一種牛β-防御素4成熟肽的制備方法及其重組菌和應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及動(dòng)物醫(yī)藥工程【技術(shù)領(lǐng)域】，提供了一種真核表達(dá)載體，由含有牛β-防御素4成熟肽基因與真核表達(dá)載體pPIC9K構(gòu)建而成的pPIC9K-mBNBD4，牛β-防御素4成熟肽基因的核苷酸序列如SEQ?IDNO：1所示；還提供了一種重組菌株；還提供了一種牛β-防御素4成熟肽的制備方法，包括1)牛β-防御素4成熟肽基因的制備；2)上述真核表達(dá)載體的構(gòu)建；3)上述重組菌株的制備；4)畢赤酵母陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子體外誘導(dǎo)表達(dá)。本發(fā)明所表達(dá)的重組牛嗜中性粒細(xì)胞β-防御素4成熟肽具有抗菌活性，且有一定的抗結(jié)核活性，適合于在畜牧生產(chǎn)及疾病治療中使用，而且生產(chǎn)成本低、生產(chǎn)效率高。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種牛β-防御素4成熟肽的制備方法及其重組菌和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于動(dòng)物醫(yī)藥工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種牛β -防御素4成熟肽的制備方法，還涉及一種表達(dá)牛防御素4成熟肽的重組菌，同時(shí)還涉及一種牛β-防御素4成熟肽在畜牧生產(chǎn)和藥物治療中抗菌作用的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]防御素(defensin)屬于內(nèi)源性抗菌妝(endogenousantibioticpeptidees)家族，具備廣譜抗微生物和細(xì)胞毒活性，對(duì)機(jī)體免疫至關(guān)重要。1991年，人們?cè)谂夤莛つど掀ぜ?xì)胞中首次發(fā)現(xiàn)防御素-2這一陽(yáng)離子多肽抗生素，命名為T(mén)AP(TracheaAntiniobial Peptide),而后在牛的粒細(xì)胞中又發(fā)現(xiàn)了 13種不同于α -防御素，卻與TAP序列高度同源的防御素，故命名為β_防御素。由于β_防御素的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)為基因序列中含有兩個(gè)exon，其中第二個(gè)exon編碼成熟的β -防御素，即發(fā)揮活性的部分，而且成熟β -防御素中含有6個(gè)半胱氨酸，可形成3對(duì)二硫鍵，是β -防御素能夠發(fā)揮生物活性的必要結(jié)構(gòu)。但是動(dòng)物體內(nèi)天然防御素的含量較低，直接提取遠(yuǎn)不能滿足需要，化學(xué)合成方法可行但成本太高，因此，通過(guò)基因重組技術(shù)生產(chǎn)防御素多肽，以滿足研究和生產(chǎn)的需要成為一種可倉(cāng)泛。
[0003]另外，有研究已證實(shí)牛巨噬細(xì)胞有牛嗜中性粒細(xì)胞β -防御素(BNBD) 4的表達(dá)，且分支桿菌主要感染巨噬細(xì)胞，并在巨噬細(xì)胞內(nèi)生存，因此，我們推測(cè)BNBD4可能在對(duì)抗分支桿菌感染中發(fā)揮著重要的作用，并可作為一種分支桿菌的新型治療藥物而廣泛使用，因此基于防御素的這一重要特點(diǎn)，我們進(jìn)行了一種真核表達(dá)牛嗜中性粒細(xì)胞β -防御素4成熟肽的生產(chǎn)方法的研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)不足，本發(fā)明的目的是提供一種牛β -防御素4成熟肽的制備方法及其重組菌和應(yīng)用。
[0005]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種真核表達(dá)載體，由含有牛β -防御素4成熟肽基因與真核表達(dá)載體PPIC9K構(gòu)建而成的pPIC9K-mBNBD4，所述牛β -防御素4成熟肽基因的核苷酸序列如SEQ ID Ν0:1所示。
[0006]一種編碼牛β -防御素4成熟肽的基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0007]本發(fā)明提供了一種重組菌株，由上述真核表達(dá)載體pPIC9K_mBNBD4轉(zhuǎn)化畢赤酵母GSl 15構(gòu)建制成的重組菌株。
[0008]優(yōu)選的，所述菌株為畢赤酵母陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子菌株巴斯德畢赤酵母Pichiapastoris (pPIC9K_mBNBD4),該菌株已于2014年3月20日被保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，簡(jiǎn)稱(chēng)CGMCC，地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101，保藏編號(hào)為CGMCC N0.8938。
[0009]本發(fā)明提供了一種牛β -防御素4成熟肽的制備方法，包括以下步驟:[0010]I)牛β -防御素4成熟肽基因的制備:根據(jù)GenBank上公布的BNBD4的⑶S區(qū)域核苷酸序列人工合成mBNBD4基因，并設(shè)計(jì)PCR引物，
[0011]mBNBD4的上游引物:
[0012]5' ~GCCGAATTCCAAAGAGTAAGAAATCCTC~3/ ；
[0013]mBNBD4的下游引物:
[0014]5' ~GCCGCGGCCGCCTAATGATGATGATGATGATGCCTCCTGCAGCATGGT~3/ 。
[0015]2)上述真核表達(dá)載體的構(gòu)建:雙酶切mBNBD4基因和真核表達(dá)載體pPIC9K，膠回收mBNBD4基因片段和開(kāi)環(huán)的真核表達(dá)載體pPIC9K，16°C連接處理16h，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌T0P10感受態(tài)細(xì)胞，即完成重組質(zhì)粒pPIC9K-mBNBD4的構(gòu)建；
[0016]3)上述重組菌株的制備:將重組質(zhì)粒pPIC9K-mBNBD4轉(zhuǎn)化到感受態(tài)GSl 15中，篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，所得陽(yáng)性克隆即為能夠表達(dá)mBNBD4的畢赤酵母陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子菌株；
[0017]4)畢赤酵母陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子體外誘導(dǎo)表達(dá)。
[0018]優(yōu)選的，步驟 3)中所述篩選依次為His+多拷貝轉(zhuǎn)化子的篩選和Mut+轉(zhuǎn)化子的篩選。
[0019]優(yōu)選的，所述步驟4)包括以下步驟:
[0020]a、挑取PCR鑒定后證實(shí)已插入目的片段的His+、Mut+酵母轉(zhuǎn)化子接種至YPD液體培養(yǎng)基中，28°C培養(yǎng)16-18h，離心棄上清；
[0021]b、重懸菌體接種至誘導(dǎo)表達(dá)前培養(yǎng)基BMGY中，28°C培養(yǎng)18_24h，至0D600nm達(dá)到
2-6時(shí)離心棄上清；
[0022]C、重懸菌體接種至誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)基BMMY中，28°C連續(xù)培養(yǎng)72h，培養(yǎng)72h后收集表達(dá)培養(yǎng)液，離心取上清，進(jìn)行Tricine-SDS-PAGE電泳分析，結(jié)果顯示，與空載體對(duì)照相比，含有目的片段的酵母表達(dá)上清在7kD處有一特異性條帶，說(shuō)明有目的蛋白表達(dá)。
[0023]優(yōu)選的，誘導(dǎo)表達(dá)前培養(yǎng)基BMGY的配方為酵母提取物10g/L、蛋白胨20g/L、K2HP043g/L、KH2PO4 11.8g/L、超純水 800mL/L、10XYNB100mL/L、0.02% 生物素的 500XBlmL/L、10% 甘油 100mL/L。
[0024]優(yōu)選的，誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)基BMMY的配方為酵母提取物10g/L、蛋白胨20g/L、K2HPO43g/L、KH2PO4 11.8g/L、超純水 800mL/L、10XYNB100mL/L、0.02% 生物素的 500XBlmL/L、5% 甲醇 100mL/L。
[0025]優(yōu)選的，所述步驟c中，培養(yǎng)過(guò)程中每隔24h補(bǔ)充甲醇使其終濃度為1%。
[0026]本發(fā)明提供了一種牛β -防御素4成熟肽在抗微生物感染中的應(yīng)用。
[0027]本發(fā)明的有益效果:對(duì)重組牛嗜中性粒細(xì)胞β -防御素4成熟肽(mBNBD4)進(jìn)行體外生產(chǎn)表達(dá)研究，僅對(duì)牛嗜中性粒細(xì)胞β -防御素4具有生物學(xué)活性的成熟肽進(jìn)行表達(dá)，同時(shí)為了方便純化，添加了不影響蛋白生物學(xué)活性的6-His.tag，從而有利于重組蛋白的純化，提高重組蛋白產(chǎn)量。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)屬于真核表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)出來(lái)的蛋白更接近于天然蛋白，有利于保持重組蛋白的天然結(jié)構(gòu)，對(duì)于牛嗜中性粒細(xì)胞β_防御素4成熟肽(mBNBD4)有助于3對(duì)二硫鍵的形成，從而保持重組蛋白的活性。活性檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)所表達(dá)的重組牛嗜中性粒細(xì)胞β-防御素4成熟肽(mBNBD4)具有抗菌活性，且有一定的抗結(jié)核活性，適合于在畜牧生產(chǎn)及疾病治療中使用，而且生產(chǎn)成本低、生產(chǎn)效率高?！緦?zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0028]圖1牛β -防御素4成熟肽的PCR結(jié)果；
[0029]圖2mBNBD4基因的測(cè)序比對(duì)結(jié)果；
[0030]圖3重組質(zhì)粒pPIC9K_mBNBD4構(gòu)建模式圖；
[0031]圖4重組菌株基因組PCR鑒定-通用引物鑒定結(jié)果，其中，1-2為空質(zhì)粒對(duì)照PPIC9K,3-8 為 pPIC9K-mBNBD4 ；
[0032]圖5重組菌株基因組PCR鑒定-mBNBD4特異性引物鑒定結(jié)果，其中，1_2為空質(zhì)粒對(duì)照 PPIC9K，3-8 為 pPIC9K-mBNBD4 ；
[0033]圖6重組蛋白mBNBD4的鑒定結(jié)果:Tricine-SDS_PAGE鑒定結(jié)果，其中，1:誘導(dǎo)48h ；2:誘導(dǎo)60h ；3:誘導(dǎo)72h ；4:誘導(dǎo)84h ;箭頭所指為最優(yōu)表達(dá)時(shí)間(72h)；
[0034]圖7重組蛋白mBNBD4的鑒定結(jié)果:Western Blotting鑒定結(jié)果，I為空質(zhì)粒對(duì)照PPIC9K表達(dá)產(chǎn)物，2為重組蛋白mBNBD4 ；
[0035]圖8重組蛋白mBNBD4對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌有抑制效果；
[0036]圖9重組蛋白mBNBD4對(duì)恥垢分支桿菌的抑制效果； [0037]圖10重組蛋白mBNBD4對(duì)牛分枝桿菌的抑制效果。
【具體實(shí)施方式】
[0038]以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明所使用的限制性?xún)?nèi)切酶EcoR 1、Not I和Sac I均購(gòu)自Takara大連寶生物；真核表達(dá)載體pPIC9K購(gòu)自Invitrogen公司；FastPfu DNA聚合酶,T4連接酶等購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；畢赤酵母宿主菌GS115菌株購(gòu)自中國(guó)質(zhì)粒載體菌株細(xì)胞株基因保藏中心；遺傳霉素G418購(gòu)自北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)廠家為美國(guó)INALCO公司。
[0039]實(shí)施例1嗜中性粒細(xì)胞β -防御素4成熟肽基因的制備
[0040]1、設(shè)計(jì)人工合成牛嗜中性粒細(xì)胞β -防御素4成熟肽(mBNBD4)基因的引物
[0041]根據(jù)GenBank上公布的BNBD4的CDS區(qū)域核苷酸序列(序列號(hào):AF008307.1)，以及真核表達(dá)載體PPIC9K的酶切位點(diǎn)，上游引物設(shè)計(jì)在基因起始端，加入了 EcoR I酶切位點(diǎn)(下劃線處)，在EcoR I酶切位點(diǎn)前加有3個(gè)保護(hù)性堿基GCC ;下游引物設(shè)計(jì)在基因末端，并加入了 Not I酶切位點(diǎn)(下劃線處)，同時(shí)為了方便以后蛋白純化，在下游引物C-端終止密碼子前加了一個(gè)6-His.tag(波浪下劃線處)，Not I酶切位點(diǎn)前加有3個(gè)保護(hù)性堿基GCC,委托Genewiz (金唯智)生物科技有限公司合成,分別為:
[0042]mBNBD4的上游引物:
[0043]5' -GCCGAATTCCAAAGAGTAAGAAATCCTC-3'；
[0044]mBNBD4的下游引物:
[0045]5' ~GCCGCGGCCGCCTAATGATGATGATGATGATGCCTCCTGCAGCATGGT~3/ 。
[0046]2、mBNBD4 的 PCR 擴(kuò)增
[0047]從正常牛肺臟組織提取RNA，反轉(zhuǎn)錄后獲得cDNA，以此DNA為模板，加入TransStart FastPfu DNA聚合酶、牛嗜中性粒細(xì)胞β -防御素4成熟肽(mBNBD4)基因上游引物/下游引物、2.5mM dNTPs進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，PCR反應(yīng)體系為:5 X TransStart FastPfubuffer (10 μ L)，2.5mM dNTPs (5 μ L)，濃度為10 μ M的牛嗜中性粒細(xì)胞β _防御素4成熟肽(mBNBD4)基因上游引物和下游引物(各I μ L)，模板為牛肺臟組織cDNA(2 μ L)，高壓滅菌ddH20 (30 μ L)，TransStart FastPfu DNA 聚合酶(I μ L)，PCR 反應(yīng)條件依次為:95°C，lmin;95°C，20sec,62°C，20sec, 72°C，30sec, 35cycles ；72°C，5min。反應(yīng)完成后即獲得牛嗜中性粒細(xì)胞β -防御素4成熟肽(mBNBD4)的PCR產(chǎn)物，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，可見(jiàn)一條158bp左右的條帶，如圖1所示，與預(yù)期結(jié)果一致。
[0048]實(shí)施例2重組質(zhì)粒pPIC9K_mBNBD4的構(gòu)建
[0049]將獲得的牛嗜中性粒細(xì)胞β -防御素4成熟肽(mBNBD4)的PCR產(chǎn)物用快速瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進(jìn)行純化及回收，回收產(chǎn)物用內(nèi)切酶EcoR I和Not I進(jìn)行雙酶切處理，膠回收大小約為150bp的條帶；以同樣的方法對(duì)真核表達(dá)載體PPIC9K進(jìn)行雙酶切處理，膠回收約為9kb大小的DNA片段，分別取3 μ L雙酶切后膠回收的牛嗜中性粒細(xì)胞β -防御素4成熟肽(mBNBD4)基因片段和2 μ L雙酶切后膠回收的真核表達(dá)載體pPIC9K，加入2 μ L的5XT4DNA連接buffer，I μ L的T4DNA連接酶，補(bǔ)充高壓滅菌ddH20至10 μ L，在16°C條件下連接處理16h，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌TOPlO感受態(tài)細(xì)胞，涂布200 μ L于LB/Amp+固體培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)14-16h，即完成重組質(zhì)粒pPIC9K-mBNBD4的構(gòu)建。LB/Amp+固體培養(yǎng)板上長(zhǎng)出的白色菌落即為含有重組質(zhì)粒pPIC9K-mBNBD4的陽(yáng)性菌。真核表達(dá)載體pPIC9K為Invitrogen公司的產(chǎn)品。
[0050]挑選LB/Amp+固體培養(yǎng)板上長(zhǎng)出的白色菌落加入LB/Amp+液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)后，送至北京三博遠(yuǎn)志公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與GenBank中公布的BNBD4的⑶S區(qū)域核苷酸序列完全一致，如圖2所示，說(shuō)明mBNBD4基因序列成功插入質(zhì)粒內(nèi)，重組質(zhì)粒pPIC9K-mBNBD4已經(jīng)構(gòu)建成功，如圖3所示。
[0051]實(shí)施例3畢赤酵 母基因工程菌株的制備
[0052]1、重組質(zhì)粒的制備和線性化
[0053]挑選轉(zhuǎn)化入重組質(zhì)粒pPIC9K-mBNBD4的TOPlO陽(yáng)性菌接種于IOOmL的LB/Amp+液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)12-14h，將菌液于4°C，5000rpm離心30min，收集沉淀的菌體，然后用無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒DNA抽提試劑盒提取質(zhì)粒，同時(shí)提取了空質(zhì)粒PPIC9K的質(zhì)粒DNA用作空白對(duì)照。用內(nèi)切酶Sac I將提取的重組質(zhì)粒pPIC9K-mBNBD4和空質(zhì)粒pPIC9K線性化。為了便于電轉(zhuǎn)化，將線性化的重組質(zhì)粒pPIC9K-mBNBD4和空質(zhì)粒pPIC9K經(jīng)酚/氯仿抽提純化，加入無(wú)水乙醇(_20°C預(yù)冷)沉淀DNA，將沉淀物自然干燥后，加入高壓滅菌ddH20溶解沉淀。
[0054]2、畢赤酵母電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的制備
[0055]接種純化后的畢赤酵母宿主菌GS115單菌落至5mL的YPD (含有酵母提取物，IOg/L;蛋白胨，20g/L;10X葡萄糖，100mL/L)液體培養(yǎng)基中，28°C，250rpm條件下過(guò)夜培養(yǎng)。然后取0.1mL的過(guò)夜培養(yǎng)物，接種于IOOmL新鮮配制的YPD液體培養(yǎng)基(250mL錐形瓶)中，28°C，250rpm條件下過(guò)夜培養(yǎng)，使0D600nm值達(dá)到1.3-1.5。取該培養(yǎng)液分裝入兩個(gè)無(wú)菌的50mL離心管中于4°C，1500g條件下離心5min，棄上清液，扣干離心管壁；依次加入25mL、15mL冰預(yù)冷的滅菌水及IOmL冰預(yù)冷的IM無(wú)菌山梨醇溶液，振蕩重懸菌體，4°C，1500g條件下離心5min，棄上清液，吸干管壁殘余液體；再次加入5mL冰預(yù)冷的IM無(wú)菌山梨醇溶液，重懸菌體，40C，1500g條件下離心5min，棄上清液，吸干管壁殘余液體；最后將細(xì)胞重懸于ImL冰預(yù)冷的IM無(wú)菌山梨醇溶液中，振蕩混勻后終體積達(dá)到約1.5mL，此時(shí)得到的即為畢赤酵母GSl 15感受態(tài)細(xì)胞。將制備的感受態(tài)細(xì)胞按100 μ L/管分裝入1.5mL無(wú)菌EP管中，-70°C冰凍保存，保存時(shí)間不宜超過(guò)兩周，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)轉(zhuǎn)化效率會(huì)變低，最好現(xiàn)用現(xiàn)做。
[0056]3、畢赤酵母的電擊轉(zhuǎn)化
[0057]電轉(zhuǎn)化前取兩管100 μ L新鮮制備的(或者_(dá)70°C冰凍保存的)GSl 15感受態(tài)細(xì)胞置于冰浴中，使其完全解凍，分別與5-20 μ g線性化的質(zhì)粒(重組質(zhì)粒pPIC9K-mBNBD4和空質(zhì)粒PPIC9K)混合，輕彈混勻，盡數(shù)吸出轉(zhuǎn)移至0.2cm的電穿孔轉(zhuǎn)化杯(冰上預(yù)冷)中，冰浴5-10min，保持低溫狀態(tài)，使用電穿孔儀(BioRad)進(jìn)行點(diǎn)擊轉(zhuǎn)化，電穿孔轉(zhuǎn)化條件為:電壓1500V，電阻300 Ω，電容25 μ F，脈沖時(shí)間6_7ms，一次電擊；電擊后，立即往電擊杯中加入ImL冰預(yù)冷的IM山梨醇溶液，用微量移液槍吹打均勻后，吸出轉(zhuǎn)移至1.5mL滅菌EP管中，放入28°C溫箱中靜置培養(yǎng)Ih ;此時(shí)取出已經(jīng)在28°C溫箱中烘至表面半干的MD培養(yǎng)基平板(含有瓊脂粉，15g/L，10XYNB，100mL/L ；500X 生物素，2mL/L ；10X 葡萄糖，100mL/L)，在超凈工作臺(tái)內(nèi)將轉(zhuǎn)化液按300 μ L/板涂于培養(yǎng)基表面；將涂布好的MD平板置于29°C溫箱中正面放置烘至表面半干，然后倒置培養(yǎng)，2天以后觀察轉(zhuǎn)化子的生長(zhǎng)情況，生長(zhǎng)出的單克隆即為含有牛嗜中性粒細(xì)胞β -防御素4成熟肽(mBNBD4)的His+重組轉(zhuǎn)化子。
[0058]實(shí)施例4含有mBNBD4基因的畢赤酵母陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的篩選
[0059]1、G418抗性篩選(多拷貝轉(zhuǎn)化子篩選)
[0060]首先配置含有不同濃度(0.5、l、1.5、2.0、3.0、4.0mg/mL)G418(遺傳霉素)的YPD-G418固體培養(yǎng)基平板，然后進(jìn)行多拷貝轉(zhuǎn)化子篩選，具體步驟如下:
[0061]a:吸取l_2mL滅菌水至含有His+轉(zhuǎn)化子的平板上(即MD平板上)；
[0062]b:用滅菌刮子重懸His+轉(zhuǎn)化子,注意不要?jiǎng)澠骗傊澹?br> [0063]c:將細(xì)胞懸液集中轉(zhuǎn)移至滅菌的50mL離心管中，渦旋(5_10s)混勻細(xì)胞；
[0064]d:分光光度計(jì)測(cè)定細(xì)胞濃度(10D = 5X107細(xì)胞/mL)；
[0065]e:在每塊含有不同濃度G418的YPD平板上涂布約IO5個(gè)細(xì)胞，同時(shí)為了確定所得到的多拷貝轉(zhuǎn)化子是否占平板轉(zhuǎn)化子的1-10%，需要涂布不含G418的YPD平板作為對(duì)照；
[0066]f:28°C溫箱培養(yǎng)平板，每天檢查轉(zhuǎn)化子生長(zhǎng)情況。其中G418抗性克隆生長(zhǎng)較慢，一般5天左右出現(xiàn)，而不含G418的YPD平板上2天就會(huì)有克隆出現(xiàn)。在G418抗性YPD平板上生長(zhǎng)的單克隆即為His+多拷貝轉(zhuǎn)化子，且G418濃度越高，拷貝數(shù)也越多。(注意:如果此步驟中重懸下來(lái)的His+轉(zhuǎn)化子還有剩余，可加15%滅菌甘油，存于-70°C，可在以后繼續(xù)做G418抗性篩選。)
[0067]2、Mut+轉(zhuǎn)化子的篩選
[0068]為了確定His+多拷貝轉(zhuǎn)化子的甲醇誘導(dǎo)型，需進(jìn)行Mut篩選，具體操作如下:將上一步所得的His+多拷貝轉(zhuǎn)化子(G418抗性YH)板上的單克隆)編號(hào)后用滅菌牙簽挑取，放入20 μ L滅菌水中混勻，然后以點(diǎn)種方式分別接種于麗平板(含有瓊脂粉，15g/L，10XYNB,100mL/L ；500X 生物素，2mL/L ;5% 甲醇，100mL/L)及 MD 平板(含有瓊脂粉，15g/L，10XYNB，100mL/L ;500X 生物素，2mL/L ;10X 葡萄糖，100mL/L)上，此時(shí)確保先在 MM 平板上點(diǎn)，每個(gè)克隆需要換一次牙簽，每塊平板上點(diǎn)20-30個(gè)單克隆，28°C溫箱中培養(yǎng)平板2天。兩天后，計(jì)數(shù)平板，并比較單菌落在MM平板及MD平板上的生長(zhǎng)情況，其中在MD平板上和MM平板上生長(zhǎng)速度一致，大小也一致的單克隆即為Mut+轉(zhuǎn)化子。
[0069]3、畢赤酵母陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子(His+Mut+多拷貝轉(zhuǎn)化子)的PCR鑒定
[0070] 抽提含有牛嗜中性粒細(xì)胞β -防御素4成熟肽(mBNBD4)的畢赤酵母陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的基因組，并以其為模板，加入TransStart FastPfu DNA聚合酶、真核表達(dá)載體pPIC9K的通用引物5’ AOXl和3’ AOXl、以及5 ' AOXl和牛嗜中性粒細(xì)胞β -防御素4成熟肽(mBNBD4)基因的下游引物、2.5mM dNTPs進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，PCR反應(yīng)體系為:5XTransStartFastPfu buffer (10 μ L) ,2.5mM dNTPs (5 μ L)，濃度為 10 μ M 的真核表達(dá)載體 pPIC9K 的通用引物5，AOXl和3，A0X1、牛嗜中性粒細(xì)胞β -防御素4成熟肽(mBNBD4)基因下游引物(各I μ L)，模板為畢赤酵母陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的基因組DNA(2 μ L)，高壓滅菌ddH20(30 μ L)，TransStart FastPfu DNA 聚合酶(I μ L)，PCR 反應(yīng)條件依次為:95°C，Imin ；95°C,20sec,62°C，20sec, 72°C，30sec, 35cycles ；72°C, 5min。加入真核表達(dá)載體 pPIC9K 的通用引物擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，可見(jiàn)兩條條帶(500bp，2Kbp)，且含有重組質(zhì)粒pPIC9K-mBNBD4的酵母基因組擴(kuò)增條帶大于含有空質(zhì)粒pPIC9K的酵母基因組擴(kuò)增條帶(圖4)，說(shuō)明插入重組質(zhì)粒的完整性良好，且重組質(zhì)粒pPIC9K-mBNBD4已完全導(dǎo)入酵母基因組。加入真核表達(dá)載體PPIC9K通用引物的上游引物和牛嗜中性粒細(xì)胞β-防御素4成熟肽(mBNBD4)基因的下游引物擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)插入真核表達(dá)載體PPIC9K的酵母基因組并未擴(kuò)增出條帶，而插入重組質(zhì)粒pPIC9K-mBNBD4的酵母基因組卻可見(jiàn)一條特異性條帶，且大小與預(yù)期一致(圖5)，說(shuō)明篩選出的酵母菌株即為畢赤酵母陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子(His+Mut+多拷貝轉(zhuǎn)化子)菌株。
[0071]實(shí)施例5含有mBNBD4基因的畢赤酵母陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的體外誘導(dǎo)表達(dá)
[0072]1.陽(yáng)性酵母轉(zhuǎn)化子的體外誘導(dǎo)表達(dá) [0073]挑取PCR鑒定后證實(shí)已插入目的片段的His+Mut+酵母轉(zhuǎn)化子接種至5mL的YPD液體培養(yǎng)基中，28°C培養(yǎng)16-18h，離心棄上清，重懸菌體接種至25mL BMGY誘導(dǎo)表達(dá)前培養(yǎng)基中，BMGY 中包含酵母提取物(10g/L)、蛋白胨(20g/L)、K2HPO4(3g/L)、KH2PO4(I1.8g/L)、超純水(800mL/L)、10XYNB(100mL/L)、500ΧΒ(0.02%生物素)(lmL/L)、10%甘油(IOOmL/L)，28°C培養(yǎng)18-24h，至0D600nm達(dá)到2_6時(shí)離心棄上清，重懸菌體接種至200mL的BMGY誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)基中，BMMY中包含酵母提取物(10g/L)、蛋白胨(20g/L)、K2HPO4(3g/L)、KH2PO4 (I 1.8g/L)、超純水(800mL/L) UO X YNB (100mL/L)、500 X B (0.02% 生物素)(lmL/L)、5%甲醇(100mL/L)，28°C連續(xù)培養(yǎng)72h，培養(yǎng)過(guò)程中，每隔24h需補(bǔ)充甲醇使其終濃度為1%，培養(yǎng)72h后收集表達(dá)培養(yǎng)液，離心取上清，進(jìn)行Tricine-SDS-PAGE電泳分析。同時(shí)進(jìn)行空載體PPIC9K陽(yáng)性酵母轉(zhuǎn)化子的誘導(dǎo)表達(dá)，離心收集表達(dá)上清做為空白對(duì)照。結(jié)果顯示，與空載體對(duì)照相比，含有目的片段的酵母表達(dá)上清在7kD處有一特異性條帶，說(shuō)明有目的蛋白表達(dá)，如圖6所不。
[0074]2、重組蛋白的純化及鑒定
[0075]重組蛋白通過(guò)鎳柱(GE)進(jìn)行純化，經(jīng)過(guò)雙蒸水透析除鹽后，真空冷凍干燥濃縮，PBS溶解后進(jìn)行Western Blotting鑒定,結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有一條單一條帶,如圖7所示,說(shuō)明重組蛋白得到表達(dá)，即牛嗜中性粒細(xì)胞β -防御素4成熟肽蛋白。
[0076]實(shí)施例6初步抑菌活性試驗(yàn)
[0077]研究重組牛嗜中性粒細(xì)胞β -防御素4成熟肽(mBNBD4)對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抗菌活性，同時(shí)以GS115上清液，空質(zhì)粒誘導(dǎo)表達(dá)上清液作為對(duì)照，結(jié)果發(fā)現(xiàn)
0.5 μ g/mL、I μ g/mL和2 μ g/mL的重組牛嗜中性粒細(xì)胞β -防御素4成熟肽(mBNBD4)體外誘導(dǎo)表達(dá)發(fā)酵液對(duì)大腸桿菌和葡萄球菌均有較強(qiáng)的抑菌作用，且有劑量依賴(lài)性，如圖8所示。而對(duì)照組則并未觀察到抑菌圈，說(shuō)明抑菌活性主要?dú)w功于重組蛋白mBNBD4。
[0078]抗分枝桿菌試驗(yàn)(CFU)研究重組牛嗜中性粒細(xì)胞β -防御素4成熟肽(mBNBD4)對(duì)恥垢分支桿菌和牛分枝桿菌的抗菌活性，同時(shí)以不加蛋白孔作為對(duì)照，分別用不同濃度的重組牛嗜中性粒細(xì)胞防御素4成熟肽(mBNBD4)與恥垢分支桿菌和牛分枝桿菌共培養(yǎng)，培養(yǎng)3h、6h、9h、12h后涂板檢測(cè)恥垢分支桿菌的存活情況；培養(yǎng)3h、24h、48h、72h后涂板檢測(cè)牛分支桿菌的存活情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)純化后的重組蛋白mBNBD4對(duì)恥垢分支桿菌(圖9)和牛分枝桿菌(圖10)均有殺菌作用，且有劑量依賴(lài)性和時(shí)間依賴(lài)性。
[0079]雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明、【具體實(shí)施方式】及試驗(yàn)，對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。因此，在不偏離本發(fā)明 精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種真核表達(dá)載體，其特征在于，由含有牛β -防御素4成熟肽基因與真核表達(dá)載體PPIC9K構(gòu)建而成的pPIC9K-mBNBD4，所述牛β -防御素4成熟肽基因的核苷酸序列如SEQID NO:1 所示。
2.—種重組菌株，其特征在于，由權(quán)利要求1所述的真核表達(dá)載體pPIC9K-mBNBD4轉(zhuǎn)化畢赤酵母GSl 15構(gòu)建制成的重組菌株。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組菌株，其特征在于，所述菌株為巴斯德畢赤酵母Pichiapastoris，保藏編號(hào)為 CGMCC N0.8938。
4.一種牛β-防御素4成熟肽的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)牛β-防御素4成熟肽基因的制備:根據(jù)GenBank上公布的BNBD4的⑶S區(qū)域核苷酸序列人工合成mBNBD4基因，并設(shè)計(jì)PCR引物， mBNBD4的上游引物:
5' -GCCGAATTCCAAAGAGTAAGAAATCCTC-3'； mBNBD4的下游引物:
5' ~GCCGCGGCCG CCTAATGATGATGATGATGATGCCTCCTGCAGCATGGT~3/。 2)權(quán)利要求1所述的真核表達(dá)載體的構(gòu)建:雙酶切mBNBD4基因和真核表達(dá)載體PPIC9K，膠回收mBNBD4基因片段和開(kāi)環(huán)的真核表達(dá)載體pPIC9K，16°C連接處理16h，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌TOPlO感受態(tài)細(xì)胞，即完成重組質(zhì)粒pPIC9K-mBNBD4的構(gòu)建； 3)權(quán)利要求3所述重組菌株的制備:將重組質(zhì)粒pPIC9K-mBNBD4轉(zhuǎn)化到感受態(tài)GSl15中，篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，所得陽(yáng)性克隆即為能夠表達(dá)mBNBD4的畢赤酵母陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子菌株； 4)畢赤酵母陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子體外誘導(dǎo)表達(dá)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，步驟3)中所述篩選依次為His+多拷貝轉(zhuǎn)化子的篩選和Mut+轉(zhuǎn)化子的篩選。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的制備方法，其特征在于，所述步驟4)包括以下步驟: a、挑取PCR鑒定后證實(shí)已插入目的片段的His+、Mut+酵母轉(zhuǎn)化子接種至YPD液體培養(yǎng)基中，28°C培養(yǎng)16-18h，離心棄上清； b、重懸菌體接種至誘導(dǎo)表達(dá)前培養(yǎng)基BMGY中，28°C培養(yǎng)18_24h，至0D600nm達(dá)到2_6時(shí)離心棄上清； C、重懸菌體接種至誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)基BMMY中，28°C連續(xù)培養(yǎng)72h，培養(yǎng)72h后收集表達(dá)培養(yǎng)液，離心取上清，進(jìn)行Tricine-SDS-PAGE電泳分析，結(jié)果顯示，與空載體對(duì)照相比，含有目的片段的酵母表達(dá)上清在7kD處有一特異性條帶，說(shuō)明有目的蛋白表達(dá)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，誘導(dǎo)表達(dá)前培養(yǎng)基BMGY的配方為酵母提取物 10g/L、蛋白胨 20g/L、K2HPO4 3g/L、KH2PO4 11.8g/L、超純水 800mL/L、10XYNB100mL/L、0.02%生物素的 500XBlmL/L、10%甘油 100mL/L。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)基BMMY的配方為酵母提取物 10g/L、蛋白胨 20g/L、K2HP043g/L、KH2PO4 11.8g/L、超純水 800mL/L、10XYNB100mL/L、0.02%生物素的 500XBlmL/L、5% 甲醇 100mL/L。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述步驟c中，培養(yǎng)過(guò)程中每隔24h補(bǔ)充甲醇使其終濃度為I %。
10.一種由權(quán)利要求4-9所述制備方法制得的牛β -防御素4成熟肽在抗微生物感染中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12R1/84GK103981210SQ201410168749
【公開(kāi)日】2014年8月13日 申請(qǐng)日期:2014年4月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月24日
【發(fā)明者】周向梅, 趙德明, 康靜靜, 呂悅, 楊利峰, 尹曉敏 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)