專(zhuān)利名稱(chēng)：優(yōu)化的小基因及其編碼的肽的制作方法
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及生物學(xué)領(lǐng)域。具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及提高了免疫原性的多表位疫苗及其設(shè)計(jì)方法。在實(shí)施方式中，所述多表位疫苗由一小基因編碼，該基因優(yōu)化了所得構(gòu)成物的免疫原性。
多表位疫苗“小基因”技術(shù)正在發(fā)展之中。多項(xiàng)研究指出，可以同時(shí)誘導(dǎo)對(duì)多個(gè)表位的免疫反應(yīng)。例如，可以誘導(dǎo)并檢測(cè)對(duì)大量不同T細(xì)胞的反應(yīng)。在天然環(huán)境中，Doolan等(免疫，Vol.7(1)97-112(1997))用同一供體的PBMC同時(shí)對(duì)17種不同惡性瘧原蟲(chóng)(P.falciparum)表位的回憶T細(xì)胞反應(yīng)進(jìn)行了檢測(cè)。類(lèi)似的，Bertoni等(臨床研究雜志，vol.100(3)503-13(1997))在同一供體中進(jìn)行了對(duì)12種不同HBV-衍生表位的同時(shí)反應(yīng)的檢測(cè)。在多表位DNA小基因疫苗免疫方面也有一些誘導(dǎo)了多種T細(xì)胞反應(yīng)的報(bào)道，例如約10個(gè)I類(lèi)MHC表位構(gòu)成的小基因疫苗，其中的所有表位都具有免疫原性和/或抗原性。具體地說(shuō)，包含9個(gè)EBV(Thomson等，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)，92(13)5845-9(1995))，7個(gè)HIV(Woodberry等，病毒學(xué)雜志，Vol.73(7)5320-5(1999))，10個(gè)鼠源表位(Thomson等，免疫學(xué)雜志，Vol.160(4)1717-23(1998))和10個(gè)腫瘤衍生表位(Mateo等，免疫學(xué)雜志，Vol.163(7)4058-63(1999))的小基因疫苗已被證明具有活性。而且已知，編碼來(lái)自HBV和HIV的9種不同HLA-A2.1和A11限制表位的一種多表位DNA質(zhì)?？烧T導(dǎo)對(duì)所有這些表位的CTL反應(yīng)(Ishioka等，免疫學(xué)雜志，Vol.162(7)3915-25(1999))。
因此，可以設(shè)計(jì)包含多種I類(lèi)MHC(即CTL)表位的小基因疫苗，并獲得所有表位的呈遞和識(shí)別。然而，多表位構(gòu)成物的的免疫原性似乎受到多種未知可變因素的很大影響。例如，同一表位在不同的疫苗構(gòu)成物背景中表達(dá)，其免疫原性可相差幾個(gè)數(shù)量級(jí)。因此，有必要確定優(yōu)化多表位疫苗構(gòu)成物的方法。所述優(yōu)化的重要性在于誘導(dǎo)強(qiáng)免疫反應(yīng)和最終的臨床效果。為此，本發(fā)明提供了一種優(yōu)化包含大量表位的多表位疫苗的抗原性和免疫原性的方法，以及由此方法獲得的優(yōu)化多表位疫苗，尤其是小基因疫苗。
以下簡(jiǎn)要描述了可能影響小基因免疫原性、表位加工和與I類(lèi)、II類(lèi)MHC分子結(jié)合的抗原呈遞細(xì)胞(APC)上抗原呈遞的部分主要可變因素。
免疫顯性在由復(fù)雜外來(lái)病原體編碼的眾多可能肽中，只有少數(shù)最終成為可結(jié)合I類(lèi)MHC抗原的肽從而被T細(xì)胞識(shí)別。該現(xiàn)象對(duì)于多表位疫苗的開(kāi)發(fā)具有多種潛在意義，稱(chēng)為免疫顯性(Yewdell等，免疫學(xué)年報(bào)，1751-88(1999))。有幾個(gè)主要因素與免疫顯性有關(guān)。在此，我們描述了通過(guò)胞內(nèi)加工對(duì)合適肽的產(chǎn)生在質(zhì)和量上都有影響的幾個(gè)因素。
連接表位連接表位是因兩個(gè)其他表位并列而形成的表位。所成新表位的C末端來(lái)自第一表位，N末端來(lái)自第二表位。連接表位的形成是設(shè)計(jì)I類(lèi)和II類(lèi)限制性表位的多表位小基因疫苗中的一個(gè)潛在問(wèn)題。因?yàn)椋紫?，在設(shè)計(jì)包含人表位的小基因時(shí)，由于通常在HLA轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)動(dòng)物體內(nèi)對(duì)人表位進(jìn)行免疫原性試驗(yàn)，鼠源表位的形成會(huì)產(chǎn)生并非所需的免疫顯性效應(yīng)。第二，新的、非所需人I類(lèi)或II類(lèi)HLA分子的表位會(huì)在疫苗受體內(nèi)引發(fā)新的、并非由感染細(xì)胞或腫瘤表達(dá)的T細(xì)胞特異性，即，并非定向誘導(dǎo)的T細(xì)胞反應(yīng)。這些反應(yīng)就原目的來(lái)說(shuō)是無(wú)關(guān)的、無(wú)效的，甚至可能因產(chǎn)生意外免疫顯性而有害。
據(jù)記載，許多不同實(shí)驗(yàn)環(huán)境中存在著連接表位。Gefter等首次在一系統(tǒng)中證實(shí)了這一效應(yīng)，所述系統(tǒng)中并列并共線合成兩個(gè)不同的II類(lèi)限制性表位(Perkins等，免疫學(xué)雜志，Vol.146(7)2137-44(1991))。這種效應(yīng)是如此明顯，以至于免疫系統(tǒng)對(duì)其他表位的識(shí)別因這些新的連接表位而被完全“沉默化”(Wang等，細(xì)胞免疫，Vol.143(2)284-97(1992))。在人體內(nèi)也觀察到了因用以下合成脂肽免疫而產(chǎn)生的針對(duì)連接表位的輔助T細(xì)胞，該脂肽包含一個(gè)HLA-A2限制性HBV衍生免疫顯性CTL表位和一個(gè)通用破傷風(fēng)毒素衍生HTL表位(Livingston等，免疫學(xué)雜志，Vol.159(3)1383-92(1997))。因此，連接表位的形成是設(shè)計(jì)多表位構(gòu)成物時(shí)的一個(gè)重要考慮因素。
本發(fā)明提供了解決這一問(wèn)題和避免或盡可能減少連接表位形成的方法。
側(cè)翼區(qū)I類(lèi)限制性表位的產(chǎn)生是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程(Yewdell等，免疫學(xué)年度評(píng)論，175188(1999))。內(nèi)切蛋白酶的限制性蛋白質(zhì)水解和可能由外切蛋白酶進(jìn)行的修剪之后是由結(jié)合了抗原加工(TAP)分子的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)行的跨內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)膜的轉(zhuǎn)運(yùn)。在抗原性肽及其前體的產(chǎn)生中，最重要的胞質(zhì)蛋白酶復(fù)合物是蛋白體(Niedermann等，免疫，Vol.2(3)289-99(1995))，雖然還證明存在著對(duì)CTL前體的ER修剪(Paz等，免疫，Vol-11(2)241-51(1999))。一直以來(lái)爭(zhēng)論不休的是，表位C末端和N末端近旁的殘基對(duì)于表位的形成是否有影響。
加工表位的得率和有效性被認(rèn)為是決定免疫原性的一個(gè)重要因素，因此對(duì)完整的小基因的總效價(jià)具有明顯的影響，即，免疫反應(yīng)的強(qiáng)度直接與MHC所結(jié)合并展示給T細(xì)胞識(shí)別的表位數(shù)量成正比。數(shù)項(xiàng)研究證明情況的確如此。例如，病毒特異性CTL的誘導(dǎo)基本上與表位密度成正比(Wherry等，免疫學(xué)雜志，Vol.163(7)3735-45(1999))。此外，可用編碼未加工最佳表位的重組小基因來(lái)誘導(dǎo)比天然全長(zhǎng)蛋白所誘導(dǎo)的更高水平的表位表達(dá)(Anton等，免疫學(xué)雜志，Vol.158(6)2535-42(1997))。一般說(shuō)來(lái)，小基因誘導(dǎo)的效果強(qiáng)于完整抗原誘導(dǎo)(Restifo等，免疫學(xué)雜志，Vol.154(9)4414-22(1995)；Ishioka等，免疫學(xué)雜志，Vol.162(7)3915-25(1999)，Iwasaki等，疫苗，Vol.17(15-16)2081-8(1999))。
早期研究認(rèn)為，免疫原性主要由表位內(nèi)的殘基調(diào)節(jié)(Hahn等，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，Vol.176(5)1335-41(1992))。其他研究也得出相似的結(jié)論，這些研究大多是基于將某個(gè)表位接入一個(gè)非相關(guān)基因，或接在原基因的不同位置(Chimini等，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，Vol.169(1)297-302(1989)；Hahn等，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，Vol.174(3)733-6(1991))。然而，其他實(shí)驗(yàn)(Del Val等，細(xì)胞，Vol.66(6)1145-53(1991)；Hahn等，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，Vol.176(5)1335-41(1992))提出，緊靠CTL表位旁邊的殘基可能直接影響著識(shí)另(Couillin等，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，Vol.180(3)1129-34(1994)；Bergmann等，病毒學(xué)雜志，Vol.68(8)5306-10(1994))。在小基因疫苗中，以上爭(zhēng)論又被重提。Shastri等發(fā)現(xiàn)(Shastri等，免疫學(xué)雜志，Vol.155(9)4339-46(1995))，T細(xì)胞反應(yīng)并未受到N末端側(cè)翼區(qū)殘基改變的顯著影響，但卻因增加了一個(gè)C末端側(cè)翼殘基而受到抑制。最明顯的抑制發(fā)生于以異亮氨酸、亮氨酸、半胱氨酸和脯氨酸作為C末端側(cè)翼殘基時(shí)。相反，Gileadi(Gileadi等，歐洲免疫學(xué)雜志，Vol.29(7)2213-22(1999))報(bào)道，小鼠流感病毒表位N末端的殘基可產(chǎn)生顯著效應(yīng)。Bergmann等發(fā)現(xiàn)，芳香族、堿性和丙氨酸殘基支持表位的有效識(shí)別，而G殘基和P殘基則具有強(qiáng)抑制性(Bergmann等，免疫學(xué)雜志，Vol.157(8)3242-9(1996))。相反，Lippolis(Lippolis等，病毒學(xué)雜志，Vol.69(5)3134-46(1995))認(rèn)為，側(cè)翼殘基的取代對(duì)識(shí)別沒(méi)有影響。然而，已經(jīng)證實(shí)，僅保守性的取代對(duì)蛋白體的特異性未必有影響。
看來(lái)，這些效應(yīng)，一般即天然表位的特異性，大致與蛋白體的特異性相關(guān)。例如，蛋白體的特異性有些類(lèi)似于胰蛋白酶(Niedermann等，免疫，Vol.2(3)289-99(1995))，在堿性氨基酸之后剪切。但是，有效剪切也可能發(fā)生在疏水性和酸性殘基的羧基一側(cè)。與這些特異性一致的是Sherman等的研究，他們發(fā)現(xiàn)，一個(gè)p53表位C末端后面R向H的突變對(duì)蛋白體介導(dǎo)的蛋白質(zhì)加工有影響(Theobald等，Vol.188(6)1017-28(1998))。其他研究(Hanke等，遺傳病毒學(xué)雜志，Vol.79(Pt1)83-90(1998)，Thomson等，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)，Vol.92(13)5845-9(1995))表明，可以用基本表位構(gòu)建小基因，側(cè)翼序列似乎并非必要，但同時(shí)承認(rèn)，可利用側(cè)翼區(qū)進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化。
綜上所述，對(duì)I類(lèi)HLA表位來(lái)說(shuō)，側(cè)翼區(qū)對(duì)于CTL表位加工和呈遞的影響尚未確定。還未曾對(duì)小基因疫苗進(jìn)行過(guò)側(cè)翼區(qū)修飾效應(yīng)的系統(tǒng)性研究。因此，需要用編碼人I類(lèi)限制性表位的小基因疫苗進(jìn)行分析。本發(fā)明就提供了這樣的分析，并提供了就免疫原性和抗原性進(jìn)行了優(yōu)化的多表位疫苗構(gòu)成物，以及設(shè)計(jì)此類(lèi)構(gòu)成物的方法。
HLA II類(lèi)肽復(fù)合物的形成也是一系列復(fù)雜的過(guò)程，且不同于HLA I類(lèi)分子的加工。該加工過(guò)程包括與固定鏈(Ii)結(jié)合，向特化區(qū)室轉(zhuǎn)運(yùn)，Ii降解為CLIP，HLA-DM催化去除CLIP(見(jiàn)Blum等，免疫學(xué)評(píng)論，Vol.17(5-6)411-7(1997)；Arndt等，免疫學(xué)研究，Vol.16(3)261-72(1997))。而且，組織蛋白酶對(duì)于Ii的降解具有重要影響，尤其是S和L組織蛋白酶(Nakagawa等，免疫，Vol.10(2)207-17(1999))。然而，就功能性表位的產(chǎn)生而言，該過(guò)程的選擇性較低(Chapman H.A.，現(xiàn)代免疫學(xué)觀點(diǎn)，Vol.10(1)93-102(1998))，不同大小的肽都可與II類(lèi)MHC分子結(jié)合(Hunt等，科學(xué)，Vol.256(5065)1817-20(1992))。大多數(shù)或所有可能的肽似乎都可得以形成(Moudgil等，免疫學(xué)雜志，Vol.159(6)2574-9(1997)；Thomson等，病毒學(xué)雜志，Vol.72(3)2246-52(1998))。因此，與側(cè)翼區(qū)問(wèn)題相比，在特定實(shí)施方式中，連接肽的形成可能更重要。
發(fā)明概述本發(fā)明揭示了可用于優(yōu)化多表位疫苗效力的參數(shù)，還公開(kāi)了多表位構(gòu)成物和編碼此類(lèi)構(gòu)成物的(小基因)核酸。
內(nèi)容之一，本發(fā)明提供了一種設(shè)計(jì)包含多個(gè)HLA表位并向HLA I類(lèi)加工路徑呈遞的多表位構(gòu)成物的方法，該方法包括(i)對(duì)HLA表位進(jìn)行分選(sorting)，以盡可能減少連接表位；(ii)在多表位構(gòu)成物內(nèi)HLA表位的C+1位置引入一個(gè)側(cè)翼氨基酸，該氨基酸選自K，R，N，Q，G，A，S，C和T；(iii)在多表位構(gòu)成物內(nèi)兩個(gè)表位之間加入一個(gè)或多個(gè)氨基酸間隔殘基，用以避免出現(xiàn)CTL或HTL連接表位；(iv)選擇一個(gè)或多個(gè)連接表位最少、氨基酸間隔殘基最少、每個(gè)HLA表位C+1位置上K，R，N，Q，A，S，C或T最多的多表位構(gòu)成物。部分實(shí)施方式中，所述間隔序列都不是已知HLA II類(lèi)一級(jí)錨殘基。特定實(shí)施方式中，引入間隔殘基可避免出現(xiàn)HTL表位。這樣的間隔序列一般包含5個(gè)氨基酸殘基，各自選自G，P和N。部分實(shí)施方式中，所述間隔序列如GPGPG。
部分實(shí)施方式中，引入間隔序列可避免出現(xiàn)CTL表位，這樣的間隔序列含1-8個(gè)氨基酸殘基，各自是A或G。通常，側(cè)翼殘基加在CTL表位的C+1位，選自K，R，N，G和A。
部分實(shí)施方式中，側(cè)翼殘基與間隔序列相鄰。本發(fā)明方法還包括用K，R，N，G或A殘基取代多表位構(gòu)成物內(nèi)與一個(gè)HLA表位的C末端相鄰的另一HLA表位的N末端殘基。
本發(fā)明方法還包括預(yù)測(cè)所述多表位構(gòu)成物的結(jié)構(gòu)，然后選擇一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)最大的構(gòu)成物，即可經(jīng)HLA加工路徑而產(chǎn)生其中所有表位的構(gòu)成物。
本發(fā)明還提供了用本發(fā)明方法制成的多表位構(gòu)成物。所述多表位構(gòu)成物內(nèi)的表位一般由一個(gè)小基因編碼。優(yōu)選實(shí)施方式中，小基因所編碼的多表位構(gòu)成物是圖9所示的HIV-TT，圖9所示的HIV-DG，或圖9所示的HIV-TC。
定義結(jié)合以下定義，可更好地理解本發(fā)明本文中，“結(jié)合數(shù)據(jù)”一般表示為“IC50”，即某肽在結(jié)合試驗(yàn)中對(duì)參照肽結(jié)合的抑制達(dá)到50％時(shí)的濃度。根據(jù)試驗(yàn)進(jìn)行的條件(即限制性HLA蛋白質(zhì)和標(biāo)記肽的濃度)，該值接近KD值。有關(guān)結(jié)合試驗(yàn)的詳細(xì)描述可參考PCT公開(kāi)WO94/20217和WO94/03205。必須指出的是，如果試驗(yàn)條件改變，IC50值也將改變，且變化幅度通常較大，并取決于所用的具體試劑(例如HLA制劑等)。例如，過(guò)量的HLA分子將提高給定配體的表觀測(cè)得IC50?；蛘撸Y(jié)合被表達(dá)為于某參照肽的相對(duì)值。雖然具體的試驗(yàn)的靈敏度可能變高或變低，被測(cè)肽的IC50也相應(yīng)會(huì)有一定程度的改變，但是與參照肽的相對(duì)結(jié)合數(shù)據(jù)卻不會(huì)有明顯改變。例如，試驗(yàn)條件令參照肽的IC50提高10倍時(shí)，被測(cè)肽的IC50也將改變約10倍。因此，為了避免混淆，評(píng)價(jià)某肽是好、一般、弱或陰性結(jié)合劑一般以其與標(biāo)準(zhǔn)肽的相對(duì)IC50為基礎(chǔ)。也可以用其他試驗(yàn)來(lái)測(cè)定結(jié)合性，包括采用以下材料的試驗(yàn)活細(xì)胞(例如Ceppellini等，自然，339392，1989；Christnick等，自然，35267，1991；Busch等，國(guó)際免疫學(xué)雜志，2443，1999；Hill等，免疫學(xué)雜志，147189，1991；del Guercio等，免疫學(xué)雜志，154687，1995)，采用除垢劑裂解液的無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)(例如Cerundolo等，免疫學(xué)雜志，212069，1991)，固定化純MHC(例如，Hill等，免疫學(xué)雜志，152，2890，1994；Marshall等，免疫學(xué)雜志，1524946，1994)，ElISA系統(tǒng)(例如Reay等，EMBOJ，112829，1992)，表面胞質(zhì)基因組共振(例如Khilko等，生物化學(xué)雜志，26815425，1993)；高流量可溶相試驗(yàn)(Hammer等，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，1802353，1994)和測(cè)定I類(lèi)MHC的穩(wěn)化或組合(例如Ljunggren等，自然，346476，1990；Schumacher等，細(xì)胞，62563，1990；Townsend等，細(xì)胞，62285，1990；Parker等，免疫學(xué)雜志，1491896，1992)。
所謂表位內(nèi)某殘基的位置在“羧基末端”或“羧基末端是”指，根據(jù)后文所述的常規(guī)命名，該殘基位于最接近肽的羧基末端的該表位末端?！癈+1”指緊接在表位C末端之后的殘基或位置，即該表位C末端近旁的殘基。多表位構(gòu)成物羧基末端的某表位的“羧基末端位置”不一定就是多肽的羧基末端。優(yōu)選實(shí)施方式中，優(yōu)化多表位構(gòu)成物中所用的表位是基元攜帶表位，其羧基端是參照特定基元的一級(jí)錨殘基來(lái)定義的。
所謂表位內(nèi)某殘基的位置在“氨基末端”或“氨基末端是”指，根據(jù)后文所述的常規(guī)命名，該殘基位于最接近肽的氨基末端的該表位末端?！癗-1”指緊鄰表位N末端(1號(hào)位)的殘基或位置。多表位構(gòu)成物氨基末端的某表位的“氨基末端位置”不一定就是多肽的氨基末端。優(yōu)選實(shí)施方式中，優(yōu)化多表位構(gòu)成物中所用的表位是基元攜帶表位，其氨基端是參照特定基元的一級(jí)錨殘基來(lái)定義的。
“計(jì)算機(jī)”或“計(jì)算機(jī)系統(tǒng)”一般包括處理器；至少一個(gè)信息存取裝置，例如硬盤(pán)驅(qū)動(dòng)器，軟盤(pán)驅(qū)動(dòng)器或磁帶驅(qū)動(dòng)器；至少一個(gè)輸入裝置，例如鍵盤(pán)，鼠標(biāo)，觸摸式顯示屏或話筒；顯示裝置。此外，計(jì)算機(jī)還包括與網(wǎng)絡(luò)相連的通訊通道。這樣的計(jì)算機(jī)其構(gòu)件可比以上所列的多或少些。
“構(gòu)成物”在此指非天然復(fù)合物，可用合成技術(shù)來(lái)制造，諸如重組DNA的制備與表達(dá)，或核酸與氨基酸的化學(xué)合成。構(gòu)成物的制造還可以是將一種物質(zhì)與另一種相加或相連從而得到非天然形式的產(chǎn)物。“多表位構(gòu)成物”包含多個(gè)表位。
“交叉結(jié)合”指一個(gè)肽被一個(gè)以上HLA分子結(jié)合；其同義詞是簡(jiǎn)并結(jié)合。
“隱蔽表位”在用分離的肽進(jìn)行免疫時(shí)可以引發(fā)反應(yīng)，但在體外用包含該表位的完整蛋白作為抗原時(shí)，該反應(yīng)沒(méi)有交叉反應(yīng)性。
“顯性表位”指可在用完整的原生抗原進(jìn)行免疫時(shí)誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的表位(見(jiàn)Sercarz等，免疫學(xué)年度評(píng)論，11729-766，1993)。在體外用分離的肽表位進(jìn)行時(shí)，該反應(yīng)具有交叉反應(yīng)性。
對(duì)特定的氨基酸序列來(lái)說(shuō)，“表位”是被特定免疫球蛋白識(shí)別的一組氨基酸殘基，或T細(xì)胞內(nèi)被T細(xì)胞受體蛋白和/或主組織相容性復(fù)合物(MHC)受體識(shí)別所必需的那些殘基。在體外或體內(nèi)免疫系統(tǒng)環(huán)境中，表位是一個(gè)分子多項(xiàng)特征的集合，例如一級(jí)、二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)以及電荷，它們共同形成一個(gè)由免疫球蛋白、T細(xì)胞受體或HLA分子識(shí)別的位置。本文中，“表位”和“肽”常?；煊?。但是需要明白的是，大于或包含本發(fā)明表位的分離或純化蛋白質(zhì)或肽分子也包括在本
“側(cè)翼殘基”指表位近旁的殘基。側(cè)翼殘基可加入或插入在表位N末端或C末端旁的位置。
“免疫原性肽”或“肽表位”指包含等位基因-特異性基元或超基元，因而可結(jié)合HLA分子并誘導(dǎo)CTL和/或HTL反應(yīng)的肽。因此，本發(fā)明的免疫原性肽能夠與相應(yīng)的HLA分子結(jié)合，然后誘導(dǎo)針對(duì)該免疫原性表位原所在抗原的細(xì)胞毒T細(xì)胞反應(yīng)或輔助T細(xì)胞反應(yīng)。
“變態(tài)類(lèi)似物”指對(duì)特定T細(xì)胞效力增強(qiáng)的肽，表現(xiàn)為，據(jù)測(cè)定，對(duì)給定劑量的反應(yīng)增強(qiáng)，或產(chǎn)生相同反應(yīng)所需劑量較低。變態(tài)類(lèi)似物的優(yōu)點(diǎn)包括，該抗原可以變得更有效，更經(jīng)濟(jì)(因?yàn)楂@得相同效果所需的量減少了)。此外，可用修飾表位克服抗原特異性T細(xì)胞無(wú)反應(yīng)(T細(xì)胞耐受性)。
“人白細(xì)胞抗原”或“HLA”即人I類(lèi)或II類(lèi)主組織相容性復(fù)合物(MHC)蛋白(見(jiàn)Stites等，免疫學(xué)，第8版，Lange Publishing，Los Altos，CA(1994))。
“HLA超型或HLA家族”指肽結(jié)合特異性相同的一族HLA分子?？蓪?duì)于帶有某些氨基酸基元的肽具有一定程度相似結(jié)合親和性的I類(lèi)HLA分子歸入這樣的HLA超型。HLA超家族、HLA超型家族，HLA家族和類(lèi)xx HLA分子(xx指一種特定的HLA型)是同義詞。
與I類(lèi)HLA分子的“高親和性”指結(jié)合的IC50或KD不超過(guò)50nM；“中等親和性”指結(jié)合的IC50或KD約在50-500nM之間。與II類(lèi)HLA分子結(jié)合的“高親和性”指結(jié)合的IC50或KD不超過(guò)100nM；“中等親和性”指結(jié)合的IC50或KD約在100-1000nM之間。
“IC50”即某肽在結(jié)合試驗(yàn)中對(duì)參照肽結(jié)合的抑制達(dá)到50％時(shí)的濃度。給定試驗(yàn)條件(即限制性HLA蛋白和標(biāo)記肽的濃度)，該值近似于KD值。
兩種或兩種以上肽序列“相同”或具有一定百分比的“相同性”指，在用對(duì)比窗進(jìn)行最大對(duì)應(yīng)性排列和比對(duì)，并用序列比對(duì)算法或手工比對(duì)后目測(cè)時(shí)，它們的序列或亞序列相同或含有一定百分比的相同氨基酸殘基。
在多表位的特定位置(例如表位的鄰位、C末端、近C末端)“引入”一個(gè)氨基酸殘基表示構(gòu)成多表位以使所需殘基位于特定位置(例如與表位相鄰)或避免有害殘基與表位的C末端相鄰。它還包括在特定位置插入一個(gè)氨基酸殘基，最好是優(yōu)選殘基或中間(intermediate)殘基。氨基酸殘基也可以通過(guò)取代原有氨基酸來(lái)引入。較好的是按照例如3/1/99提交的U.S.S.N.09/260,714和PCT/US00/19774中設(shè)定的原則進(jìn)行所述取代。
“分離的”或“生物學(xué)純”指物質(zhì)中基本不含原天然狀態(tài)下與之共存的組分。因此，本發(fā)明所述分離的肽不含原環(huán)境中與之結(jié)合的物質(zhì)。
“連接”或“相連”指本領(lǐng)域?qū)㈦墓δ苄赃B接的各種已知方法，包括但不限于重組融合，共價(jià)結(jié)合，二硫鍵結(jié)合，離子鍵結(jié)合，氫鍵結(jié)合和靜電結(jié)合。
“主組織相容性復(fù)合物”或“MHC”指一個(gè)基因簇，它參與調(diào)控引起生理性免疫應(yīng)答的細(xì)胞間相互作用。在人體內(nèi)，MHC復(fù)合物又稱(chēng)HLA復(fù)合物。有關(guān)MHC和HLA復(fù)合物的詳細(xì)信息可參考Paul，基礎(chǔ)免疫學(xué)，第3版，Raven Press，NewYork，1993。
“肽中部”指肽內(nèi)既非氨基末端又非羧基末端的位置。
“最少的連接表位”在此表示連接表位的數(shù)量少于用隨機(jī)選擇標(biāo)準(zhǔn)可能產(chǎn)生的數(shù)量。
“基元”指可被特定HLA分子識(shí)別的一定長(zhǎng)度肽內(nèi)的殘基模塊，對(duì)于I類(lèi)HLA基元來(lái)說(shuō)，肽長(zhǎng)度一般約為8-13個(gè)氨基酸，對(duì)II類(lèi)HLA基元來(lái)說(shuō)約為6-25個(gè)。通常，各個(gè)人HLA等位基因編碼的各蛋白質(zhì)的肽基元各不相同，而且一級(jí)錨殘基和二級(jí)錨殘基之間也不同。
“陰性結(jié)合殘基”或“有害殘基”指該氨基酸若位于肽表位內(nèi)某特定位置(一般不在一級(jí)錨定位置)會(huì)降低該肽對(duì)其HLA分子的結(jié)合親和力。
多表位構(gòu)成物的“優(yōu)化”指通過(guò)對(duì)表位進(jìn)行分選以盡可能減少連接表位，在表位C末端或N末端旁插入側(cè)翼殘基，插入間隔序列進(jìn)一步避免連接表位或提供側(cè)翼殘基從而提高構(gòu)成物的免疫原性或抗原性。優(yōu)化多表位構(gòu)成物的免疫原性或抗原性提高可通過(guò)與非優(yōu)化多表位構(gòu)成物的對(duì)比，用本領(lǐng)域已知方法，例如轉(zhuǎn)基因動(dòng)物體內(nèi)免疫原性測(cè)評(píng)，ELISPOT，γ干擾素釋放試驗(yàn)，四聚體染色、鉻釋放試驗(yàn)和樹(shù)狀細(xì)胞呈遞來(lái)測(cè)定。
本發(fā)明中，“肽”與“寡聚肽”通用，都表示彼此相連的一系列氨基酸殘基，所述氨基酸一般為L(zhǎng)-氨基酸，所述相連一般是通過(guò)α氨基與相鄰氨基酸的羧基之間的肽鍵。本發(fā)明優(yōu)選的CTL誘導(dǎo)肽長(zhǎng)度不超過(guò)13個(gè)殘基，一般約8-11個(gè)，以9或10個(gè)為佳。優(yōu)選的HTL誘導(dǎo)寡聚肽長(zhǎng)度不超過(guò)50個(gè)殘基，通常約6-30個(gè)，常見(jiàn)的約12-25個(gè)，一般約15-20個(gè)。
“泛DR結(jié)合肽或PADRETM肽”是結(jié)合一種以上II類(lèi)HLA DR分子的一個(gè)分子族中的一員。PADRETM分子族的特征可理解為一個(gè)II類(lèi)HLA超基元。PADRE可與大多數(shù)HLA-DR分子結(jié)合，并在體外和體內(nèi)激發(fā)人輔助T淋巴細(xì)胞(HTL)反應(yīng)。
“藥用”指基本無(wú)毒、惰性和/或生理相容性組合物。
“向I類(lèi)HLA加工路徑呈遞”表示將多表位構(gòu)成物引入細(xì)胞，從而主要接受I類(lèi)HLA加工路徑的加工。通常，多表位構(gòu)成物引入細(xì)胞用編碼該多表位構(gòu)成物的表達(dá)載體進(jìn)行。由此類(lèi)小基因編碼的II類(lèi)HLA表位也傳遞II類(lèi)分子，但這些表位進(jìn)入II類(lèi)加工路徑的機(jī)制尚不清楚。
“一級(jí)錨殘基”或“一級(jí)MHC錨”指肽序列內(nèi)特定位置上的一個(gè)氨基酸，它被認(rèn)為是免疫原性肽與HLA分子的接觸點(diǎn)。通常，一定長(zhǎng)度肽內(nèi)的1-3個(gè)(通常為2個(gè))一級(jí)錨殘基構(gòu)成免疫原性肽的一個(gè)“基元”。這些殘基與HLA分子的肽結(jié)合槽緊密配合接觸，側(cè)鏈埋入槽的特定穴位內(nèi)。例如，實(shí)施方式之一中，本發(fā)明一個(gè)9殘基肽表位的HLA I類(lèi)表位的一級(jí)錨殘基位于其二位(從氨基末端數(shù)起)和羧基末端。有關(guān)各基元和超基元的一級(jí)錨定位點(diǎn)可參考PCT/US00/27766和PCT/US00/19774中的表I和表III。此外，改變這些一級(jí)錨定位點(diǎn)內(nèi)特定殘基的有無(wú)可形成肽類(lèi)似物。這些類(lèi)似物可用于調(diào)節(jié)含有特定基元或超基元的肽的結(jié)合親和性。
“濫交識(shí)別”指一個(gè)特定肽在不同的HLA分子背景中被同一T細(xì)胞克隆識(shí)別。“濫交識(shí)別或結(jié)合”與“交叉反應(yīng)”同義。
“保護(hù)性免疫反應(yīng)”或“治療性免疫反應(yīng)”指感染原形成的抗原或腫瘤抗原引起的CTL和/或HTL反應(yīng)，它們?cè)谝欢ǔ潭壬媳苊饣蛑辽俨糠忠种屏思膊〉陌Y狀，不良反應(yīng)或發(fā)展。所述免疫反應(yīng)還包括輔助T細(xì)胞刺激所促進(jìn)的抗體反應(yīng)。
“殘基”指通過(guò)酰胺鍵或其模擬鍵結(jié)合在肽或蛋白質(zhì)內(nèi)的氨基酸或其模擬物。
“二級(jí)錨殘基”指肽內(nèi)除一級(jí)錨定位置以外某位置上的一個(gè)氨基酸，也影響著肽的結(jié)合性。結(jié)合的肽內(nèi)二級(jí)錨殘基的出現(xiàn)幾率明顯高于一個(gè)位置上氨基酸隨機(jī)分布的預(yù)期幾率?！岸?jí)錨殘基”位于“二級(jí)錨定位置”。二級(jí)錨殘基可定義為高親和力或中等親和力結(jié)合肽內(nèi)的高頻率殘基，或定義為與高親和力或中等親和力相關(guān)的殘基。例如，可通過(guò)改變此類(lèi)二級(jí)錨定位置內(nèi)特定殘基的有無(wú)來(lái)制造類(lèi)似肽。此類(lèi)類(lèi)似物可用于含有特定基元或超基元的肽的結(jié)合親和性微調(diào)。“固定肽(fixed peptide)”有時(shí)用于表示類(lèi)似肽。
“分選表位”表示確定或設(shè)計(jì)多表位構(gòu)成物內(nèi)的表位序列。
“間隔序列”指位于多表位構(gòu)成物內(nèi)兩表位之間的一段序列，用以避免連接表位的形成。對(duì)HLA II類(lèi)表位來(lái)說(shuō)，間隔序列一般長(zhǎng)約5個(gè)或5個(gè)以上氨基酸，而且間隔序列內(nèi)的氨基酸殘基，例如G，P或N，一般不是HLA II類(lèi)基元的一級(jí)錨殘基(見(jiàn)PCT/US00/19774)。
“亞顯性表位”指該表位在用其所在全抗原進(jìn)行免疫時(shí)沒(méi)有或基本無(wú)反應(yīng)，但用分離的肽進(jìn)行免疫時(shí)有反應(yīng)，而且，用全蛋白體外或體內(nèi)回憶該反應(yīng)時(shí)可以測(cè)得該反應(yīng)(與隱蔽表位不同)。
“超基元”指與兩個(gè)或更多個(gè)HLA等位基因所編碼的多個(gè)HLA分子具有共同結(jié)合特異性的肽。較好的是，含有所述超基元的肽被多個(gè)HLA抗原識(shí)別，并具有中到高度親和力。
“合成肽”指非天然而是用化學(xué)合成或重組DNA技術(shù)人工制造的肽。
“TCR接觸殘基”或“T細(xì)胞受體接觸殘基”指表位內(nèi)與T細(xì)胞受體結(jié)合的氨基酸殘基；在此不能是一級(jí)MHC錨殘基。T細(xì)胞受體接觸殘基被定義為，與野生型肽所誘導(dǎo)的相比，所有被測(cè)類(lèi)似物誘導(dǎo)都呈IFNγ產(chǎn)生陰性的肽內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)位置。
有關(guān)肽類(lèi)化合物的命名遵循常規(guī)規(guī)則，即，每個(gè)氨基酸殘基的氨基(N末端)在左，羧基(C末端)在右。在講到某氨基酸殘基在肽表位內(nèi)的位置時(shí)，編號(hào)方向?yàn)閺陌被┒讼螋然┒?，一位即最靠近該表位或肽或蛋白質(zhì)(可能是部分蛋白質(zhì))氨基末端的位置。在表示本發(fā)明特定實(shí)施方式的分子式中，雖未具體指明，但除非另作說(shuō)明，氨基末端和羧基末端都呈其在生理pH下的形式。在氨基酸結(jié)構(gòu)式內(nèi)，各殘基一般用三字母或單字母代碼表示。氨基酸殘基的L型用大寫(xiě)的單字母或首字母大寫(xiě)的三字母代碼表示，D型用小寫(xiě)單字母或小寫(xiě)三字母代碼表示。甘氨酸沒(méi)有不對(duì)稱(chēng)碳原子，因此只有“Gly”或G。氨基酸代碼如下所示單字母代碼 三字母代碼 氨基酸A Ala 丙氨酸C Cys 半胱氨酸D Asp 天冬氨酸E Glu 谷氨酸F Phe 苯丙氨酸G Gly 甘氨酸H His 組氨酸I Ile 異亮氨酸K Lys 賴(lài)氨酸
L Leu 亮氨酸M Met 甲硫氨酸N Asn 天冬酰胺P Pro 脯氨酸Q Gln 谷氨酰胺R Arg 精氨酸S Ser 絲氨酸T Thr 蘇氨酸V Val 纈氨酸W Trp 色氨酸Y Tyr 酪氨酸氨基酸的“化學(xué)特征”為芳族的(F，W，Y)；脂族疏水性的(L，I，V，M)；小極性氨基酸(S，T，C)；大極性氨基酸(Q，N)；酸性(D，E)；堿性(R，H，K)；脯氨酸；丙氨酸；和甘氨酸。
首字母縮寫(xiě)意義如-APC 抗原呈遞細(xì)胞CD3 泛T細(xì)胞標(biāo)記CD4 輔助T淋巴細(xì)胞標(biāo)記CD8 細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞標(biāo)記CEA 癌胚抗原CTL 細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞DC 樹(shù)狀細(xì)胞。DC是一種強(qiáng)抗原呈遞細(xì)胞，刺激乙肝病毒(HBV)衍生模型肽特異性CTL細(xì)胞線釋放細(xì)胞因子。HBV肽表位脈沖DC的體外實(shí)驗(yàn)中，在給予無(wú)免疫小鼠后，體外激發(fā)的CTL免疫反應(yīng)。DMSO二甲基亞砜ELISA 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)E∶T效應(yīng)子∶靶分子之比FCS 胎牛血清G-CSF 粒細(xì)胞集落刺激因子GM-CSF 粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞(單核細(xì)胞)集落刺激因子HBV 乙肝病毒HER2/Neu c-erbB-2HLA 人白細(xì)胞抗原HLA-DR II類(lèi)人白細(xì)胞抗原HPLC高效液相層析HTC 輔助T細(xì)胞HTL 輔助T淋巴細(xì)胞ID 相同性IFNγ γ干擾素IL-4白介素-4細(xì)胞因子IV 靜脈內(nèi)LU30％ (E∶T)之比為100∶1時(shí)達(dá)到30％裂解率所需的細(xì)胞毒性MAb 單克隆抗體MAGE黑素瘤抗原MLR 混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)MNC 單核細(xì)胞PB 外周血PBMC外周血單核細(xì)胞SC 皮下S.E.M. 平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差QD 每日一次TAA 腫瘤相關(guān)抗原TCR T細(xì)胞受體TNF 腫瘤壞死因子WBC 白細(xì)胞本申請(qǐng)的相關(guān)申請(qǐng)是11/10/98提交的U.S.S.N.09/189,702，它是3/4/94提交的U.S.S.N.08/205,713的CIP，后者是11/29/93提交的08/159,184(已放棄)的CIP，后者又是6/4/93提交的08/073,205(已放棄)的CIP，后者又是3/5/93提交的08/027,146(已放棄)的CIP。本申請(qǐng)的相關(guān)申請(qǐng)還包括U.S.S.N.09/226,775，它是08/815,396的CIP，后者以60/016,116(已放棄)為優(yōu)先權(quán)基礎(chǔ)。此外，本申請(qǐng)的相關(guān)申請(qǐng)還包括U.S.S.N.09/017,735，它是08/589,108的(已放棄)的CIP；08/753,622，08/822,382，60/013980(已放棄)，08/454,033，09/116,424和08/349,177。本申請(qǐng)的相關(guān)申請(qǐng)還包括09/017,524，08/821,739，60/013,833(已放棄)，08/758,409，08/589,107，08/451,913，08/186,266，09/116,061和08/347,610，它是08/159,339的CIP，后者是08/103,396(已放棄)的CIP，后者又是08/027,746(已放棄)的CIP，后者又是07/926,666(已放棄)的CIP。本申請(qǐng)的相關(guān)申請(qǐng)還包括09/017,743，08/753,615；08/590,298，09/115,400和08/452,843，它是08/344,824的CIP，后者是08/278,634(已放棄)的CIP。本申請(qǐng)的相關(guān)申請(qǐng)還包括60/087,192和09/009,953后者是60/036,713(已放棄)和60/037,432(已放棄)的CIP。此外，本申請(qǐng)的相關(guān)申請(qǐng)還包括09/098,584和09/239,043。本發(fā)明的相關(guān)申請(qǐng)還包括相關(guān)待審的5/30/00提交的09/583,200，3/1/99提交的09/260,714和美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)“變態(tài)類(lèi)似物及相關(guān)方法”，卷宗編號(hào)018623-015810US，申請(qǐng)日為10/6/00。以上申請(qǐng)均在本申請(qǐng)中作為參考。


圖1是關(guān)于三種不同多表位構(gòu)成物的數(shù)據(jù)，三種構(gòu)成物各自含有20-25個(gè)不同的CTL表位。
圖2是兩種不同的合成多肽(圖2a)，第一種構(gòu)成物含有4個(gè)不同表位，線性共合成而得，第二種構(gòu)成物含有一個(gè)GPGPG間隔序列(圖2b)，顯示2nmol的這兩種構(gòu)成物能夠在IAb陽(yáng)性小鼠內(nèi)誘發(fā)對(duì)多種表位的增殖反應(yīng)，并可與等量相同肽的混合物(每種肽3μg)所誘導(dǎo)的反應(yīng)相比。
圖3顯示多表位DNA構(gòu)成物的結(jié)構(gòu)。在各表位上方是HLA限制型，A*0201表位為粗體。各表位下方是HLA結(jié)合親和力(IC50nM)。(a)HIV-FT圖示，顯示了所編碼表位的順序；(b)HBV特異性構(gòu)成物圖示。箭頭表示核心18的C+1位氨基酸。核心18的C1位上插入了一個(gè)氨基酸的HBV特異性構(gòu)成物記作HBV.1X。
圖4HIV-FT內(nèi)HLA-A*0201表位在HLA-A*0201/Kb轉(zhuǎn)基因小鼠內(nèi)的免疫原性。(a)對(duì)表位Pol498(圓)，Vpr62(三角)和Gag386(方塊)的代表性CTL反應(yīng)。用對(duì)Jurkat-HLA-A*0201/Kb靶細(xì)胞的51Cr釋放試驗(yàn)，在所述各肽存在(實(shí)心標(biāo)記)和不存在(空心標(biāo)記)情況下測(cè)定細(xì)胞毒性。(b)HLA-A*0201/Kb轉(zhuǎn)基因小鼠內(nèi)HIV-FT免疫原性引起的CTL反應(yīng)的概括。條柱顯示的是陽(yáng)性株CTL反應(yīng)的幾何平均值，同時(shí)還顯示了陽(yáng)性CTL株的幾率。
圖5顯示C+1氨基酸對(duì)于表位免疫原性的影響。分析包含94種表位/C+1氨基酸組合的小基因的CTL反應(yīng)的數(shù)據(jù)庫(kù)，測(cè)定某一組合與最佳CTL反應(yīng)相關(guān)聯(lián)的頻率(％)。如果至少30％的培養(yǎng)物高于100SU或20LU，則認(rèn)為是最佳CTL反應(yīng)。圖中還顯示了某一表位/C+1氨基酸組合的出現(xiàn)幾率。
圖6對(duì)HBV-特異性構(gòu)成物的CTL反應(yīng)。(a)DNA免疫HLA-A*0201/Kb轉(zhuǎn)基因小鼠后對(duì)核心18表位的CTL反應(yīng)。(b)DNA免疫HLA-A*0201/Kb轉(zhuǎn)基因小鼠后對(duì)HBV核心18表位的CTL反應(yīng)，但構(gòu)成物中核心18的C+1位上插入了一個(gè)氨基酸。
圖7HBV.1(空心柱)和HBV.1K(陰影柱)轉(zhuǎn)染細(xì)胞線內(nèi)HBV核心18的呈遞水平。用肽特異性CTL細(xì)胞線定量測(cè)定表位呈遞水平。HBV Pol455的呈遞水平用于比較。
圖8HIV-1小基因轉(zhuǎn)染的221A2Kb靶細(xì)胞的數(shù)據(jù)。測(cè)定這些轉(zhuǎn)染細(xì)胞向HLA轉(zhuǎn)基因小鼠的不同HIV衍生CTL表位特異性CTL細(xì)胞線呈遞表位的能力。為了校正不同CTL細(xì)胞線之間的抗原性靈敏度差異，用非轉(zhuǎn)染細(xì)胞例如APC進(jìn)行平行的肽劑量滴定。
圖9本發(fā)明方法優(yōu)化的HIV多表位構(gòu)成物。
具體實(shí)施例方式
暨本發(fā)明的詳細(xì)描述I.引言本發(fā)明涉及設(shè)計(jì)具有優(yōu)化免疫原性的多表位疫苗的方法。優(yōu)選實(shí)施方式中，所述疫苗含有CTL和HTL表位。本發(fā)明疫苗具有廣泛、無(wú)種族歧視的人群覆蓋性，并適合針對(duì)不同病毒或其他抗原性分離體中的保守性表位。所述疫苗可以就其反應(yīng)強(qiáng)度和廣度進(jìn)行優(yōu)化，并可具有最簡(jiǎn)單的表位構(gòu)型。而且，本發(fā)明還提供了測(cè)評(píng)多表位疫苗在人體內(nèi)免疫原性的方法。
本發(fā)明方法包括根據(jù)本文所述的原則設(shè)計(jì)多表位構(gòu)成物。內(nèi)容之一，本發(fā)明可用同一啟動(dòng)小基因疫苗同時(shí)誘導(dǎo)對(duì)特定CTL和HTL表位的反應(yīng)。這樣的小基因構(gòu)成物可包含多種不同表位，最好超過(guò)10個(gè)，通常在20，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70以上。
在多表位構(gòu)成物的設(shè)計(jì)中，采用了以下幾點(diǎn)考慮(i)對(duì)欲引入多表位構(gòu)成物的表位進(jìn)行分選，以確定連接表位數(shù)量最少的順序。部分實(shí)施方式中，分選由計(jì)算機(jī)進(jìn)行。較好的是，作為表位排序中的第二考慮因素，某表位的增強(qiáng)CTL免疫原性的N末端殘基最好與另一CTL表位的C末端并列。
(ii)在表位的近旁位置插入可增強(qiáng)免疫原性的側(cè)翼殘基。
具體實(shí)施方式
中，側(cè)翼殘基插入在CTL表位的C+1位置。
(iii)在表位之間插入間隔序列以避免出現(xiàn)連接表位。
具體實(shí)施方式
中，間隔序列還可在其N(xiāo)端含有一個(gè)促進(jìn)免疫原性的殘基，使之與另一CTL表位的C末端毗鄰。
在避免HTL連接表位的具體實(shí)施方式
中，所用間隔序列中的氨基酸殘基不是任何II類(lèi)HLA錨殘基，例如，兩HTL表位之間是交替的G和P殘基(即GP間隔序列)。
本發(fā)明還包括在表位的近旁位置(例如毗鄰表位的C末端)引入或取代某氨基酸殘基，從而形成抗原性和免疫原性相對(duì)無(wú)此插入或取代的構(gòu)成物有所增強(qiáng)的多表位構(gòu)成物，即優(yōu)化小基因。本發(fā)明優(yōu)化多表位構(gòu)成物的方法包括在表位的C+1位置即緊靠該表位C末端側(cè)位引入一個(gè)側(cè)翼殘基，最好是K，N，G，R或A。另一實(shí)施方式中，造成免疫原性下降的殘基，例如負(fù)電殘基(如D)，脂族殘基(I，L，M，V)或芳族非色氨酸殘基，被替換。側(cè)翼殘基的引入可以通過(guò)表位的適當(dāng)排布從而獲得優(yōu)選的側(cè)翼殘基，也可通過(guò)特定殘基的插入。優(yōu)化多表位疫苗構(gòu)成物設(shè)計(jì)中的考慮因素正如背景部分所述，編碼長(zhǎng)至10表位的小基因已被用于誘導(dǎo)對(duì)多種不同表位的反應(yīng)。有關(guān)一實(shí)驗(yàn)小基因pMin.1的數(shù)據(jù)已經(jīng)公開(kāi)(Ishioka等，免疫學(xué)雜志，Vol.162(7)3915-25(1999))。本文所述的是，具有優(yōu)化免疫原性的多表位構(gòu)成物的設(shè)計(jì)和測(cè)評(píng)參數(shù)，所述免疫原性針對(duì)多種重要的疾病適應(yīng)癥。
設(shè)計(jì)參數(shù)的確定建立在大量研究的基礎(chǔ)之上。在對(duì)多表位構(gòu)成物的預(yù)備性測(cè)評(píng)中，給出了三種不同多表位構(gòu)成物的數(shù)據(jù)，這些構(gòu)成物各自含有20-25個(gè)不同CTL表位(圖1)。其中一種構(gòu)成物是基于HIV衍生表位(HIV-1)，另兩種則包含HCV衍生表位(HCV1和HCV2)。在A2或A11HLA轉(zhuǎn)基因小鼠內(nèi)測(cè)定這些不同小基因的免疫原性(沒(méi)有測(cè)評(píng)A1，A24和B7限制性表位)。
這樣，一次i.m.DNA疫苗注射后11天，然后用CTL活性測(cè)定試驗(yàn)(鉻釋放或原位IFN產(chǎn)生，如前所述)測(cè)評(píng)6天一次進(jìn)行體外再刺激后對(duì)8-14種不同代表性表位的反應(yīng)。HIV-1，HCV1和HCV2中可引發(fā)表位特異性CTL的表位數(shù)分別為6/8(75％)，10/14(72％)和13/14(93％)。因此，能夠同時(shí)引發(fā)對(duì)大量表位的CTL反應(yīng)的小基因不難設(shè)計(jì)。然而，需要注意的是，沒(méi)有測(cè)到對(duì)某些表位的CTL引發(fā)，而且，在所考慮的36種情況中，有些反應(yīng)發(fā)生的頻率不高，或者強(qiáng)度差異超過(guò)3個(gè)數(shù)量級(jí)(1000倍)左右。這些結(jié)果清楚地表明，需要對(duì)小基因構(gòu)成物進(jìn)行更細(xì)致的分析和優(yōu)化。
對(duì)以下可能性進(jìn)行了研究，即，對(duì)某些表位的非最佳引發(fā)可能與小基因的大小相關(guān)。事實(shí)上，大多數(shù)已公開(kāi)的報(bào)道描述的都是至多10個(gè)表位的小基因，甚少涉及20個(gè)表位的小基因，而且僅測(cè)定了對(duì)2個(gè)或3個(gè)表位的活性。為了研究所述可能性，本發(fā)明合成并試驗(yàn)了兩個(gè)小型小基因(HIV-1.1和HIV-1.2)，各自包含10個(gè)表位，相當(dāng)于HIV-1小基因的一半。測(cè)定了對(duì)4種代表性表位的反應(yīng)。

可發(fā)現(xiàn)，小型小基因誘導(dǎo)的反應(yīng)比20表位構(gòu)成物所誘導(dǎo)的低得多(表1)。所以，小基因大小相關(guān)因素不能解釋對(duì)某些表位的非最佳引發(fā)，因此需采用本文所述的其他參數(shù)來(lái)設(shè)計(jì)有效的多表位構(gòu)成物。盡可能減少連接基元設(shè)計(jì)多表位構(gòu)成物時(shí)需要考慮的問(wèn)題之一是在將表位彼此相鄰安置時(shí)會(huì)意外形成連接表位。小基因中若出現(xiàn)此類(lèi)表位會(huì)大大降低其性能。本發(fā)明公開(kāi)了避免此種不良效應(yīng)的方法，適用于多表位或小基因疫苗的開(kāi)發(fā)。首先，可以通過(guò)對(duì)表位進(jìn)行分選，以確定可使連接表位最少的表位順序。所述分選可用計(jì)算機(jī)進(jìn)行，也可通過(guò)目測(cè)，或者根據(jù)多表位構(gòu)成物欲包含的表位數(shù)選擇合適的方法。
例如，可用方案查找程序例如Panorama設(shè)計(jì)多表位小基因。在設(shè)計(jì)一特定小基因構(gòu)成物時(shí)可考慮大量不同的表位排布方案。計(jì)算機(jī)程序接受的輸入信息包括所考慮的特定表位組合，待掃描基元，這是為了確定是否存在攜帶這些基元的連接表位。例如，某程序可模擬建立一個(gè)小基因，通過(guò)一種計(jì)算機(jī)算法檢查表位對(duì)，避免或盡可能減少連接基元。例如，該程序可每秒測(cè)評(píng)6×105種小基因構(gòu)型?；蛘撸部梢赃M(jìn)行非計(jì)算機(jī)輔助的分析，但因?yàn)檫@比較費(fèi)時(shí)，所以并非上選。
如前所述用計(jì)算機(jī)程序?qū)σ粋€(gè)10表位構(gòu)成物的完全分析需要檢查10的階乘約3.6×106種組合，需時(shí)6秒。對(duì)14表位構(gòu)成物的完全分析需數(shù)天。然而，隨著構(gòu)思的小基因增大，分析時(shí)間迅速增長(zhǎng)。如果不需要進(jìn)行完全分析，則程序的運(yùn)行時(shí)間可以是任意長(zhǎng)度。此時(shí)，可以獲得連接表位最少的構(gòu)型。
表2是這種方法所得結(jié)果的一個(gè)例子。該表內(nèi)是經(jīng)2天計(jì)算機(jī)分析所得，同樣表位在HCV1小基因(內(nèi)含25表位)內(nèi)10種不同隨機(jī)分選中的連接基元數(shù)。在非優(yōu)選分選中，發(fā)現(xiàn)了大量A2，A11和Kb基元，約為25-38個(gè)，平均31個(gè)。相比之下，在HCV1小基因分選中，這樣的連接基元只有2個(gè)。因此，可用計(jì)算機(jī)程序盡可能減少小基因構(gòu)成物內(nèi)的連接基元。
表2連接表位的發(fā)生率

消除II類(lèi)連接表位和體內(nèi)檢測(cè)II類(lèi)限制性反應(yīng)作為消除連接表位的另一種考慮，可以在并列時(shí)會(huì)形成連接表位的兩表位之間插入間隔序列。
為了解決HTL表位的連接表位問(wèn)題，可在兩表位之間插入一段至少5氨基酸的間隔序列。此類(lèi)間隔序列中的氨基酸殘基最好不是已知的任一II類(lèi)HLA結(jié)合基元的一級(jí)錨殘基。此類(lèi)殘基包括G，P和N。一優(yōu)選實(shí)施方式中，兩表位間的間隔序列為GPGPG。先前的工作已證明，GP間隔序列對(duì)于阻滯II類(lèi)結(jié)合特別有效(Sette等，免疫學(xué)雜志，1431268-73(1989))。所有的已知人II類(lèi)結(jié)合基元和小鼠IAb(HLA轉(zhuǎn)基因小鼠所表達(dá)的II類(lèi)基元)都不能耐受G或P殘基位于相距4個(gè)殘基的這些主要錨定位置。這一方法可以確保不形成II類(lèi)限制性的連接表位。
在驗(yàn)證以上設(shè)計(jì)構(gòu)思的一個(gè)實(shí)例中，我們合成了含有HIV衍生HTL表位的多肽。這些表位是廣泛交叉反應(yīng)性HLA DR結(jié)合表位。因此，測(cè)定這些表位是否同樣可有效結(jié)合鼠IAbII類(lèi)分子。圖2a是構(gòu)思的兩種不同合成多肽的圖示。
第一種構(gòu)成物含有線性排列的4個(gè)不同表位，第二種構(gòu)成物含有GPGPG間隔序列。另外合成了對(duì)應(yīng)于三種可能性連接表位的合成肽。
2nmol的這些不同構(gòu)成物可以在IAb陽(yáng)性小鼠內(nèi)引發(fā)對(duì)不同表位的增殖反應(yīng)，并與等量同表位混合物(每種表位3μg)所引起的反應(yīng)相當(dāng)。具體地說(shuō)，給每組3個(gè)小鼠注射CFA乳液，11天后取其淋巴結(jié)細(xì)胞體外培養(yǎng)3天，測(cè)定最后24小時(shí)的胸苷摻入率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)(圖2b)，正如基于它們與IAb高親和力結(jié)合能力所做的預(yù)測(cè)，4種表位都誘導(dǎo)了良好的增殖反應(yīng)。注射表位混合物時(shí)的刺激指數(shù)(SI)在4.9-17.9之間。然而，在用含有同樣這4種表位的線性多肽進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)，對(duì)Pol 335的反應(yīng)沒(méi)有了。與此相關(guān)的是出現(xiàn)了一個(gè)針對(duì)跨Gag 171和Pol 335的連接表位的反應(yīng)。GPGPG間隔序列的采用消除了這一問(wèn)題，這可能是因?yàn)殚g隔序列破壞了連接表位，從而恢復(fù)了Pol 335反應(yīng)。所測(cè)得反應(yīng)的強(qiáng)度與獨(dú)立肽混合物所誘導(dǎo)的相近。
以上結(jié)果表明可以同時(shí)誘導(dǎo)針對(duì)多個(gè)HIV衍生II類(lèi)表位的反應(yīng)，并且說(shuō)明了如何利用IAb/DR交叉反應(yīng)性來(lái)研究各種含HTL表位的候選構(gòu)成物的免疫原性。最后，這些結(jié)果還表明，合適的間隔序列可有效破壞原本可能影響疫苗免疫原性的II類(lèi)連接表位。
就I類(lèi)限制性反應(yīng)而言，McMichael等描述了一種天然連接表位及其抑制表位特異性反應(yīng)的情況(Tussey等，免疫，Vol.3(1)65-77(1995))。為了解決I類(lèi)連接表位的問(wèn)題，可進(jìn)行類(lèi)似的分析。例如，可用特定的計(jì)算機(jī)程序篩選鼠基元和最常見(jiàn)人I類(lèi)HLA A基元和B基元，從而鑒定可能性I類(lèi)限制性連接表位。
也可類(lèi)似的利用間隔序列來(lái)避免CTL連接表位。通常優(yōu)選很小的殘基作為間隔殘基，例如A或G。G還是I類(lèi)HLA結(jié)合基元的低頻優(yōu)選一級(jí)錨殘基(見(jiàn)例如PCT/US00/24802)。這些間隔序列可以具有不同的長(zhǎng)度，例如一般長(zhǎng)1，2，3，4，5，6，7或8個(gè)氨基酸，有時(shí)更長(zhǎng)些?？紤]到形成多表位構(gòu)成物的空間限制，優(yōu)選短序列。側(cè)翼區(qū)對(duì)CTL小基因免疫原性的影響設(shè)計(jì)小基因時(shí)的另一項(xiàng)考慮是在CTL表位C末端的近旁位置插入增強(qiáng)免疫原性的殘基。
本發(fā)明描述了此類(lèi)殘基的鑒定。側(cè)翼區(qū)(至少有時(shí))可調(diào)節(jié)CTL表位的表觀呈遞。然而，迄今為止，對(duì)于側(cè)翼區(qū)的調(diào)節(jié)效應(yīng)只進(jìn)行過(guò)有限的分析，而且都是小鼠MHC限制性表位(Ishioka 1998年的研究除外，Ishioka等，免疫學(xué)雜志，Vol.162(7)3915-25(1999))。這一點(diǎn)非常重要，因?yàn)樾∈蠛腿说腗HC基元具有不同的C末端，因而可能受到蛋白體剪切偏性不同的影響。而且，極少(如果有的話)的研究考慮到了小鼠與人在蛋白體和/或ER蛋白酶加工特異性方面的潛在差異。因此，采用人和小鼠表位的實(shí)驗(yàn)可能得到不同的結(jié)果和側(cè)翼殘基“規(guī)則”。本文所述是鑒定增強(qiáng)免疫原性的殘基的研究，因此所述的是插入多表位構(gòu)成物以?xún)?yōu)化免疫原性的殘基。
表位表達(dá)所處的分子環(huán)境極大地影響著該表位在HLA轉(zhuǎn)基因小鼠內(nèi)引發(fā)CTL特異性反應(yīng)的頻率和強(qiáng)度。表3顯示了兩個(gè)例子。

1)γ干擾素分泌單位小基因pMin5內(nèi)表達(dá)的HBV核心18表位的免疫原性比在pMin1小基因中的低約200倍。類(lèi)似的，在HCV1小基因內(nèi)表達(dá)的HCV核心132表位的免疫原性幾乎空白，12個(gè)不同CTL實(shí)驗(yàn)/培養(yǎng)物中只有2個(gè)測(cè)得了明顯的T細(xì)胞反應(yīng)。這兩個(gè)陽(yáng)性反應(yīng)的IFN-γ分泌單位約為100SU。然而，當(dāng)同樣表位在HCV2小基因中表達(dá)時(shí)，可在17/18個(gè)實(shí)驗(yàn)中觀察到陽(yáng)性反應(yīng)，平均強(qiáng)度高約5倍。HIV-FT在HLA-A*0201/Kb轉(zhuǎn)基因小鼠內(nèi)的免疫原性一種HIV多表位DNA疫苗，HIV-FT(圖3a)，編碼20個(gè)HIV衍生CTL表位。其中，8個(gè)是HLA-A*0201限制型，9個(gè)是HLA-A*1101限制型，3個(gè)是HLA-B*070118限制型。全部表位與各自的限制元件(restriction element)結(jié)合親和力良好。全部HLA-A*0201限制性表位與純化HLA-A*0201分子的結(jié)合親和力大致相同，IC50在19-192nM之間(圖3a)。選入HIV-FT的HLA-A*0201表位可在HIV-1感染的個(gè)體內(nèi)被識(shí)別，并且，以IFA乳化后用于引發(fā)HLA-A*0201/Kb轉(zhuǎn)基因小鼠能高效引發(fā)記憶性CTL反應(yīng)。構(gòu)成物的設(shè)計(jì)為連續(xù)編碼多表位，彼此間沒(méi)有間隔序列，在5′端融合一個(gè)共用Igκ信號(hào)序列，用于將所編碼的抗原轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)(Ishioka等，免疫學(xué)雜志，1623915-3925，1999)。
通過(guò)肌內(nèi)免疫HLA-A*0201/Kb轉(zhuǎn)基因小鼠來(lái)測(cè)評(píng)HIV-FT體內(nèi)引發(fā)記憶性CTL反應(yīng)的能力。用100μg HIV-FT質(zhì)粒DNA免疫小鼠脾細(xì)胞，用HIV-FT內(nèi)編碼的各HLA-A*0201表位激發(fā)，培養(yǎng)6天后測(cè)定肽特異性CTL活性。圖4a顯示了對(duì)HIV-FT三種表位的代表性CTL反應(yīng)。為了方便不同實(shí)驗(yàn)結(jié)果的匯總，每份脾細(xì)胞培養(yǎng)物的細(xì)胞毒性百分比以溶胞單位表示(Vitiello等，臨床研究雜志，95341-349，1995)。在HIV-FT內(nèi)編碼的8個(gè)HLA-A*0201限制性表位中，Pol498，Env134，Pol448，Vpr62，Nef221和Gag271在DNA免疫后引發(fā)了CTL反應(yīng)(圖4b)。這些CTL反應(yīng)的強(qiáng)度相差10倍以上，從Pol498的高達(dá)50LU到Nef221和Gag271的低至4LU。類(lèi)似的，各表位的記憶性CTL反應(yīng)頻率也不相同，Pol498表位的誘導(dǎo)率為94％，Gag271則僅為31％。因此，以無(wú)間隔連續(xù)編碼多表位的HIV-FT進(jìn)行DNA免疫可以誘導(dǎo)對(duì)大多數(shù)表位的記憶性CTL反應(yīng)。然而，各表位之間這些反應(yīng)的強(qiáng)度和頻率有巨大差異。表位的免疫原性與轉(zhuǎn)染細(xì)胞線內(nèi)HIV-FT表位呈遞水平之間的關(guān)系本發(fā)明對(duì)HIV-FT內(nèi)各HLA-A*0201表位的不同免疫原性進(jìn)行了測(cè)評(píng)?？梢耘懦齅HC結(jié)合親和力差異因素，因?yàn)槿勘砦慌cHLA-A*0201都以高親和力結(jié)合(圖3a)。此外，也可以排除HLA-A*0201/Kb轉(zhuǎn)基因小鼠沒(méi)有合適的TCR特異型庫(kù)(repertoires)這一因素，因?yàn)樵谟肐FA乳化的優(yōu)化預(yù)加工肽免疫HLA轉(zhuǎn)基因小鼠后，全部表位都引發(fā)了相當(dāng)水平的CTL反應(yīng)。各表位呈遞給T細(xì)胞識(shí)別的相對(duì)量差異至少是表位免疫原性差異的部分原因。
為了驗(yàn)證這一點(diǎn)，用游離型載體內(nèi)表達(dá)的HIV-FT轉(zhuǎn)染表達(dá)HLA-A*0201/Kb基因的人T細(xì)胞線Juukat細(xì)胞(Vitiello等，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，1731007-1015，1991)。選擇合適的人細(xì)胞線以消除可能與人與小鼠之間加工能力差異相關(guān)的任何可能性人為因素。該轉(zhuǎn)染細(xì)胞線需與帶有抗原加工能力的MHC呈遞相匹配，并可以為以后發(fā)展為基于CTL表位的人用DNA疫苗提供支持。
肽特異性CTL細(xì)胞線在轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)到HIV-FT內(nèi)編碼的4種HLA-A*0201表位的呈遞，它們是Pol 498，Env 134，Pol 448和Nef 221。為了測(cè)定各表位的產(chǎn)生量和呈遞量，將各表位特異性CTL細(xì)胞線與非轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞和不同量的各表位一起培養(yǎng)。將這些CTL劑量-反應(yīng)曲線用作標(biāo)準(zhǔn)曲線，用于確定所誘導(dǎo)IFN-γ分泌水平與在HIV-FT轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞內(nèi)所觀察到的相當(dāng)時(shí)的肽濃度。該值稱(chēng)為“肽當(dāng)量劑量”，并作為轉(zhuǎn)染細(xì)胞上表位呈遞量的相對(duì)指標(biāo)。
表5概括了HIV-FT內(nèi)編碼的7種HLA-A*0201表位的以上試驗(yàn)的結(jié)果。肽當(dāng)量劑量各不相同，從Nef 221的高達(dá)33.3ng/ml，到Gag 271，Gag 386和Pol 774的低至0.4ng/ml以下。匯總起來(lái)看，以上結(jié)果表明，在HIV-FT轉(zhuǎn)染的人細(xì)胞線內(nèi)，不同HLA-A*0201限制性表位之間的呈遞水平差異至少為100倍。在抗原性試驗(yàn)中以可測(cè)水平呈遞的表位在體內(nèi)也都具有免疫原性。唯一具有免疫原性而沒(méi)有抗原性的表位是Gag 271。此時(shí)，以HIV-FT免疫HLA-A*0201/Kb轉(zhuǎn)基因小鼠只在不到1/3的培養(yǎng)物內(nèi)誘導(dǎo)了弱CTL反應(yīng)。另兩種呈遞水平低于抗原試驗(yàn)靈敏度的表位，Gag 386和Pol 774，沒(méi)有免疫原性。因此，以上結(jié)果表明，非最佳表位呈遞至少是HIV-FT免疫誘導(dǎo)CTL反應(yīng)不均的部分原因。
表5HIV-FT免疫原性和抗原性比較

1以LU為單位的強(qiáng)度與肽當(dāng)量的相關(guān)系數(shù)等于R+0.442陽(yáng)性培養(yǎng)物頻率(＞2LU的培養(yǎng)物數(shù)量/被測(cè)總培養(yǎng)物數(shù)量)與肽當(dāng)量的相關(guān)系數(shù)等于R+0.8；3以ng/ml為單位的強(qiáng)度；4獨(dú)立試驗(yàn)次數(shù)側(cè)翼氨基酸影響接種后CTL表位的體內(nèi)免疫原性如前所述，各CTL表位近旁的特定氨基酸可改變抗原對(duì)蛋白酶剪切的易感性，因而是影響該表位效力的因素之一。為了確定側(cè)翼氨基酸對(duì)表位免疫原性的影響，用大量非相關(guān)性實(shí)驗(yàn)性多表位DNA構(gòu)成物免疫HLA-A*0201、-A*1101和-B*0701轉(zhuǎn)基因小鼠，獲得了免疫原性數(shù)據(jù)，所述構(gòu)成物編碼最少的CTL表位，彼此間沒(méi)有間隔序列。建立了一個(gè)代表94種不同表位/側(cè)翼殘基組合的數(shù)據(jù)庫(kù)，用于確定側(cè)翼氨基酸對(duì)表位免疫原性可能的影響。為了避免重復(fù)造成的分析偏差，每種表位與側(cè)翼氨基酸的組合只收入數(shù)據(jù)庫(kù)中一次。如果30％以上被測(cè)培養(yǎng)物的強(qiáng)度高于100SU或20LU，則認(rèn)為該表位在HLA轉(zhuǎn)基因小鼠內(nèi)的免疫原性為最佳。CTL反應(yīng)一般分為4等(+++)優(yōu)異-高于200LU或1000SU；(++)良好-20-200LU或100-1000SU；(+)中等-2-20LU或10-100SU；(+/-)弱或陰性-低于2LU或10SU。根據(jù)近旁位置的氨基酸化學(xué)類(lèi)型對(duì)最佳和非最佳反應(yīng)次數(shù)進(jìn)行區(qū)分，并用Chi-squar試驗(yàn)計(jì)算差異的顯著性。
以上試驗(yàn)沒(méi)有發(fā)現(xiàn)表位氨基末端氨基酸類(lèi)型與免疫原性之間的任何關(guān)聯(lián)，但卻發(fā)現(xiàn)羧基末端的側(cè)翼殘基即C+1殘基具有明顯的影響。正電氨基酸K或R與最佳CTL反應(yīng)相關(guān)的頻率最高(68％)(圖5)。C+1位上的N和Q也與強(qiáng)CTL反應(yīng)相關(guān)，頻率為55.5％；當(dāng)C+1位上為N時(shí)，其誘導(dǎo)最佳CTL反應(yīng)的頻率為3/4?？偟恼f(shuō)來(lái)，小殘基，例如C，G，A，T和S促進(jìn)中等CTL反應(yīng)，在54％的所試組合中誘導(dǎo)強(qiáng)反應(yīng)。相反，近旁為芳族或脂族氨基酸的表位體內(nèi)誘導(dǎo)最佳反應(yīng)的頻率分別僅為36％和17％。負(fù)電殘基D誘導(dǎo)的是非最佳CTL反應(yīng)。Chi方(Chi-square)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，C+1位氨基酸對(duì)表位免疫原性的影響具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P＜0.03)。對(duì)距離C末端C+1之外位置的殘基進(jìn)行同樣的分析，發(fā)現(xiàn)它們對(duì)表位的免疫原性沒(méi)有顯著影響。C1殘基影響表位免疫原性的直接測(cè)評(píng)為了直接測(cè)評(píng)優(yōu)選和不良氨基酸在C+1近旁位置上的影響，對(duì)兩種多表位構(gòu)成物，HBV.1和HBV.2(圖3b)進(jìn)行了測(cè)評(píng)。和HIV-FT一樣，這些HBV構(gòu)成物連續(xù)編碼各表位，彼此間沒(méi)有間隔序列。實(shí)際上，HBV.1和HBV.2是用HVB衍生表位取代pMin1(已知實(shí)驗(yàn)性多表位構(gòu)成物(Ishioka，同上))內(nèi)的HIV-1表位制得。
就HBV.1而言，直接位于高免疫原性HBV核心18表位之后的HIV-1表位被HBV Pol 562表位取代。這使得C+1殘基由K變成了F。第二種構(gòu)成物，HBV.2，是在HBV核心18與Pol 562之間插入表位HBV Pol 629制得，這將C+1氨基酸變成了K殘基。在HLA-A*0201/Kb轉(zhuǎn)基因小鼠內(nèi)測(cè)評(píng)以上位于不同環(huán)境中核心18表位的免疫原性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HBV.1內(nèi)的核心18表位基本上無(wú)免疫原性，而在HBV.2中則具有強(qiáng)免疫原性(圖6a)。該表位的體內(nèi)免疫原性降低與我們先前的預(yù)計(jì)相符。
為了進(jìn)一步檢測(cè)C1側(cè)翼氨基酸對(duì)CTL表位免疫原性的影響，對(duì)一組區(qū)別于HBV.1的構(gòu)成物進(jìn)行了測(cè)評(píng)，所述區(qū)別在于在核心18表位的C+1位插入了一個(gè)氨基酸(圖3c)。當(dāng)C+1位是W，Y或L時(shí)，幾乎沒(méi)有或沒(méi)有發(fā)現(xiàn)抗核心18表位的CTL反應(yīng)(圖6b)。相反，插入一個(gè)K殘基極大增強(qiáng)了對(duì)核心18的CTL反應(yīng)。這些反應(yīng)可與HBV.2的反應(yīng)相比，HBV.2中核心18表位旁是N末端為K的Pol629表位。插入R，C，N或G也可觀察到核心18CTL反應(yīng)的增強(qiáng)。以上插入的效應(yīng)具有特異性，因?yàn)檫@些構(gòu)成物內(nèi)其他表位的免疫原性并沒(méi)有表現(xiàn)出顯著的CTL反應(yīng)改變(未顯示數(shù)據(jù))。因此，以上數(shù)據(jù)表明，C+1氨基酸可顯著影響表位的免疫原性。CTL表位免疫原性差異與呈遞量相關(guān)如果與C+1殘基不同相關(guān)的核心18免疫原性差異是對(duì)蛋白酶剪切敏感性差異所致，那么就應(yīng)當(dāng)能夠測(cè)得不同構(gòu)成物的表位呈遞水平之間存在顯著差異。為了驗(yàn)證這一點(diǎn)，用表達(dá)HBV.1或HBV.1K的游離型載體轉(zhuǎn)染Jurkat細(xì)胞，該細(xì)胞也表達(dá)在轉(zhuǎn)基因小鼠20內(nèi)表達(dá)的HLA-A*0201/Kb基因。當(dāng)C+1位是K時(shí)，核心18的呈遞水平比該位置為F時(shí)高105倍以上(圖7)。這一核心18呈遞差異不可能是因?yàn)榘屑?xì)胞間的基因表達(dá)差異，因?yàn)镻ol455的呈遞差異不到10倍。以上數(shù)據(jù)顯示，C+1位氨基酸的驚人效應(yīng)可影響到多表位DNA疫苗內(nèi)表位的呈遞效率。因此，以上數(shù)據(jù)表明，可以通過(guò)針對(duì)影響表位呈遞水平的設(shè)計(jì)來(lái)優(yōu)化DNA疫苗內(nèi)CTL表位的免疫原性。這種優(yōu)化適合于用其他方式(例如病毒載體及本領(lǐng)域已知的其他表達(dá)載體)給予的基于表位的疫苗，因?yàn)檫@種效應(yīng)發(fā)生在轉(zhuǎn)錄和翻譯之后。
總之，就側(cè)翼殘基而言，不論小殘基，例如A，C或G，還是大殘基，例如Q，W，K或R，都與良好或優(yōu)異的反應(yīng)相關(guān)。C+1位因小基因的終止密碼子而缺失或?yàn)镾或T等中等大小殘基時(shí)，更多的是中等強(qiáng)度的反應(yīng)。最后，如果是負(fù)電殘基D，脂族殘基(V，I，L，M)或芳族非色氨酸殘基(Y，F(xiàn))，則將觀察到較弱的反應(yīng)。以上結(jié)果表明，表位C末端的特定側(cè)翼氨基酸可以顯著影響免疫反應(yīng)的頻率和強(qiáng)度。也可將引入C+1位側(cè)翼氨基酸與間隔序列相結(jié)合。這樣，可以增強(qiáng)免疫原性的殘基作為間隔序列的側(cè)翼殘基，優(yōu)選的是K，R，N，A或G。多表位構(gòu)成物的分選和優(yōu)化為了用本發(fā)明形成多表位構(gòu)成物，用所述的參數(shù)對(duì)引入多表位構(gòu)成物的表位進(jìn)行分選和優(yōu)化。分選和優(yōu)化可以用計(jì)算機(jī)進(jìn)行，如果表位數(shù)量較少，則也可以不用計(jì)算機(jī)進(jìn)行。
計(jì)算機(jī)優(yōu)化一般如下進(jìn)行。以下是一個(gè)確定并優(yōu)化表位組合物的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)實(shí)例，所述優(yōu)化即確保連接表位最少而側(cè)翼殘基最多。
表位分選的組件之一是“連接分析程序”。該程序用一文本文件說(shuō)明其操作參數(shù)。將5類(lèi)數(shù)據(jù)輸入該程序1)一組待處理的肽；2)各氨基酸位于C+1位置和N-1位置時(shí)的權(quán)重(weight)；3)檢測(cè)連接時(shí)所用的一組基元；4)各對(duì)表位之間欲插入的最多氨基酸數(shù)量；5)控制程序運(yùn)行的其他數(shù)值。該程序?qū)λ锌赡艿碾膶?duì)進(jìn)行測(cè)評(píng)，并計(jì)算出連接數(shù)、C+1和N-1的權(quán)重，并根據(jù)預(yù)先設(shè)定的方程對(duì)它們進(jìn)行綜合。目前，所述方程只是兩權(quán)重之積除以連接數(shù)。如果連接數(shù)為0，則除數(shù)設(shè)定為0.5。可以將其他測(cè)評(píng)肽對(duì)的方程在任何時(shí)候方便地加入該程序中。該程序輸出的是一個(gè)文本文件，其中列出對(duì)每一對(duì)肽而言可實(shí)現(xiàn)最佳功能的允許插入。該文件還包括肽的原始列表和控制后一處理步驟中兩程序的指令。后兩程序?yàn)椤叭鍶檢索”和“隨機(jī)J檢索”。
“全面J搜索”檢查所有的肽排列組合，并選出函數(shù)總值最大的排列。該程序可找出函數(shù)總值最大的排列形式。然而，由于排列組合的階乘性質(zhì)，該程序只適用于最多12到13個(gè)肽。對(duì)13肽的運(yùn)行時(shí)間預(yù)計(jì)為2.9小時(shí)，14肽預(yù)計(jì)約40小時(shí)?！半S機(jī)J搜索”搜索排列組合序列的許多區(qū)域(area)，并告知找到的最佳函數(shù)總值。因?yàn)橹桓嬷匣虺^(guò)當(dāng)前最高函數(shù)總值(function total)的排列組合，它可以搜索排列順序的更大范圍(area)。該方法已成功運(yùn)用于20肽的排列。對(duì)20肽的全面搜索耗時(shí)可能長(zhǎng)達(dá)1.3×105年。
該程序如下運(yùn)作輸入以下參數(shù)1.待分選表位；2.如前所述的C+1和N-1氨基酸“權(quán)重”3.檢測(cè)連接表位的基元4.最大間隔殘基數(shù)5.控制程序選項(xiàng)的參數(shù)連接分析程序進(jìn)行以下操作1.形成所有表位對(duì)；2.為每一對(duì)肽確定如下插入序列組連接表位最少，而間隔殘基C+1和N-1的效應(yīng)最大。
3.輸出每一表位對(duì)的最佳間隔殘基，以及優(yōu)化連接值。
如果多表位構(gòu)成物包含14或14個(gè)以上表位，則宜采用隨機(jī)搜索程序。隨機(jī)搜索程序采用的是本領(lǐng)域已知的Monte Carlo技術(shù)，對(duì)排列空間的眾多區(qū)域進(jìn)行檢查，從而找出肽的預(yù)計(jì)最佳排列形式。
如果構(gòu)成物包含的表位少于14個(gè)，則宜采用全面搜索程序。該程序?qū)?gòu)成多表位構(gòu)成物的表位的所有排列進(jìn)行檢查，尋找所有表位對(duì)優(yōu)化函數(shù)總值最佳的排列。由于該程序?qū)λ信帕羞M(jìn)行了搜索，所以可以確保找到的是“最好”的。
以上程序的輸出值是一張表位最佳排列表，由于許多排列具有相同的測(cè)評(píng)函數(shù)值，所以可得到多條排列，因此需要考慮其他因素來(lái)選擇最佳排列。
表9列出了用以上程序系統(tǒng)得出的多表位構(gòu)成物實(shí)例。
可將諸如電荷分布、疏水區(qū)/親水區(qū)分析或折疊預(yù)測(cè)等其他因素引入測(cè)評(píng)函數(shù)以便進(jìn)一步優(yōu)化小基因構(gòu)成物。
大分子結(jié)構(gòu)，例如多肽結(jié)構(gòu)，可從多種組織水平進(jìn)行描述。有關(guān)這種組織的綜述可參考Alberts等，細(xì)胞分子生物學(xué)(第3版，1994)，和Cantor和Schimmel，生物物理化學(xué)第1部分生物大分子的構(gòu)象(1980)?！耙患?jí)結(jié)構(gòu)”指特定肽的氨基酸序列?！岸?jí)結(jié)構(gòu)”指肽內(nèi)的局部有序三維結(jié)構(gòu)。此類(lèi)結(jié)構(gòu)一般稱(chēng)為結(jié)構(gòu)域。結(jié)構(gòu)域是多肽的某些部分，它們可形成一個(gè)多肽的緊密單位。典型的結(jié)構(gòu)域由多段更小的組織組成，例如一連串β平面和α螺旋?！叭?jí)結(jié)構(gòu)”指一個(gè)多肽單體完整的三維結(jié)構(gòu)?！八募?jí)結(jié)構(gòu)”指三級(jí)結(jié)構(gòu)單位非共價(jià)結(jié)合而形成的三維結(jié)構(gòu)。
可用本領(lǐng)域已知的序列分析程序進(jìn)行例如電荷分布、疏水區(qū)/親水區(qū)分析或折疊預(yù)測(cè)等結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，例如可確定疏水性和親水性結(jié)構(gòu)域(參考例如Kyte&Doolittle，分子生物學(xué)雜志，157105-132(1982)和Stryer，生物化學(xué)(第3版，1988)；還可以參考其他互聯(lián)網(wǎng)上的序列分析程序，例如查詢(xún)dot.imgen.bcm.tmc.edu網(wǎng)站。
還可以制作某多表位構(gòu)成物的三維結(jié)構(gòu)模型。為此，一般需將待分析的氨基酸序列輸入計(jì)算機(jī)系統(tǒng)。該氨基酸序列代表了該蛋白質(zhì)的一級(jí)序列或亞序列，編碼著該蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息。然后由計(jì)算機(jī)系統(tǒng)用已知軟件生成該蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)模型。
氨基酸序列代表了編碼形成目標(biāo)蛋白二級(jí)、三級(jí)和四極結(jié)構(gòu)所需的一級(jí)結(jié)構(gòu)信息。軟件利用一級(jí)結(jié)構(gòu)所編碼的特定參數(shù)形成結(jié)構(gòu)模型。這些參數(shù)稱(chēng)作“能量項(xiàng)(energy terms)”，主要包括靜電勢(shì)，疏水性，溶劑可接觸表面和氫鍵。二級(jí)能量項(xiàng)包括范得華力。生物分子一般形成以上能量項(xiàng)累積值最小的結(jié)構(gòu)。于是，計(jì)算機(jī)利用一級(jí)結(jié)構(gòu)或氨基酸序列所編碼的這些能量項(xiàng)形成二級(jí)結(jié)構(gòu)模型。
然后，根據(jù)二級(jí)結(jié)構(gòu)的能量項(xiàng)形成二級(jí)結(jié)構(gòu)所編碼的蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)。使用者可輸入其他變量，例如該蛋白質(zhì)是膜結(jié)合蛋白還是可溶性蛋白，蛋白質(zhì)的體內(nèi)位置，細(xì)胞位置(例如在胞質(zhì)，表面和細(xì)胞核內(nèi))。這些變量與二級(jí)結(jié)構(gòu)的能量項(xiàng)一起用于形成三級(jí)結(jié)構(gòu)模型。在建立三級(jí)結(jié)構(gòu)模型時(shí)，計(jì)算機(jī)程序?qū)⑾嗨频亩?jí)結(jié)構(gòu)疏水面相互匹配，相似的二級(jí)結(jié)構(gòu)親水面相互匹配。
然后，挑選出最適宜HLA加工機(jī)制的多表位構(gòu)成物。II.多表位疫苗免疫原性的測(cè)評(píng)開(kāi)發(fā)多表位小基因是一項(xiàng)獨(dú)特的挑戰(zhàn)，因?yàn)殡呐cMHC的結(jié)合具有種特異性。不同物種的不同MHC類(lèi)別將結(jié)合不同的肽(Rammensee等，免疫遺傳學(xué)，Vol.41(4)178-228(1995))。結(jié)果是不可能在常規(guī)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行人表位構(gòu)成物的試驗(yàn)。但是已基本上有了克服該問(wèn)題的替代方法，這包括1)用包含非人MHC限制性表位的類(lèi)似構(gòu)成物進(jìn)行試驗(yàn)；2)依據(jù)非人MHC限制性控制(control)表位；3)依據(jù)人與非人MHC之間的交叉反應(yīng)性；4)使用HLA轉(zhuǎn)基因動(dòng)物；5)用人細(xì)胞進(jìn)行的體內(nèi)抗原性試驗(yàn)。以下是抗原性和免疫原性分析技術(shù)發(fā)展的簡(jiǎn)要綜述。I類(lèi)HLA轉(zhuǎn)基因小鼠用HLA轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行表位鑒定(Sette等，免疫學(xué)雜志，Vol.153(12)5586-92(1994)；Wentworth等，國(guó)際免疫學(xué)，Vol.8(5)651-9(1996)；Engelhard等，免疫學(xué)雜志，Vol.146(4)1226-32(1991)；Man等，國(guó)際免疫學(xué)，Vol.7(4)597-605(1995)；Shirai等，免疫學(xué)雜志，Vol.154(6)2733-42(1995))和疫苗開(kāi)發(fā)(Ishioka等，免疫學(xué)雜志，Vol.162(7)3915-25(1999))是已知的。大多數(shù)已公開(kāi)的報(bào)道研究了HLA A*0201/Kb小鼠的使用，但需要注意的是，已有的還包括B*27和B*3501小鼠。此外，已形成的還有HLA A*11/Kb小鼠(Alexander等，免疫學(xué)雜志，Vol.159(10)4753-61(1997))和HLA B7/Kb，HLA A1/Kb小鼠。
對(duì)38種潛在表位的數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析，以確定A2.1/Kb轉(zhuǎn)基因小鼠與A2.1+人的A2.1限制性CTL庫(kù)的重疊水平(Wentworth等，歐洲免疫學(xué)雜志，Vol.26(1)97-101(1996))。在人和小鼠中，MHC肽結(jié)合親和力的閾值約500nM，這與肽能夠體內(nèi)激發(fā)CTL反應(yīng)相關(guān)。人體內(nèi)數(shù)據(jù)與小鼠體內(nèi)數(shù)據(jù)之間的高水平一致性可見(jiàn)于85％的高結(jié)合性肽，58％的中等結(jié)合肽，83％低結(jié)合性/陰性結(jié)合肽。用HLA A11和HLA B7小鼠也獲得了類(lèi)似的結(jié)果(Alexander等，免疫學(xué)雜志，Vol.159(10)4753-61(1997))。因此，由于HLA轉(zhuǎn)基因小鼠和人的CTL的T細(xì)胞受體庫(kù)之間存在廣泛的重疊性，所以，轉(zhuǎn)基因小鼠對(duì)于本發(fā)明多表位構(gòu)成物的免疫原性測(cè)評(píng)具有重要的利用價(jià)值。
涉及HLA A11小鼠的TAP轉(zhuǎn)運(yùn)特異性差異并不妨礙用HLA-A11轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行免疫原性測(cè)評(píng)。雖然鼠和人的TAP都能有效轉(zhuǎn)運(yùn)帶有疏水性末端的肽，但據(jù)報(bào)道只有人的TAP能夠轉(zhuǎn)運(yùn)帶有正電C末端的肽，例如可被A3，A11以及其他A3超型成員所結(jié)合的肽。但這一發(fā)現(xiàn)并不適用于A2，A1和B7，因?yàn)槭蠛腿说腡AP轉(zhuǎn)運(yùn)A2，B7或A1結(jié)合性肽的能力應(yīng)該是相當(dāng)?shù)摹Ｅc這一理解相一致的是，Vitiello(Vitiello等，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，Vol.173(4)1007-15(1991))和Rotzschke(Rotzschke O，F(xiàn)alk K，現(xiàn)代免疫學(xué)觀點(diǎn)，Vol.6(1)45-51(1994))認(rèn)為小鼠和人細(xì)胞內(nèi)的加工過(guò)程是相同的，但Cerundolo(Rotzschke O，F(xiàn)alk K.，現(xiàn)代免疫學(xué)觀點(diǎn)，Vol.6(1)45-51(1994))則認(rèn)為同樣表達(dá)HLA A3分子的鼠細(xì)胞和人細(xì)胞內(nèi)的加工是不同的。然而，用HLA A11轉(zhuǎn)基因小鼠觀察到了T細(xì)胞和B細(xì)胞上的HLA分子體內(nèi)表達(dá)，說(shuō)明報(bào)道中不利的鼠TAP特異性并不妨礙A11/Kb分子的體內(nèi)穩(wěn)化和轉(zhuǎn)運(yùn)(Alexander等，免疫學(xué)雜志，Vol.159(10)4753-61(1997))。以上數(shù)據(jù)附和先前觀察到的具有帶電C末端的肽可從A11分子轉(zhuǎn)染的鼠細(xì)胞內(nèi)被洗脫(Maier等，免疫遺傳學(xué)，Vol.40(4)306-8(1994))。而且，已經(jīng)在HLA A11小鼠體內(nèi)檢測(cè)到了對(duì)復(fù)雜抗原，例如對(duì)流感病毒，最重要的是對(duì)多表位小基因編碼的A11限制性表位的反應(yīng)(Ishioka等，免疫學(xué)雜志，Vol.162(7)3915-25(1999))。因此，TAP似乎并非轉(zhuǎn)基因小鼠的主要問(wèn)題。
可能與采用HLA轉(zhuǎn)基因小鼠相關(guān)的另一問(wèn)題是β2微球蛋白可能影響HLA的表達(dá)和結(jié)合特異性。已知，人β2微球蛋白既結(jié)合人MHC也結(jié)合小鼠MHC，結(jié)合親和力和穩(wěn)定性都高于小鼠β2微球蛋白(Shields等，分子免疫學(xué)，Vol.35(14-15)919-28(1998))。還已知，較穩(wěn)定的MHC重鏈與β2的復(fù)合物可促進(jìn)I類(lèi)MHC的外源性加載(Vitiello等，科學(xué)，Vol.250(4986)1423-6(1990))。我們用HLA/Kb和人β2雙重轉(zhuǎn)基因小鼠研究了這一因素可能的影響。人β2的表達(dá)對(duì)HLA B7/Kb小鼠有利，在HLA A1轉(zhuǎn)基因小鼠中，則絕對(duì)是獲得良好表達(dá)水平的必要條件。因此，本發(fā)明當(dāng)前主要培育并使用HLA/Kb和β2雙重轉(zhuǎn)基因小鼠。因此，HLA轉(zhuǎn)基因小鼠可以用于建立對(duì)4種主要HLA特異性(即A2，A11，B7和A1)的HLA限制性識(shí)別模型，而且還可以建立其他HLA特異性轉(zhuǎn)基因小鼠用作相關(guān)免疫原性的測(cè)評(píng)模型。I類(lèi)表位的抗原性試驗(yàn)數(shù)個(gè)非相關(guān)性實(shí)驗(yàn)顯示，細(xì)胞表面上I類(lèi)/肽復(fù)合物的密度可能與T細(xì)胞的引發(fā)水平相關(guān)。因此，測(cè)定APC表面上表位的產(chǎn)生水平和呈遞水平提供了間接評(píng)價(jià)小基因疫苗在人細(xì)胞內(nèi)效力的途徑。作為對(duì)采用I類(lèi)HLA轉(zhuǎn)基因小鼠的補(bǔ)充，該方法的優(yōu)點(diǎn)在于可研究人細(xì)胞內(nèi)的加工(Ishioka等，免疫學(xué)雜志，Vol.162(7)3915-25(1999))。
目前已有多種對(duì)加工肽進(jìn)行定量的實(shí)驗(yàn)方法。細(xì)胞表面上的肽量可通過(guò)測(cè)定從APC表面洗下的肽量來(lái)確定(Sijts等，免疫學(xué)雜志，Vol.156(2)683-92(1996)；Demotz等，自然，Vol.342(6250)682-4(1989))?；蛘?，可以估計(jì)肽-MHC復(fù)合物數(shù)量測(cè)定感染或轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞誘發(fā)的溶胞量或淋巴因子釋放量，然后測(cè)定達(dá)到相同水平溶胞或淋巴因子釋放所需的肽濃度(Kageyama等，免疫學(xué)雜志，Vol.154(2)567-76(1995))。
還有一類(lèi)似的方法可用于測(cè)定小基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞線內(nèi)的表位呈遞。具體地說(shuō)，在HLA轉(zhuǎn)基因小鼠內(nèi)具有免疫原性的小基因構(gòu)成物也能被同樣小基因所轉(zhuǎn)染的人細(xì)胞加工成最佳表位，而且，在轉(zhuǎn)基因小鼠內(nèi)觀察到的反應(yīng)強(qiáng)度與在轉(zhuǎn)染的靶細(xì)胞內(nèi)觀察到的抗原性相關(guān)。(Ishioka等，免疫學(xué)雜志，Vol.162(7)3915-25(1999))。
用抗原性實(shí)驗(yàn)，可將大量區(qū)別在于表位順序或側(cè)翼殘基的相關(guān)小基因轉(zhuǎn)染到APC內(nèi)，然后評(píng)價(jià)這些因素對(duì)于表位呈遞的影響。這可以作為測(cè)評(píng)大量不同構(gòu)成物的優(yōu)選系統(tǒng)。雖然，這需要有大量表位特異性CTL來(lái)生成高靈敏度CTL細(xì)胞線(Alexander-Miller等，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)，Vol.93(9)4102-7(1996))和放大其數(shù)量(Greenberg P.D.，Riddell S.R.，科學(xué)，Vol.285(5427)546-51(1999))，從而可解決這一潛在問(wèn)題的方法。
另需記住的是，如果所選轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞不具有體內(nèi)APC功能，則將獲得誤導(dǎo)性結(jié)果。一般用被認(rèn)為是“專(zhuān)業(yè)”APC的B細(xì)胞作為轉(zhuǎn)染受體。采用此類(lèi)轉(zhuǎn)染B細(xì)胞已是本領(lǐng)域公認(rèn)的操作。此外，已經(jīng)注意到，如本文所述，用轉(zhuǎn)染人B細(xì)胞獲得的體外數(shù)據(jù)與用HLA轉(zhuǎn)基因小鼠獲得的體內(nèi)數(shù)據(jù)之間存在著良好的相關(guān)性。測(cè)定HTL反應(yīng)優(yōu)選實(shí)施方式中，疫苗構(gòu)成物的優(yōu)化是為了誘導(dǎo)II類(lèi)限制性免疫反應(yīng)。含II類(lèi)表位的多表位構(gòu)成物的測(cè)評(píng)方法之一是使用HLA-DR轉(zhuǎn)基因小鼠。已有多個(gè)研究組產(chǎn)生了HLA-DR轉(zhuǎn)基因小鼠并對(duì)其進(jìn)行了鑒定(Taneja V.，David C.S.，免疫學(xué)評(píng)論，Vol.16967-79(1999))。
還有另一種方法，它基于某些人MHC分子與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物表達(dá)的某些MHC分子之間的交叉反應(yīng)性。Bertoni等(Bertoni等，免疫學(xué)雜志，Vol.161(8)4447-55(1998))提出，某些I類(lèi)超型HLA分子與猩猩表達(dá)的PATR分子之間具有明顯的交叉反應(yīng)性。還發(fā)現(xiàn)了人與獼猴的II類(lèi)分子和I類(lèi)分子水平的交叉反應(yīng)性(Dzuris等，免疫學(xué)雜志，1999年7月)。最后，還可以發(fā)現(xiàn)，人HLA B7超型所識(shí)別的基元與鼠I類(lèi)Ld所識(shí)別的相同(Rammensee等，免疫遺傳學(xué)，Vol.41(4)178-228(1995))。關(guān)于在小鼠內(nèi)試驗(yàn)HLA DR限制性表位，Wall等(Wall等，免疫學(xué)雜志，1524526-36(1994))曾提出，DR1基元與IAb基元之間存在著相似性。我們按照常規(guī)方法培育了我們的轉(zhuǎn)基因小鼠以利用這一有價(jià)值的相似性。此外，我們還發(fā)現(xiàn)，我們的肽大多數(shù)能夠結(jié)合IAb，因此，我們用這些小鼠來(lái)研究CTL和HTL免疫原性。臨床樣品引起的免疫反應(yīng)的測(cè)定和定量評(píng)價(jià)疫苗性能的一個(gè)關(guān)鍵因素是其誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的能力。業(yè)內(nèi)通常采用的是抗免疫原和抗共同回憶抗原的CTL和HTL反應(yīng)試驗(yàn)。所用的試驗(yàn)包括鉻釋放，淋巴因子釋放和淋巴增殖試驗(yàn)。
本領(lǐng)域已經(jīng)有了更靈敏的技術(shù)，例如ELISPOT試驗(yàn)，胞內(nèi)細(xì)胞因子染色和四聚體染色。據(jù)估計(jì)，這些新方法的靈敏度比傳統(tǒng)CTL和HTL試驗(yàn)高10-100倍(Murali-Krishna等，免疫，Vol.8(2)177-87(1998))，因?yàn)閭鹘y(tǒng)方法只測(cè)定能夠體外增殖的T細(xì)胞亞類(lèi)，因此，實(shí)際上可能只代表了部分記憶T細(xì)胞區(qū)室(Ogg G.S.，McMichael A.J.，當(dāng)代免疫學(xué)觀點(diǎn)，Vol.10(4)393-6(1998))。具體就HIV而言，這些技術(shù)已被用于檢測(cè)用過(guò)去的方法無(wú)法測(cè)得的患者體內(nèi)的抗原特異性CTL反應(yīng)(Ogg等，科學(xué)，Vol.279(5359)2103-6(1998)；Gray等，免疫學(xué)雜志，Vol.162(3)1780-8(1999)；Ogg等，病毒學(xué)雜志，Vol.73(11)9153-60(1999)；Kalams等，病毒學(xué)雜志，73(8)6721-8(1999)；Larsson等，艾滋病，Vol.13(7)767-77(1999)；Come等，獲得性免疫缺陷綜合征人逆病毒學(xué)，Vol.20(5)442-7(1999))。
傳統(tǒng)試驗(yàn)難以顯示剛分離細(xì)胞的直接活性，而且鮮有例外(Ogg G.S.，McMichael A.J.，當(dāng)代免疫學(xué)觀點(diǎn)，Vol.10(4)393-6(1998))。然而，新技術(shù)靈敏度的提高使得研究者能夠檢測(cè)感染患者或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物的剛分離細(xì)胞引起的反應(yīng)(Murali-Krishna等，免疫，Vol.8(2)177-87(1998)；Ogg G.S.，McMichael A.J.，當(dāng)代免疫學(xué)觀點(diǎn)，Vol.10(4)393-6(1998))。這些高靈敏度方法不依賴(lài)于體外再刺激，大大促進(jìn)了對(duì)自然感染和癌癥中CTL功能的研究。相反，作為評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)疫苗效力的終點(diǎn)試驗(yàn)的進(jìn)行一般與一步或多步體外再刺激相結(jié)合(Ogg G.S.，McMichael A.J.，當(dāng)代免疫學(xué)觀點(diǎn)，Vol.10(4)393-6(1998))。實(shí)際上，剛分離的I類(lèi)限制性CD8+T細(xì)胞對(duì)專(zhuān)為激發(fā)CTL反應(yīng)而設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)疫苗免疫都難以表現(xiàn)出反應(yīng)，且鮮有例外(Hanke等，疫苗，Vol.16(4)426-35(1998))(Allen等，已提交)。目前，將ELISPOT或原位IFN-γELISA等敏感試驗(yàn)與再刺激步驟聯(lián)用來(lái)獲取最高的靈敏度；為此還可以采用MHC四聚體。
Altman等在1996年最早描述了MHC四聚體。他們制造了可溶性I類(lèi)HLA-A2分子，它們被含有CTL表位的HIV特異性肽所折疊，彼此復(fù)合成四聚體，并帶有熒光標(biāo)記。用它們標(biāo)記HIV感染者的能夠識(shí)別上述表位的T細(xì)胞群(Ogg G.S.，McMichael A.J.，當(dāng)代免疫學(xué)觀點(diǎn)，Vol.10(4)393-6(1998))。然后，用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法對(duì)這些細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，得出該表位特異性T細(xì)胞的頻率。在HIV和其他感染性疾病的研究中，該方法已相當(dāng)普及(Ogg G.S.，McMichael A.J.，當(dāng)代免疫學(xué)觀點(diǎn)，Vol.10(4)393-6(1998)；Ogg等，科學(xué)，Vol.279(5359)2103-6(1998)；Gray等，免疫學(xué)雜志，Vol.162(3)1780-8(1999)；Ogg等，病毒學(xué)雜志，Vol.73(11)9153-60(1999)；Kalams等，病毒學(xué)雜志，Vol.73(8)6721-8(1999))。然而，HLA多態(tài)性會(huì)限制該方法的普遍適用，因?yàn)椋木垠w方法依賴(lài)于確定的HLA/肽組合。然而，已知許多肽，包括HIV衍生肽，是結(jié)合在不同的A2，A3和B7超型成員中而被CTL細(xì)胞線識(shí)別的(Threlkeld等，免疫學(xué)雜志，Vol.159(4)1648-57(1997)；Bertoni等，臨床研究雜志，Vol.100(3)503-13(1997))。綜合以上結(jié)論給定MHC/肽組合的T細(xì)胞受體(TCR)可能對(duì)同一超型的不同MHC分子所呈遞的同一肽具有可測(cè)水平的親和力。
當(dāng)預(yù)防性疫苗的效力主要與持久記憶性反應(yīng)的誘導(dǎo)相關(guān)時(shí)，再刺激試驗(yàn)可能是監(jiān)測(cè)疫苗所誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)的最合適、最靈敏的方法。相反，如果是治療性疫苗，則與其活性最相關(guān)的是效應(yīng)T細(xì)胞功能的誘導(dǎo)，因此，最合適的是初次免疫試驗(yàn)。因此，采用靈敏的試驗(yàn)可以得出監(jiān)測(cè)疫苗效力最合適的免疫學(xué)試驗(yàn)方案。多表位小基因在被轉(zhuǎn)染人APG中的抗原性用抗原性試驗(yàn)測(cè)評(píng)表位在人細(xì)胞內(nèi)的加工和呈遞。該試驗(yàn)采用一種游離型載體進(jìn)行，該載體可有效地將基于表位的小基因疫苗轉(zhuǎn)染給人靶細(xì)胞。
例如，用HIV-1小基因疫苗轉(zhuǎn)染221A2Kb靶細(xì)胞。221A2Kb靶細(xì)胞可表達(dá)HLA轉(zhuǎn)基因小鼠所表達(dá)的A2Kb基因，但不表達(dá)內(nèi)源性I類(lèi)分子(Shimizu Y，DeMars R，免疫學(xué)雜志，Vol.142(9)3320-8(1989))。檢測(cè)這些轉(zhuǎn)染細(xì)胞將抗原呈遞給CTL細(xì)胞線的能力，這些CTL細(xì)胞線來(lái)自HLA轉(zhuǎn)基因小鼠并具有不同的HIV衍生CTL表位的特異性。為了校正不同CTL細(xì)胞線之間的抗原靈敏度差異，用非轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為APC進(jìn)行平行的肽劑量滴定。圖8中是代表性數(shù)據(jù)。對(duì)于HIVPol 498特異性CTL，轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞誘導(dǎo)的IFN-γ釋放為378pg/ml。對(duì)肽的劑量-反應(yīng)研究發(fā)現(xiàn)，要獲得以上水平的IFN-γ釋放，需外源加入的肽為48ng/ml。該結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染細(xì)胞的Pol 498表位呈遞量較大，相當(dāng)于外源加入48ng/ml肽。

比較可知，用Gag 271特異性CTL測(cè)得的IFN-γ釋放少于25pg/ml。用非轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞進(jìn)行的對(duì)照肽滴定顯示，不能認(rèn)為該陰性結(jié)果是由于所用CTL細(xì)胞線的靈敏度低，因?yàn)榭蓽y(cè)得的“肽當(dāng)量”(PE)可低至0.2pg/ml。因此，Gag 271在HIV-1轉(zhuǎn)染的靶細(xì)胞內(nèi)似乎未得到有效的加工和呈遞。用“肽當(dāng)量”大致定量加工的效率，可以估測(cè)，轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞呈遞的Gag 271比Pol 498表位少約200倍。
表4匯總了HIV-1內(nèi)4種不同表位的多項(xiàng)獨(dú)立測(cè)定結(jié)果。HIV-1轉(zhuǎn)染細(xì)胞的各種表位呈遞量從Pol 498的30.5PE到Gag 271的0.2PE不等。Env 134和Nef 221的呈遞量為中等，各為6.1PE和2.1PE。
接著，將以上結(jié)果與以此HIV-1構(gòu)成物免疫后各表位的體內(nèi)免疫原性相關(guān)聯(lián)。和預(yù)計(jì)的一樣，Pol 498具有最強(qiáng)的免疫原性。Env 134和Nef 221的體內(nèi)免疫原性為中等，轉(zhuǎn)染人細(xì)胞的體外加工效率也為中等。最后，無(wú)法檢測(cè)到體外加工的Gag 271，其體內(nèi)免疫原性不論頻率還是強(qiáng)度也都不佳。
以上數(shù)據(jù)提示了數(shù)項(xiàng)重要信息。首先，同一給定小基因內(nèi)的不同表位的加工和呈遞效力是有差異的。其次，免疫原性與所產(chǎn)生的加工后表位的數(shù)量成正比。最后，轉(zhuǎn)基因小鼠可以用于對(duì)人用多表位疫苗的優(yōu)化。III.多表位構(gòu)成物的制備多表位構(gòu)成物所包含的表位一般具有I類(lèi)或II類(lèi)HLA結(jié)合基元，例如PCT/US00/27766和PCT/US00/19774所述。
同一多表位構(gòu)成物內(nèi)的多個(gè)II類(lèi)或I類(lèi)HLA表位可以來(lái)自同一抗原，也可來(lái)自不同抗原。例如，一個(gè)多表位構(gòu)成物所含的一個(gè)或多個(gè)HLA表位可以是來(lái)自同一病毒的兩個(gè)不同抗原，或來(lái)自不同病毒的兩個(gè)不同抗原。例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員可利用計(jì)算機(jī)挑選含有HLA等位基因特異性基元或超基元的表位引入多表位構(gòu)成物。本發(fā)明的多表位構(gòu)成物還可以編碼一個(gè)或多個(gè)廣泛交叉反應(yīng)結(jié)合性或通用II類(lèi)HLA表位，例如PADRETM(Epimmune，San Diego，CA)(相關(guān)描述可參考美國(guó)專(zhuān)利5,736,142)或PADRE家族的分子。
較好的是將通用II類(lèi)HLA表位與其他I類(lèi)HLA和II類(lèi)HLA表位組合，從而增加一個(gè)抗原激活的細(xì)胞數(shù)量，并擴(kuò)大HLA反應(yīng)性等位基因的范圍。因此，本發(fā)明的多表位構(gòu)成物可以包含對(duì)一個(gè)抗原具有特異性的HLA表位，通用II類(lèi)HLA表位，或特異性HLA表位與至少一個(gè)通用II類(lèi)HLA表位的組合。
I類(lèi)HLA表位的長(zhǎng)度一般約為8-13個(gè)氨基酸，尤其是8，9，10或11個(gè)。II類(lèi)HLA表位的長(zhǎng)度一般約為6-25個(gè)氨基酸，尤其是13-21個(gè)氨基酸。I類(lèi)或II類(lèi)HLA表位可以來(lái)自任意感興趣的抗原，可以是病毒抗原，表面受體，腫瘤抗原，致癌基因，酶，或需要對(duì)其誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的任意病原、細(xì)胞或分子。表位可根據(jù)其結(jié)合一種或多種HLA等位基因產(chǎn)物的能力來(lái)選擇。本發(fā)明的多表位構(gòu)成物還可以包含與天然序列相類(lèi)似的表位。有關(guān)此類(lèi)肽類(lèi)似物可參考PCT/US97/03778，PCT/US00/19774和3/1/99提交的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)09/260,714。
所述多表位構(gòu)成物可用本領(lǐng)域已知的方法來(lái)制備。例如，可通過(guò)合成和連接來(lái)制備包含多表位構(gòu)成物的多肽，小基因多表位構(gòu)成物一般采用重組DNA技術(shù)來(lái)制備。IV.表達(dá)載體和小基因的構(gòu)建本發(fā)明的多表位構(gòu)成物一般呈表達(dá)載體的形式，其中包含編碼該多表位構(gòu)成物的小基因。此類(lèi)表達(dá)載體的構(gòu)建可參考例如PCT/US99/10646。所述表達(dá)載體包含至少一個(gè)啟動(dòng)元件，它能夠在合適生物體的合適細(xì)胞內(nèi)表達(dá)編碼所述小基因的轉(zhuǎn)錄單元，從而實(shí)現(xiàn)抗原的表達(dá)，并導(dǎo)向相應(yīng)的HLA分子。例如，為了用于人，可將人細(xì)胞內(nèi)有效的啟動(dòng)元件加入表達(dá)載體。
本發(fā)明可借助于常規(guī)重組技術(shù)。描述本發(fā)明所用一般性方法的基礎(chǔ)教科書(shū)包括Sambrook等的分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(第2版，1989)Kreigler，基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(1990)；當(dāng)代分子生物學(xué)方法(Ausubel等，1994)；寡核苷酸合成實(shí)用方法(Gait，1984)；Kuijpers，核酸研究，18(17)5197(1994)；Dueholm，有機(jī)化學(xué)雜志，595767-5773(1994)；分子生物學(xué)方法，Vol.20(Agrawal)；和Tijssen，生物化學(xué)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)-核酸探針雜交，第1部分，第2章，“雜交原理和核酸探針試驗(yàn)策略綜述”(1993)。
按照標(biāo)準(zhǔn)方法將編碼各表位的核酸組裝成一個(gè)小基因。一般說(shuō)來(lái)，用寡核苷酸引物擴(kuò)增法分離或化學(xué)合成編碼小基因內(nèi)各表位的核酸序列。也可在合適的情況下采用重組克隆技術(shù)。挑選能夠擴(kuò)增(如果用PCR組裝小基因)或編碼(如果用合成寡核苷酸來(lái)組裝小基因)所需表位的寡核苷酸序列。
通常采用引物擴(kuò)增由DNA或RNA擴(kuò)增和分離所需表位的編碼序列(美國(guó)專(zhuān)利4,683,195和4,683,202；PCR方法方法和應(yīng)用指引(Innis等，1990))?？捎镁酆厦告湻磻?yīng)(PCR)和連接酶鏈反應(yīng)(LCR)直接從mRNA，cDNA，基因組文庫(kù)或cDNA文庫(kù)中擴(kuò)增表位的核酸序列?？蓪⑾拗菩悦盖形稽c(diǎn)加入引物。PCR擴(kuò)增所得的小基因可用瓊脂糖凝膠純化，然后克隆到合適的載體中。
也可用合成的寡核苷酸來(lái)構(gòu)建小基因。該方法用到一系列重疊寡核苷酸，各自代表著基因的有義鏈和反義鏈。然后，將這些DNA片斷退火，連接，然后克隆。無(wú)法購(gòu)得的寡核苷酸可以用自動(dòng)合成儀(Van Devanter等，核酸研究，126159-6168(1984))通過(guò)固相亞磷酰胺三酯法(Beaucage&Caruthers，TetrahedronLetts.221859-1862(1981))化學(xué)合成。寡核苷酸的純化可采用非變性丙烯酰胺凝膠電泳或陰離子交換HPLC(Pearson&Reanier，層析法雜志，255137-149(1983))。
通常，將小基因的各表位亞克隆到一個(gè)表達(dá)載體中，該載體含有引導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的強(qiáng)啟動(dòng)子以及增強(qiáng)子和聚腺苷酸化位點(diǎn)等其他調(diào)控元件。合適的啟動(dòng)子是本領(lǐng)域已知的，并可參考Sambrook等和Ausubel等的前述文獻(xiàn)。哺乳動(dòng)物細(xì)胞真核表達(dá)系統(tǒng)也是本領(lǐng)域已知的，并可購(gòu)買(mǎi)得到。所述啟動(dòng)元件包括例如巨細(xì)胞病毒(CMV)，Rous肉瘤病毒LTR和SV40。
表達(dá)載體一般包含一個(gè)轉(zhuǎn)錄單元或表達(dá)盒，其中包含了小基因在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)所需的全部附加元件。因此，典型的表達(dá)盒包含與小基因操作性連接的啟動(dòng)子，使轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物有效聚腺苷酸化所需的信號(hào)，另外還可以包括增強(qiáng)子和帶有功能性供體和受體剪切位點(diǎn)的內(nèi)含子。
除了啟動(dòng)子序列之外，表達(dá)盒還可以包含位于結(jié)構(gòu)基因下游的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)。該區(qū)可與啟動(dòng)子序列來(lái)自同一基因，也可來(lái)自不同的基因。
用什么表達(dá)載體將遺傳信息傳遞到細(xì)胞內(nèi)并不重要。各種可在真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的常用表達(dá)載體都可采用，通常采用的是含有真核病毒調(diào)控元件的表達(dá)載體，例如SV40載體，CMV載體，乳頭瘤病毒載體和EB病毒載體。
本發(fā)明的多表位構(gòu)成物可用多種載體來(lái)表達(dá)，包括質(zhì)粒載體，病毒載體和細(xì)菌載體。病毒表達(dá)載體的例子包括減毒病毒宿主(例如牛痘或禽痘)。作為該方法的一個(gè)例子，可用牛痘病毒作為載體來(lái)表達(dá)本發(fā)明編碼肽的核苷酸序列。引入患有腫瘤的宿主后，重組牛痘病毒表達(dá)所述免疫原性肽，于是引發(fā)宿主的CTL和/或HTL反應(yīng)。有關(guān)用于免疫的牛痘載體及方法可參考例如美國(guó)專(zhuān)利4,722,848。
本領(lǐng)域技術(shù)人員還可以想到可用于治療性給藥或免疫的大量其他載體，例如腺病毒和腺伴隨病毒載體，逆病毒載體，非病毒載體(例如BCG(Bacille CalmetteGuerin))，傷寒沙門(mén)氏桿菌載體，脫毒炭疽毒素載體等。
多表位構(gòu)成物的免疫原性和抗原性評(píng)價(jià)如前文所述。靶向序列本發(fā)明表達(dá)載體編碼的一個(gè)或多個(gè)MHC表位與一段MHC靶向序列操作性相連。MHC靶向序列的作用在于比之給予純抗原增強(qiáng)對(duì)該抗原的免疫反應(yīng)，這是通過(guò)將肽表位引向MHC分子組件上的位點(diǎn)，并向細(xì)胞表面轉(zhuǎn)運(yùn)，從而提高可與T細(xì)胞結(jié)合并使其激活的MHC-肽表位復(fù)合物的數(shù)量。
本發(fā)明可采用I類(lèi)MHC靶向序列，例如可將I類(lèi)MHC表位肽引向胞質(zhì)路徑或引向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的序列(Rammensee等，免疫遺傳學(xué)，41178-228(1995))。例如，胞質(zhì)路徑可加工細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的內(nèi)源性抗原。雖然不想局限于任何具體的理論，但是據(jù)信，胞質(zhì)蛋白被蛋白體的內(nèi)切蛋白酶活性至少部分降解，然后由TAP分子運(yùn)送到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(與加工相關(guān)的轉(zhuǎn)運(yùn))。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，抗原與I類(lèi)MHC分子結(jié)合。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)信號(hào)序列繞過(guò)胞質(zhì)加工路徑而將內(nèi)源性抗原直接引向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，在其中通過(guò)蛋白酶水解降解成肽片斷。以上I類(lèi)MHC靶向序列是本領(lǐng)域已知的，例如Igκ、組織血纖蛋白溶酶原激活物或胰島素的信號(hào)序列。優(yōu)選的信號(hào)肽是人Igκ鏈序列。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)信號(hào)序列還可以用于將II類(lèi)MHC表位引向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，I類(lèi)MHC分子組件所在的位點(diǎn)。
II類(lèi)MHC靶向序列也可用于本發(fā)明，例如可將肽引向胞吞(endocytic)路徑的序列。此類(lèi)靶向序列一般將胞外抗原引入胞吞路徑，從而將抗原轉(zhuǎn)移到溶酶體區(qū)室內(nèi)，在此被剪切成抗原肽，然后與II類(lèi)MHC分子結(jié)合。和常規(guī)外源性抗原加工一樣，可將II類(lèi)MHC表位引向胞吞路徑的內(nèi)體以及/或然后引向溶酶體，使得該II類(lèi)MHC表位在此與II類(lèi)MHC分子結(jié)合的序列即II類(lèi)MHC靶向序列。例如，一組可用于本發(fā)明的II類(lèi)MHC靶向序列是將肽定位于溶酶體內(nèi)的溶酶體靶向序列。由于II類(lèi)MHC分子一般結(jié)合胞吞抗原在溶酶體內(nèi)經(jīng)蛋白酶解加工后形成的抗原肽，所以，溶酶體靶向序列可用作II類(lèi)MHC靶向序列。溶酶體靶向序列是本領(lǐng)域所熟知的，包括溶酶體蛋白LAMP-1和LAMP-2中的序列(August等，美國(guó)專(zhuān)利5,633,234，1997年5月27日)。
含有溶酶體靶向序列的其他溶酶體蛋白還包括HLA-DM。這是一種內(nèi)體/溶酶體蛋白，其作用在于促進(jìn)抗原肽與II類(lèi)MHC分子的結(jié)合。因?yàn)槲挥谌苊阁w內(nèi)，所以，HLA-DM含有可作為II類(lèi)MHC分子靶向序列的溶酶體靶向序列(Copier等，免疫學(xué)雜志，1571017-1027(1996))。
滯留溶酶體蛋白HLA-DO也可作為溶酶體靶向序列。與前述滯留溶酶體蛋白LAMP-1和HLA-DM編碼將蛋白質(zhì)引向溶酶體的特異性含Tyr基元不同，HLA-DO通過(guò)與HLA-DM結(jié)合而靶向溶酶體(Liljedahl等，EMBO J.154817-4824(1996))。因此，可將與HLA-DM結(jié)合從而將轉(zhuǎn)移到溶酶體內(nèi)的HLA-DO序列用作II類(lèi)MHC靶向序列。類(lèi)似的，HAL-DO的鼠源同系物H2-DO也可以用于衍生II類(lèi)MHC靶向序列?？赏ㄟ^(guò)將II類(lèi)MHC表位與HLA-DO或H2-DO融合而將其靶向溶酶體。
另一實(shí)施例中，B細(xì)胞受體亞基Ig-α和Ig-β的胞質(zhì)區(qū)誘導(dǎo)抗原的內(nèi)化，并增強(qiáng)抗原的呈遞效率(Bonnerot等，免疫，3335-347(1995))。因此，可將Ig-α和Ig-β的胞質(zhì)區(qū)用作II類(lèi)MHC靶向序列，將II類(lèi)MHC表位靶向胞吞路徑接受加工并與II類(lèi)MHC分子結(jié)合。
將II類(lèi)MHC表位引向胞吞路徑的II類(lèi)MHC靶向序列的另一個(gè)例子是誘導(dǎo)多肽分泌從而可進(jìn)入內(nèi)體路徑的序列。此類(lèi)誘導(dǎo)多肽分泌的II類(lèi)MHC靶向序列模擬外源的胞外抗原被加工成II類(lèi)MHC分子結(jié)合性肽的常規(guī)路徑。可引導(dǎo)多肽通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)最終分泌的各種信號(hào)序列都可用作II類(lèi)MHC靶向序列，條件是分泌后的肽能夠進(jìn)入內(nèi)體/溶酶體路徑并被剪切成能與II類(lèi)MHC分子結(jié)合的肽。
另一實(shí)施例中，Ii蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中與II類(lèi)MHC分子結(jié)合，從而阻礙內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的肽與II類(lèi)MHC分子結(jié)合。所以，將II類(lèi)MHC表位與Ii蛋白融合可將其靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和II類(lèi)MHC分子。例如，可分離出Ii蛋白的CLIP序列，代之以II類(lèi)MHC表位序列，從而將II類(lèi)MHC表位導(dǎo)向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，并與II類(lèi)MHC分子在此結(jié)合。
有時(shí)，抗原本身可作為II類(lèi)或I類(lèi)MHC靶向序列，因而可與通用II類(lèi)MHC表位融合而引發(fā)免疫反應(yīng)。雖然胞質(zhì)病毒性抗原一般被加工后以與I類(lèi)MHC分子所成復(fù)合物的形式呈遞，長(zhǎng)命胞質(zhì)蛋白例如流感基質(zhì)蛋白也可進(jìn)入II類(lèi)MHC加工路徑(Gueguen&Long，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)，9314692-14697(1996))。所以，長(zhǎng)命胞質(zhì)蛋白也可作為II類(lèi)MHC靶向序列。例如，可將編碼流感基質(zhì)蛋白的表達(dá)載體與通用II類(lèi)MHC表位融合，用于將流感抗原和通用II類(lèi)MHC表位靶向II類(lèi)MHC路徑，從而引發(fā)對(duì)流感的免疫反應(yīng)。
可用作II類(lèi)MHC靶向序列的抗原的例子還包括可自發(fā)形成顆粒的多肽。這些多肽由其生成細(xì)胞分泌到胞外，自發(fā)形成顆粒，然后通過(guò)胞吞作用(例如受體介導(dǎo)的胞吞)被抗原呈遞細(xì)胞攝取或吞噬。然后，這些顆粒在進(jìn)入內(nèi)體/溶酶體路徑后被蛋白酶剪切成抗原肽。
此類(lèi)可自發(fā)形成顆粒的多肽的例子之一是HBV表面抗原(HBV-S)(Diminsky等，疫苗，15637-647(1997)；Le Borgne等，病毒學(xué)，240304-315(1998))?？勺园l(fā)形成顆粒的多肽還包括HBV核心抗原(Kuhrober等，國(guó)際免疫學(xué)，91203-1212(1997))，酵母Ty蛋白(Weber等，疫苗，13831-834(1995))。例如，可將含HBV-S抗原的表達(dá)載體與一通用II類(lèi)MHC表位融合，用于將HBV-S抗原和通用II類(lèi)MHC表位靶向II類(lèi)MHC路徑，從而引發(fā)對(duì)HBV的免疫反應(yīng)。體內(nèi)給藥本發(fā)明還提供了通過(guò)給予本發(fā)明表達(dá)載體來(lái)引發(fā)個(gè)體免疫反應(yīng)的方法。給予本發(fā)明表達(dá)載體來(lái)引發(fā)免疫反應(yīng)的優(yōu)點(diǎn)在于本發(fā)明表達(dá)載體可將MHC表位靶向MHC分子，因此可以提高被表達(dá)載體所編碼抗原激活的CTL和HTL數(shù)量。
首先，以小鼠篩選本發(fā)明的表達(dá)載體，確定其是否具有激發(fā)所需免疫反應(yīng)的最佳活性。因此，用MHC靶向序列的小鼠基因進(jìn)行初篩。測(cè)定本發(fā)明表達(dá)載體活性的方法是本領(lǐng)域所熟知的，包括例如通過(guò)3H胸苷摻入來(lái)測(cè)定T細(xì)胞的活化，通過(guò)51Cr的釋放來(lái)測(cè)定CTL的活性，見(jiàn)后文實(shí)施例II和III所述。用類(lèi)似實(shí)施例IV所述的實(shí)驗(yàn)來(lái)確定具有激發(fā)免疫反應(yīng)活性的表達(dá)載體。然后在人體對(duì)具有所述活性的表達(dá)載體進(jìn)行試驗(yàn)。為了避免小鼠編碼序列可能引起是不良免疫反應(yīng)，需對(duì)具有活性的表達(dá)載體進(jìn)行修飾，將其II類(lèi)MHC靶向序列人源化。例如，用含有各種II類(lèi)MHC靶向序列的各種人同系基因的同源區(qū)在本發(fā)明表達(dá)載體內(nèi)進(jìn)行取代。然后在人體內(nèi)對(duì)含有人II類(lèi)MHC靶向序列的表達(dá)載體(如實(shí)施例I所述)進(jìn)行試驗(yàn)。
本發(fā)明還涉及包含藥用載體和本發(fā)明表達(dá)載體的藥物組合物。所述藥用載體是本領(lǐng)域所熟知的，包括水性或非水性溶液，懸浮液和乳液，包括生理鹽水，醇/水乳液或其他溶劑或運(yùn)載體，例如乙二醇，甘油，油(例如橄欖油)或注射用有機(jī)酯。
藥用載體中可包含例如用于穩(wěn)定表達(dá)載體或提高其吸收率的藥用化合物。此類(lèi)藥用化合物包括例如糖類(lèi)，例如葡萄糖、蔗糖或右旋糖苷；抗氧化劑，例如抗壞血酸或谷胱甘肽；螯合劑；小分子多肽；抗微生物劑；惰性氣體，或其他穩(wěn)定劑或賦形劑。表達(dá)載體還可以與肽、多肽和糖等其他組分結(jié)合。表達(dá)載體還可以與可(例如用疫苗槍)給予個(gè)體的顆?；蛭⒅榻Y(jié)合。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，藥用載體以及藥用化合物的選擇取決于例如表達(dá)載體的給藥途徑等因素。
本發(fā)明還涉及通過(guò)給予包含本發(fā)明表達(dá)載體的藥物組合物來(lái)引發(fā)免疫反應(yīng)的方法。所述表達(dá)載體可通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法來(lái)給予，例如Donnelly等(免疫學(xué)年度評(píng)論，15617-648(1997))；Felgner等(美國(guó)專(zhuān)利5,580,859，1996年12月3日授權(quán))；Felgner(美國(guó)專(zhuān)利5,703,055，1997年12月3日授權(quán))和Carson等(美國(guó)專(zhuān)利5,679,647，1997年10月12日授權(quán))所述。實(shí)施方式之一中，所述小基因以裸核酸的形式給藥。
包含本發(fā)明表達(dá)載體的藥物組合物可通過(guò)各種途徑給予受主來(lái)引發(fā)免疫反應(yīng)，例如口服，陰道內(nèi)，直腸內(nèi)或非胃腸道，例如靜脈，肌內(nèi)，皮下，眶內(nèi)，囊內(nèi)，腹膜內(nèi)，腦池內(nèi)，或通過(guò)皮膚的被動(dòng)或增強(qiáng)吸收，例如皮膚藥貼或透皮離子電滲，此外，所述組合物還可以通過(guò)注射，插管或局部途徑來(lái)給藥，后者可以是被動(dòng)的，例如膏劑或粉劑的直接涂布，也可以是主動(dòng)的，例如采用鼻噴霧劑或吸入劑。表達(dá)載體還可以以局部噴霧劑的形式給藥，此時(shí)，組合物的組分之一是合適的推進(jìn)劑。如有必要，還可以將所述組合物加入脂質(zhì)體、微球體或其他聚合物基質(zhì)中(Felgner等，美國(guó)專(zhuān)利5,703,055；Gregoriadis，脂質(zhì)體技術(shù)，Vol.I-II(第2版，1993))。例如，含有磷脂或其他脂類(lèi)的脂質(zhì)體是無(wú)毒的、生理學(xué)上認(rèn)可的可代謝載體，其制造和給藥都比較簡(jiǎn)便。
可將本發(fā)明的表達(dá)載體給到動(dòng)物體的組織間隙中(Felgner等，美國(guó)專(zhuān)利5,580,859和5,703,055)。本發(fā)明載體的肌肉給藥特別有效，這包括皮內(nèi)、皮下注射和透皮給藥。透皮給藥，例如離子電滲，也是一種將本發(fā)明表達(dá)載體給予肌肉的有效方法。還可以采用表皮給藥。表皮給藥包括對(duì)表皮的最外層給予機(jī)械或化學(xué)刺激，從而引發(fā)對(duì)刺激劑的免疫反應(yīng)(Carson等，美國(guó)專(zhuān)利5,679,647)。
其他方法還包括粘膜給藥(Carson等，美國(guó)專(zhuān)利5,679,647)。就粘膜給藥而言，最有效的是氣霧劑鼻內(nèi)給藥，所述氣霧劑包含本發(fā)明的表達(dá)載體和藥用組合物。栓劑和局部制劑也可有效地將本發(fā)明表達(dá)載體給予生殖器、陰道和眼睛的粘膜組織。此外，還可以將所述表達(dá)載體與顆粒結(jié)合，然后用疫苗槍給藥。
給藥劑量取決于給藥方法，一般約為0.1-200μg，例如0.05μg/kg-50mg/kg，尤其是0.005-5mg/kg。有效量可以通過(guò)給予表達(dá)載體后測(cè)定免疫反應(yīng)來(lái)確定。例如，可用ELISA等免疫學(xué)試驗(yàn)及其他本領(lǐng)域熟知的方法來(lái)測(cè)定表達(dá)載體所編碼I類(lèi)或II類(lèi)MHC表位特異性抗體的產(chǎn)生。此外，可用已知方法來(lái)測(cè)定T輔助細(xì)胞的活化或CTL反應(yīng)，例如，通過(guò)3H胸苷摻入來(lái)測(cè)定T細(xì)胞的活化，通過(guò)51Cr的釋放來(lái)測(cè)定CTL的活性((見(jiàn)后文實(shí)施例II和III)。
可將包含本發(fā)明表達(dá)載體的藥物組合物給予哺乳動(dòng)物，尤其是人，用于預(yù)防或治療?？捎帽景l(fā)明表達(dá)載體治療或預(yù)防的疾病的例子包括HBV、HCV、HIV和CMV感染，以及前列腺癌，腎癌，宮頸癌，淋巴瘤，尖銳濕疣和獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)。
在治療性應(yīng)用中，可將本發(fā)明表達(dá)載體給予已經(jīng)患上癌癥、自身免疫疾病或病毒感染的患者。處于疾病潛伏期或急性期的患者可單獨(dú)用本發(fā)明表達(dá)載體(包括表達(dá)所有通用II類(lèi)MHC表位的載體)來(lái)治療，也可以聯(lián)合其他治療方法。
在治療和預(yù)防性應(yīng)用中，將含有有效量本發(fā)明表達(dá)載體的藥物組合物給予患者，所述有效量可引發(fā)對(duì)抗原的有效免疫反應(yīng)，并可減退疾病體征或癥狀。阻抑改善疾病體征或癥狀的表達(dá)載體的給予量稱(chēng)為治療有效量。足以達(dá)到治療有效量的表達(dá)載體量取決于其所在的藥物組合物，給藥方式，所治疾病的狀況和嚴(yán)重程度，患者的體重和總體健康狀況，以及醫(yī)生的判斷。
實(shí)施例以下實(shí)施例用于說(shuō)明而非限定本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)承認(rèn)，本文中的實(shí)施例和實(shí)施方式只是用于說(shuō)明，它們會(huì)為本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員提示各種改換形式，因此，這些都應(yīng)包含在權(quán)利要求所代表的本發(fā)明構(gòu)思和范圍內(nèi)。
實(shí)施例1-9例舉了評(píng)價(jià)本發(fā)明多表位構(gòu)成物免疫原性和抗原性的試驗(yàn)。實(shí)施例1抗原性試驗(yàn)用DNA、肽/IFA或脂肽刺激轉(zhuǎn)基因小鼠脾細(xì)胞，使之成為高親和性肽特異性CTL細(xì)胞線。簡(jiǎn)而言之，用0.1μg/ml肽和LPS母細(xì)胞(blast)刺激轉(zhuǎn)基因小鼠的脾細(xì)胞。初次刺激10天后，用以0.1μg/ml肽脈沖了1小時(shí)的LPS母細(xì)胞接受再刺激，此后隔周進(jìn)行。再刺激后5天，對(duì)CTL細(xì)胞線進(jìn)行前述原位IFN-γELISA分析?；蛘?，也可以采用靶病原感染患者或靶疾病(例如癌癥)患者的CTL細(xì)胞線。從轉(zhuǎn)基因小鼠和患者都無(wú)法獲得的特異性CTL細(xì)胞線可以利用本領(lǐng)域已知技術(shù)由普通供體的PBMC制得。
此類(lèi)試驗(yàn)所用的靶細(xì)胞是針對(duì)轉(zhuǎn)基因小鼠CTL細(xì)胞線的A2.1/Kb、A11/Kb、A1/Kb或B7/Kb轉(zhuǎn)染的Jurkat或.221細(xì)胞。以上細(xì)胞線都是已有的(Epimmune Inc.，San Diego，CA)。如果是人CTL細(xì)胞線，可采用以合適的人HLA等位基因轉(zhuǎn)染的.221細(xì)胞。我們目前已經(jīng)得到了A2和A1轉(zhuǎn)染的.221細(xì)胞，正在制造A11、A24和B7轉(zhuǎn)染細(xì)胞。如果在靶細(xì)胞方面出現(xiàn)了沒(méi)有預(yù)計(jì)到的問(wèn)題，也可采用LPS母細(xì)胞和EBV轉(zhuǎn)化的細(xì)胞線分別作為鼠源和人源CTL細(xì)胞線的靶細(xì)胞。
為了檢測(cè)抗原性，連續(xù)稀釋的CTL與105靶細(xì)胞和1-10-6μg/ml不同濃度的肽共培養(yǎng)。此外，CTL還與以含有待測(cè)小基因的游離型載體轉(zhuǎn)染的靶細(xì)胞共培養(yǎng)。游離型載體是本領(lǐng)域的已知技術(shù)。
如下測(cè)定小基因轉(zhuǎn)染APC內(nèi)天然加工產(chǎn)生的肽的相對(duì)量。記錄CTL細(xì)胞線識(shí)別轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞后的IFN-γ產(chǎn)量。用插入法由標(biāo)準(zhǔn)曲線得出獲得相同IFN-γ產(chǎn)量所需的合成肽的量，所述標(biāo)準(zhǔn)曲線通過(guò)同樣的CTL細(xì)胞線與已知濃度的肽進(jìn)行平行培養(yǎng)而獲得。實(shí)施例2小鼠免疫和細(xì)胞培養(yǎng)本試驗(yàn)所用HLA-A2.1/Kb(Vitiello等，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，Vol.173(4)1007-15(1991))和A11/Kb(Alexander等，免疫學(xué)雜志，Vol.159(10)4753-61(1997))轉(zhuǎn)基因小鼠的來(lái)歷已經(jīng)描述過(guò)了。HLA B7/Kb和A1/Kb轉(zhuǎn)基因小鼠可購(gòu)得(EpimmuneInc.，San Diego，CA)。HLA DR2、DR3和DR4轉(zhuǎn)基因小鼠由C.David提供(MayoClinic)。非轉(zhuǎn)基因H-2b小鼠購(gòu)自Charles River實(shí)驗(yàn)室，也可向其他供應(yīng)商購(gòu)買(mǎi)。免疫按照已知方法進(jìn)行(Ishioka等，免疫學(xué)雜志，Vol.162(7)3915-25(1999))。所有細(xì)胞的培養(yǎng)都采用含RPMI1640培養(yǎng)基和HEPES(Gibco Life Technonogies)，并補(bǔ)充有10％FBS，4mM L-谷氨酰胺，50μM 2-ME，0.5mM丙酮酸鈉，100μg/ml鏈霉素和100U/ml青霉素的培養(yǎng)基。
HLA轉(zhuǎn)基因小鼠和抗原性試驗(yàn)的目的是檢測(cè)和優(yōu)化CTL反應(yīng)。也可以利用HLA-DR與IAb之間的天然交叉反應(yīng)性來(lái)檢測(cè)HTL反應(yīng)。該測(cè)評(píng)提供了多表位構(gòu)成物抗原性和免疫原性的衡量標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)施例3增殖試驗(yàn)通常進(jìn)行增殖試驗(yàn)等來(lái)測(cè)定HTL表位誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的能力。例如，用DynaBeads小鼠CD4(L3T4)(Dynal)，從脾細(xì)胞的單細(xì)胞懸液中通過(guò)免疫磁性分離法分離出小鼠CD4T淋巴細(xì)胞。簡(jiǎn)而言之，于4℃用5.6×107個(gè)磁珠培養(yǎng)2×107個(gè)脾細(xì)胞40分鐘，然后洗滌3次。用Detachabead Mouse CD4(Dynal)從磁珠上解吸。在平底96孔微滴板上，用5×105個(gè)經(jīng)輻照(3500rad)同系脾細(xì)胞與分離所得CD4 T淋巴細(xì)胞(2×105個(gè)/孔)共培養(yǎng)，一式三份。將純化肽加入各孔，最終濃度為20，1，0.05和0μg/ml，再培養(yǎng)4天。收獲前約14小時(shí)，在各孔內(nèi)加入1μCi的3H-胸苷(ICN)。用Filtermate收獲儀(Packard)將各孔內(nèi)容收獲到Unifilter GF/B板上(Packard)。用TopCountTM微滴板閃爍計(jì)數(shù)儀(Packard)通過(guò)液體閃爍計(jì)數(shù)法測(cè)定3H-胸苷摻入。實(shí)施例451鉻釋放試驗(yàn)測(cè)定CTL活性的該試驗(yàn)是本領(lǐng)域所熟知的。該試驗(yàn)通過(guò)測(cè)定51鉻標(biāo)記靶細(xì)胞群的51鉻釋放百分比定量測(cè)定T細(xì)胞群的溶胞活性(Brunner等，免疫學(xué)，Vol.14(2)181-96(1968))。該試驗(yàn)的結(jié)果通常表示為CTL頻率/106細(xì)胞(有限稀釋分析法，LDA；(當(dāng)代免疫學(xué)方法，Vol.1，John Wiley&Sons，Inc.，USA，1991，第3章；臨床實(shí)驗(yàn)室免疫學(xué)方法，第5版，ASM Press，1997，R部分)，或由一種較簡(jiǎn)便的CTL總活性定量方法來(lái)表示(溶胞單位；LU試驗(yàn))。在LU試驗(yàn)中，在51鉻釋放試驗(yàn)中獲得E∶T之比與細(xì)胞毒性百分比數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，轉(zhuǎn)化為每106效應(yīng)細(xì)胞的溶胞單位(LU)，1LU表示裂解30％靶細(xì)胞所需的溶胞活性(WunderlickJ.，Shearer G.，和Livingston，A.，J.Coligan，A.Kruisbeek，D.Margulies，E.Shevach和W.Strober編輯的當(dāng)代免疫學(xué)方法，Vol.1，“T細(xì)胞功能試驗(yàn)細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞活性的誘導(dǎo)和測(cè)定”，John Wiley&Sons，Inc.，USA，p.3.11.18)。計(jì)算出LU可以對(duì)反應(yīng)進(jìn)行定量，這便于不同實(shí)驗(yàn)結(jié)果之間的比較。實(shí)施例5原位IFN-γELISA適用于剛分離和肽再刺激脾細(xì)胞的原位IFN-γELISA試驗(yàn)都已確立并得到優(yōu)化(例如McKinney，D.M.，Skvoretz，R.，Mingsheng，Q.，Ishioka，G.，Sette，A.，能夠檢測(cè)剛分離的脾細(xì)胞由DNA小基因免疫誘導(dǎo)的特異性肽反應(yīng)的原位IFN-γELISA試驗(yàn)，出版中)。該試驗(yàn)的基礎(chǔ)是ELISPOT，但采用了可溶性色原，使之非常適合高通量的分析。在初次免疫和再刺激試驗(yàn)中，該方法比傳統(tǒng)的上清液ELISA或51Cr釋放試驗(yàn)都更靈敏，因?yàn)樵籈LISA試驗(yàn)中觀察到的反應(yīng)在其他試驗(yàn)中都無(wú)法測(cè)得。以每細(xì)胞計(jì)，原位ELISA試驗(yàn)的靈敏度約為每104個(gè)平板培養(yǎng)細(xì)胞中可測(cè)出一個(gè)IFN-γ分泌細(xì)胞。
96孔ELISA板上涂以抗IFN-γ(大鼠抗小鼠IFN-αmAb，克隆R4-6A2，Pharmingen)抗體，4℃過(guò)夜，然后在室溫下用10％FBS的PBS溶液封閉2小時(shí)。連續(xù)稀釋的未免疫脾細(xì)胞或CTL與肽和105個(gè)/孔的Jurkat A2.1/Kb細(xì)胞于37℃，5％CO2共培養(yǎng)20小時(shí)。第二天，洗出細(xì)胞，用夾心ELISA法檢測(cè)分泌到孔內(nèi)的IFN-γ量，即用生物素化α-IFN-γ(大鼠抗小鼠IFN-γmAb，克隆XMG1.2，Pharmingen)檢測(cè)分泌的IFN-γ。按照廠商說(shuō)明用HRP-偶聯(lián)的鏈霉親和素(Zymed)和TMB(ImmunoPureTMB底物試劑盒，Pierce)顯色。在Labsystems Multiskan RCELISA板讀數(shù)儀上讀取450nm吸光度。測(cè)得對(duì)特定肽發(fā)生反應(yīng)而分泌100pg IFN-γ的細(xì)胞數(shù)量，并根據(jù)無(wú)肽背景IFN量進(jìn)行校正后，用分泌單位(SU)評(píng)價(jià)IFN-γELISA數(shù)據(jù)。實(shí)施例6ELISPOT試驗(yàn)ELISPOT試驗(yàn)可定量測(cè)定肽特異性T細(xì)胞的產(chǎn)生頻率，這是通過(guò)測(cè)定單個(gè)細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)而產(chǎn)生并釋放淋巴因子(通常為IFN-γ)的能力?；贓LISPOT試驗(yàn)靈敏度的提高，可以檢測(cè)受感染的患者或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物的剛分離細(xì)胞的反應(yīng)(Murali-Krishna，免疫，Vol.8(2)177-87(1998)；Ogg等，科學(xué)，Vol.279(5359)2103-6(1998))。ELISPOT與前述IFN-γELISA的區(qū)別僅在于最后一步，ELISPOT采用ExtrAvidin-AP(Sigma，1∶500稀釋度)代替了HRP-鏈霉親和素。按照廠商說(shuō)明書(shū)，用5-BCIP(BioRad)作為底物進(jìn)行顯色。用相差顯微鏡計(jì)點(diǎn)斑點(diǎn)數(shù)?；蛘?，如果采用的底物是BCIP/NBT，則用Zeiss KS ELISPOT讀數(shù)儀計(jì)點(diǎn)斑點(diǎn)數(shù)。
ELISPOT試驗(yàn)一般用于免疫反應(yīng)的定量檢測(cè)。斑點(diǎn)數(shù)也可以人工計(jì)點(diǎn)，但優(yōu)選采用Zeiss的KS ELISPOT讀數(shù)儀這種配有識(shí)別和計(jì)點(diǎn)斑點(diǎn)數(shù)的專(zhuān)用軟件的基于顯微鏡的系統(tǒng)。實(shí)施例7四聚體染色四聚體染色是一種流式細(xì)胞計(jì)數(shù)技術(shù)，它根據(jù)肽表位、I類(lèi)抗原和所述表位特異性T細(xì)胞受體之間的反應(yīng)來(lái)檢測(cè)表位特異性人CD8+T淋巴細(xì)胞。該試驗(yàn)?zāi)軌蜓杆俚囟繙y(cè)出剛分離的血樣中的表位特異性人CD8+T淋巴細(xì)胞。各種HIV肽/HLA組合物的MHC四聚體可向保藏機(jī)構(gòu)NIH獲取(四聚體中心研究所http//www.miaid，nih.gov/reposit/tetramer/index.html)。為了標(biāo)記表位特異性細(xì)胞，在100μl體積中，1×106個(gè)PBMC與5μg/ml相應(yīng)的四聚體和識(shí)別人CD3和CD8的單克隆抗體(由不同商家獲得時(shí)呈不同的熒光染料-結(jié)合形式，所述商家包括PharMingen，San Diego，CA或BioSource，Camarillo，CA)一起避光培養(yǎng)40分鐘。清洗細(xì)胞，用低聚甲醛固定，然后用FACsan或FACSCalibur流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(Becton Dickinson Immunocytometry Systems，San Jose，CA)進(jìn)行分析。用CellQuest軟件分析樣品數(shù)據(jù)。實(shí)施例8對(duì)臨床樣品進(jìn)行的測(cè)定本試驗(yàn)可用于對(duì)患者或志愿者的冷凍PBMC樣品評(píng)價(jià)特異性CD8+CTL活性。ELISPOT，鉻釋放，原位IFN-γ釋放，增殖和四聚體試驗(yàn)都可用于評(píng)價(jià)各種(鼠源和/或靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭械姆磻?yīng)。
前文已描述了鼠源背景以上試驗(yàn)的方法，但是本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員可以看出，這些方法也同樣適用于人試驗(yàn)系統(tǒng)(Livingston等，免疫學(xué)雜志，Vol.159(3)1383-92(1997)；Heathcote等，肝臟學(xué)，Vol.30(2)531-6(1999)；Livingston等，免疫學(xué)雜志，Vol.162(5)3088-95(1999))并可進(jìn)一步改進(jìn)。實(shí)施例14詳細(xì)說(shuō)明了完成以上試驗(yàn)所需冷凍PBMC樣品量的計(jì)算。實(shí)施例9轉(zhuǎn)基因動(dòng)物轉(zhuǎn)基因小鼠(HLA-A2.1/KbH2b；HLA-A11/Kb；HLA-A1/Kb；HLA-B7/Kb)接受100μg的DNA或肽(稀釋成10-100μl)的脛骨前肌肌內(nèi)注射或尾根皮下注射免疫。用鹽水配制DNA，用不完全弗氏佐劑配制肽。11-21天后，用CO2窒息法處死動(dòng)物，取出脾臟，從中獲取用于體外檢測(cè)CTL功能的細(xì)胞。通常，每試驗(yàn)組3-6個(gè)小鼠。此外，由非免疫小鼠的脾臟獲取APC，用于再刺激CTL培養(yǎng)物。采用的小鼠為8-12周齡的雌性和雄性小鼠。實(shí)施例10對(duì)多種CTL和HTL表位反應(yīng)的同時(shí)誘導(dǎo)CTL表位鏈的構(gòu)建和試驗(yàn)本實(shí)施例是多CTL和HTL表位的試驗(yàn)。例如，合成一段由10-12個(gè)不同CTL表位串聯(lián)而成并位于同一啟動(dòng)子調(diào)控之下的表位鏈，并將其引入標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒pcDNA3.1(Invitrogen，San Diego)或NGVL(國(guó)家基因載體實(shí)驗(yàn)室，University ofMichigan)提供的質(zhì)粒中。這些構(gòu)成物包含一段標(biāo)準(zhǔn)信號(hào)序列和一個(gè)通用HTL表位PADRETM。每一組表位的選擇都對(duì)人群覆蓋率進(jìn)行了平衡。為了便于試驗(yàn)和優(yōu)化，本實(shí)施例包含的是一組已被證明在轉(zhuǎn)基因小鼠中具有免疫原性并/或在人體內(nèi)具有抗原性的經(jīng)平衡的代表性表位。
如前所述，用計(jì)算機(jī)程序EPISORTTM選擇這些CTL表位順序，盡可能減少I(mǎi)類(lèi)連接基元。如果盡可能對(duì)順序進(jìn)行優(yōu)化后本發(fā)明構(gòu)成物中仍然存在潛在的連接表位，則可合成相應(yīng)的肽以便在HLA轉(zhuǎn)基因小鼠中對(duì)此類(lèi)表位的CTL反應(yīng)進(jìn)行監(jiān)測(cè)。一般，以上連接表位最少化處理有效且已足夠。然而，如果測(cè)得任何連接表位的反應(yīng)，可用1-2個(gè)殘基的短間隔序列(例如K，AK，KA，KK或A)將其打斷，這些間隔序列不能干擾前述期望的蛋白酶切偏性。
由于優(yōu)化構(gòu)成物的最終用途是人用疫苗，因此本發(fā)明采用了優(yōu)化的人密碼子。然而，為了便于HLA轉(zhuǎn)基因小鼠中的優(yōu)化過(guò)程，本發(fā)明盡可能選擇同時(shí)最適于小鼠的人密碼子。人和小鼠的密碼子使用情況非常相似(密碼子使用數(shù)據(jù)庫(kù)http//www.kazusa.or.jp/codon)。
抗原性試驗(yàn)可采用以各種小基因疫苗構(gòu)成物轉(zhuǎn)染的人細(xì)胞，同時(shí)平行進(jìn)行HLA轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)試驗(yàn)。這兩項(xiàng)不同的試驗(yàn)可解決可能因密碼子使用不同造成的小基因疫苗效率差異。
通常，對(duì)質(zhì)粒構(gòu)成物抗原性和免疫原性的試驗(yàn)是平行進(jìn)行的。轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)試驗(yàn)用A2，A11，B7和A1 HLA轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行。根據(jù)我們實(shí)驗(yàn)室的一套成熟方案，用心臟毒素預(yù)處理小鼠，然后肌內(nèi)(i.m.)注射100μg質(zhì)粒，11天后測(cè)評(píng)反應(yīng)(Ishioka等，免疫學(xué)雜志，Vol.162(7)3915-25(1999))。所述試驗(yàn)包括剛分離細(xì)胞的ELISPOT試驗(yàn)，再刺激細(xì)胞的IFN-γ釋放試驗(yàn)和細(xì)胞毒性鉻釋放試驗(yàn)。所有上述技術(shù)在本領(lǐng)域中都已相當(dāng)成熟。初期試驗(yàn)側(cè)重于已知在HLA轉(zhuǎn)基因動(dòng)物內(nèi)具有免疫原性的8HLA A2，9HLA A11和6HLA B7限制性表位。同時(shí)檢測(cè)對(duì)這些表位的反應(yīng)不成問(wèn)題，因?yàn)橐呀?jīng)由商家建立了針對(duì)這些HLA型的轉(zhuǎn)基因小鼠的大群落。在多輸出(multiple readout)試驗(yàn)中，每組4-6個(gè)小鼠足以檢測(cè)對(duì)6-10個(gè)不同表位的反應(yīng)。一般采用的是HLA A1轉(zhuǎn)基因小鼠內(nèi)HLA A1限制性HIV衍生表位試驗(yàn)。然而，如有問(wèn)題，也可換用人APC抗原性試驗(yàn)，或用該試驗(yàn)對(duì)轉(zhuǎn)基因小鼠試驗(yàn)進(jìn)行補(bǔ)充。
為了建立轉(zhuǎn)基因動(dòng)物內(nèi)免疫原性與抗原性之間的關(guān)聯(lián)，用抗原性試驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)對(duì)Pol 498，Env 134，Nef 221，Gag 271等表位的反應(yīng)，可以購(gòu)得這些表位的高親和性CTL細(xì)胞線。為了獲得其他適合的CTL細(xì)胞線，我們實(shí)驗(yàn)室一般采用以佐劑乳化或脂肽形式的肽直接免疫HLA轉(zhuǎn)基因小鼠，以得到用于抗原性試驗(yàn)的細(xì)胞線。
如果不能進(jìn)行體內(nèi)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，還可用抗原性實(shí)驗(yàn)作為對(duì)表位的主要試驗(yàn)。此類(lèi)表位包括A24，可能還包括A1限制性表位，以及許多在HLA轉(zhuǎn)基因小鼠內(nèi)沒(méi)有免疫原性的表位。此類(lèi)情況下，我們總是采用接觸過(guò)HIV者的人CTL細(xì)胞線。或者，我們用GMCSF/IL4-誘導(dǎo)的樹(shù)狀細(xì)胞和外周血淋巴細(xì)胞形成了用于體外CTL誘導(dǎo)的CTL細(xì)胞線(Celis等，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)，Vol.91(6)2105-9(1994))。
制備編碼小基因的游離型載體，轉(zhuǎn)染到合適的人細(xì)胞內(nèi)形成靶細(xì)胞。例如，可以采用人T細(xì)胞線Jurkat，也可采用淋巴母細(xì)胞細(xì)胞線。在采用人源CTL細(xì)胞線的實(shí)驗(yàn)中，一般用熟知的HLA匹配型純合EBV細(xì)胞線作為純MHC的來(lái)源和靶細(xì)胞，并用作小基因轉(zhuǎn)染的受體。在采用HLA轉(zhuǎn)基因小鼠的CTL細(xì)胞線的實(shí)驗(yàn)中，一般采用匹配的HLA/Kb嵌合構(gòu)成物轉(zhuǎn)染的I類(lèi)分子陰性、EBV轉(zhuǎn)化的突變細(xì)胞線.221(Shimizu Y.DeMars R，免疫學(xué)雜志，Vol.142(9)3320-8(1989))作為小基因轉(zhuǎn)染的受體。此類(lèi)細(xì)胞可有效地向CTL細(xì)胞線呈遞抗原(Celis等，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)，Vol.96(6)2105-9(1994))。HTL表位鏈的構(gòu)成和實(shí)驗(yàn)合成由3-5個(gè)不同HTL表位構(gòu)成并位于同一啟動(dòng)子調(diào)控之下的表位鏈，將其引入標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒pcDNA3.1(Invitrogen，San Diego)。全部構(gòu)成物都含有一段Ig-α靶向序列。為了便于實(shí)驗(yàn)和優(yōu)化，所選的每一組表位都綜合代表了已知在IAb小鼠內(nèi)具有免疫原性的表位。用EPISORT程序選擇表位的順序，盡可能避免連接表位。此外，合成所有與連接對(duì)應(yīng)的肽，檢測(cè)其是否與IAb結(jié)合，最重要的是是否與14種不同的DR分子結(jié)合，后者代表了世界上最常見(jiàn)的DR等位基因產(chǎn)物(Southwood等，免疫學(xué)雜志，Vol.160(7)3363-73(1998))。因此，以上質(zhì)粒中沒(méi)有非感興趣抗原的HTL表位。然而，假設(shè)測(cè)得與DR分子結(jié)合良好的連接區(qū)(因此具有體內(nèi)DR限制性免疫原性)，可引入GPGPG間隔序列將其消除。在全部構(gòu)成物中，還必須如前所述地盡可能減少I(mǎi)類(lèi)連接基元。
用HLA DR轉(zhuǎn)基因小鼠和/或H2b單元型小鼠檢測(cè)實(shí)驗(yàn)疫苗質(zhì)粒的免疫原性，并檢測(cè)其增殖和/或細(xì)胞因子(IL5，IFN-γ)的產(chǎn)生。在一典型方案中，以心臟毒素處理小鼠，然后i.m.注射100微克質(zhì)粒，11天后進(jìn)行反應(yīng)評(píng)價(jià)(Ishioka等，免疫學(xué)雜志，Vol.162(7)3915-25(1999))。CTL表位與HTL表位之間相互作用的試驗(yàn)由前所述得到一些表型的小型功能性序列段，可用于研究對(duì)所有可分析表位的同時(shí)反應(yīng)/抗原性。在以下實(shí)施例中，可對(duì)這些序列段加以?xún)?yōu)化。仍用這些小基因評(píng)價(jià)免疫顯性。具體地說(shuō)，混合全部CTL質(zhì)?；騂TL質(zhì)粒。然后，將用此小基因混合物所得的結(jié)果與各小基因分別注射所得的結(jié)果進(jìn)行比較。
還用這些小基因質(zhì)粒來(lái)測(cè)定HTL表位對(duì)CTL表位反應(yīng)的影響。具體地說(shuō)，將含有HTL的質(zhì)粒與含有CTL的質(zhì)?；旌虾蠼o小鼠注射，如前所述檢測(cè)對(duì)選定表位的CTL反應(yīng)和HTL反應(yīng)。通常是檢測(cè)，例如，存在著靶抗原的HTL表位是否增強(qiáng)了CTL反應(yīng)，使之高于用CTL小基因內(nèi)含有泛DR結(jié)合表位(例如PADRETM或PADRE家族分子)的質(zhì)粒所得的結(jié)果。通常，還測(cè)定PADRE是抑制還是增強(qiáng)對(duì)靶抗原衍生的HTL表位的反應(yīng)，或者，靶抗原衍生的HTL是抑制還是增強(qiáng)對(duì)PADRE的反應(yīng)。
用以上方法測(cè)得了對(duì)大量表位的反應(yīng)。構(gòu)成物的混合物可能抑制某些較弱表位的反應(yīng)。此時(shí)，可在優(yōu)化后重復(fù)混合實(shí)驗(yàn)。實(shí)施例11CTL和HTL小基因構(gòu)成物的優(yōu)化該實(shí)施例描述的是實(shí)施例10所述CTL和HTL構(gòu)成物的優(yōu)化，還評(píng)價(jià)了在小基因構(gòu)成物優(yōu)化過(guò)程中，側(cè)翼殘基對(duì)抗原性和免疫原性可能存在的影響。所述研究包括加入側(cè)翼殘基即用于促進(jìn)有效加工的“間隔序列”。
以上分析可如下進(jìn)行。首先，分析實(shí)施例10所述CTL多表位構(gòu)成物的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，找出其活性與表位N末端和C末端3個(gè)相鄰殘基位置上特定殘基之間的關(guān)聯(lián)。以觀察到非最佳CTL引發(fā)反應(yīng)(就反應(yīng)強(qiáng)度而言非最佳)的表位作為側(cè)翼區(qū)優(yōu)化的對(duì)象。由此可產(chǎn)生各種編碼10-12個(gè)不同CTL表位的CTL小基因疫苗的優(yōu)化構(gòu)型的“第二代”小基因疫苗。
第一項(xiàng)優(yōu)化是在所有表現(xiàn)不佳表位的C+1位置引入丙氨酸(A)或賴(lài)氨酸(K)。第二項(xiàng)優(yōu)化是在C+1位置引入原存在于靶抗原(例如HIV)中與抗原性相關(guān)的殘基。
對(duì)于選定的表位還引入了其他修飾。具體地說(shuō)，還研究了在表位的C末端和N末端引入其他殘基間隔序列的影響。根據(jù)實(shí)施例10所述小基因疫苗的分析結(jié)果，所研究的殘基可進(jìn)一步包含G，Q，W，S和T。如果這些修飾造成了連接表位，則可以通過(guò)如本文所述地刻意改變表位的排列來(lái)加以消除。對(duì)全部第二代構(gòu)成物進(jìn)行抗原性和免疫原性實(shí)驗(yàn)。
以上修飾的結(jié)果是，活性會(huì)因不同的修飾而不同。有些修飾被發(fā)現(xiàn)具有普遍的有利影響。為了驗(yàn)證這一點(diǎn)，構(gòu)建全部表位(宜是具有相當(dāng)抗原性和免疫原性的表位)都接受此類(lèi)修飾的小基因疫苗，并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。有時(shí)，某些表位的活性提高了，其他的則沒(méi)有，換言之，有些修飾能夠增強(qiáng)某些表位的活性，但不能增強(qiáng)其他表位的活性。此時(shí)，再設(shè)計(jì)保留良性修飾而取消不良或無(wú)效修飾的小基因疫苗，并進(jìn)行試驗(yàn)。
這些小基因疫苗被設(shè)計(jì)成a)預(yù)計(jì)連接表位最少；而且，b)前小基因疫苗內(nèi)無(wú)功能的表位現(xiàn)在處于新的更有效的背景中。
對(duì)HTL小基因疫苗來(lái)說(shuō)，用“第一代”小基因疫苗的數(shù)據(jù)找尋有關(guān)連接表位、表位在小基因內(nèi)的位置，與間隔序列(例如GPGPG間隔序列)之間的距離等方面的傾向性。如果發(fā)現(xiàn)了特殊的傾向性，則基于這些傾向性設(shè)計(jì)第二代小基因疫苗?；蛘撸绻』虻幕钚圆患?，則再評(píng)價(jià)其他靶向策略的潛在效果，例如那些基于Ii和LAMP的策略，并將它們與無(wú)靶向策略和單純的前導(dǎo)序列靶向策略進(jìn)行比較。
如果發(fā)現(xiàn)CTL或HTL小基因疫苗之間活性差異很大，這樣的結(jié)果符合諸如構(gòu)象或“遠(yuǎn)程”效應(yīng)等對(duì)小基因活性的影響?？捎卯?dāng)前分子和細(xì)胞生物學(xué)方法對(duì)這些因素進(jìn)行分析。例如，可用不同的小基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞線，然后用Northern試驗(yàn)或引物延伸試驗(yàn)研究mRNA的表達(dá)水平和穩(wěn)定性(當(dāng)代分子生物學(xué)雜志方法，Vol.3，John Wiley&Sons，Inc.，USA，1999))。
在所有小基因疫苗中都可以包含一段抗體標(biāo)簽，例如MYC/his，用于檢測(cè)蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。MYC/his標(biāo)簽(Manstein等，基于，Vol.162(1)129-134(1995))加入后，還可以用脈沖追蹤試驗(yàn)來(lái)檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性。然后，可將這些試驗(yàn)的結(jié)果與抗原性和免疫原性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行比較，找尋是否存在某些傾向性，普遍規(guī)律，以及不同因素之間的關(guān)聯(lián)性。實(shí)施例12確定能夠有效傳遞選定表位的最簡(jiǎn)質(zhì)粒構(gòu)型實(shí)施例11和12所述的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)是為了提出與小基因疫苗設(shè)計(jì)相關(guān)的各種因素。理想的是全過(guò)程只使用一種人用載體，但是，也可以在疫苗表位優(yōu)化研究中先使用一種DNA疫苗質(zhì)粒，然后再轉(zhuǎn)化成人用載體。載體的選擇實(shí)際上取決于多種因素，例如載體的可得性，是否適合人用，來(lái)源是否可靠，例如可以是來(lái)自國(guó)家基因載體實(shí)驗(yàn)室(University of Michigan)。
本實(shí)施例中，仍將優(yōu)化后的小基因連接成更大的表位序列段。CTL小基因都宜包含PADRE和前導(dǎo)靶向序列，HTL表位小基因則都宜包含Ig-α序列。具體地說(shuō)，兩對(duì)10-12個(gè)CTL表位的小基因連接成兩個(gè)20-24CTL表位的小基因。如果表位的連接造成其活性低于原小型小基因，則改變連接的組合和順序，進(jìn)行研究。然后將活性最佳的20-24表位小基因?qū)B接成包含全部CTL表位的小基因，接受活性評(píng)價(jià)。再次對(duì)至多兩種可選取向進(jìn)行研究。由于該構(gòu)成物較大，所以需確認(rèn)靶向序列的特異性作用，因?yàn)榍皩?dǎo)序列靶向可能對(duì)小型小基因比較有效，而對(duì)大型構(gòu)成物靶向最有效的可能是遍在蛋白信號(hào)。具體地說(shuō)，制造一個(gè)不含任何特異性靶向序列的構(gòu)成物，將其與通過(guò)加入遍在蛋白分子而靶向降解的構(gòu)成物進(jìn)行比較。
將此方法用于HTL。將兩對(duì)3-5個(gè)HTL表位的小基因連接成兩個(gè)7-9 HTL表位的小基因。同樣，如果表位的連接造成活性不佳(降低)，則改變組合和連接順序，進(jìn)行研究。將活性最佳的7-9HTL表位小基因?qū)B接，所得小基因包含全部HTL表位，測(cè)定其活性。同樣，對(duì)至多2種取向進(jìn)行研究。
根據(jù)以上結(jié)果，可以選出一個(gè)能夠有效傳遞一組表位(例如HIV表位)的優(yōu)化質(zhì)粒構(gòu)型以待臨床試驗(yàn)評(píng)價(jià)。當(dāng)然，任何靶抗原(感染性或疾病相關(guān)性)的表位都既可單獨(dú)使用也可聯(lián)合使用。這一構(gòu)型需要一個(gè)或多個(gè)HTL表位小基因和一個(gè)或多個(gè)CTL表位小基因。能夠傳遞全部表位的一個(gè)長(zhǎng)CTL小基因與一個(gè)長(zhǎng)HTL小基因的組合是最理想的，因?yàn)樗?jiǎn)化了疫苗的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)。如果兩種小基因的共同注射造成了彼此間不良的相互作用，則將不同的質(zhì)粒在不同的部位或在不同的時(shí)間進(jìn)行注射，然后進(jìn)行檢查?；蛘撸绻麤](méi)有找到編碼所有所需表位的單個(gè)CTL小基因和HTL小基因，則可以考慮用小基因的混合物來(lái)進(jìn)行下一步的研究。實(shí)施例13多表位疫苗誘導(dǎo)的CD8+淋巴細(xì)胞反應(yīng)的評(píng)價(jià)和鑒定主要利用ELISPOT技術(shù)來(lái)測(cè)定CD8+淋巴細(xì)胞反應(yīng)。該技術(shù)是本領(lǐng)域的已知技術(shù)，經(jīng)常為本實(shí)驗(yàn)室所采用。而且，采用的是前述自動(dòng)化的Zeiss ELISPOT讀數(shù)儀。用于檢測(cè)CD8+反應(yīng)的主要是對(duì)剛分離細(xì)胞和肽體外再刺激細(xì)胞的IFN-γELISPOT實(shí)驗(yàn)。此外，在選定條件下還對(duì)再刺激細(xì)胞進(jìn)行了鉻釋放試驗(yàn)，并將結(jié)果與ELISPOT試驗(yàn)的結(jié)果相關(guān)聯(lián)。還對(duì)選定肽/MHC組合進(jìn)行了四聚體染色試驗(yàn)。需要指出的是，本發(fā)明疫苗所針對(duì)的大量潛在HLA/肽組合可能使得四聚體染色試驗(yàn)不適合作為主要臨床試驗(yàn)，于此更詳細(xì)的論述可參考“臨床樣品引起的免疫反應(yīng)的測(cè)定和定量”小標(biāo)題下的背景部分。
需建立臨床試驗(yàn)方法并驗(yàn)證其有效，這可以是在選出臨床疫苗小基因后到由臨床試驗(yàn)參加者獲取實(shí)際樣品之前的一段時(shí)間內(nèi)。CTL評(píng)價(jià)試驗(yàn)可建立在本領(lǐng)域已有經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，例如HBV試驗(yàn)疫苗I期和II期試驗(yàn)中建立CTL評(píng)價(jià)試驗(yàn)的經(jīng)驗(yàn)，Theradigm(Livingston等，免疫學(xué)雜志，Vol.159(3)1383-92(1997)；Heathcote等，肝臟學(xué)，Vol.30(2)531-6(1999)；Livingston等，免疫學(xué)雜志，Vol.162(5)3088-95(1999))。具體地說(shuō)，可以采用來(lái)自健康人或例如HIV感染、未免疫志愿者的Ficoll純化的PBMC。如前所述，本發(fā)明還可采用其他抗原靶。
所用的表位是A2，A3和B7流感衍生超型表位組(Gianfrani等，歐洲免疫學(xué)雜志(1999))，以及Ennis等所述的表位(Tamura等，病毒學(xué)雜志，Vol.72(11)9404-6(1998))。這可以驗(yàn)證試驗(yàn)，并確立接受治療的患者群中的反應(yīng)水平基線。
確立了試驗(yàn)方法后，即可對(duì)臨床樣品進(jìn)行評(píng)價(jià)。一般性試驗(yàn)策略如下所述。采用冷凍保藏的PBMC一份。一般采用肽脈沖的自身PBMC作為APC，因?yàn)槎啾砦粯?gòu)成物中所用的表位受大量不同I類(lèi)MHC等位基因產(chǎn)物的限制，因而無(wú)法使用確定類(lèi)型的EBV細(xì)胞線作為APC和靶細(xì)胞。
對(duì)非刺激和肽刺激的培養(yǎng)物都進(jìn)行了評(píng)價(jià)。有些反應(yīng)可以在非刺激培養(yǎng)物中測(cè)得，但較弱的反應(yīng)/表位也許需要1到2次體外再刺激。試驗(yàn)可如下進(jìn)行。例如，如果對(duì)50個(gè)左右的I類(lèi)限制性表位的反應(yīng)進(jìn)行試驗(yàn)，可以分為7組混合物，每組約7個(gè)肽。還用肽的混合物進(jìn)行再刺激。還測(cè)定了對(duì)PADRE表位的反應(yīng)。如果肽混合物的結(jié)果呈陽(yáng)性，則測(cè)定單獨(dú)各表位以確定引起所述反應(yīng)的表位。陽(yáng)性對(duì)照包括全破傷風(fēng)毒素和/或促細(xì)胞分裂原PHA，以及流感病毒衍生表位的混合物。另外合成可能性連接表位，并單獨(dú)作為一組混合物進(jìn)行試驗(yàn)。
接著，對(duì)少數(shù)選出的效應(yīng)者肽和個(gè)體進(jìn)行了剛分離或再刺激細(xì)胞的四聚體染色，并將結(jié)果與ELISPOT結(jié)果相關(guān)聯(lián)。必須指出的是，只制得與通用等位基因產(chǎn)物例如A*0201，A*0301，A*1101和B*0702結(jié)合的選定肽的四聚體。測(cè)定了這些四聚體對(duì)這些肽反應(yīng)呈陽(yáng)性但被給定超型中其他成員所限制的細(xì)胞染色能力。這些結(jié)果的意義在于確定以上反應(yīng)物是否可普遍用作診斷/治療的替代性標(biāo)記。
關(guān)于以上分析所需的細(xì)胞量，標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)可能需要7組肽，1組陰性對(duì)照和2組陽(yáng)性對(duì)照(總共10組)。對(duì)平行試驗(yàn)來(lái)說(shuō)，每孔2×105個(gè)細(xì)胞，則這就是10×2×2×105，共4×106個(gè)細(xì)胞。保守地估計(jì)熔融后的復(fù)蘇率為50％，則預(yù)計(jì)需要約106PBMC/ml血液。這不包括臨床對(duì)象間PBMC數(shù)量的較大差異，因?yàn)樗袀€(gè)體都是健康志愿者，或者，如果是HIV感染者，則都是HAART治療接受者。因此，4-8ml血液的PBMC一般應(yīng)足夠進(jìn)行一輪試驗(yàn)。為了確定陽(yáng)性肽，和/或?yàn)榱诉M(jìn)行體外再刺激來(lái)提高靈敏度，常需要重復(fù)試驗(yàn)。因此，約需3-4份血樣，總共約20ml。
本發(fā)明就各項(xiàng)目的，全面參考了文中提到的全部出版物、授權(quán)專(zhuān)利和公開(kāi)專(zhuān)利。
權(quán)利要求
1.一種設(shè)計(jì)多表位構(gòu)成物的方法，所述多表位構(gòu)成物包含多個(gè)HLA表位，并被呈遞給I類(lèi)HLA加工路徑，所述方法包括(i)進(jìn)行多HLA表位分選，以盡可能減少連接表位；(ii)在所述多表位構(gòu)成物內(nèi)HLA表位的C+1位置引入側(cè)翼氨基酸殘基，所述殘基選自K，R，N，Q，G，A，S，C和T；(iii)在所述多表位構(gòu)成物內(nèi)兩表位之間引入一個(gè)或多個(gè)氨基酸的間隔序列，用以避免出現(xiàn)CTL或HTL連接表位；(iv)挑選連接表位最少，氨基酸間隔殘基最少，各HLA表位C+1位置上以下氨基酸最多的一種或多種多表位構(gòu)成物，所述氨基酸為K，R，N，G，A，S，C或T。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述的間隔殘基各自都不是已知的II類(lèi)HLA一級(jí)錨殘基。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述間隔序列的引入避免了HTL表位，且包含至少5個(gè)氨基酸殘基，它們各自選自G，P和N。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，所述的間隔序列為GPGPG。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述間隔殘基的引入避免了HTL表位，且包含1，2，3，4，5，6，7或8個(gè)氨基酸殘基，它們各自選自A和G。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述側(cè)翼殘基引入在CTL表位的C+1位置。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述側(cè)翼殘基選自K，R，N，G和A。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述側(cè)翼殘基與間隔序列氨基酸殘基相鄰。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，還包括用一個(gè)氨基酸殘基取代多表位構(gòu)成物內(nèi)所述一個(gè)HLA表位C末端旁另一HLA表位的N末端殘基，所述用于取代的氨基酸殘基選自K，R，N，G和A。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，還包括預(yù)測(cè)所述多表位構(gòu)成物的結(jié)構(gòu)，而且，所述的挑選步驟還包括挑選一個(gè)或多個(gè)如下多表位構(gòu)成物引入細(xì)胞后由HLA加工路徑加工，使得該構(gòu)成物內(nèi)所有表位都由HLA加工路徑加工形成。
11.用前述1-9中任一項(xiàng)所述方法制備的多表位構(gòu)成物。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的多表位構(gòu)成物，其中的表位由一個(gè)小基因編碼。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的多表位構(gòu)成物，它由圖9所示的小基因HIV-TT編碼。
14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的多表位構(gòu)成物，它由圖9所示的小基因HIV-DG編碼。
15.根據(jù)權(quán)利要求12所述的多表位構(gòu)成物，它由圖9所示的小基因HIV-TC編碼。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物學(xué)領(lǐng)域。具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及提高了免疫原性的多表位疫苗及其設(shè)計(jì)方法。在實(shí)施方式中，所述多表位疫苗由一小基因編碼，該基因優(yōu)化了所得構(gòu)成物的免疫原性。
文檔編號(hào)C12N15/86GK1437476SQ00819182
公開(kāi)日2003年8月20日 申請(qǐng)日期2000年12月28日 優(yōu)先權(quán)日1999年12月28日
發(fā)明者A·塞特, R·切斯納特, B·D·利文斯頓, D·M·貝克, M·J·紐曼 申請(qǐng)人:埃皮繆納股份有限公司