專利名稱：通過(guò)猝滅團(tuán)體感應(yīng)信號(hào)防治細(xì)菌疾病的細(xì)菌菌株、基因和酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及編碼細(xì)菌代謝調(diào)節(jié)物的基因，尤其涉及編碼猝滅團(tuán)體感應(yīng)(quorum-sensing)信號(hào)的酶的基因。本發(fā)明還涉及防治細(xì)菌疾病的方法，所述方法包含表達(dá)編碼自體誘導(dǎo)物抑制劑的基因。
背景技術(shù)：
N-?；?高絲氨酸內(nèi)酯，已知是自體誘導(dǎo)物(autoinducers，AI)，是存在于許多革蘭氏陰性菌的團(tuán)體感應(yīng)系統(tǒng)中的廣泛保守的信號(hào)分子。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)AI參與調(diào)節(jié)許多生物功能，包括在弧菌種屬中的生物發(fā)光功能(Eberhard等，1981；Cao和Meighen，1989)，在根癌土壤桿菌中Ti質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移(Zhang等，1993)，在胡蘿卜軟腐歐文氏菌(Erwiniacarotovora)，菊歐文氏菌(Erw.Chrysanthemi)，斯氏泛菌(Erw.Stewartii)，銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，茄伯克霍爾德氏菌(P.Solanacerum)，和嗜線蟲致病桿菌(Xenorhabdus nematophilus)中產(chǎn)生毒力基因(Jones等，1993；Passador等，1993；Pirhonen等，1993；Pearson等，1994；Beck von Bodman和Farrand，1995；Flavier等，1998；Costa和Loper，1997；Nasser等，1998)，在致金色假單胞菌(P.Aureofaciens)和胡蘿卜軟腐歐文氏菌中調(diào)節(jié)抗生素產(chǎn)生(Costa和Loper，1997；Pierson等，1994)，在液化沙雷氏菌(Serratia liquifaciens)中調(diào)節(jié)游動(dòng)能力(swarming motility)(Eberl等，1996)，及在熒光假單胞菌(P.fluorescens)和銅綠假單胞菌中形成生物膜(Allison等，1998；Davies等，1998)。已知許多細(xì)菌種屬產(chǎn)生AI，但相關(guān)生物學(xué)功能還未確定(Bassler等，1997；Dumenyo等，1998；Cha等，1998)。生物膜形成對(duì)細(xì)菌的致病性是特別重要的，其使細(xì)菌對(duì)抗生素和宿主防御應(yīng)答更具抗性，而且在醫(yī)療設(shè)施和飲用水管道中導(dǎo)致微生物污染。
不同的細(xì)菌菌種可以產(chǎn)生不同的AI。所有的AI衍生物均呈現(xiàn)相同的高絲氨酸內(nèi)酯組分，但其酰基團(tuán)的長(zhǎng)度和結(jié)構(gòu)不同。盡管由AI調(diào)節(jié)的靶基因是非常不同的，但AI生物合成和基因調(diào)節(jié)的基本機(jī)制在不同的細(xì)菌中看起來(lái)是不變的。AI的基因調(diào)節(jié)的一般特點(diǎn)是細(xì)胞密度依賴性，也稱為團(tuán)體感應(yīng)。在低細(xì)胞密度，AI是低濃度的，在高細(xì)胞密度，AI可以積聚達(dá)到一定的濃度，從而足以激活相關(guān)的調(diào)節(jié)基因(Fuqua和Winans，1996)。由AI調(diào)節(jié)的生物學(xué)功能在學(xué)術(shù)、經(jīng)濟(jì)和醫(yī)學(xué)上具有相當(dāng)?shù)闹匾?。正或?fù)調(diào)節(jié)細(xì)菌團(tuán)體感應(yīng)系統(tǒng)的新措施不僅在學(xué)術(shù)方面，在實(shí)際應(yīng)用方面也有重要價(jià)值。
近來(lái)已經(jīng)報(bào)道一種編碼自體誘導(dǎo)物滅活的新基因(aiiA)，已經(jīng)從革蘭氏陽(yáng)性芽孢桿菌屬菌株240B1中克隆(Dong等，2000)。胡蘿卜軟腐歐文氏菌菌株SCG1是在許多植物中導(dǎo)致軟腐病的一種病原體，在轉(zhuǎn)化的胡蘿卜軟腐歐文氏菌菌株SCG1中表達(dá)aiiA，可明顯減少AI的釋放，降低胞外pectrolytic酶活性，并弱化其對(duì)馬鈴薯，茄子，白菜，胡蘿卜，芹菜，花椰菜和煙草的致病性胡蘿卜軟腐歐文氏菌。這些結(jié)果表明使用AI滅活措施來(lái)預(yù)防一些其毒力由團(tuán)體感應(yīng)信號(hào)調(diào)節(jié)的疾病具有很大的潛力。
發(fā)明概述能有效滅活N-?；呓z氨酸內(nèi)酯自體誘導(dǎo)物(AI)的細(xì)菌菌株和酶具有相當(dāng)大的生物技術(shù)應(yīng)用價(jià)值。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，所有經(jīng)測(cè)試的蘇云金芽孢桿菌菌株及其密切相關(guān)的菌種均能酶促滅活A(yù)I。通過(guò)Tn5插入誘變產(chǎn)生的一個(gè)根癌土壤桿菌菌株A6的AI合成負(fù)突變體，也發(fā)現(xiàn)其能產(chǎn)生AI滅活酶。從選擇的細(xì)菌菌株中，通過(guò)功能克隆方法或通過(guò)PCR方法克隆編碼AI滅活酶的基因。肽序列對(duì)比表明所有這些酶均屬于金屬水解酶家族，與先前報(bào)道的AiiA酶具有35.4％-94.0％的氨基酸相同性。當(dāng)與產(chǎn)生AI的致病細(xì)菌共同培養(yǎng)時(shí)，蘇云金芽孢桿菌菌株有效猝滅AI活性，并可有效地生物防治由胡蘿卜軟腐歐文氏菌導(dǎo)致的馬鈴薯軟腐病。這些結(jié)果提示猝滅調(diào)節(jié)毒力的生物信號(hào)是防治疾病的一種有效策略，而且已知具有殺蟲作用的蘇云金芽孢桿菌菌株也可作為一類大有希望的生物防治劑以用于預(yù)防那些其毒力是由AI調(diào)節(jié)的疾病。
附圖簡(jiǎn)述


圖1示出通過(guò)根癌土壤桿菌菌株M103的蛋白質(zhì)提取物滅活A(yù)I(OOHL)的時(shí)程。M103的總蛋白質(zhì)是通過(guò)在1/15M磷酸鹽緩沖液(pH8.0)中超聲破壞細(xì)菌細(xì)胞提取的。將等體積的M103蛋白提取物(1.46mg/ml)和5000nM OOHL混合，并在1.5ml Eppendorf離心管中在28℃溫育。將同樣的蛋白質(zhì)提取物通過(guò)煮沸5分鐘變性并用作對(duì)照。在反應(yīng)后1，3，6小時(shí)取樣品，并通過(guò)煮沸3分鐘中止反應(yīng)。分析樣品的AI活性。
圖2示出來(lái)自突變體M103的粘?？寺〉腁I滅活區(qū)的克隆。兩個(gè)粘?？寺“谡沉］d體pLAFR3中，而4個(gè)亞克隆在質(zhì)粒載體pBluescript II SK(+)中。符號(hào)+，在AI滅活中是陽(yáng)性的；-，在AI滅活中是陰性的；EEcoRI；PPstI。
圖3示出(A)，用序列分析程序推定的1.5kb AI滅活區(qū)中潛在的ORFs；及(B)，缺失分析以確定編碼AI滅活酶(AiiB)的ORF。將PCR擴(kuò)增的片段克隆入載體pBluescript II SK(+)(pBM克隆)或載體pKK223-3(pKM克隆)中。每個(gè)克隆下的數(shù)字表示相當(dāng)于所述1.5kb區(qū)的核苷酸序列的PCR片段的起始和終止位置。通過(guò)測(cè)序分析證實(shí)所有的構(gòu)建體。aiiB ORF的起始密碼子(GTG)和終止密碼子(TAA)示于克隆pKM103-315之下。
實(shí)線箭頭表示在這些克隆中l(wèi)ac和tac啟動(dòng)子的位置和方向，ORFs是用虛線箭頭表示的。符號(hào)+，陽(yáng)性AI滅活活性；-，陰性AI滅活活性。
圖4示出從根癌土壤桿菌M103中克隆的aiiB具有的(A)，核苷酸序列(SEQ ID NO1)，和(B)，推定的肽序列(SEQ ID NO11)。下劃線處是推導(dǎo)的核糖體結(jié)合(SD)區(qū)和兩個(gè)PstI限制酶位點(diǎn)，并表示出了推導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄終止密碼子。
圖5示出AiiB(SEQ ID NO11)和AttM(SEQ ID NO21)蛋白質(zhì)序列對(duì)比，所述AttM是在根癌土壤桿菌的att區(qū)域中由attM基因編碼的一種推導(dǎo)的蛋白質(zhì)，但其功能還未經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)(基因庫(kù)登記號(hào)No.U59485)。這兩種蛋白質(zhì)呈現(xiàn)高度相似性(中心序列表示共有序列，4個(gè)片段等同于SEQ ID NO11的8-43，45-158，160-186和188-263位氨基酸)，但功能性AiiB蛋白在N末端具有額外的7個(gè)氨基酸。
圖6示出AiiB(SEQ ID NO11)和AiiA(SEQ ID NO22)的蛋白質(zhì)序列對(duì)比，AiiA是滅活克隆自芽孢桿菌屬240B1的AI的一種推導(dǎo)的金屬水解酶。下劃線處是兩個(gè)保守的鋅結(jié)合區(qū)。
圖7示出aiiC基因的功能性克隆。(A)，通過(guò)懸浮培養(yǎng)Bt菌株酶促滅活A(yù)I。將等體積的細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物(OD600＝1.1)和40uM OOHL混合，并在28℃溫育(▲)。將煮沸的培養(yǎng)物和同濃度的OOHL用作對(duì)照(■)。在所示時(shí)間取樣品進(jìn)行AI活性分析。(B)，從蘇云金芽孢桿菌Cotl的粘粒克隆pLAFR3-aiiC中直接亞克隆AI-滅活區(qū)。將粘?？寺∮肊coRI消化并亞克隆至pGEM-7Z載體中。通過(guò)酶活性分析鑒別AI滅活陽(yáng)性克隆pGEM7-aiiC。在BamHI消化后，將pGEM7aiiC進(jìn)一步亞克隆至pBluescript II SK(+)載體中。將包含于克隆pBSaiiC中的大約1.4kb的AI滅活區(qū)完整測(cè)序。限制酶EEcoRI；BBamHI。
圖8示出從Bt菌株Cotl中克隆的aiiC基因的(A)，核苷酸序列(SEQID NO2)和(B)推定的肽序列(SEQ ID NO12)。aiiC ORF的核苷酸序列是用大寫字母表示的，未翻譯區(qū)是用小寫字母表示的。
圖9示出分別來(lái)自Bt菌株B1，B2，B17，B18，B20，B21，B22和B25的基因aiiD(SEQ ID NOS 3和13)，aiiE(SEQ ID NOS 4和14)，aiiF(SEQ ID NOS 5和15)，aiiG(SEQ ID NOS 6和16)，aiiH(SEQ ID NOS 7和17)，aiiI(SEQ ID NOS 8和18)，aiiJ(SEQ IDNOS 9和19)和aiiK(SEQ ID NOS 10和20)的核苷酸序列和推定的蛋白質(zhì)序列(括號(hào)內(nèi))。
圖10示出11個(gè)克隆的AI滅活基因的系統(tǒng)樹分析和氨基酸相同性。所述系統(tǒng)樹是通過(guò)DNASTAR序列分析軟件(DNASTAR Inc.)產(chǎn)生的。距離在樹下示出。每個(gè)樣品與AiiA的氨基酸相同性在圖的右手側(cè)示出。
圖11示出Bt菌株對(duì)胡蘿卜軟腐歐文氏菌產(chǎn)生AI的作用。將胡蘿卜軟腐歐文氏菌SCG1單獨(dú)接種在15ml的LB培養(yǎng)基中(◆)，或分別與以下菌株一起以1∶1比例共同接種在相同培養(yǎng)基中Bt菌株Cotl(△)和B1(●)，大腸桿菌菌株DH5α(▲)及梭形氣芽孢桿菌(■)。SCG1的接種濃度(T0)為1×107CFU/ml(菌落形成單位/ml)，其它為1×106CFU/ml。在30℃溫育1，2，3，4，6和24小時(shí)后，取細(xì)菌懸浮液并將上清用于生物學(xué)分析產(chǎn)生的AI。數(shù)據(jù)是4次重復(fù)試驗(yàn)的平均值。
圖12示出Bt菌株Cotl對(duì)胡蘿卜軟腐歐文氏菌SCG1所致的馬鈴薯軟腐病的防治作用。浸漬將馬鈴薯切片浸漬在水平為大約5×108CFU/ml的Bt菌株Cotl(C)，大腸桿菌DH5α(D)或梭形氣芽孢桿菌(Bf)懸浮液中，或浸漬在水(W)中，時(shí)間為20秒，然后在無(wú)菌氣流中干燥大約20分鐘。將表面無(wú)水分的切片用2.5μl的細(xì)菌懸浮液接種，所述懸浮液含有等于5×105或5×104CFU的SCG1細(xì)胞?；旌衔飳CG1的細(xì)胞培養(yǎng)物(2×108或2×107CFU/ml)分別與等體積的Cotl(C)，大腸桿菌DH5α(D)，梭形氣芽孢桿菌(Bf)(5×108CFU/ml)或水(W)混合。將2.5μl的所述混合物接種于切片上部。接種的SCG1的最終細(xì)胞數(shù)目是2.5×105或2.5×104CFU，在圖下的第二條線表示。在28℃溫育20小時(shí)后，測(cè)定軟化部位的面積。數(shù)據(jù)是4或12次(對(duì)Cotl是12次)重復(fù)試驗(yàn)的平均值。
圖13示出Bt菌株Cotl和B1對(duì)胡蘿卜軟腐歐文氏菌SCG1生長(zhǎng)的影響。將胡蘿卜軟腐歐文氏菌SCG1(■)單獨(dú)接種于或分別與Bt菌株Cotl(◆)和B1(▲)一起以1∶1比例接種于15ml LB培養(yǎng)基中。在T0培養(yǎng)基中，每個(gè)菌株的接種終濃度SCG1為大約1×107CFU/ml，其它的為1×106CFU/ml。在30℃培養(yǎng)2，4，6和24小時(shí)后，取細(xì)菌懸浮液，并稀釋以涂布于平板上計(jì)數(shù)菌落。將所述試驗(yàn)重復(fù)4次，以平均值表示結(jié)果。上方將SCG1，Cotl和B1溫育并單獨(dú)生長(zhǎng)；中間將SCG1與Cotl一起溫育；下方將SCG1與B1一起溫育。
圖14示出接種的馬鈴薯切片上細(xì)菌細(xì)胞數(shù)目的變化(A)，及軟腐癥狀的發(fā)生(B)。將馬鈴薯切片浸漬在Cotl懸浮液中(5×108CFU/ml)(▲)或水(◆)，時(shí)間為20秒，然后在層流室中干燥大約20分鐘。然后將切片用5μl的胡蘿卜軟腐歐文氏菌SCG1接種(2×109CFU/ml)。在28℃溫育1，2，3和4天后，將接種的切片切成小片，并加入10ml的0.1M的NaCl溶液以重懸所述細(xì)菌細(xì)胞。將混合物搖動(dòng)30分鐘，并將懸浮液稀釋，涂布于平板上計(jì)數(shù)菌落。SCG1的菌落數(shù)示為log10CFU/切片(▲，只有SCG1；■，在Cotl中浸漬)，Cotl的菌落數(shù)為log10CFU/mm2(◆)。將試驗(yàn)重復(fù)4次，取平均數(shù)據(jù)表示結(jié)果。
發(fā)明詳述已經(jīng)從9個(gè)革蘭氏陽(yáng)性菌分離株和1個(gè)革蘭氏陰性菌(根癌土壤桿菌)中克隆了編碼AI滅活酶的10個(gè)基因。這些基因示出與aiiA基因具有不同水平的同源性，所述aiiA編碼一種具有強(qiáng)AI滅活活性的推定的金屬水解酶(Dong等，2000)。與AiiA相似，在這些新克隆的AI滅活基因編碼的酶蛋白中，鋅結(jié)合基序區(qū)是高保守的。很可能這10個(gè)基因也是金屬水解酶家族成員，并使用與AiiA相同的分子學(xué)機(jī)制滅活N-酰基高絲氨酸內(nèi)酯自體誘導(dǎo)物。本發(fā)明進(jìn)一步豐富了AI滅活酶的基因集合。
在根癌土壤桿菌中，N-酰基高絲氨酸內(nèi)酯自體誘導(dǎo)物，主要是OOHL，參與調(diào)節(jié)Ti質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移(Zhang等，1993)。OOHL在根癌土壤桿菌中的產(chǎn)生是通過(guò)冠癭瘤分泌的接合冠癭氨基酸誘導(dǎo)的(Zhang和Kerr，1991)。反過(guò)來(lái)OOHL誘導(dǎo)tra基因表達(dá)。Tra蛋白負(fù)責(zé)完成Ti質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的過(guò)程。從冠癭氨基酸產(chǎn)生到完成Ti質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移只需要幾個(gè)小時(shí)，因此Ti質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移可以認(rèn)為是瞬時(shí)的。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，在根癌土壤桿菌中鑒別的針對(duì)N-?；呓z氨酸內(nèi)酯降解的aiiB基因，突出了所述細(xì)菌具有防治AI信號(hào)翻轉(zhuǎn)的復(fù)雜機(jī)制的可能性。似乎可能的是AI在完成Ti質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移后在土壤桿菌屬中降解。
已經(jīng)注意到大多數(shù)能滅活A(yù)I的細(xì)菌分離株是革蘭氏陽(yáng)性的，屬于蘇云金芽孢桿菌及密切相關(guān)的種屬。迄今為止，大多數(shù)以被描述的革蘭氏陰性菌的團(tuán)體感應(yīng)信號(hào)是N-酰基高絲氨酸內(nèi)酯(Fuqua等，1996)，而革蘭氏陽(yáng)性菌產(chǎn)生寡肽作為團(tuán)體感應(yīng)信號(hào)(Dunny和Leonard，1997)。
在過(guò)去的30年中，蘇云金芽孢桿菌(Bt)已經(jīng)廣泛用作殺微生物劑。所述微生物是革蘭氏陽(yáng)性的產(chǎn)芽孢土壤桿菌，并在孢子形成期間產(chǎn)生由一或多個(gè)晶體(Cry)蛋白組成的伴孢晶體，其示出對(duì)昆蟲家族如鱗翅目昆蟲，雙翅目昆蟲，和鞘翅目昆蟲幼蟲期的殺滅活性(Lambert和Peferoen，1992)。還報(bào)道了一些Bt菌株具有抗其它昆蟲家族，以及螨蟲，線蟲，扁形動(dòng)物和原生動(dòng)物的活性(Feitelson等，1992)。不同的Bt菌株產(chǎn)生28種以上不同但相關(guān)的殺昆蟲晶體蛋白基團(tuán)(http//www.biols.susx.ac.uk/Home/Neil Crickmore/Bt/)。不同的晶體蛋白基團(tuán)通常對(duì)一特定范圍的昆蟲屬具有活性，但不影響對(duì)農(nóng)業(yè)有益的其它昆蟲。目前，基于Bt的組方是最廣泛使用的，而且是農(nóng)業(yè)最有效的微生物殺蟲劑。
作為有價(jià)值的生物防治劑，Bt有許多優(yōu)點(diǎn)，包括其對(duì)靶昆蟲具有特異性，低廉的生產(chǎn)費(fèi)用，及其環(huán)境相容性(Lambert和Peferoen，1992)。Bt通常見于天然土壤中，一般通過(guò)細(xì)胞分裂而增殖，但當(dāng)養(yǎng)分缺乏或當(dāng)環(huán)境不利時(shí)產(chǎn)生孢子。這些孢子對(duì)應(yīng)激條件如熱和干旱具有高度抗性，使細(xì)菌在應(yīng)激條件下存活一段時(shí)間。這個(gè)形成孢子的革蘭氏陽(yáng)性微生物易于制成穩(wěn)定的產(chǎn)物，如干粉，以用于對(duì)昆蟲或疾病的生物防治。Bt也已經(jīng)進(jìn)行了許多安全性測(cè)試，對(duì)動(dòng)物和人沒(méi)有有害作用。
Bt還未開發(fā)用于疾病防治，因?yàn)槠渫ǔ２划a(chǎn)生有效的抗細(xì)菌和真菌的抗生素。在本發(fā)明中，發(fā)現(xiàn)所有測(cè)試的Bt菌株均能滅活A(yù)I，而且這個(gè)Bt菌株提供有效抗胡蘿卜軟腐歐文氏菌感染的生物防治作用，而不具有AI滅活基因的梭形氣芽孢桿菌和大腸桿菌菌株不能提供抗胡蘿卜軟腐歐文氏菌的生物防治作用。Bt菌株不產(chǎn)生任何抗生素，且不抑制病原體的生長(zhǎng)。這些結(jié)果明顯提示AI滅活基因在疾病防治中的重要作用。由于AI易于擴(kuò)散至細(xì)菌細(xì)胞中，因此能將AI從其周圍環(huán)境中持續(xù)消除的Bt是一種有前途的生物防治劑，不僅可用于防治由胡蘿卜軟腐歐文氏菌引起的植物軟腐病，還可用于防治其中毒力基因是由AI調(diào)節(jié)的其它疾病。
因此，本發(fā)明的一方面是提供一種提高植物或動(dòng)物對(duì)毒力是由AI調(diào)節(jié)的疾病的抗性的方法(如由銅綠假單胞菌，斯氏泛菌，菊歐文氏菌，茄伯克霍爾德氏菌，和野油菜黃單胞菌(Passador等1993；Pirhonen等，1993；Pearson等，1994；Beck von Bodman和Farrand，1995；Barber等，1997；Clough等，1997；Costa和Loper，1997；Nasser等，1998)引起的疾病，尤其是由胡蘿卜軟腐歐文氏菌引起的植物軟腐病)，包括為所述植物或動(dòng)物施用有效量的細(xì)菌，所述細(xì)菌能產(chǎn)生一種自體誘導(dǎo)物抑制劑。在本發(fā)明這方面的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，施用的細(xì)菌是芽孢桿菌屬，更優(yōu)選的是各種蘇云金芽孢桿菌，最優(yōu)選的是選自B1，B2，B17，B18，B20，B21，B22和B25的各種蘇云金芽孢桿菌。在本發(fā)明此方面的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所處理的動(dòng)物優(yōu)選是人。
本發(fā)明另一目的是提供分離的編碼自體誘導(dǎo)物滅活蛋白的核酸分子。這些核酸分子編碼自體誘導(dǎo)物滅活蛋白，其呈現(xiàn)保守的氨基酸基序104HXHXDH109～60aa～H169～21aa～D191，或相似的基序103HXHXDH108～72aa～H180～21aa～D202。這些核酸分子優(yōu)選編碼SEQ ID NO11-20的蛋白，最優(yōu)選這些核酸分子具有SEQ ID NO1-10的序列。
本發(fā)明另一目的是提供一種表達(dá)載體，其包含至少一個(gè)編碼自體誘導(dǎo)物滅活蛋白的核酸序列，其中編碼的蛋白包含保守的氨基酸基序104HXHXDH109～60aa～H169～21aa～D191，或類似的基序103HXHXDH108～72aa～H180～21aa～D202，其中所述表達(dá)載體在原核或真核細(xì)胞中增殖。這些表達(dá)載體優(yōu)選包含至少一個(gè)核酸序列，所述核酸序列編碼具有選自SEQ ID NO11-20序列的蛋白質(zhì)，最優(yōu)選具有SEQ ID NO1-10的核酸序列。
本發(fā)明的另一目的是提供一種用本發(fā)明表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。
本發(fā)明的又一目的是提供一種分離的具有自體誘導(dǎo)物滅活活性的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白包含保守的氨基酸序列104HXHXDH109～60aa～H169～21aa～D191，或相似基序103HXHXDH108～72aa～H180～21aa～D202。本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案包含具有SEQ ID NO11-20氨基酸序列的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的再一目的是提供一種提高植物或動(dòng)物對(duì)疾病的抗性的方法，所述方法包括將至少一種編碼自體誘導(dǎo)物滅活蛋白的核酸分子導(dǎo)入這種植物或動(dòng)物細(xì)胞中，以使所述細(xì)胞表達(dá)所述核酸序列，其中所述自體誘導(dǎo)物滅活蛋白包含保守的氨基酸序列104HXHXDH109～60aa～H169～21aa～D191，或相似基序103HXHXDH108～72aa～H180～21aa～D202。本發(fā)明此方面的優(yōu)選實(shí)施方案包括導(dǎo)入至少一種核酸分子，所述核酸分子編碼具有選自SEQ ID NO11-20序列的蛋白質(zhì)，及最優(yōu)選的實(shí)施方案可導(dǎo)入至少一種核酸序列，所述核酸序列選自SEQ ID NO1-10。
本發(fā)明的另一目的涉及一種預(yù)防或降低細(xì)菌對(duì)植物或動(dòng)物損害的方法，所述方法包括為需要這種預(yù)防或降低損害的植物或動(dòng)物施用有效量的至少一種自體誘導(dǎo)物滅活蛋白，其中所述蛋白包含保守的氨基酸序列104HXHXDH109～60aa～H169～21aa～D191，或相似基序103HXHXDH108～72aa～H180～21aa～D202。本發(fā)明此方面的優(yōu)選實(shí)施方案包含至少提供具有SEQ ID NO11-20氨基酸序列的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的另一目的涉及一種預(yù)防或降低細(xì)菌生物膜形成的方法，所述方法包括將形成生物膜的細(xì)菌暴露于至少一種自體誘導(dǎo)物抑制蛋白，其中所述蛋白包含保守氨基酸序列104HXHXDH109～60aa～H169～21aa～D191，或相似基序103HXHXDH108～72aa～H180～21aa～D202。本發(fā)明此方面優(yōu)選的實(shí)施方案包括將形成生物膜的細(xì)菌暴露于至少具有SEQ ID NO11-20氨基酸序列的蛋白質(zhì)。
使用遺傳方法修飾此類菌株，例如通過(guò)導(dǎo)入編碼額外的或更具活性的自體誘導(dǎo)物抑制劑的基因，有可能進(jìn)一步增強(qiáng)Aii-產(chǎn)生菌株的效力。通過(guò)體外DNA進(jìn)化方法，也可以使aii基因的酶活性最佳化。通過(guò)將aii基因偶聯(lián)于強(qiáng)啟動(dòng)子或提高Bt細(xì)胞中aii基因的拷貝數(shù)而提高Aii酶的表達(dá)，是增強(qiáng)Bt菌株猝滅AI信號(hào)能力的另一種有效方式。分泌AI滅活酶或在細(xì)胞外膜中含有所述酶的經(jīng)遺傳修飾的Bt菌株，其猝滅AI信號(hào)的效力比其野生型親代菌株更好。這可以通過(guò)將aii基因與編碼分泌信號(hào)肽或膜附著信號(hào)肽的序列融合而實(shí)現(xiàn)。
可以通過(guò)熟知的方法將所述序列導(dǎo)入植物或動(dòng)物細(xì)胞中。用外源核酸序列轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞的方法包括轉(zhuǎn)染，發(fā)射轟擊，電穿孔或通過(guò)根癌土壤桿菌感染。這些方法是分子生物學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，在此不需要詳細(xì)闡述。
由于病原菌細(xì)胞限于植物組織的細(xì)胞間區(qū)域，因此需要將Aii蛋白導(dǎo)向細(xì)胞間隙。這可以通過(guò)將分泌信號(hào)肽融合于Aii蛋白而實(shí)現(xiàn)(Sato等，1995；Firek等，1993；Conrad和Fiedler，1998；Borisjuk等，1999)?；蛘撸梢詫⒅参锬じ街驌饺階ii肽序列中，以將Aii酶錨定在植物細(xì)胞膜的外表面。
本發(fā)明還涵蓋了細(xì)菌自體誘導(dǎo)物滅活蛋白在直接治療或預(yù)防細(xì)菌損害方面的用途。例如，可以將所述蛋白直接用于需要這種治療或預(yù)防的植物中。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述蛋白是以組合物形式應(yīng)用的，所述組合物包含有效量的所述蛋白質(zhì)和一種適當(dāng)?shù)妮d體。所述組合物可以是各種形式的，包括溶液，粉末，乳狀液，分散液，膏狀，氣霧劑等。
所述細(xì)菌自體誘導(dǎo)物滅活蛋白也可以用于治療動(dòng)物包括人體內(nèi)的細(xì)菌感染。在這樣的應(yīng)用中，將有效量的活性成分施用于需要這種治療的動(dòng)物。
針對(duì)治療性處理，所述活性成分可以配制為藥用組合物，除了有效量的活性成分之外，可以包括可藥用的載體，稀釋劑，緩沖劑，防腐劑，表面活性劑等。如果必需或需要，組合物還可以包括一或多種其它活性成分。
本發(fā)明的藥物組合物可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種方式施用。可以例如局部，口服，吸入，或非腸道施用。局部施用配方可以包括軟膏，洗液，乳劑，凝膠，滴劑，栓劑，噴霧劑，液體和粉末。口服配方包括例如粉末，顆粒，在水或非水介質(zhì)中的懸浮液或溶液，膠囊或片劑。如果需要可以使用增稠劑，香料，稀釋劑，乳化劑，分散劑或結(jié)合劑。非腸道配方可以包括無(wú)菌水溶液，其也可以含有緩沖劑，稀釋劑和其它適當(dāng)添加劑。劑量應(yīng)用方案依賴于許多易于確定的因素，如所治療的病變的嚴(yán)重程度和反應(yīng)。
傳統(tǒng)地，微生物的生物防治依賴于抗生素或抗微生物化合物的產(chǎn)生(Cronin等，1997；Liao和Sapers，1999；Emmert和Handelsman，1999)。本發(fā)明提供了另一種生物防治策略，其基于猝滅毒力所必需的生物信號(hào)。
實(shí)施例1能滅活自體誘導(dǎo)物的細(xì)菌菌株為鑒別負(fù)責(zé)滅活自體誘導(dǎo)物信號(hào)的基因，對(duì)400個(gè)以上的土壤和植物細(xì)菌分離株及大約100個(gè)實(shí)驗(yàn)室細(xì)菌培養(yǎng)物進(jìn)行了篩選。用于測(cè)試滅活自體誘導(dǎo)物信號(hào)能力的所述細(xì)菌菌株，可如前所述分離自土壤和植物懸浮液(Dong等，2000)，或者得自芽孢桿菌Genetic StockCentre(BGSC)和美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)。胡蘿卜軟腐歐文氏菌SCG1分離自出現(xiàn)軟腐癥狀的中國(guó)白菜葉，其已從16S DNA序列、及其特征性產(chǎn)生自體誘導(dǎo)物及在馬鈴薯和中國(guó)白菜中導(dǎo)致軟腐病得到證實(shí)。將這些菌株在28℃在Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，當(dāng)必需時(shí)進(jìn)行搖動(dòng)培養(yǎng)。將根癌土壤桿菌菌株在28℃在YEB中，在BM基本培養(yǎng)基(基本營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，添加甘露醇作為唯一碳源)，或在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上(Difco Laboratories)生長(zhǎng)。終濃度為0.2％的甘露醇在基本培養(yǎng)基中用作唯一碳源。將大腸桿菌菌株在37℃在LB中或LB瓊脂平板上生長(zhǎng)。當(dāng)需要時(shí)，加入以下濃度的抗生素50μg/ml利福平，100μg/ml鏈霉素，100μg/ml氨芐青霉素，50μg/ml卡那霉素，和10μg/ml四環(huán)素。培養(yǎng)基中包含50μg/ml的X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-B-D-吡喃半乳糖苷)(Promega)以檢測(cè)β-半乳糖苷酶活性。
有30多個(gè)菌株示出不同水平的AI滅活活性。為定性所述未知分離株，將這些分離株的16S rRNA序列通過(guò)PCR擴(kuò)增加以分析，及隨后進(jìn)行測(cè)序。這些序列研究示出能滅活A(yù)I的這些菌株的16S rRNA序列是與蘇云金芽孢桿菌(Bt)高度同源的。
為測(cè)試其它芽孢桿菌菌株是否也具有AI-滅活活性，選擇已知的菌株蘇云金芽孢桿菌，臘狀芽孢桿菌，蕈狀芽孢桿菌和球形芽孢桿菌進(jìn)行生物分析。為確定細(xì)菌菌株和分離株的AI滅活能力，將自體誘導(dǎo)物，N-β-氧-己?；?L-高絲氨酸內(nèi)酯(OHHL)或N-β-氧-辛酰基-L-高絲氨酸內(nèi)酯(OOHL)，加入到已稀釋為OD600＝1.1的細(xì)菌過(guò)夜培養(yǎng)物中，或加入到蛋白質(zhì)提取物中，OHHL或OOHL的終濃度為20uM，在28℃溫育30分鐘。然后如前所述確定上清中的剩余的AI(Zhang，1993；Dong等，2000)。
表1示出選擇的菌株和一些新鑒別的分離株的AI滅活活性。所有測(cè)試的細(xì)菌菌株，除了球形芽孢桿菌和梭形氣芽孢桿菌之外，均以不同水平的酶活性消除了AI(濃度為20uM OHHL)。這些菌株包括13個(gè)已知的芽孢桿菌菌種(表1中以B打頭的菌株)，1個(gè)已知土壤桿菌菌種和9個(gè)通過(guò)16S rDNA序列分析鑒別的芽孢桿菌菌種。其中，12個(gè)細(xì)菌菌株示出高水平AI滅活活性(＞30μM/h/OD600)；8個(gè)示出中等水平活性(25-30μM/h/OD600)；及根癌土壤桿菌菌株M103示出低水平活性(4.5μM/h/OD600)。除了根癌土壤桿菌之外，所有這些AI滅活菌株均為革蘭氏陽(yáng)性并屬于蘇云金芽孢桿菌或其密切相關(guān)菌種。
表1 細(xì)菌菌株及其AI滅活活性菌株 來(lái)源酶活性(μM/h/OD600)28-32 蘇云金芽孢桿菌 此項(xiàng)研究 32.4±1.1258-3 蘇云金芽孢桿菌 此項(xiàng)研究 32.5±1.269 蘇云金芽孢桿菌 此項(xiàng)研究 30.9±2.360-1 蘇云金芽孢桿菌 此項(xiàng)研究 28.2±5.1250蘇云金芽孢桿菌 此項(xiàng)研究 23.4±3.9262蘇云金芽孢桿菌 此項(xiàng)研究 23.1±1.5B18蘇云金芽孢桿菌 此項(xiàng)研究 27.4±3.0B20蘇云金芽孢桿菌 此項(xiàng)研究 32.7±2.4B21蘇云金芽孢桿菌 此項(xiàng)研究 33.1±0.8B22蘇云金芽孢桿菌庫(kù)爾斯塔克亞種*此項(xiàng)研究 32.8±1.3B23蘇云金芽孢桿菌以色列亞種*BGSC(4Q7)26.7±3.5B1 蘇云金芽孢桿菌蘇云金亞種BGSC(4A3)32.5±0.3B2 蘇云金芽孢桿菌 庫(kù)爾斯塔克亞種 BGSC(4D1)33.0±0.6B12蘇云金芽孢桿菌鲇澤亞種 BGSC(4J4)33.5±0.9B17蘇云金芽孢桿菌武漢亞種 Mycogen(PSS2A1) 28.8±4.1B25蠟狀芽孢桿菌此項(xiàng)研究 33.7±0.8B14579 蠟狀芽孢桿菌ATCC(14579) 31.7±0.6B6462 蕈狀芽孢桿菌ATCC(6462) 29.8±2.2240B 芽孢桿菌屬 此項(xiàng)研究 33.0±1.0Cot蘇云金芽孢桿菌 此項(xiàng)研究 25.1±2.4M103 根癌土壤桿菌此項(xiàng)研究 4.5269梭形氣芽孢桿菌 此項(xiàng)研究 0B29球形芽孢桿菌BGSC(12A4) 0*不含質(zhì)粒(Plasmid minus)**將等體積的細(xì)菌懸浮液(來(lái)自過(guò)夜培養(yǎng)物，稀釋為OD600＝1.1)和OHHL(40μM)在28℃溫育30分鐘，然后如前所述確定上清中剩余的OHHL(Zhang，1993)。所述酶活性以每小時(shí)每OD600細(xì)菌培養(yǎng)物被消化的OOHL的μM值表示。數(shù)值是4次重復(fù)試驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差。以“B”打頭的菌株是已知的桿菌屬。其它桿菌菌株是通過(guò)16S rDNA序列分析鑒別的。
這些證據(jù)提示AI滅活基因位于染色體DNA中，但不在質(zhì)粒中，因?yàn)樘K云金芽孢桿菌庫(kù)爾斯塔克亞種菌株B2及其不含質(zhì)粒的衍生菌株B22，均示出相似水平的酶活性。第二個(gè)不含質(zhì)粒菌株B23屬于蘇云金芽孢桿菌以色列亞種，也能酶促滅活A(yù)I。
為研究滅活A(yù)I的基因的遺傳多樣性，選擇示出高水平，中等及低水平AI-滅活活性的代表性菌株進(jìn)行進(jìn)一步克隆試驗(yàn)。實(shí)施例2從根癌土壤桿菌菌株M103中功能性克隆aiiB基因使用大腸桿菌SM10中自殺質(zhì)粒pSUP10(Simon等，1983)將轉(zhuǎn)座子Tn5插入體導(dǎo)入根癌土壤桿菌章魚肉堿(octopine)菌株A6中，按照Garfinkel和Nester(1980)所述方法進(jìn)行，將細(xì)菌懸浮液涂布于含有卡那霉素(100μg/ml)的BM基本培養(yǎng)平板上。將根癌土壤桿菌突變菌株M103的總DNA用EcoRI部分酶切，從低熔點(diǎn)的瓊脂糖凝膠中回收20-30kb片段并純化。將純化的片段連接于粘粒載體pLAFR3的去磷酸化EcoRI位點(diǎn)(Staskawicz等，1987)。將所述連接混合物用GigapackTMIII XL包裝提取試劑盒(Stratagene)包裝，然后轉(zhuǎn)染入大腸桿菌DH5α中。將在含有四環(huán)素的選擇培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的大約2000個(gè)菌落加以維持，作為根癌土壤桿菌突變體菌株M103的基因組文庫(kù)。將含有Tn5的粘?？寺≡诤锌敲顾氐呐囵B(yǎng)基上選擇，并通過(guò)上述生物分析方法進(jìn)一步分析AI滅活活性。通過(guò)常規(guī)方法亞克隆入測(cè)序載體pGEM-7Zf(+)中(Sambrook等，1989)。使用ABI PrismdRhodamine終止子循環(huán)測(cè)序便利反應(yīng)試劑盒(Perkin-Elmer應(yīng)用生物系統(tǒng))對(duì)兩個(gè)鏈均進(jìn)行測(cè)序。
根癌土壤桿菌菌株A6產(chǎn)生N-?；呓z氨酸內(nèi)酯自體誘導(dǎo)物(AI)，其參與調(diào)節(jié)Ti質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移(Zhang和Kerr，1991)。但其通過(guò)Tn5插入誘變產(chǎn)生的衍生物M103能滅活A(yù)I(表1和
圖1)。菌株A6中編碼AI降解的基因可能是由陰性調(diào)節(jié)物調(diào)節(jié)的，而且Tn5插入導(dǎo)致滅活A(yù)I的基因的組成型表達(dá)。
基于AI滅活基因可以位于Tn5插入位點(diǎn)下游的假設(shè)，含有Tn5轉(zhuǎn)座子的粘粒克隆通過(guò)卡那霉素抗性表型選擇。對(duì)卡那霉素具有抗性的及示出AI滅活活性的兩個(gè)粘粒克隆，得自M103的粘粒文庫(kù)。限制分析和生物分析示出一個(gè)5.2kb的EcoRI片段具有AI滅活活性。進(jìn)一步的亞克隆限定所述區(qū)域?yàn)橐粋€(gè)1.5kb的PstI片段(圖2)。序列分析示出在所述片段內(nèi)存在一些推定的起自ATG或UTG的開放讀框(ORF)。所述ORF之一示出與預(yù)先鑒別的根癌土壤桿菌的attM基因(U59485)具有96.8％核苷酸序列相同性和98％的氨基酸序列相同性。然而，當(dāng)通過(guò)表達(dá)載體pKK223-3在大腸桿菌中表達(dá)attM中時(shí)，未檢測(cè)到AI滅活活性。對(duì)所述1.5kb片段的缺失分析示出一個(gè)792bp的ORF，其起始密碼子是GTG，而非通常的ATG，其編碼AI滅活(圖3)。將該基因命名為aiiB(圖4)。與尚未經(jīng)試驗(yàn)鑒定生物功能的AttM相對(duì)比，所述AiiB在N末端具有7個(gè)額外的氨基酸(圖5)。AiiB與先前報(bào)道的AiiA相對(duì)比，在氨基酸水平示出35.4％相同性(圖6)。實(shí)施例3從蘇云金芽孢桿菌菌株Cotl中功能性克隆aiiC基因菌株Cotl的懸浮培養(yǎng)物在溫育2小時(shí)后完全消除AI(20uM)，但通過(guò)煮沸5分鐘殺死的細(xì)菌細(xì)胞不能滅活A(yù)I(圖7A)，表明存在一種酶促滅活機(jī)制。為從C0tl中鑒別編碼AI滅活的基因，用EcoRI部分酶切細(xì)菌分離株Cotl的基因組DNA構(gòu)建一個(gè)粘粒文庫(kù)。從細(xì)菌分離株Cotl中提取基因組DNA，并用EcoRI部分酶切。將所述DNA片段與粘粒載體pLAFR3的去磷酸化的EcoRI位點(diǎn)連接。包裝連接的DNA并轉(zhuǎn)染入大腸桿菌DH5α中。通過(guò)上述生物分析方法鑒定具有AI滅活活性的粘?？寺?。通過(guò)常規(guī)方法亞克隆入測(cè)序載體pGEM-7Zf(+)或pBlueScript SK中。
從1000個(gè)篩選的粘?？寺≈需b別一個(gè)示出AI滅活功能的克隆。限制性內(nèi)切酶分析示出這個(gè)克隆含有一個(gè)24kb的插入體。將通過(guò)EcoRI完全消化產(chǎn)生的所有5個(gè)片段亞克隆入pGEM7載體中。對(duì)這些亞克隆進(jìn)行的生物分析示出一個(gè)克隆，即具有5kb插入體的pGEM7-aiiC，具有AI滅活活性。進(jìn)一步的亞克隆鑒定發(fā)現(xiàn)在克隆pBS-AiiC中含有一個(gè)1.4kb BamHI片段，其與AI滅活功能相關(guān)(圖7B)?？寺BS-AiiC的完整序列示出其具有一個(gè)750bp核苷酸的ORF(從166到918)，其編碼一種250個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)(圖8)。將這個(gè)ORF在大腸桿菌表達(dá)載體中克隆證實(shí)其編碼一種功能性AI滅活酶，稱為AiiC。在肽序列水平，所述AiiC基因與AiiA和AiiB分別示出91％和33％的相同性。通過(guò)FASTA和BLAST分析，在核苷酸或肽水平所述aiiC基因與數(shù)據(jù)庫(kù)中其它已知序列沒(méi)有明顯相似性。實(shí)施例4Bt中自體誘導(dǎo)物滅活基因?qū)儆谙嗤蚣易逶诮?jīng)過(guò)檢測(cè)的具有AI滅活活性的細(xì)菌分離株中，除了根癌土壤桿菌菌株M103之外，所有菌株均是革蘭氏陽(yáng)性的，并屬于蘇云金芽孢桿菌(Bt)或密切相關(guān)的細(xì)菌屬。來(lái)自兩種桿菌菌株的aiiA和aiiC基因示出高水平相似性。非常有可能的是aiiA和aiiC基因在蘇云金芽孢桿菌菌株中是高度保守的。使用aiiC片段作為探針進(jìn)行DNA雜交(Southern印跡)。從以下18個(gè)選擇的細(xì)菌菌株中分離基因組DNAB1(Bt ssp.thuringiensis)，B2，B3和B4(Bt ssp.kurstaki)，B22(Bt ssp.kurstaki plasmid minus)，B12(Bt ssp.Aizawai)，B16和B17(Bt ssp.Wuhanensis)，B23(Bt ssp.Israelensis)，和其它Bt菌株B18，B20，B21，240B1，471W，和Cotl以及B25和B26(臘狀芽孢桿菌)，及B29(球形芽孢桿菌)。根據(jù)廠商指導(dǎo)，將用EcoRI酶切的基因組DNA(20μg)在0.8％瓊脂糖凝膠中通過(guò)電泳分離，然后將所述DNA移至Hybond-N+膜上(Amersham Pharmacia，Biotech.)。將含有aiiC密碼子區(qū)域的1.4kb的BamHI片段用DIG標(biāo)記，以用作雜交探針。
在65℃雜交后，將所述膜在2×SSC，0.1％SDS中，在室溫沖洗5分鐘，共兩次，隨后在0.1×SSC，0.1×SDS中，在65℃沖洗15分鐘，共兩次。在沖洗后，根據(jù)廠商指導(dǎo)(Boehringer Mannheim)，將所述膜用抗DIG-AP綴合物檢測(cè)，NBT/BCIP溶液用作顯色底物。
結(jié)果示出除了B29(球形芽孢桿菌)之外，從所有測(cè)試的菌株中清晰檢測(cè)出一個(gè)雜交條帶。這些結(jié)果表明在所有測(cè)試的蘇云金芽孢桿菌菌株及其密切相關(guān)的蠟狀芽孢桿菌中，均存在一個(gè)基因，其具有類似于aiiC的序列。這與生物分析數(shù)據(jù)一致(表1)。實(shí)施例5從更多的細(xì)菌分離株中克隆其它AI滅活基因由于AI滅活基因是高度保守的，因此使用PCR方法從選擇的蘇云金芽孢桿菌分離株中克隆其它的AI滅活基因。分離自細(xì)菌分離株B1，B2，B17，B18，B20，B21，B22和B25的基因組DNA用作模板。引物是基于aiiA和aiiC基因的5’和3’末端的保守序列而設(shè)計(jì)的。使用標(biāo)準(zhǔn)PCR條件從選擇的細(xì)菌分離株中擴(kuò)增AI滅活基因。所述引物序列是C5f 5′-ATG GGA TCC ATG ACA GTA AAG AAG CTT TAT-3′；C3r5′-GTC GAA TTC CTC AAC AAG ATA CTC CTA ATG-3′。所述PCR反應(yīng)如下進(jìn)行35次循環(huán)94℃ 30秒，55℃30秒，及72℃ 1分鐘，使用Perkin Elmer GenAmp PCR系統(tǒng)2400。進(jìn)行兩次獨(dú)立的PCR反應(yīng)，以保證在擴(kuò)增的序列中沒(méi)有誤差。將所述PCR產(chǎn)物通過(guò)使用QIAquick PCR純化試劑盒(QIAGEN)純化，并將純化的PCR片段連接于pGEM-T載體(Promega)。選擇具有滅活自體誘導(dǎo)物活性的克隆進(jìn)行進(jìn)一步研究。對(duì)得自每個(gè)菌株的兩個(gè)這樣的克隆測(cè)序。對(duì)核酸序列數(shù)據(jù)和推導(dǎo)的氨基酸序列，用DNASTARTM序列分析軟件包(DNASTAR公司)和GCG序列分析軟件(Genetics ComputerGroup，Wisconsin)進(jìn)行分析。使用BLASTA研究程序進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)研究。
圖9示出分別從Bt菌株B1，B2，B17，B18，B20，B21，B22和B25中克隆的8個(gè)AI滅活基因(稱為aiiD-aiiK)的核苷酸序列和推導(dǎo)的肽序列。這些序列均含有一個(gè)750bp的ORF，其編碼一種250個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。實(shí)施例6自體誘導(dǎo)物滅活基因在Bt和密切相關(guān)的芽孢桿菌菌種的成員中是高度保守的除了aiiB基因，所有其它基因均是克隆自革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌分離株。序列分析表明克隆自革蘭氏陽(yáng)性菌分離株的aii基因是高度保守的，與AiiA相對(duì)比具有90.4％-94.0％的高度氨基酸相同性(
圖10)?？寺∽愿锾m氏陰性根癌土壤桿菌的aiiB基因示出與其它aii基因的相似性較低，在進(jìn)化樹中簇集為一個(gè)小組(
圖10)。這些結(jié)果表明自體誘導(dǎo)物基因在Bt和與其密切相關(guān)的芽孢桿菌成員中是高度保守的。
在所有這些Aii蛋白質(zhì)序列中，除了AiiB之外均含有一些具有谷氨酸殘基的不變的組氨酸，模式為104HXHXDH109～60aa～H169～21aa～D191；根癌土壤桿菌的AiiB含有相似的但又不同的基序103HXHXDH108～72aa～H180～21aa～D202。這個(gè)模式與金屬水解酶標(biāo)準(zhǔn)一致(Vallee和Galdes，1984)。據(jù)推測(cè)，Arabidopsis乙二醛酶II中的基序HXHXDH參與了與鋅離子的結(jié)合(Crowder等，1997)。定點(diǎn)誘變示出除了第一個(gè)組氨酸(AiiA中的104H)之外，這個(gè)基序中所有這些殘基均是AiiA活性所必需的。這些不變的組氨酸和谷氨酸殘基也存在于AiiB到AiiK中，表明它們屬于相同的自體誘導(dǎo)物金屬水解酶。實(shí)施例7Bt菌株對(duì)胡蘿卜軟腐歐文氏菌產(chǎn)生AI的作用為測(cè)試Bt菌株對(duì)猝滅病原菌產(chǎn)生AI的作用，將胡蘿卜軟腐歐文氏菌SCG1分別與Bt菌株Cotl，B1，大腸桿菌DH5α和梭形氣芽孢桿菌一起培養(yǎng)。如實(shí)施例1所述分析AI。在溫育2小時(shí)后檢測(cè)到菌株SCG1產(chǎn)生AI，并在第2-6小時(shí)溫育期間迅速提高(細(xì)胞數(shù)目見
圖14)，而在SCG1與產(chǎn)生AI滅活酶的Cotl或B1菌株一起培養(yǎng)的上清中未檢測(cè)到AI。在SCG1與不含有aii基因的大腸桿菌DH5α或梭形氣芽孢桿菌一起培養(yǎng)的上清中，檢測(cè)到的AI產(chǎn)生水平與SCG1的單獨(dú)培養(yǎng)物中觀測(cè)的結(jié)果相似(
圖11)。這些結(jié)果表明當(dāng)將兩者一起培養(yǎng)時(shí)，Bt菌株可有效猝滅由病原胡蘿卜軟腐歐文氏菌SCG1產(chǎn)生的AI信號(hào)。實(shí)施例8Bt菌株對(duì)胡蘿卜軟腐歐文氏菌致病性的作用已知AI在調(diào)節(jié)一些病原菌屬的毒力決定因素中起關(guān)鍵作用。由于Bt菌株有效猝滅由病原產(chǎn)生的AI信號(hào)，因此Bt菌株的這種新功能可以用于疾病防治。為測(cè)試這種可能性，研究了Bt菌株抗植物軟腐病的生物防治作用。馬鈴薯(Solanum tuberosum L. cv.Bintje)塊莖得自本地的商店。在自來(lái)水中清洗后，在紙杯上干燥，將馬鈴薯塊莖表面用70％乙醇滅菌，然后切成3mm的切片。就浸漬處理而言，將馬鈴薯切片浸漬在Cotl或其它細(xì)菌菌株的懸浮液中，稀釋至濃度為5×108菌落形成單位(CFU)/ml，時(shí)間為大約20秒。用無(wú)菌水作對(duì)照。將所述切片在層流室中干燥20分鐘，以除去表面水分，之后在每個(gè)切片的上部用含有將近2×108或2×107CFU/ml的2.5μ1的胡蘿卜軟腐歐文氏菌SCG1細(xì)菌懸浮液接種。就混合處理而言，將等體積的每種測(cè)試有機(jī)體(5×108CFU/ml)或無(wú)菌水與胡蘿卜軟腐歐文氏菌SCG1細(xì)菌懸浮液(2×108或2×107CFU/ml)混合。將所述混合物(2.5μl)接種于馬鈴薯切片的切面。將所有的馬鈴薯切片在28℃在Petri平皿中溫育。在溫育期間測(cè)定軟化面積。將每次處理重復(fù)4-12次(針對(duì)Cotl進(jìn)行12次)，在一個(gè)切面上將每次重復(fù)接種3處。針對(duì)集群現(xiàn)象(colonisation)實(shí)驗(yàn)，每個(gè)塊莖切片只在切片中心接種一次，每種處理重復(fù)4次。將馬鈴薯塊莖切片首先用Bt菌株Cotl或其它對(duì)照物處理，之后接種胡蘿卜軟腐歐文氏菌SCG1，或者將SCG1菌與Cotl或其它對(duì)照物混合，之后接種于馬鈴薯切片上。
在溫育20小時(shí)后，胡蘿卜軟腐歐文氏菌SCG1導(dǎo)致嚴(yán)重的組織軟化，而在Bt菌株Cotl預(yù)處理的馬鈴薯切片上，軟化現(xiàn)象明顯減弱(
圖12)。SCG1與Bt菌株Cotl共同接種也減弱軟腐爛現(xiàn)象，尤其以較低濃度接種的情況下。相反，用大腸桿菌或梭形氣芽孢桿菌預(yù)處理馬鈴薯切片之后接種SCG1，或者SCG1分別與大腸桿菌和梭形氣芽孢桿菌一起接種，這樣的對(duì)照處理示出嚴(yán)重的組織軟化現(xiàn)象(
圖12)。這些結(jié)果提示Bt菌株可以用作抗植物軟腐病的生物防治劑。實(shí)施例9Bt菌株和胡蘿卜軟腐歐文氏菌SCG1之間的體外競(jìng)爭(zhēng)測(cè)試Bt菌株Cotl和B1產(chǎn)生抗胡蘿卜軟腐歐文氏菌SCG1的抗生素情況。將Bt菌株和胡蘿卜軟腐歐文氏菌以1∶1比例一起接種進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)。針對(duì)胡蘿卜軟腐歐文氏菌，每個(gè)菌株均以1×107CFU/ml水平接種，其它菌株以1×106CFU/ml水平接種。將混合物在30℃溫育。在不同時(shí)間點(diǎn)取細(xì)菌樣品，進(jìn)行生物學(xué)分析AI的產(chǎn)生(如實(shí)施例1中進(jìn)行的生物學(xué)分析)，并稀釋為適當(dāng)濃度涂布于平板上以計(jì)數(shù)菌落。將此試驗(yàn)重復(fù)4次。針對(duì)集群現(xiàn)象試驗(yàn)，在指定的時(shí)間取用胡蘿卜軟腐歐文氏菌接種的馬鈴薯切片，并切成環(huán)繞接種點(diǎn)大約15×15mm的植物組織。將此組織切成小片并置于10ml的0.1M NaCl中。在搖動(dòng)30分鐘后，將上清稀釋為適當(dāng)濃度。計(jì)數(shù)細(xì)菌細(xì)胞的存活數(shù)目。
在豐富培養(yǎng)基(rich media)和基本培養(yǎng)基(minimum media)平板上，Bt菌株均未示出對(duì)SCG1生長(zhǎng)的任何抑制作用。當(dāng)菌株SCG1與Bt菌株Cotl或B1一起接種時(shí)，Bt菌株和SCG1均正常生長(zhǎng)，示出在24小時(shí)后相同的生長(zhǎng)趨勢(shì)(
圖13)。實(shí)施例10Bt菌株對(duì)胡蘿卜軟腐歐文氏菌對(duì)塊莖切片集群現(xiàn)象的作用為研究在溫育后馬鈴薯切片上胡蘿卜軟腐歐文氏菌SCG1的集群現(xiàn)象，將含有GFP基因的一種表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入菌株SCG1中。所述表達(dá)載體在沒(méi)有選擇壓力時(shí)可以穩(wěn)定保持在菌株SCG1中。SCG1(GFP)和野生型SCG1之間毒力無(wú)差別。為在植物上研究Bt菌對(duì)SCG1的存活和生長(zhǎng)的作用，將馬鈴薯塊莖切片浸漬在Cotl細(xì)菌懸浮液中，然后用SCG1(GFP)接種，或者用SCG1(GFP)和Cotl同時(shí)接種。每天監(jiān)測(cè)細(xì)菌細(xì)胞數(shù)目變化和馬鈴薯組織的軟腐爛現(xiàn)象的發(fā)生，共4天。結(jié)果示出在4天溫育期間，SCG1(GFP)對(duì)Cotl處理的切片和SCG1(GFP)對(duì)水處理的切片之間，細(xì)胞數(shù)目無(wú)大的變化(
圖14)。結(jié)果表明Bt菌株Cotl不明顯影響馬鈴薯塊莖切片上SCG1(GFP)的生長(zhǎng)，提示Bt菌株Cotl對(duì)Erwinia SCG1(GFP)的毒力的弱化作用的原因不是SCG1(GFP)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制。
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序列表序列表<110> 分子農(nóng)業(yè)生物學(xué)院<120> 通過(guò)猝滅團(tuán)體感應(yīng)信號(hào)防治細(xì)菌疾病的細(xì)菌菌株、基因和酶<130> 2577-140<160> 22<170> PatentIn version 3.0<210> 1<211> 1581<212> DNA<213> Agrobacterium tumefaciens M103<220><221> misc_feature<222> (315)..(1103)<223> 編碼序列<400> 1ctgcagcgtc gctttatgcg gagcttgccg acgtgctggg tgttccgggt gaaggggatg 60cggcaacccg ttcggatgcg ttcgttcagc atatggaaac gctgatggac gaaagcggcg120cgccgcgacg tctgcgcgat ctcggcgtga cggacaacac gctcgccatg cttgcgtccg180acgcaatgaa acagagccgt ctgttggtca ataatccggt cgaagtccgc gaagaggatg240cgcttgcgct ctaccgcgag gcgttctgac ccatttctga cagcaatatc ttcagtccca300agggaggaaa acgagtgacc gatatcagac tttacatgct tcagtcgggt acgctgaaat360gcaaggtaca caacatcaag atgaaccagg ggaacggtgc agactatgag atccccgttc420cgtttttcct gattacccat ccgggcgggc acaccgtgat cgacggcggc aacgcgattg480aagttgcaac ggatccgcgt ggccattggg gcggcatctg cgatgtctat tggccagtgc540tggacaagga ccagggctgc gttgaccaga tcaaggcgct tggtttcgat ccggccgatg600tcaagtatgt tgtgcagtcg cacctgcatc tcgatcatac cggcgccatc 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Leu35 40 45Val Asp Thr Gly Met Pro Glu Ser Ala Val Asn Asn Glu Gly Leu Phe50 55 60Asn Gly Thr Phe Val Glu Gly Gln Ile Leu Pro Lys Met Thr Glu Glu65 70 75 80Asp Arg Ile Val Asn Ile Leu Lys Arg Val Gly Tyr Glu Pro Asp Asp85 90 95Leu Leu Tyr Ile Ile Ser Ser His Leu His Phe Asp His Ala Gly Gly100 105 110Asn Gly Ala Phe Thr Asn Thr Pro Ile Ile Val Gln Arg Thr Glu Tyr115 120 125Glu Ala Ala Leu His Arg Glu Glu Tyr Met Lys Glu Cys Ile Leu Pro130 135 140His Leu Asn Tyr Lys Ile Ile Glu Gly Asp Tyr Glu Val Val Pro Gly145 150 155 160Val Gln Leu Leu Tyr Thr Pro Gly His Ser Pro Gly His Gln Ser Leu165 170 175Phe Ile Glu Thr Glu Gln Ser G1y Ser Val Leu Leu Thr Ile Asp Ala180 185 190Ser Tyr Thr Lys Glu Asn Phe Glu Asp Glu Val Pro Phe Ala Gly Phe195 200 205Asp Pro Glu Leu Ala Leu Ser Ser Ile Lys Arg Leu Lys Gly Val Val210 215220Ala Lys Glu Lys Pro Ile Val Phe Phe Gly His Asp Ile Glu Gln Glu225 230 235 240Lys Gly Cys Arg Val Phe Pro Glu Tyr Ile245 250<210> 21<211> 256<212> PRT<213> Agrobacterium tumefaciens<400> 21Met Leu Gln Ser Gly Thr Leu Lys Cys Lys Val His Asn Ile Lys Met1 5 10 15Asn Gln Gly Asn Gly Ala Asp Tyr Glu Ile Pro Val Pro Phe Phe Leu20 25 30Ile Thr His Pro Ala Gly His Thr Val Ile Asp Gly Gly Asn Ala Ile35 40 45Glu Val Ala Thr Asp Pro Arg Gly His Trp Gly Gly Ile Cys Asp Val50 55 60Tyr Trp Pro Val Leu Asp Lys Asp Gln Gly Cys Val Asp Gln Ile Lys65 70 75 80Ala Leu Gly Phe Asp Pro Ala Asp Val Lys Tyr Val Val Gln Ser His85 90 95Leu His Leu Asp His Thr Gly Ala Ile Gly Arg Phe Pro Asn Ala Thr100 105 110His Ile Val Gln Arg Ser Glu Tyr Glu Tyr Ala Phe Thr Pro Asp Trp115 120 125Phe Ala Gly Gly Gly Tyr Ile Arg Lys Asp Phe Asp Lys Pro Gly Leu130 135 140Lys Trp Gln Phe Leu Asn Gly Ala Gln Asp Asp Tyr Tyr Asp Val Tyr145 150 155 160Gly Asp Gly Thr Leu Thr Thr Ile Phe Thr Pro Gly His Ala Pro Gly165 170 175His Gln Ser Phe Leu Val Arg Leu Pro Asn Ser Lys Pro Leu Leu Leu180 185 190Thr Ile Asp Ala Ala Tyr Thr Leu Asp His Trp Glu Glu Lys Ala Leu195 200 205Pro Gly Phe Leu Ala Ser Thr Val Asp Thr Val Arg Ser Val Gln Lys210 215 220Leu Arg Thr Tyr Ala Glu Lys His Asp Ala Thr Val Val Thr Gly His225 230 235 240Asp Pro Asp Ala Trp Ala Asn Phe Lys Lys Ala Pro Glu Phe Tyr Ala245 250 255<210> 22<211> 248<212> PRT<213> Bacillus sp. 240B1<400> 22Met Thr Val Lys Lys Leu Tyr Phe Val Pro Ala Gly Arg Cys Met Leu1 5 10 15Asp His Ser Ser Val Asn Ser Thr Leu Thr Pro Gly Glu Leu Leu Asp20 25 30Leu Pro Val Trp Cys Tyr Leu Leu Glu Thr Glu Glu Gly Pro Ile Leu35 40 45Val Asp Thr Gly Met Pro Glu Ser Ala Val Asn Asn Glu Gly Leu Phe50 55 60Asn Gly Thr Phe Val Glu Gly Gln Val Leu Pro Lys Met Thr Glu Glu65 70 75 80Asp Arg Ile Val Asn Ile Leu Lys Arg Val Gly Tyr Glu Pro Glu Asp85 90 95Leu Leu Tyr Ile Ile Ser Ser His Leu His Phe Asp His Ala Gly Gly100 105 110Asn Gly Ala Phe Ile Asn Thr Pro Ile Ile Val Gln Arg Ala Glu Tyr115 120 125Glu Ala Ala Gln His Ser Glu Glu Tyr Leu Lys Glu Cys Ile Leu Pro130 135 140Asn Leu Asn Tyr Lys Ile Ile Glu Gly Asp Tyr Glu Val Val Pro Gly145 150 155 160Val Gln Leu Leu His Thr Pro Gly His Thr Pro Gly His Gln Ser Leu165 170 175Leu Ile Glu Thr Glu Lys Ser Gly Pro Val Leu Leu Thr Ile Asp Ala180 185 190Ser Tyr Thr Lys Glu Asn Phe Glu Asn Glu Val Pro Phe Ala Gly Phe195 200 205Asp Ser Glu Leu Ala Leu Ser Ser Ile Lys Arg Leu Lys Glu Val Val210 215 220Met Lys Glu Lys Pro Ile Val Phe Phe Gly His Asp Ile Glu Gln Glu225 230 235 240Arg Gly Cys Lys Val Phe Pro Glu24權(quán)利要求
1.一種編碼自體誘導(dǎo)物滅活蛋白的分離的核酸分子，其中所述被編碼的蛋白質(zhì)包含選自104HXHXDH109～60aa～H169～21aa～D191和103HXHXDH108～72aa～H80～21aa～D191的一種氨基酸序列，附帶條件是被編碼的蛋白質(zhì)不是由SEQ ID NO22的氨基酸序列組成的。
2.權(quán)利要求1的分離的核酸分子，其中被編碼的蛋白質(zhì)包含氨基酸序列104HXHXDH109～60aa～H169～21aa～D191，附帶條件是被編碼的蛋白質(zhì)不是由SEQ ID NO22氨基酸序列組成的。
3.權(quán)利要求1的分離的核酸分子，其中被編碼的蛋白質(zhì)包含選自SEQ ID NO11-20的一種氨基酸序列。
4.權(quán)利要求3的分離的核酸分子，包含選自SEQ ID NO1-10的一個(gè)序列。
5.一種提高易感植物或動(dòng)物對(duì)毒力由自體誘導(dǎo)物調(diào)節(jié)的疾病的抗性的方法，包含為所述植物或動(dòng)物施用有效量的能產(chǎn)生自體誘導(dǎo)物抑制劑的細(xì)菌。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述施用的細(xì)菌是芽孢桿菌菌種。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述芽孢桿菌菌種是蘇云金芽孢桿菌的一種變種。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述蘇云金芽孢桿菌的變種選自B1，B2，B17，B18，B20，B21，B22和B25。
9.權(quán)利要求5-8中任一項(xiàng)的方法，其中是施用于一種動(dòng)物。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述動(dòng)物是人。
11.一種包含至少一種編碼自體誘導(dǎo)物滅活蛋白的核酸序列的表達(dá)載體，其中所述被編碼的蛋白包含選自104HXHXDH109～60aa～H69～21aa～D191和103HXHXDH108～72aa～H180～21aa～D202的一種氨基酸序列，而且其中所述表達(dá)載體在原核細(xì)胞或真核細(xì)胞中增殖，附帶條件是所述被編碼的蛋白質(zhì)不是由SEQ ID NO22的氨基酸序列組成的。
12.權(quán)利要求11的表達(dá)載體，所述表達(dá)載體包含至少一個(gè)編碼自體誘導(dǎo)物滅活蛋白的核酸序列，其中被編碼的蛋白質(zhì)包含氨基酸序列104HXHXDH109～60aa～H169～21aa～D191，附帶條件是所述被編碼的蛋白質(zhì)不是由SEQ ID NO22的氨基酸序列組成的。
13.權(quán)利要求11的表達(dá)載體，所述表達(dá)載體包含至少一個(gè)編碼選自SEQ ID NO11-20的氨基酸序列的核酸序列。
14.權(quán)利要求13的表達(dá)載體，所述表達(dá)載體包含選自SEQ IDNO1-10的一個(gè)序列。
15.一種具有自體誘導(dǎo)滅活活性的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)包含選自104HXHXDH109～60aa～H169～21aa～D191和103HXHXDH108～72aa～H180～21aa～D202的一個(gè)氨基酸序列，附帶條件是所述蛋白質(zhì)不是由SEQ ID NO22氨基酸序列組成的。
16.權(quán)利要求15的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)包含氨基酸序列104HXHXDH109～60aa～H169～21aa～D191，附帶條件是所述蛋白質(zhì)不是由SEQ ID NO22的氨基酸序列組成的，。
17.權(quán)利要求15的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)包含選自SEQ IDNO11-20的一個(gè)氨基酸序列。
18.一種提高植物或動(dòng)物的疾病抗性的方法，所述方法包括在這種植物或動(dòng)物細(xì)胞中導(dǎo)入至少一種編碼自體誘導(dǎo)物滅活蛋白的核酸序列，以使得所述細(xì)胞表達(dá)所述核酸序列，其中所述自體誘導(dǎo)物滅活蛋白包含選自104HXHXDH109～60aa～H169～21aa～D191和103HXHXDH108～72aa～H180～21aa～D202的一種氨基酸序列，附帶條件是所述被編碼的蛋白質(zhì)不是由SEQ ID NO22的氨基酸序列組成的。
19.權(quán)利要求18的方法，其中被編碼的蛋白質(zhì)包含氨基酸序列104HXHXDH109～60aa～H169～21aa～D191，附帶條件是所述被編碼的蛋白質(zhì)不是由SEQ ID NO22的氨基酸序列組成的。
20.權(quán)利要求18的方法，其中所述至少一種核酸序列選自SEQ IDNO1-10。
21.一種降低細(xì)菌對(duì)植物或動(dòng)物造成的損害的方法，所述方法包含為需要降低這種損害的植物或動(dòng)物施用有效量的自體誘導(dǎo)物滅活蛋白，其中所述蛋白包含選自104HXHXDH109～60aa～H169～21aa～D191和103HXHXDH108～72aa～H180～21aa～D202的一種氨基酸序列，附帶條件是所述蛋白質(zhì)不是由SEQ ID NO22的氨基酸序列組成的。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述蛋白質(zhì)包含氨基酸序列104HXHXDH109～60aa～H169～21aa～D191，附帶條件是所述編碼的蛋白質(zhì)不是由SEQ ID NO22氨基酸序列組成的。
23.權(quán)利要求21的方法，其中所述蛋白質(zhì)包含選自SEQ ID NO11-20的一種氨基酸序列。
24.權(quán)利要求21-23中任一項(xiàng)的方法，其中所述方法是施用于一種動(dòng)物的。
25.權(quán)利要求24的方法，其中所述動(dòng)物是人。
26.一種用至少一種編碼自體誘導(dǎo)物滅活蛋白的核酸序列穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的原核或真核細(xì)胞，其中所述被編碼的蛋白質(zhì)包含選自104HXHXDH109～60aa～H169～21aa～D191和103HXHXDH108～72aa～H180～21aa～D202的一種氨基酸序列，附帶條件是所述被編碼的蛋白質(zhì)不是由SEQ ID NO22的氨基酸序列組成的。
27.權(quán)利要求26的細(xì)胞，其中所述被編碼的蛋白質(zhì)包含氨基酸序列104HXHXDH109～60aa～H169～21aa～D191，附帶條件是所述被編碼的蛋白質(zhì)不是由SEQ ID NO22的氨基酸序列組成的。
28.權(quán)利要求26的細(xì)胞，其中被編碼的蛋白質(zhì)包含選自SEQ IDNO11-20的一種氨基酸序列。
29.權(quán)利要求28的細(xì)胞，所述細(xì)胞包含選自SEQ ID NO1-10的一種序列。
30.一種降低細(xì)菌生物膜形成的方法，所述方法包含將形成生物膜的細(xì)菌暴露于至少一種自體誘導(dǎo)物抑制蛋白，其中所述蛋白包含選自104HXHXDH109～60aa～H169～21aa～D191和103HXHXDH108～72aa～H180～21aa～D202的一種氨基酸序列，附帶條件是所述蛋白質(zhì)不是由SEQ ID NO22的氨基酸序列組成的。
31.權(quán)利要求30的方法，其中所述蛋白包含氨基酸序列104HXHXDH109～60aa～H169～21aa～D191，附帶條件是所述蛋白質(zhì)不是由SEQ ID NO22的氨基酸序列組成的。
32.權(quán)利要求31的方法，其中所述蛋白包含選自SEQ ID NO11-20的一種氨基酸序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及編碼自體誘導(dǎo)物滅活蛋白的、分離的核酸分子，其中所述被編碼的蛋白包含選自
文檔編號(hào)C12N15/82GK1454260SQ00819848
公開日2003年11月5日 申請(qǐng)日期2000年8月23日 優(yōu)先權(quán)日2000年8月23日
發(fā)明者張煉輝, 董義虎, 張海保, 徐金玲 申請(qǐng)人:分子農(nóng)業(yè)生物學(xué)院