樹蛙防御肽PopuDef及其基因和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種樹蛙防御肽及其基因和應(yīng)用，屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。該多肽分子量4636.12道爾頓，等電點(diǎn)4.75，全序列一級(jí)結(jié)構(gòu)為：GASPALWGCDSFLGYCRIACFAHEASVGQKDCAEGMICC?LPNVF，其第九位半胱氨酸和第三十八位半胱氨酸組成分子內(nèi)二硫鍵，第十六位半胱氨酸和第三十二位半胱氨酸組成分子內(nèi)二硫鍵，其第二十位半胱氨酸和第三十九位半胱氨酸組成分子內(nèi)二硫鍵。編碼樹蛙防御肽的基因由401個(gè)核苷酸組成，其中編碼成熟樹蛙防御肽為第67-198位核苷酸。該樹蛙防御肽具有顯著的抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的作用，能夠作為制備病原微生物感染疾病的治療藥物的應(yīng)用。
【專利說(shuō)明】樹蛙防御肽PopuDef及其基因和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】:
[0001]本發(fā)明涉及一種樹娃(Polypedates puerensis)防御肽PopuDef及其基因和應(yīng)用，屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】:
[0002]抗生素廣泛用于治療敏感微生物(常為細(xì)菌或真菌)所致的感染。但是，由于人們對(duì)這些“傳統(tǒng)抗生素”的不合理使用、甚至濫用，導(dǎo)致許多細(xì)菌對(duì)它們產(chǎn)生了耐藥性。于是人們開(kāi)始尋找新的抗微生物替代藥物。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，多肽類抗生素不但具有廣譜的抗微生物活性，同時(shí)具有“傳統(tǒng)抗生素”無(wú)法比擬的優(yōu)越性:在很低的濃度時(shí)，就可以快速地殺死各種細(xì)菌(含臨床耐藥性 菌株)；對(duì)真菌和病毒也有抑制作用；微生物不易產(chǎn)生耐藥性；對(duì)于局部感染和全身感染都有效，有希望成為新一代抗微生物藥物。目前，對(duì)多肽類抗微生物藥物的研制受到了日益廣泛的重視。
[0003]許多兩棲動(dòng)物被廣泛應(yīng)用在傳統(tǒng)中藥和民族藥物中，如中華蟾蜍Bufogar gar i z an s和滇娃Rana p Ieuraden等。近年來(lái)的研究表明,這些兩棲類動(dòng)物的皮膚分泌物具有廣泛的藥理活性，如抗微生物、抗腫瘤、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、創(chuàng)傷修復(fù)、鎮(zhèn)痛作用等。目前，從兩棲動(dòng)物皮膚中篩選一些藥理活性單體化合物是新藥發(fā)明的熱點(diǎn)。據(jù)國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道，已從各種生物來(lái)源分離得到不同的活性多肽，而且有些已進(jìn)入臨床階段。雖然我國(guó)對(duì)兩棲動(dòng)物應(yīng)用有著悠久的歷史，但是都是整體入藥，對(duì)其活性成分和藥理性質(zhì)的研究比較薄弱。樹娃Polypedates puerensis主要分布于四川、云南省,是我國(guó)特色資源動(dòng)物之一，其皮膚分泌物中的活性物質(zhì)成分尚未見(jiàn)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】
:
[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種新的具有廣譜抗微生物(包括革蘭氏陰、陽(yáng)性細(xì)菌)的樹蛙防御肽及其基因和應(yīng)用。
[0005]本發(fā)明的樹蛙防御肽PopuDef是中國(guó)兩棲類樹蛙防御肽基因編碼的一種環(huán)狀多肽，分子量4636.12道爾頓，等電點(diǎn)4.75，多肽全序列一級(jí)結(jié)構(gòu)(氨基酸序列SEQ ID NO:1)為:
[0006]Gly Ala Ser Pro Ala Leu Trp Gly Cys Asp Ser Phe Leu Gly Tyr Cys Arg He AlaCys Phe Ala His Glu Ala Ser Val Gly Gln Lys Asp Cys Ala Glu Gly Met He Cys Cys Leu ProAsn Val Phe (GASPALWGCDSFLGYCRIACFAHEASVGQKDCAEGMICC LPNVF)，其第九位半胱氨酸和第三十八位半胱氨酸組成分子內(nèi)二硫鍵，第十六位半胱氨酸和第三十二位半胱氨酸組成分子內(nèi)二硫鍵，其第二十位半胱氨酸和第三十九位半胱氨酸組成分子內(nèi)二硫鍵。
[0007]編碼樹蛙防御肽的基因由401個(gè)核苷酸(SEQ ID NO: 2)組成，其自5’端至3’端序
列為:
[0008]atgaaactgt tcatcatgct actggtattc ttgggacttg tggccatcac ctggggaaca 60
agtgatggcg cctctcccgc tttgtggggc tgtgacagtt tcctcggtta ttgccgtatt 120
gcctgctttg ctcacgaggc ttcggtaggg cagaaggact gtgctgaggg aatgatttgc 180
tgcctgccca atgttttctg atgcactttg gcatttattg accttggatt ctgtggactt 240
ccttccatga cttaactgtg tgtccatctt gcaatcgaag ataatgatta caagggtgca 300
gaaaccttcg tttgtgcttg cttctggtgg tactaacatt ggaaaaatgg gaataaaact 360
ctgacatgat tatacacaca catgttaaaa aaaaaaaaaa a401
[0009]編碼樹蛙防御肽的基因，其成熟樹蛙防御肽為SEQ ID NO: 2的第67-198位核苷酸，其氨基酸序列(SEQ ID NO:3)為:
[0010]
Gly Ala Scr Pro Ala Leu Trp Gly Cys Asp Scr Phc Leu Gly Tyr Cys Arg He Ala Cys

5101520
Phc Ala His Glu Ala Scr Val Gly Gln Lys Asp Cys Ala Glu Gly Met Ilc Cys Cys Lcu

25303540
Pro Asn Val Phc
[0011]本發(fā) 明的樹蛙防御肽作為制備病原微生物感染疾病的治療藥物的應(yīng)用。
[0012]本發(fā)明的有益效果在于:提供一種新的具有廣譜抗微生物(包括革蘭氏陰、陽(yáng)性細(xì)菌)的樹蛙防御肽，該樹蛙防御肽具有顯著的抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的作用，能夠作為制備病原微生物感染疾病的治療藥物的應(yīng)用。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】:
[0013]附圖顯示樹娃防御肽PopuDef的分離純化。箭頭所示為純化的防御肽PopuDef?！揪唧w實(shí)施方式】:
[0014]下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)說(shuō)明。
[0015]1、樹娃防御肽PopuDef的制備和氨基酸序列測(cè)定:
[0016](I)、樹蛙皮膚勻漿:
[0017]活體樹蛙用水清洗干凈，剝離皮膚組織，稱重，取2g皮膚組織，加入1ml0.1MPH6.0的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)，于20ml玻璃勻漿器中勻漿。勻漿液于4°C條件下12000rpm離心15分鐘，上清于-80°C保存。
[0018](2)、樹蛙防御肽PopuDef的分離純化:
[0019]以上述收集的上清液為原料，按照下述程序純化防御肽PopuDef，分離純化的每個(gè)組分都進(jìn)行抗菌活性檢測(cè)，具體方法如下:
[0020]A.采用美國(guó)Millipore公司的Ccntriprcpt超濾管將上清液中分子量大于1kDa的物質(zhì)去除。上清液加入Ccntriprcpt超濾管(lOkDa，15ml)中進(jìn)行第一次離心(3000Xg，40分鐘)，收集濾液，再進(jìn)行第二次離心(3000 X g，10分鐘)，收集濾液，再進(jìn)行第三次離心(3000 X g，5分鐘)，收集剩余的濾液，于_20°C保存。
[0021]B.上述的濾液采用C18反相高壓液相色譜柱進(jìn)行進(jìn)一步純化，該步驟在美國(guó)Waters公司的2795四元梯度高效液相色譜儀中進(jìn)行，以0-60%乙腈線性梯度進(jìn)行洗脫，流速為0.7ml/min,如圖1所示，得到純化的樹蛙防御肽PopuDef。
[0022](3)、樹蛙防御肽PopuDef的氨基酸測(cè)定
[0023]純化的樹蛙防御肽PopuDef運(yùn)用Edman降解法進(jìn)行測(cè)序，該步驟在美國(guó)ABI公司的Pr0SCiSe?491蛋白質(zhì)測(cè)序儀中進(jìn)行。氨基酸測(cè)序結(jié)果表明樹蛙防御肽的全序列一級(jí)結(jié)構(gòu)為:GASPALWGCDSFLGYCRIACFAHEASVGQKDCAEGMICC LPNVF。
[0024]2、樹蛙防御肽PopuDef基因的克隆
[0025](I)、樹蛙皮膚總RNA提取:
[0026]A.活體樹蛙用水清洗干凈，放入液氮中速凍10小時(shí)，取皮膚組織，稱重，取300mg皮膚組織，加入3ml Trizol溶液，于20ml玻璃勻漿器中勻漿30分鐘。
[0027]B.加入等體積酚/氯仿溶液，劇烈混勻，室溫放置10分鐘，4°C，12000rpm離心10分鐘，棄除沉淀。
[0028]C.上清加入等體積的異丙醇，室溫放置10分鐘，4°C，12000rpm,離心10分鐘，沉淀用75%乙醇洗一次，晾干，管底沉淀物即為樹蛙皮膚總RNA。
[0029](2)、樹蛙皮膚mRNA的純化: [0030]樹蛙皮膚mRNA分離純化采用美國(guó)PR0MEGA公司的PoIyATtracts mRNA Isolat1nSystems試劑盒。
[0031]A.提取的樹蛙皮膚總RNA溶于500 μ I DEPC水中，放入65°C水浴10分鐘，加人3μ I的Oligo(dT)探針和13μ 120XSSC溶液，混勻，放置室溫冷卻，稱為A液。
[0032]B.磁珠(SA-PMP)的洗滌:將磁珠輕彈混勻，至磁力架吸附30秒，棄上清，加
0.5XSSC0.3ml，至磁力架吸附30秒，最后加0.1ml0.5 X SSC懸浮，稱之為B液。
[0033]C.將A液加入B液中，室溫放置10分鐘，至磁力架吸附30秒，棄上清，用0.1 X SSC洗滌4次，最后棄上清，加0.L ml DEPC水懸浮，至磁力架上吸附30秒，將上清移至新的試管，再加入0.15mlDEPC水重新懸浮，至磁力架吸附30秒，移上清至上述試管，則上清中為純化的樹蛙皮膚mRNA。
[0034]D.加入1/10體積3M乙酸鈉，ρΗ5.2，等體積異丙醇，于_70°C放置30分鐘，4°C，12000rpm離心10分鐘，棄上清，沉淀溶解于10 μ I DEPC水中。
[0035](3)樹蛙皮膚cDNA文庫(kù)構(gòu)建:
[0036]米用CL0NTECH 公司 Creator? SMART ? cDNA Library Construct1n Kit 質(zhì)粒 cDNA文庫(kù)構(gòu)建試劑盒。
[0037]A.cDNA第一鏈合成(mRNA反轉(zhuǎn)錄):
[0038]在0.5ml無(wú)菌的離心管加入I μ I樹蛙皮膚mRNA、ly I SMART IV寡聚核苷酸、I μ I⑶S 111/3’ PCR引物，加2μ I去離子水使總體積達(dá)到5 μ I?；靹螂x心管中的試劑并以12000rpm離心15秒，72°C保溫2分鐘。將離心管在冰上孵育2分鐘。在離心管中加入以下試劑2.0μ 15X第一鏈緩沖、1.0μ 120mM 二硫蘇糖醇、1.0μ IlOmM dNTP混合物、1.0 μ IPowerScript反轉(zhuǎn)錄酶。混合離心管中試劑并以12000rpm離心15秒,在42°C保溫I小時(shí)。將離心管置于冰上中止第一鏈的合成。從離心管取2μ I所合成的cDNA第一鏈備用。
[0039]B.采用長(zhǎng)末端聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LD-PCR)方法擴(kuò)增第二鏈
[0040]95 V預(yù)熱PCR儀，將2 μ I cDNA第一鏈(mRNA反轉(zhuǎn)錄)、80 μ I去離子水、10μ 110XAdvantage2PCR 緩沖、2 μ 150 X dNTP 混合物、2μ 15’PCR 引物、2μ I CDSIII/3’PCR引物以及2μ I大腸桿菌聚合酶離心管進(jìn)行反應(yīng)。在PCR儀中按以下程序擴(kuò)增:95°C，20秒鐘；22個(gè)循環(huán)(95°C，5秒鐘；68°C，6分鐘)。循環(huán)結(jié)束后，將離心管中合成的cDNA雙鏈進(jìn)行抽提。
[0041 ] C.PCR 產(chǎn)物用 PR0MEGA 公司的 WizarcT SV Gel and PCR Clean-Up System 試劑盒進(jìn)行抽提回收，步驟如下:
[0042]將通過(guò)PCR得到的cDNA雙鏈加入等體積的膜結(jié)合緩沖顛倒混勻，然后將混和液轉(zhuǎn)入離心純化柱，室溫靜置5分鐘，使DNA充分與硅膠膜結(jié)合。12000rpm離心30秒，倒掉收集管中的廢液。加入700 μ I的洗脫液(含乙醇)于離心純化柱中，以12000rpm離心30秒，倒掉收集管中的廢液。重復(fù)步驟2。12000rpm離心5分鐘，將離心純化柱置于新的離心管中。加入30 μ I超純水,在室溫下靜置5分鐘。12000rpm離心30秒,管底溶液即為所純化過(guò)的cDNA雙鏈。
[0043]D.大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞的制備:
[0044]挑取單個(gè)DH5 α菌落,接種于3ml不含氨節(jié)青霉素的Luria-Bertani (LB)培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)過(guò)夜，次日取上述菌液按比例1:100再接種于50mlLB培養(yǎng)液中，37°C振蕩2小時(shí)。當(dāng)OD6tltl值達(dá)到0.35時(shí)，收獲細(xì)菌培養(yǎng)物。將細(xì)菌轉(zhuǎn)移到一個(gè)無(wú)菌、一次性使用的、用冰預(yù)冷的50ml聚丙烯管中，在冰上方置10分鐘，使培養(yǎng)物冷卻至0°C。于4°C以4100rpm離心10分鐘，回收細(xì) 胞。倒出培養(yǎng)液，將管倒置I min以使最后的痕量培養(yǎng)液流盡。每50ml初始培養(yǎng)液且 30ml 預(yù)冷的 0.lmol/LCaCl2-MgCl2 溶液(80mmol/L MgCl2, 20mmol/L CaCl2)重懸每份細(xì)胞沉淀。
[0045]于4°C以4100rpm離心10分鐘，回收細(xì)胞。倒出培養(yǎng)液，將管倒置I分鐘以使最后的痕量培養(yǎng)液流盡。每50ml初始培養(yǎng)物用2ml用冰預(yù)冷的0.lmol/L CaCl2重懸每份細(xì)胞沉淀，分裝后備用。
[0046]E.酶切、連接以及連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化:
[0047]在微量離心管中加入I μ I Takara pMD18_T載體、4 μ I樹蛙cDNA雙鏈溶液，全量為5μ1。加入5μ1 (等量)的連接酶緩沖混合物。16°C反應(yīng)2小時(shí)。全量(10 μ I)加入至100μ1?Η5α感受態(tài)細(xì)胞中，冰中放置30分鐘。42°C加熱90秒鐘后，再在冰中放置I分鐘。加入37°C溫浴過(guò)的LB培養(yǎng)基890 μ 1，37°C緩慢振蕩培養(yǎng)60分鐘。取200 μ I涂布于含有X-Gal、IPTG、Amp的LB培養(yǎng)基上37°C培養(yǎng)16小時(shí)，形成單菌落。每個(gè)LB平皿用5mlLB液體培養(yǎng)基洗滌菌落，加30%甘油凍存。構(gòu)建的cDNA大約含IX 16個(gè)單獨(dú)克隆。
[0048](4)、樹蛙防御肽基因克隆篩選:
[0049]擴(kuò)增弓丨物序列為5 ’ ATGAAACTGTTCATCATGCTAC3 ’，PCR另一擴(kuò)增引物為CL0NTECH公司 SMART ? cDNA Library Construct1n Kit 中的 3，PCR Primer 引物，其序列為 5，ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG3，。
[0050]PCR反應(yīng)在如下條件下進(jìn)行:94°C，30秒鐘；52°C，45秒鐘；72°C，2分30秒鐘，共35個(gè)循環(huán)。
[0051]首先滴定構(gòu)建的細(xì)菌cDNA文庫(kù)，然后用含100μ g/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基稀釋至適當(dāng)?shù)募?xì)菌濃度(大約5000個(gè)細(xì)菌/毫升，和30個(gè)細(xì)菌/毫升分別用于首輪篩選第二輪篩選)，在96孔培養(yǎng)板上按8X8矩陣鋪板(共64孔，每孔100 μ I)，37°C過(guò)夜培養(yǎng)。按行、列分別合并細(xì)菌培養(yǎng)液，有16個(gè)樣品進(jìn)行PCR鑒定，交叉陽(yáng)性孔細(xì)菌樣品進(jìn)入第二輪篩選。
[0052](5)、樹蛙防御肽基因序列測(cè)定和結(jié)果:
[0053]提取質(zhì)粒DNA用雙脫氧法測(cè)定核苷酸序列，使用儀器為美國(guó)AppliedB1systems373A全自動(dòng)核苷酸序列測(cè)定儀，測(cè)序引物為BcaBEST? Sequencing PrimerRV-M 和 BcaBEST? Sequencing Primer M13-47， BcaBEST? Sequencing Primer RV-M序列:5'GAGCGGATAACAATTTCACACAGG3，， BcaBEST? Sequencing Primer M13-47:5’ CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC3’。
[0054]基因測(cè)序結(jié)果表明編碼樹蛙防御肽PopuDef的基因由401個(gè)核苷酸(SEQ ID NO: 2)組成(GenBank Access1n N0.KJ809087)，自 5，端至 3，端序列為:
[0055]
【權(quán)利要求】
1.樹蛙防御肽，其特征在于該防御肽是中國(guó)兩棲類樹蛙防御肽基因編碼的一種環(huán)狀多肽，分子量4636.12道爾頓，等電點(diǎn)4.75，其氨基酸序列為SEQ ID NO:1所示。
2.編碼樹蛙防御肽的基因，其特征在于由SEQID NO:2所示的核苷酸序列組成。
3.編碼樹蛙防御肽的基因，其成熟樹蛙防御肽為SEQID NO:2的第67-198位核苷酸，其氨基酸序列為SEQ ID NO:3。
4.權(quán)利要求 1所述的樹蛙防御肽，作為制備病原微生物感染疾病的治療藥物的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61K38/17GK104031135SQ201410288772
【公開(kāi)日】2014年9月10日 申請(qǐng)日期:2014年6月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月25日
【發(fā)明者】楊海龍, 武靜, 呂靖, 韓毅, 劉彤, 孫曉華, 木麗仙 申請(qǐng)人:昆明醫(yī)科大學(xué)