時EGF的濃度)分別為0.6ng/ml和0.88ng/ml。
本發(fā)明還對用高效表達EGF的家蠶幼蟲和蛹制成口服藥物進行動物實驗。將高效表達人EGF的蠶蛹進行粗分離純化研制成口服藥物，以不同劑量喂服SD大鼠，三天后(每天一次)，用無水乙醇灌胃后發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，大鼠胃粘膜受乙醇損傷的程度明顯降低，其保護胃粘膜效果在50-200ug/kg.d-1范圍內呈量效關系(表1)，表明用表達hEGF的蠶幼蟲和蛹制成口服藥物有明顯的抗乙醇損傷的胃粘膜保護作用，成為一種新型的治療人消化性潰瘍的口服藥物。
綜合所述，本發(fā)明的優(yōu)點如下由于hEGF分子中二硫鍵及其他多種官能團的存在，因而化學合成的產物純度及產率無法滿足工業(yè)化生產。目前hEGF的生產主要通過基因工程技術在大腸桿菌酵母中獲得，但表達產物往往形成包涵體，分離純化時涉及到蛋白質變性和復性問題，以及給后處理和純化工藝帶來繁衍的多步操作。為了克服上述困難，本發(fā)明以家蠶作為生物反應器，高效表達人表皮生長因子，表達量達到0.5mg/蛹，用表達hEGF的蠶幼蟲和蛹制成口服藥物，經動物試驗，確定其對胃腸潰瘍的治療功能，為開發(fā)治療消化道潰瘍基因工程藥物開辟一條新途徑。
將重組桿狀病毒BmBacEGF注射到五齡家蠶幼蟲和蛹(Bombyx mori)(申請人自行飼養(yǎng))中，每頭注射2ul左右(滴度為1×107/ml)，分別取24、48、72、96和120小時表達的家蠶淋巴血，5000rpm 5min離心后取上清，用PBSpH7.4稀釋10倍后，加入等體積的2×蛋白質上樣緩沖液(100Mm Tris.HCl，4％SDS，0.1％溴酚藍，10％甘油)，煮沸變性取20ul進行SDS-PAGE電泳，與PVDF膜(寶靈曼公司)一起電轉過夜，通過與一抗(鼠抗人EGF，深圳晶美公司)，二抗(羊抗鼠IgG，上海生物工程公司)雜交，結果表明，Western雜交條帶分子量為6KD)左右。ELASA檢測表明感染后第120小時每條蠶平均表達量為0.42mg，感染后第120小時每個蛹平均表達量為0.5mg(圖3)。實施例5、蠶表達的人EGF的生物活性測定EGF的生物活性應用Balb/c3T3細胞(中國生物制品檢定所)，采用MTT結合酶聯(lián)儀進行檢測。取無菌96孔板一塊，以1號孔為空白，2好孔為對照，加入培養(yǎng)基50ul，每一樣品4個平行組，在1號孔與3號孔各加入待測樣品50ul，從3號開始向右對半稀釋；選對數生長期細胞一瓶，胰酶消化，細胞收集后用0.5％培養(yǎng)基洗一次，用0.5％培養(yǎng)基調整細胞數到所需濃度，每孔加入細胞懸液50ul(對照組各孔加50ul培養(yǎng)基)，37℃，5％ CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)40-50小時，然后加MTT(Sigma公司)20ul，37℃，5％ CO2繼續(xù)培養(yǎng)4小時，加10％SDS-0.01NH4Cl 100ul，過夜，酶標儀測OD值，λ＝490nm。結果表明，用BmBacEGF穿刺接種五齡家蠶幼蟲和蛹體，于感染后不同時間收集蠶血淋巴，高速離心后測血淋巴中的EGF的活性，在感染的第120小時后蠶血和蛹體血淋巴中的EGF ED50(Effective dose 50使細胞生長量達到最大值一半時EGF的濃度)分別為0.6ng/ml和0.88ng/ml。實施例6、用高效表達人EGF的蠶蛹制成口服藥物進行的動物實驗用高效表達人EGF的五齡家蠶幼蟲、蛹體，4℃研磨經12000rpm高速離心后，取上清，再40000rpm超速離心，取上清冷凍干燥制成口服藥物。實驗動物為SD大鼠，購自浙江醫(yī)學科學院動物中心，共50只，每只體重220-250g，隨機分成5組，每組10只，分別為hEGF I組(50ug/kg.d-1口服)，hEGFII組(100ug/kg.d-1口服)，hEGF III組(200ug/kg.d-1口服)，西咪替丁組(30mg/kg.d-1口服)，對照組(0.9％生理鹽水1ml，口服)。實驗前3天起大鼠分別給予胃腔內灌注或皮下注射藥物，所有藥物均用0.9％生理鹽水稀釋，分一日3次，每次等容積灌鼠。實驗前2天起禁食，但不禁水，空腹48小時后各鼠用無水乙醇1ml/只灌胃，灌乙醇1小時后取血，處死大鼠，解剖取出胃，用1％甲醛溶液固定。沿胃大彎側剪開并展平，肉眼觀察損傷情況，測量損傷長度，損傷程度以潰瘍指數表達并做病理組織切片行光鏡檢查。損傷指數計分標準線狀損傷，每mm長度計1分，損傷寬度超過2mm者計分加倍，所有計分累加之和，作為每只大鼠胃粘膜損傷的潰瘍指數(表1)。結果表明用表達hEGF的蠶幼蟲和蛹制成口服藥物有明顯的抗乙醇損傷的胃粘膜保護作用，成為一種治療人消化性潰瘍的口服藥物的新方法。
表1、用蠶表達EGF口服藥物的動物實驗結果

注P值為各用藥組與對照組潰瘍指數比較
權利要求
1.一種用蠶表達人表皮生長因子制備藥物的方法，其特征在于通過基因工程方法獲得重組的帶人表皮生長因子(EGF)基因的家蠶重組桿狀病毒，該病毒已提交中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保存，地址在北京中關村，保藏日期為2001年7月2日，保藏編號為0593，并用該病毒接種家蠶幼蟲和蛹進行表達人EGF，所獲得的表達產物經冷凍干燥，以家蠶蛹為填充料配制成口服藥物，成為一種治療消化性潰瘍疾病的新方法。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述的人EGF基因的桿狀病毒轉移質粒pBacEGF的構建是通過化學合成人EGF基因，克隆到pSK的EcoRI位點，將人EGF基因片段克隆進入轉移載體pBacPAK-8中，獲得的重組轉移載體質粒pBacEGF。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述的人EGF基因的重組家蠶桿狀病毒BmBacEGF的構建是通過重組轉移載體pBacEGF與已線性化的病毒BmBacPAK6 DNA由脂質體介導共轉染家蠶培養(yǎng)細胞，再通過2輪的噬斑和Southern雜交斑篩選獲得純化的重組病毒BmBacEGF，該病毒已提交中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保存，地址在北京中關村，保藏日期為2001年7月2日，保藏編號為0593。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述的人EGF基因在家蠶五齡幼蟲和蛹中的表達產物是通過重組桿狀病毒BmBacEGF注射至五齡家蠶幼蟲和蛹體內表達產生。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述的口服藥物是通過表達人EGF的家蠶五齡幼蟲和蛹經冷凍干燥后制成的，通過動物試驗表明用表達hEGF的蠶幼蟲和蛹制成口服藥物有明顯的抗乙醇損傷的胃粘膜保護作用，成為一種治療人消化性潰瘍的口服藥物的新方法。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術制藥工程中的基因工程生產多肽類藥物技術領域。本發(fā)明將人EGF基因克隆到家蠶桿狀病毒(Bombyx mori Nuclear polyhedrosis Virus)轉移載體pBacPAK8中，與線性化家蠶桿狀病毒，在家蠶細胞中進行同源重組，獲得帶人表皮生長因子基因的重組家蠶桿狀病毒BmBacEGF，該病毒已提交中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保存，地址在北京中關村，保藏日期為2001年7月2日，保藏編號為0593，用重組家蠶桿狀病毒針刺接種家蠶幼蟲和蛹體，使人表皮生長因子在家蠶幼蟲和蛹中獲得高效表達，將高效表達人表皮生長因子的幼蟲和蠶蛹研制成口服藥物，經動物試驗表明對治療消化性潰瘍具有的顯著作用，成為一種治療消化性潰瘍疾病的新方法。與現(xiàn)有技術相比，原料易得，生產成本低，治療效果良好。
文檔編號C12N15/12GK1405310SQ0112412
公開日2003年3月26日 申請日期2001年8月15日 優(yōu)先權日2001年8月15日
發(fā)明者張耀洲, 金勇豐, 吳祥甫 申請人:浙江中奇生物藥業(yè)股份有限公司