專利名稱：酰胺化合物的制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是有關(guān)酰胺化合物的制造方法，更具體地說是有關(guān)酰胺化合物水溶液的制造方法。該方法是將腈化合物以高轉(zhuǎn)化率進(jìn)行水合作用而連續(xù)地制造高濃度酰胺化合物水溶液的方法，其反應(yīng)后的殘留腈化合物少而適于工業(yè)化生產(chǎn)。
作為酰胺化合物的主要制造方法之一，現(xiàn)經(jīng)常使用的是以腈化合物為原料的水合法。尤其是已知的以丙烯腈為原料，通過過去常用的以拉奈銅(Ranay銅)等金屬銅催化劑或者于近年使用的以含有腈水化酶的微生物菌體和該菌體處理物等的水合催化劑制造丙烯酰胺的方法。
上述方法中，通常，產(chǎn)品丙烯酰胺以水溶液或其結(jié)晶的形態(tài)供給，而在使用它們時(shí)，以水性溶劑進(jìn)行稀釋或者溶解。因此，近年來，其幾乎多以水溶液的形態(tài)供給。
就丙烯酰胺水溶液的供給而言，制品形態(tài)從輸送和貯存等的成本來看，要求更高的濃度；而另一方面又必須在輸送或貯存等情況下防止結(jié)晶的析出。因此，適合于常溫附近的輸送和貯存等的丙烯酰胺水溶液的濃度通常為40-50％左右(重量比)。
然而，在該產(chǎn)品的現(xiàn)有工業(yè)制造技術(shù)中，在反應(yīng)過程中，丙烯酰胺的濃度雖隨制造工藝和使用催化劑的種類的不同而不同，但通常都不足40％(重量比)。其原因是因?yàn)椋诜磻?yīng)過程中提高丙烯腈和/或丙烯酰胺的濃度時(shí)，發(fā)現(xiàn)了以下一系列傾向催化劑活性失活、反應(yīng)不能進(jìn)行到底而使原料丙烯腈殘留、反應(yīng)付產(chǎn)物增加等，同時(shí)出現(xiàn)了受反應(yīng)熱的除熱能力限制等問題，從而要在上述反應(yīng)結(jié)束時(shí)直接得到最終產(chǎn)品濃度的丙烯酰胺產(chǎn)品通常是很困難的。
因此，在現(xiàn)有的丙烯酰胺的工業(yè)化制造工藝中，通過將原料丙烯腈多段供給的方法(日本特許公告公報(bào)昭57-1234號(hào))以及通過使反應(yīng)液的一部分循環(huán)的原料稀釋法(日本特許公告公報(bào)昭58-35077號(hào))等方法以限制原料丙烯腈的濃度，或者通過壓低丙烯腈的轉(zhuǎn)化率，使反應(yīng)液中丙烯酰胺的濃度不足40％(重量比)，從而抑制催化劑活性的失活及付產(chǎn)物的增加。因此，通常，為了達(dá)到將所得到的丙烯酰胺水溶液的濃度提高和/或?qū)⑺鶜埩舻谋╇嫒コ哪康?，往往再進(jìn)行濃縮。
然而，雖然濃縮含有丙烯酰胺的液體一般是在負(fù)壓下進(jìn)行，但由于丙烯酰胺是一種極易反應(yīng)的聚合性單體，在濃縮中產(chǎn)生聚合的危險(xiǎn)性極大。因此，雖然在濃縮時(shí)采用了種種方法，諸如通入氧氣進(jìn)行穩(wěn)定化處理的方法，使一氧化氮與其共存的方法和使金屬離子與其共存的方法等，要完全防止聚合也是困難的。
在日本特許公開公報(bào)平11-89575號(hào)中，公開了利用微生物的菌體或菌體處理物來制造丙烯酰胺的方法。在該公報(bào)中，主要記載了通過添加原料丙烯腈使得反應(yīng)開始時(shí)或者反應(yīng)過程中丙烯腈的濃度達(dá)到在水性媒質(zhì)中丙烯腈的飽和濃度以上，從而以更少的菌體量來得到高濃度丙烯酰胺溶液。因此，即使不進(jìn)行濃縮，雖可得到濃度達(dá)40％(重量比)以上的丙烯酰胺水溶液，但由于反應(yīng)催化劑的使用量、反應(yīng)溫度和開始時(shí)或反應(yīng)過程中的丙烯腈濃度的關(guān)系的不同，有時(shí)會(huì)產(chǎn)生不協(xié)調(diào)的問題。例如，在短時(shí)間之內(nèi)就使反應(yīng)結(jié)束這種情況下，由于初期的反應(yīng)熱很大，對(duì)反應(yīng)器而言必須有比較大的熱交換器，或者相反，為了使丙烯腈的轉(zhuǎn)化率達(dá)到99％以上，就需要相當(dāng)長的反應(yīng)時(shí)間。
由于以上的原因，作為酰胺化合物的工業(yè)化制法，迫切期望能有一種方法，它能使腈化合物的轉(zhuǎn)化率更高，不需要濃縮工序而且可以更高的效率得到高濃度的酰胺化合物。
本發(fā)明就是為了解決以上各問題而提出，其目的在于提供一種制造方法，它可以高的轉(zhuǎn)化率將腈化合物轉(zhuǎn)化來制造高濃度的酰胺化合物，其殘留的腈化合物極少而且可連續(xù)作業(yè)，適于工業(yè)化生產(chǎn)。
本發(fā)明的發(fā)明人為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的而精心研究的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，將含有腈水化酶的微生物的菌體或者菌體處理物在水性媒質(zhì)中使其同腈化合物接觸并反應(yīng)，隨后將該反應(yīng)液在具有活塞式流動(dòng)性流域的條件下再進(jìn)行反應(yīng)的這種方法是為實(shí)現(xiàn)上述目的的極有效的手段，從而完成了本發(fā)明。
即，本發(fā)明的制造方法是(1)，一種酰胺化合物的制造方法，在將含有腈水化酶的微生物的菌體或者菌體處理物在水性媒質(zhì)中同腈化合物反應(yīng)而連續(xù)地制造酰胺化合物的方法中，其特征在于將該菌體或者菌體處理物在水性媒質(zhì)中同腈化合物接觸反應(yīng)后所得到的反應(yīng)液，在具有活塞式流動(dòng)性的流域條件下再進(jìn)行反應(yīng)；(2)，在上述(1)記載的制造方法中，腈化合物是丙烯腈，使其同微生物的菌體或者其菌體處理物接觸時(shí)的水和丙烯腈的比例是相對(duì)于水1份(重量)，丙烯腈為0.4-1.5份(重量)；(3)，在上述(1)或(2)記載的制造方法中，微生物的菌體是在任意宿主中所發(fā)現(xiàn)的用微生物經(jīng)純株培養(yǎng)的腈水化酶基因的轉(zhuǎn)型變異體。
本發(fā)明的要點(diǎn)在于，將含有腈水化酶的微生物的菌體或者其菌體處理物用作使腈化合物的腈基酰胺化的催化劑，尤其是能夠既抑制付產(chǎn)物的生成，又以高的轉(zhuǎn)化率而且高效率地制造高濃度的酰胺化合物水溶液。
本發(fā)明中的所謂腈水化酶指的是具有加水分解腈化合物而生成相應(yīng)的酰胺化合物這種能力的酶。
此處，作為含有腈水化酶的微生物沒有特別地限制，只要是該微生物能產(chǎn)生腈水化酶而該腈水化酶具有加水分解腈化合物而生成相應(yīng)的酰胺化合物的能力，而且該微生物能在30％(重量比)的丙烯酰胺水溶液中保持腈水化酶的活性即可。具體地可列舉屬于以下種屬的微生物作為合適的例子，即諾卡氏放線菌屬、棒狀桿菌屬、芽胞桿菌屬、假單胞細(xì)菌屬、細(xì)球菌屬、好熱的芽胞桿菌屬、代表粉紅色菌(Rhodochrous)種的紅球菌屬、不動(dòng)細(xì)菌屬、黃色細(xì)菌屬、鏈霉菌屬、根瘤菌屬、克雷伯氏菌屬、腸細(xì)菌屬、歐文氏菌屬、氣單胞菌屬、檸檬酸細(xì)菌屬、無色菌屬、土壤桿菌屬或者代表嗜熱菌種的假諾卡氏菌屬。
另外，在任意宿主中所發(fā)現(xiàn)的由以上微生物經(jīng)純株培養(yǎng)的腈水化酶基因的轉(zhuǎn)形變異體也包含在本發(fā)明所稱的微生物中。再有，此處所稱的任意的宿主，雖如后述的實(shí)施例那樣列舉了大腸菌作為代表例子，但并不特別限定于大腸菌，也包括枯草菌等芽胞桿菌屬菌、酵母及放線菌等其他微生物菌株。MT-10822可列舉作為這類微生物菌株的例子。(根據(jù)有關(guān)專利程序方面的微生物保藏國際間相互承認(rèn)的布達(dá)佩斯條約，本菌株于1996年2月7日保藏在日本國茨城縣筑波市東1丁目1番3號(hào)的通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所，保藏號(hào)為FERM BP-5785)另外，通過使用重組DNA技術(shù)，通過將該酶的結(jié)構(gòu)氨基酸的1個(gè)或2個(gè)以上以別的氨基酸置換、缺失、削除或者抻入等所發(fā)現(xiàn)的更加提高了耐丙烯酰胺性及耐丙烯腈性，耐溫性的變異型腈水化酶的轉(zhuǎn)型變異體也包括在本發(fā)明所稱的微生物中。
當(dāng)使用上述各種微生物來制造酰胺化合物時(shí)，通常，使用該微生物的菌體或菌體處理物。菌體可利用在分子生物學(xué)、生物工程學(xué)、基因工程學(xué)各領(lǐng)域中所公知的一般方法來培制，例如，可列舉如下的方法在LB培養(yǎng)基或M9培養(yǎng)基等常用液體培養(yǎng)基中將該微生物植菌后，在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)溫度下使其繁殖(通常為20-50℃，對(duì)于好熱菌，也可在50℃以上)，隨后，用離心分離法將該微生物與培養(yǎng)液分離、回收即可。
另外，本發(fā)明中的微生物的菌體處理物是指上述微生物菌體的提取物及磨碎物、將該提取物及磨碎物的腈水化酶活性成分分離精制而成的后分離物、用適當(dāng)?shù)妮d體將該微生物菌體及該菌體的提取物、磨碎物、后分離物進(jìn)行固定化處理的固定化物等，這些只要具有腈水化酶的活性都屬于本發(fā)明的菌體處理物。這些既可以使用單獨(dú)一類，也可以同時(shí)或者交替使用二種以上不同形態(tài)的東西。
本發(fā)明中，使用含有腈水化酶的微生物菌體或該微生物菌體的處理物，由腈化合物制得酰胺化合物時(shí)的反應(yīng)形式為使用二臺(tái)以上的反應(yīng)器，在其前段的反應(yīng)器中，供給微生物菌體或菌體處理物，腈化合物和水性媒質(zhì)。對(duì)于這時(shí)的反應(yīng)形式?jīng)]有特別限定。例如既可用懸浮床進(jìn)行，也可用固定床進(jìn)行；但通常，從反應(yīng)熱的除熱容易度考慮，使用裝有攪拌機(jī)的槽形反應(yīng)器的懸浮床為更好。
本發(fā)明中，關(guān)于腈化合物的種類也沒有特別限定，具體地說是炭原子數(shù)為2-20左右的腈化合物，包括范圍廣泛的腈，例如脂肪族腈、芳香族腈等。作為脂肪族腈，可以是炭原子數(shù)2-6的飽和腈或不飽和腈，例如，可列舉乙腈、丙腈、丁腈、異丁腈、戍腈、異戍腈、己腈等脂肪族飽和單腈類；丙二酰腈、丁二腈、己二腈等脂肪族雙腈類；丙烯腈、甲基丙烯腈、丁烯腈等脂肪族不飽和腈等。作為芳香族腈，可列舉芐腈、o-(正)，m-(間)和p-(對(duì))位的氟芐腈，o-,m-和p-位的硝基芐腈，o-,m-和p-位的甲苯基腈，芐基氰化物等。其中，丙烯腈、甲基丙烯腈和丁烯腈可列為合適的例子。
另外，本發(fā)明中所稱的水性媒質(zhì)是指水或者以適當(dāng)濃度溶解以下物質(zhì)的水溶液磷酸鹽等緩沖劑、硫酸鹽及碳酸鹽等無機(jī)鹽、堿金屬的氫氧化物、或者酰胺化合物等。
本發(fā)明中，供給前段反應(yīng)器的腈化合物的濃度在反應(yīng)開始時(shí)是該腈化合物飽和濃度以上的濃度。該濃度的上限沒有特別限制；然而腈化合物太過量的供給，使得必須具有為完成反應(yīng)所需大量催化劑和具有過大容積的反應(yīng)器和為了除熱所需的過大的熱交換器等，從而使設(shè)備方面的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)加大。因此，作為腈化合物的供給濃度最好是將其完全轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的酰胺化合物時(shí)其理論生成液的濃度，對(duì)丙烯酰胺來說，是在40-80％(重量比)范圍內(nèi)；更具體地說，相對(duì)于1份水(重量)，供給丙烯腈0.4-1.5份(重量)。另外，對(duì)于甲基丙烯酰胺來說最好供給腈化合物和水使其理論生成液濃度為10-40％(重量比)范圍內(nèi)，更具體地說，相對(duì)于1份水(重量)，甲基丙烯腈為0.08-0.5份(重量)。
隨后，將本發(fā)明中由上述前段反應(yīng)器取出的反應(yīng)液在具有活塞式流動(dòng)性流域的條件下再進(jìn)行反應(yīng)。更具體地說，將由前段反應(yīng)器得到的反應(yīng)液輸送到具有活塞式流動(dòng)性流域的后段反應(yīng)器中。此處所謂具有活塞式流動(dòng)性流域的反應(yīng)器通常是管型反應(yīng)器或者有時(shí)也被叫作管子反應(yīng)器的那種反應(yīng)器，通過活塞的移動(dòng)使反應(yīng)液在具有管道形狀的管子中一邊移動(dòng)一邊進(jìn)行反應(yīng)；為了除去反應(yīng)熱，可使用雙管形式以及外殼和內(nèi)管形式等。
然而，作為本發(fā)明中的具有活塞式流動(dòng)性流域的反應(yīng)器并不局限于上述形式，即使是別的形式的反應(yīng)器，只要是難于引起反應(yīng)液的短路的形式，均可使用。也就是說，根據(jù)流速等條件的情況只要反應(yīng)器能具有活塞式流動(dòng)性流域，而且其結(jié)構(gòu)又能去除反應(yīng)熱，就可作為具有活塞式流動(dòng)性流域的反應(yīng)器使用。例如，可使用熱交換器中的螺旋型及層板型或者塔型反應(yīng)器等各種設(shè)備。再者，即使是在這些設(shè)備內(nèi)部有為保持反應(yīng)液流動(dòng)狀態(tài)均勻的攏流板及填充物，只要根據(jù)流速等條件的情況反應(yīng)器具有活塞式流動(dòng)性流域，均可作為具有活塞式流動(dòng)性流域的反應(yīng)器使用。
再有，上述的前段反應(yīng)器和后段具有活塞式流動(dòng)性流域的反應(yīng)器每種都不限制為一臺(tái)，它們既可單獨(dú)設(shè)置，也可將多個(gè)以串連或并連的形式排列。另外，關(guān)于上述前段和后段反應(yīng)的反應(yīng)時(shí)間(滯留時(shí)間)，不一定按催化劑的使用量及溫度等條件控制，通常分別取在0.5-40小時(shí)范圍內(nèi)，最好在1-20小時(shí)范圍內(nèi)。另外，在全部反應(yīng)時(shí)間中，在前段反應(yīng)器的反應(yīng)時(shí)間應(yīng)為全部反應(yīng)時(shí)間的20-99％，最好是40-90％；而在后段反應(yīng)器的反應(yīng)時(shí)間應(yīng)為全部反應(yīng)時(shí)間的1-80％，最好是10-60％。
關(guān)于催化劑的使用量，是隨反應(yīng)條件、催化劑的種類及其形態(tài)的不同而變化，但通常是根據(jù)該微生物干燥菌體的重量進(jìn)行換算，相對(duì)于反應(yīng)液為10-50000ppm(重量)，最好是50-30000ppm(重量)。
另外，酰胺化反應(yīng)通常在常壓或者常壓附近進(jìn)行，為了提高腈化合物在水性媒質(zhì)中的溶解度，也可以加壓進(jìn)行。另外，關(guān)于反應(yīng)溫度，只要是在水性媒質(zhì)的冰點(diǎn)以上即可，沒有特別限制；通常在0-50℃范圍內(nèi)進(jìn)行為好，最好是在10-40℃范圍內(nèi)。再有，即使在生成物從反應(yīng)液中析出結(jié)晶的粉漿狀態(tài)下，反應(yīng)仍可進(jìn)行。
另外，上述酰胺化反應(yīng)時(shí)的反應(yīng)液的PH值只要能維持腈水化酶的活性即可，沒有特別限制，但以PH值在6-10范圍內(nèi)為好，PH值最好在7-9范圍內(nèi)。
再有，在本發(fā)明的實(shí)施例中，保持了腈水化酶活性的氨基酸置換體的取得通過部位特異的變異來實(shí)現(xiàn)。但是，根據(jù)同實(shí)施例中所公開的變異點(diǎn)所置換的堿基的種類的不同，即使用部位特異的變異以外的方法來構(gòu)建重組質(zhì)粒并將其導(dǎo)入宿主細(xì)胞中，也可得到同本發(fā)明實(shí)施例相同的結(jié)果。例如，通過以下方法也可取得作為目標(biāo)物的重組質(zhì)粒，即使用DNA合成器等將具有下述堿基序列的DNA斷片合成，該堿基序列是將與實(shí)施例中所公開的變異點(diǎn)相應(yīng)部位的DNA的堿基序列變成氨基酸置換后的序列，然后再置換用另外的辦法同所得到的斷片分離的pPT-DB1的該斷片相應(yīng)的部位。
以下，列舉實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作更詳細(xì)的說明，但本發(fā)明并不受以下實(shí)施例的任何限制。以下內(nèi)容中，反應(yīng)液的高性能液體色譜分析(HPLC)使用VLTRON 80HG(φ8*50mm)作為HPLC柱，使用10mM磷酸水溶液作為展開液，丙烯酰胺和丙烯腈用220nm的吸光度檢測(cè)并測(cè)定其濃度。
實(shí)施例1(1)保持了腈水化酶活性的氨基酸置換體的取得為了將α亞基第6號(hào)的Leu置換成Met，將日本特許公開公報(bào)平9-275978號(hào)所得到的pPT-DB1質(zhì)粒DNA作為鑄型，實(shí)施用寶酒造社制的《LA PCR in vitro mutagenesis Kit》部位特異的變異導(dǎo)入。下文，將《LA PCR in vitro mutagenesis Kit》簡稱為《Kit》。在以下的實(shí)施例中，基本上沿襲<Kit>的原理和操作方法。
在30ml的試管中配制10ml的LB液體培養(yǎng)基，用高壓鍋在121℃滅菌20分鐘。將氨芐青霉素添加到該培養(yǎng)基中使其最終濃度達(dá)到100μg/ml，然后將MT-10822菌株植菌一白金耳，在37℃、300rpm條件下培養(yǎng)約20小時(shí)。將該培養(yǎng)液1ml分裝到適當(dāng)?shù)碾x心管中，然用離心分離法(15000rpm*5分鐘)將該菌體分離。隨后，用堿SDS提取法由該菌體制得pPT-DB1的質(zhì)粒DNA。
將pPT-DB1的質(zhì)粒DNA 1μg作為鑄型進(jìn)行二種PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)1號(hào)是用各自含有50pmol的序列表的序列1號(hào)記載的引物(primer)及M13引物M4(在序列表的序列2號(hào)中記載的序列)總量為50μl的混合液(其組成根據(jù)《Kit》記載的條件)，在以下條件下重復(fù)進(jìn)行25次循環(huán)，即熱變性(98℃)15秒，緩冷(55℃)30秒、伸長反應(yīng)(72℃)120秒。PCR反應(yīng)2號(hào)是用各自含有50pmol的MUT4引物(序列表的序列3號(hào)記載的序列)及M13引物RV(序列表的序列4號(hào)記載的序列)總量為50μl的混合液(其組成根據(jù)《Kit》中記載的條件)，進(jìn)行同PCR反應(yīng)1號(hào)同樣的操作。通過使用PCR反應(yīng)1號(hào)和2號(hào)反應(yīng)完成后的反應(yīng)液各5μl的瓊脂糖電泳分析(瓊脂糖的濃度為1.0％-重量比)，進(jìn)行DNA增幅產(chǎn)物的分析，證實(shí)了增幅DNA產(chǎn)物的存在。使用Microcon100(寶酒造社制)由各自的PCR反應(yīng)完成液除去過剩的引物和dNTP后，加入TE(三羥基甲胺基甲烷.乙二胺四醋酸緩沖液)，分別配制50μl的溶液。將含有該TE溶液的每0.5μl配制成總量為47.5μl的緩冷溶液(組成根據(jù)《Lit》記載的條件)，在進(jìn)行熱變性處理(98℃)10分鐘后，花60分鐘的時(shí)間以一定速度進(jìn)行冷卻直到37℃，隨后在37℃保持15分鐘進(jìn)行保溫處理。在該緩冷處理液中加入0.5μl TAKARALA Tag在72℃進(jìn)行3分鐘加熱處理，完成了不均勻的2條鏈。在它們中分別加入50pmol的M13引物M4(序列表的序列2號(hào)記載的序列)及M13引物RV(序列表的序列4號(hào)中記載的序列)，使其總量為50μl，然后在以下條件下重復(fù)進(jìn)行25次循環(huán)從而實(shí)現(xiàn)PCR反應(yīng)3號(hào)熱變性(98℃)15秒、緩冷(55℃)30秒伸長反應(yīng)(72℃)120秒。通過使用了PCR反應(yīng)3號(hào)的反應(yīng)完成液5μl的瓊脂糖電泳分析(使用西格馬社制的型號(hào)為Ⅶ型的低熔點(diǎn)瓊脂糖，瓊脂糖濃度為0.8％-重量比)，進(jìn)行DNA增幅產(chǎn)物的分析，證實(shí)了約2.0kbp的增幅DNA產(chǎn)物的存在。隨后，由瓊脂糖凝膠切出約2.0Kbp的DNA斷片，將該瓊脂糖片(約0.1g)精細(xì)粉碎并在1ml的TE溶液中制成懸浮液后，于55℃保溫1小時(shí)使瓊脂糖完成溶解。對(duì)該溶液按常規(guī)實(shí)施酚/氯仿提取和乙醇沉淀來精制該DNA斷片，最終將其溶解在10μl的TE溶液中。將精制而成的約2.0Kbp的增幅DNA斷片用有限制的酶EcoRⅠ及HindⅢ切斷后，再對(duì)該有限制的酶的處理液實(shí)施酚/氯仿提取和乙醇沉淀來精制該DNA斷片，最終溶解在10μl的TE溶液中，同樣，對(duì)pPT-DB1唯一有限制的酶的部位用EcoRⅠ和HindⅢ切斷pPT-DB1，進(jìn)行瓊脂糖凝膠的電泳分析(使用西格馬社制的型號(hào)為Ⅶ型的低熔點(diǎn)瓊脂糖，瓊脂糖的濃度為0.7％)由瓊脂糖凝膠切出約2.7Kbp的DNA斷片。將切出的瓊脂糖片(約0.1g)精細(xì)粉碎并在1ml的TE溶液中制成懸浮液，于55℃保溫1小時(shí)使瓊脂糖完全溶解。對(duì)于該溶液實(shí)施酚/氯仿提取和乙醇沉淀來精制該DNA斷片，最后溶解在10μl的TE溶液中。使用DNAラィグ-ション kit(寶酒造社制)將這樣得到的增幅DNA產(chǎn)物和pPT-DB1斷片連接后，對(duì)大腸菌HB101的コンピテントセル(東洋紡織社制)進(jìn)行轉(zhuǎn)型變異，從而制得大腸菌組群。
在30ml的試管中配制含有40μg/ml的七水硫酸鐵和10μg/ml的二水氯化鈷的10ml的LB液體培養(yǎng)基(以后，稱為顯現(xiàn)活性的培養(yǎng)基)，在121℃用高壓鍋滅菌20分鐘。在該培養(yǎng)基中添加氨芐青霉素使其最終濃度達(dá)到100μg/ml后，將由該大腸菌組任意挑選的5個(gè)無性繁殖系各植菌一白金耳，在37℃和300rpm的條件下培養(yǎng)約20小時(shí)。將完成培養(yǎng)的培養(yǎng)液1ml分別分裝到適當(dāng)?shù)碾x心管中，然后用離心分離法(15000rpm×5分鐘)將該菌體分離。將該菌體懸浮在200μl的磷酸鉀緩沖液中(PH值為7.0)，然后往其中添加1％(重量比)的丙烯腈在10℃反應(yīng)2分鐘。在反應(yīng)液中添加同其等量的1M磷酸水溶液使反應(yīng)停止，用同前實(shí)施例中同樣的HPLC分析測(cè)定所生成的丙烯酰胺濃度。其結(jié)果，在5個(gè)無性繁殖系中的4個(gè)檢出了有丙烯酰胺生成，證實(shí)保持了腈水化酶的活性。由供測(cè)定腈水化酶活性的上述培養(yǎng)液的剩余部分1ml分別分離該4個(gè)無性繁殖系中的菌體，用堿SDS提取法制得各無性繁殖系的質(zhì)粒DNA。隨后，通過使用ABI社制的定序用《Kit》和自動(dòng)定序裝置373A的引物擴(kuò)展法(Primer extension)確定了各無性繁殖系的腈水化酶的組成基因的堿基序列。其結(jié)果，示于表1的無性繁殖系NO:1中的腈水化酶的α亞基第6號(hào)的Leu被置換為Met。
表1
隨后，為了將α亞基內(nèi)的第126號(hào)的Phe置換成Tyr，將無性繁殖系NO:1的質(zhì)粒DNA作為鑄型，通過同上述相同的操作實(shí)現(xiàn)部位特異的變異導(dǎo)入。
也就是說，在30ml的試管中配制10ml的LB液體培養(yǎng)基，在121℃用高壓鍋滅菌20分鐘。添加氨芐青霉素使該培養(yǎng)基的最終濃度達(dá)到100μg/ml后，將所得到的無性繁殖系NO:1菌株植菌一白金耳，在37℃，300rpm條件下培養(yǎng)約20小時(shí)。將該培養(yǎng)液1ml分裝到適當(dāng)?shù)碾x心管中，用離心分離法(15000rpm×5分鐘)分離菌體，隨后用堿SDS提取法由該菌體制得無性繁殖系No:1菌株的質(zhì)粒DNA。將無性繁殖系No:1菌株的質(zhì)粒DNA1μg作為鑄型進(jìn)行兩種PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)4號(hào)是用各自含有50pmol的序列表的序列5號(hào)記載的引物及M13引物M4(序列表的序列2號(hào)中記載的序列)總量為50μl的混合液(其組成根據(jù)《kit》記載的條件)，在以下的條件下重復(fù)進(jìn)行25次循環(huán)，即熱變性(98℃)15秒、緩冷(55℃)30秒、伸長反應(yīng)(72℃)120秒。PCR反應(yīng)5號(hào)是用各自含有50pmol的MUT4引物(序列表的序列3號(hào)中記載的序列)及M13引物RV(序列表的序列4號(hào)中記載的序列)總量50μl的混合液(其組成根據(jù)《kit》記載的條件)實(shí)施同PCR反應(yīng)4號(hào)相同的操作。通過用PCR反應(yīng)4號(hào)和5號(hào)反應(yīng)完成后的反應(yīng)液各5μl的瓊脂糖電泳分析(瓊脂糖的濃度為1.0％--重量比)，進(jìn)行DNA增幅產(chǎn)物的分析，證實(shí)增幅DNA產(chǎn)物的存在。以后，通過同無性繁殖系No:1情況完全相同的操作，制得大腸菌組群。
將由該大腸菌組任意挑選的5個(gè)無性繁殖系各殖菌一白金耳于同無性繁殖系NO:1情況相同的顯示活性的培養(yǎng)基10ml中，在37℃、300rpm的條件下培養(yǎng)約20小時(shí)。將完成培養(yǎng)的該培養(yǎng)液1ml分別分裝于適當(dāng)?shù)碾x心管中，然后測(cè)定腈水化酶的活性。其結(jié)果，在5個(gè)無性繁殖系中有4個(gè)檢測(cè)出生成了丙烯酰胺，證實(shí)保持了腈水化酶的活性。
由供測(cè)定腈水化酶活性的上述培養(yǎng)液的剩余部分1ml分別分離出該4個(gè)無性繁殖系的菌體，用堿SDS提取法制得各無性繁殖系的質(zhì)粒DNA。隨后，通過同無性繁殖系NO:1情況同樣的操作，決定各無性繁殖系的腈水化酶的組成基因加堿基序列。其結(jié)果，如表2所示的無性繁殖NO:2中的腈水化酶的α亞基第6號(hào)的Leu被置換成Met,α亞基的第126號(hào)的Phe被置換成Tyr。
表2
隨后，為了將β亞基的第212號(hào)的Ser置換成Tyr，將無性繁殖系NO:2的質(zhì)粒DNA作為鑄型，通過同上述相同的操作，實(shí)施部位特異的變異導(dǎo)入。
也就是說，在30ml的試管中配制10ml的LB液體培養(yǎng)基，用高壓鍋在121℃、300rpm的條件下滅菌約20分鐘。添加安芐青霉素使該培養(yǎng)基的最終濃度達(dá)到100μg/ml，然后將所得到的無性繁殖第No:2的菌株植菌一白金耳，在37℃、300rpm的條件下培養(yǎng)約20小時(shí)。將該培養(yǎng)液1ml分裝到適當(dāng)?shù)碾x心管中，用離心分離法(15000rpm×5分鐘)分離菌體。隨后，用堿SDS提取法由該菌體制得無性繁殖系NO:1菌株的質(zhì)粒DNA。
將該無性繁殖系NO:2的質(zhì)粒DNA1μg作為鑄型，實(shí)施二種PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)6號(hào)是分別使用含有50pmol的序列表的序列6號(hào)記載的引物及M13引物M4(序列表的序列2號(hào)中記載的序列)總量為50μl的混合液體(其組成根據(jù)《kit》記載的條件)，在以下條件下重復(fù)進(jìn)行25次循環(huán)，即熱變性(98℃)15秒、緩冷(55℃)30秒、伸長反應(yīng)(72℃)120秒。PCR反應(yīng)7號(hào)是分別使用含有50pmol的MUT4引物(序列表的序列3號(hào)中記載的序列)及M13引物RV(序列表的序列4號(hào)中的記載的序列)總量為50μl的混合液體(其組成根據(jù)《kit》記載的條件)，實(shí)施同PCR反應(yīng)6號(hào)相同的操作。通過用PCR反應(yīng)6號(hào)和7號(hào)的反應(yīng)完成后的反應(yīng)液各5μl進(jìn)行瓊脂糖電泳分析(瓊脂糖濃度為1.0％-重量比)進(jìn)行DNA增幅產(chǎn)物的分析，證實(shí)了增幅DNA產(chǎn)物的存在。以后，進(jìn)行同無性繁殖系No:1情況完全相同的操作，制得大腸菌組群。
將由該大腸菌組群任意挑選的5個(gè)無性繁殖系各植菌一白金耳于同無性繁殖系NO:1情況相同的顯示活性的培養(yǎng)基10ml中，在37℃、300rpm條件下培養(yǎng)約20小時(shí)。將該培養(yǎng)完成后的培養(yǎng)液1ml分別分裝到適當(dāng)?shù)碾x心管中，然后測(cè)定腈水化酶的活性。其結(jié)果，在5個(gè)無性繁殖系的4個(gè)中檢測(cè)出丙烯酰胺的生成，從而證實(shí)保持了腈水化酶的活性。
由供測(cè)定腈水化酶活性的上述培養(yǎng)液的剩余部分lml分別分離該4個(gè)無性繁殖系的菌體，用堿SDS提取法制得各無性繁殖系的質(zhì)粒DNA。隨后，通過同無性繁殖系NO:1情況相同的操作，決定各無性繁殖系的腈水化酶的組成基因的堿基序列。其結(jié)果，如表3所示的無性繁殖系NO:3中的腈水化酶的β亞基的第212號(hào)的Ser被置換成Tyr。
表3
培養(yǎng)該無性繁殖系NO:3的菌體，得到反應(yīng)中所必須的菌體。以下列出典型的培養(yǎng)例子。
在500ml的帶有緩沖板的三角燒瓶中配制下述組成的培養(yǎng)基100ml，用高壓鍋在121℃滅菌20分鐘，在該培養(yǎng)基中添加氨芐青霉素使其最終濃度達(dá)到50μg/ml，然后將上述無性繁殖系NO:3的菌體植菌一白金耳，在37℃、130rpm的條件下培養(yǎng)20小時(shí)。通過離心分離(15000rpm×5分鐘)僅將該菌體與培養(yǎng)液分離，隨后，將該菌體再次懸浮于50ml的生理食鹽水中，然后再次進(jìn)行離心分離從而得到濕菌體。
培養(yǎng)基的組成酵母提取物5.0克/升細(xì)菌培養(yǎng)基用胨 10克/升氯化鈉 5克/升六水氯化鈷 10毫克/升七水硫酸鐵 40毫克/升
PH值為7.5(2)由丙烯腈的水合產(chǎn)生的丙烯酰胺的合成反應(yīng)將用上述培養(yǎng)方法得到的濕菌體2份(重量)懸浮在0.3mM氫氧化鈉水溶液98份(重量)中，將該懸浮液和丙烯腈分別以50克/小時(shí)、30克/小時(shí)的量邊攪拌邊連續(xù)地供給作為第1反應(yīng)器并預(yù)先裝入400克水的1升玻璃制的燒瓶中，同時(shí)以80克/小時(shí)的量連續(xù)地抽取反應(yīng)液使其液面保持一定，將該液液體連續(xù)地供給作為第2反應(yīng)器的內(nèi)徑為5毫米長度為20米的聚四氟乙烯制的管子中。反應(yīng)溫度如下控制將上述第1反應(yīng)器和第2反應(yīng)器都浸沒在約10℃-20℃的水浴中，使其內(nèi)部溫度為15℃。
從反應(yīng)開始計(jì)時(shí)在200小時(shí)后進(jìn)行HPLC分析，對(duì)第2反應(yīng)器出口的反應(yīng)液進(jìn)行分析的結(jié)果，反應(yīng)液中只有丙烯酰胺存在(濃度為50％-重量比)，丙烯腈在檢測(cè)誤差范圍以下(100ppm-重量)。
比較例1反應(yīng)時(shí)間同上述實(shí)施例的情況相同，只是反應(yīng)器僅有做為第1反應(yīng)器的攪拌槽。也就是說，除了將反應(yīng)器變更為2升的玻璃制燒瓶而且將其中的液體量變更為800克外，其余同實(shí)施例的操作相同。從開始反應(yīng)計(jì)時(shí)在200小時(shí)后進(jìn)行HPLC分析，對(duì)反應(yīng)器出口的反應(yīng)液進(jìn)行分析的結(jié)果，檢測(cè)出反應(yīng)液中的丙烯酰胺為48％(重量比)，丙烯腈為1.9％(重量比)。這樣，證實(shí)了在本比較例中，殘留著未反應(yīng)的丙烯腈，反應(yīng)沒有完成。
比較例2作為第二反應(yīng)器，除了連續(xù)地進(jìn)行抽取反應(yīng)液這樣的操作外，其余同實(shí)施例1同樣地進(jìn)行操作，即同第一反應(yīng)器同樣地在預(yù)先裝入400克水的一升玻璃制的燒瓶中，一邊進(jìn)行攪拌，一邊連續(xù)地供給第一反應(yīng)器出口的反應(yīng)液，從而使其液面水平保持一定。
從開始反應(yīng)計(jì)時(shí)在200小時(shí)后通過HPLC分析，對(duì)第二反應(yīng)器出口的反應(yīng)液進(jìn)行分析的結(jié)果，檢測(cè)出反應(yīng)液中的丙烯酰胺為49.5％(重量比)，丙烯腈為3000ppm(重量)。證實(shí)了在本比較例中，殘留著未反應(yīng)的丙烯腈，反應(yīng)沒有完成。
使用本發(fā)明可以高的轉(zhuǎn)化率使腈化合物進(jìn)行水合反應(yīng)而連續(xù)地制造高濃度的酰胺化合物水溶液，也未見到殘留的腈化合物；另外，可在比較短的時(shí)間內(nèi)容易地制造。本發(fā)明的方法可適合用作工業(yè)化生產(chǎn)酰胺化合物的方法。
序列表<110>三井化學(xué)株式會(huì)社<120>制造酰胺化合物的方法<130>F-1893<140>
<141>
<150>JP 2000-091203<151>2000-03-29<160>6<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的說明PCR引物用低核苷酸<400>1aacatcatgc gcaagtcg 18<210>2<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的說明PCR引物用低核苷酸<400>2caggaaacag ctatgac 17<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的說明PCR引物用低核苷酸<400>3ggccagtgcc tagcttacat 20<210>4<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的說明PCR引物用低核苷酸<400>4gttttcccag tcacgac 17<210>5<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的說明PCR引物用低核苷酸<400>5aactggtaca aggagccg 18<210>6<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的說明PCR引物用低核苷酸<400>6ccgaactaca gcgtctac 18
權(quán)利要求
1.一種酰胺化合物的制造方法，在將含有腈水化酶的微生物的菌體或其菌體處理物在水性媒質(zhì)中同腈化合物反應(yīng)而連續(xù)地制造酰胺化合物的方法中，其特征在于將該菌體或其菌體處理物在水性媒質(zhì)中同腈化合物接觸反應(yīng)后所得到的反應(yīng)液在具有活塞式流動(dòng)性流域的條件下再進(jìn)行反應(yīng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制造方法，其特征在于腈化合物是丙烯腈，同微生物的菌體或其菌體處理物接觸時(shí)的水和丙烯腈的比例是相對(duì)于1份(重量)水，丙烯腈為0.4-1.5份(重量)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的制造方法，其特征在于該微生物菌體是在任意宿主中所發(fā)現(xiàn)的由微生物經(jīng)純株培養(yǎng)的腈水化酶的基因的轉(zhuǎn)型變異體。
全文摘要
本發(fā)明是有關(guān)酰胺化合物的制造方法,在將含有腈水化酶的微生物的菌體或其菌體處理物在水性媒質(zhì)中同腈化合物反應(yīng)而連續(xù)地制造酰胺化合物的方法中,其特征在于:將該菌體或其菌體處理物在水性媒質(zhì)中同腈化合物接觸反應(yīng)后,將所得到的反應(yīng)液在具有活塞式流動(dòng)性流域的條件下再進(jìn)行反應(yīng)。使用本發(fā)明,腈化合物的轉(zhuǎn)化率極高,無需濃縮工序,可容易地制得高純度且高濃度的酰胺化合物溶液。
文檔編號(hào)C12N15/60GK1320705SQ0111017
公開日2001年11月7日 申請(qǐng)日期2001年3月28日 優(yōu)先權(quán)日2000年3月29日
發(fā)明者阿部剛也, 伊藤潔, 佐佐木賢樹, 渡邊清一, 立花稔久, 淺野保 申請(qǐng)人:三井化學(xué)株式會(huì)社