2-苯磺酰胺基苯甲酰胺類化合物在肝損傷保護和肝纖維化防治中的應用
【技術領域】：
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥領域，涉及2-苯磺酰胺基苯甲酰胺類化合物在肝病防治中的應 用。
【背景技術】：
[0002] 慢性肝病是威脅人類健康的一個重要問題，每年死于慢性肝病的人數接近80萬。 急慢性肝損傷都會導致肝纖維化（Liverfibrosis)的產生。肝纖維化是肝臟內彌漫性細 胞外基質（extracellularmatrix，ECM)，特別是I型膠原α1過度沉積的病理過程，其細 胞學基礎是肝星狀細胞的活化。肝纖維化是機體對肝損傷的一種修復反應。這種自我修復 并不完美，肝纖維化的進一步發(fā)展會導致肝硬化、肝功能衰竭及門脈高壓，并最終需要肝移 植來延續(xù)生命。著名的肝病專家Rogking在對肝纖維化進行深入研究后提出，人典型的肝 纖維化是可以逆轉的，而一旦發(fā)展到中晚期肝硬化則無法逆轉。由于肝纖維化是各種慢性 肝病的共有病理改變，也是肝硬化、肝癌等嚴重致死性疾病的必經病變過程，因此，研究如 何控制纖維化進程，在各種慢性肝病、肝硬化甚至肝癌的治療和預防中具有重要的意義。隨 著對肝纖維化產生機制及病理過程研究的深入，發(fā)現了越來越多抗肝纖維化的潛在作用靶 點，如TGFP1 及其受體、TIMP1、TLR4、整合素av、大麻素受體（cannabioniodreceptor)、 內皮素A受體（endothelinArec印tor)、Smad7、IL-1/4/6、PDGF、FGF、VEGF、Toll樣受體 (TLR)、ATlR、mT0R等。但是，目前除針對病因治療外，僅有中國批準了兩種中藥一一復方鱉 甲軟肝片和扶正化瘀膠囊用于其治療，其中復方鱉甲軟肝片正在進行IV期臨床試驗，而扶 正化瘀膠囊已在國內完成IV期臨床試驗，目前已經通過美國FDA的臨床II期實驗。除此之 外，國際上尚無其它藥物被批準用于肝纖維化的治療。我國是一個肝病高發(fā)國家，現有1. 2 億HBsAg攜帶者，3000萬慢性HBV患者需要治療。慢性HBV病人經過5~20年后約有12 % 可發(fā)展為肝硬化。此外丙肝、酒精肝、脂肪肝和藥物性肝炎等的發(fā)病率也在逐年上升。因此， 肝損傷保護和肝纖維化新藥的研發(fā)迫在眉睫。
[0003] 2-苯磺酰胺基苯甲酰胺類化合物，是課題組王菊仙副研究員等以Baringhaus等 人篩選的ASBT抑制劑S-1647為先導化合物，經結構改造得到的一系列新型苯磺酰胺基苯 甲酰胺類衍生物。目前，據文獻報道，該類化合物具有抗炎、抗菌、抗腫瘤、抗膽固醇等活性。 近年來，本實驗室利用已構建的基于I型膠原α1基因C0L1A1啟動子藥物篩選靶標的抗 肝纖維化藥物細胞篩選模型，對2-苯磺酰胺基苯甲酰胺類化合物抗纖維化活性進行研究， 發(fā)現該類化合物對C0L1A1啟動子具有不同程度的抑制作用，表明該類化合物具有潛在的 抗肝纖維化活性。本實驗室以Ν-(3, 4, 5-三氯苯基）-2-(3-硝基苯磺酰胺基）苯甲酰胺 (16-4)、N-(2, 4-二氯苯基）-2-(3-硝基苯磺酰胺基）苯甲酰胺（16-5)和N-(3, 4-二氯苯 基）-2-(3-三氟甲氧基苯磺酰胺基）苯甲酰胺（17-15)為代表化合物，對其體外抗肝纖維 化作用進行了深入地研究，并在考察化合物安全性的基礎上，從體內動物模型中進一步驗 證了化合物16-4和16-5對化學誘導劑α-萘異硫氰酸酯（alpha-naphthylisothiocyan ate，ANIT)所致肝損傷的保護作用以及16-4抗膽管結扎肝纖維化作用。本實驗研究所述 2_苯磺酰胺基苯甲酰胺類化合物的肝損傷保護作用和抗纖維化活性，迄今尚未見有國內外 的相關報道。

【發(fā)明內容】
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[0004] 本發(fā)明提供了2-苯磺酰胺基苯甲酰胺類化合物在肝損傷保護和制備抗肝纖維化 藥物或保健品中的應用。
[0005] 本發(fā)明以I型膠原α1基因C0L1A1啟動子作為藥物篩選靶標，將本實驗室構建 的C0L1A1熒光素酶質粒pGL4. 17-C0L1A1與Renailla質粒共轉染人肝星狀細胞LX2,利 用雙熒光素酶報告系統(tǒng)發(fā)現2-苯磺酰胺基苯甲酰胺類化合物對C0L1A1啟動子均具有不 同程度的抑制作用。為確定該類化合物的體外抗肝纖維化作用，本發(fā)明以N-(3, 4, 5-三氯 苯基）-2-(3-硝基苯磺酰胺基）苯甲酰胺（16-4)、N-(2, 4-二氯苯基）-2-(3-硝基苯磺 酰胺基）苯甲酰胺（16-5)和N-(3, 4-二氯苯基）-2-(3-三氟甲氧基苯磺酰胺基）苯甲酰 胺（17-15)為代表化合物，在人肝星狀細胞LX2上進行體外抗肝纖維化實驗研究。利用 Real-timePCR、WesternBlot實驗證明，三個化合物均能顯著地抑制經TGFP1誘導活化的 LX2細胞中肝纖維化主要標志物mRNA水平和蛋白水平的表達。為進一步評價化合物體內藥 效，本發(fā)明首先采用2000mg/kg劑量水平進行急性毒性試驗評估藥物毒性，結果顯示，給藥 14天后各組小鼠體重無明顯下降，并且無中毒跡象及死亡發(fā)生，表明藥物安全性較高，這不 僅為化合物體內藥效學評價提供了依據，也為該類化合物開發(fā)成為藥物或保健品奠定了基 礎。本發(fā)明體內藥效學實驗，首先是利用化學誘導劑α-萘異硫氰酸酯（alpha-naphthylis othiocyanate，ANIT)肝損傷模型，評價16-4和16-5的肝損傷保護作用。肝組織病理切片 染色結果表明，16-4和16-5均能緩解ANIT誘導的肝損傷。與此同時本發(fā)明還利用膽總管 結扎（BDL)肝纖維化模型，系統(tǒng)分析了 16-4給藥后對模型組動物肝功能、肝組織病理改變、 肝組織纖維化程度、膠原纖維含量及肝纖維化相關標志物的影響，結果顯示，16-4能改善模 型組大鼠肝功能和肝臟病理改變，降低肝纖維化的程度，延緩肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展。
[0006] 本發(fā)明用于肝損傷保護和肝纖維化防治時，2-苯磺酰胺基苯甲酰胺類化合物口服 或非口服給藥均屬安全有效的?？诜盟幙梢灾瞥扇魏纬Ｒ?guī)劑型，如片劑、膠囊、散劑、顆粒 等；非口服用藥，可制成注射液針劑等。
[0007] 本發(fā)明所述2-苯磺酰胺基苯甲酰胺類化合物給藥劑量，可根據給藥方式、患病程 度、患者年齡，有無既往病史等因素綜合考慮進行調整。
[0008] 本發(fā)明用于肝損傷保護和制備抗肝纖維化藥物或保健品時，其輔料及制備方法可 選用藥學上可接受的任何形式。
【附圖說明】：
[0009] 圖1-2-苯磺酰胺基苯甲酰胺類化合物16-4、16-5、17-15對I型膠原α 1基因 C0L1A1啟動子活性的抑制作用
[0010] 其中：*ρ〈〇· 05, #ρ〈0· 01與對照組（給藥濃度為零）相比。
[0011] 圖2-Real-timePCR檢測2-苯磺酰胺基苯甲酰胺類化合物16-4、16-5、17-15對 肝纖維化主要標志物mRNA水平的影響
[0012] 其中：*ρ〈0· 05, #ρ〈0· 01與對照組（未誘導活化的LX2細胞）相比，#ρ〈0· 05， ffip〈0. 01與TGFf3 1誘導組（給藥濃度為零）相比。
[0013] 圖3-WesternBlot檢測2-苯磺酰胺基苯甲酰胺類化合物16-4、16-5、17-15對肝 纖維化主要標志物蛋白水平的影響
[0014] 圖4-小鼠急性毒性試驗評價2-苯磺酰胺基苯甲酰胺類化合物16-4U7-15安全 性
[0015] 其中：A圖為16-4給藥組小鼠體重變化情況；B圖為17-15給藥組小鼠體重變化情 況；相對體重=第14天體重/第1天體重。
[0016] 圖5-2-苯磺酰胺基苯甲酰胺類化合物16-4、16-5對α-萘異硫氰酸酯（alpha-n aphthylisothiocyanate,ANIT)所致肝損傷的保護作用
[0017] 其中：A為對照組（未加ANIT)小鼠肝臟組織切片HE染色結果；B為ANIT模型組 小鼠肝臟組織切片HE染色結果；C為16-4給藥組小鼠肝臟組織切片HE染色結果；D為16-5 給藥組小鼠肝臟組織切片HE染色結果。
[0018] 圖6-2-苯磺酰胺基苯甲酰胺類化合物16-4對BDL模型大鼠肝臟病理變化的影響
[0019] 其中：A為假手術組大鼠肝臟組織切片HE染色結果；B為BDL模型組大鼠肝臟組織 切片HE染色結果；C為16-4給藥組大鼠肝臟組織切片HE染色結果；D為對所有動物組織 HE染色雙盲評分的統(tǒng)計圖；#P〈〇. 01與假手術組相比；##P〈〇. 01與BDL模型組相比。
[0020] 圖7-2-苯磺酰胺基苯甲酰胺類化合物16-4對BDL模型大鼠肝纖維化程度的影響
[0021] 其中：A為假手術組大鼠肝臟組織切片Masson染色結果；B為BDL模型組大鼠肝臟 組織切片Masson染色結果；C為16-4給藥組大鼠肝臟組織切片Masson染色結果；D為對所 有動物組織Masson染色雙盲評分的統(tǒng)計圖；#p〈0. 01與假手術組相比；##p〈0. 01與BDL模 型組相比。
[0022] 圖8-2-苯磺酰胺基苯甲酰胺類化合物16-4對大鼠肝臟組織羥脯氨酸含量的影響
[0023] 其中：**p〈0. 01與假手術組相比；ttp〈0. 05與BDL模型組相比。
[0024] 圖9-Real-timePCR檢測2-苯磺酰胺基苯甲酰胺類化合物16-4對大鼠肝臟組織 中肝纖維化相關基因表達的影響
[0025] 其中：#p〈0. 01與假手術組相比；#p〈0. 05, ##p〈0. 01與BDL模型組相比。圖 10-WesternBlot檢測2-苯磺酰胺基苯甲酰胺類化合物16-4對大鼠肝臟組織中肝纖維化 主要蛋白表達的影響
【具體實施方式】：
[0026] 下面結合附圖和實施例對本發(fā)明進行詳細描述，但所述內容是對本發(fā)明的解釋而 不是限定。
[0027] 《實施例1》雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測2-苯磺酰胺基苯甲酰胺類化合物16-4、 16-5、17-15抑制I型膠原α1基因C0L1A1啟動子活性試驗
[0028] 在37°C，5%C02條件下，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基（Gibco)培養(yǎng)人肝星 狀細胞LX2。待細胞匯合度約95%后，以每孔2X104個細胞鋪于96孔白板。待細胞匯 合度約90%，換成不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基（Gibco)無血清培養(yǎng)24h，用Lip〇2000將 pGL4. 17-C0L1A1與Renailla質粒共轉染LX2細胞，轉染6h后加TGF0 1 (2ng/ml)誘導，同 時加入不同濃度的 16-4、16-5、17-15，濃度分別為1以111〇1.1^1、5 41]1〇1.1^1、1〇41]1〇1.1^1，每 組實驗設至少3個復孔，繼續(xù)培養(yǎng)24h。按照Dual-Glo?LuciferaseAssaySystem說明 書操作步驟，吸棄培養(yǎng)基，PBS漂洗一遍。加入lxPLB20μL/孔，裂解細胞（15min