專(zhuān)利名稱(chēng)：：鼠β-防御素1的重組質(zhì)粒、多肽及其用途與制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及重組鼠e-防御素i的重組質(zhì)粒、多肽及其用途與制備方法。
背景技術(shù)：
：e-防御素是近幾年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)廣泛存在于動(dòng)物體內(nèi)具有廣泛抗微生物活性的陽(yáng)離子多肽，主要分布在上皮細(xì)胞中，包括皮膚、呼吸道、尿道、腸道和口腔粘膜上皮細(xì)胞等。通過(guò)基因組學(xué)分析，已發(fā)現(xiàn)了29種編碼e-防御素的基因(Z￡F5)，己經(jīng)克隆的有人防御素(hBD)1-5,6和鼠e-防御素(mBD)1-8,12，29。研究發(fā)現(xiàn)，鼠e-防御素1基因(/ffl^-7)(來(lái)自GenBank，#AA065510)上游序列中缺乏NF-kB、IL-6和STAT等的結(jié)合位點(diǎn)，不能受LPS和促炎細(xì)胞因子誘導(dǎo)表達(dá)，屬于固有性表達(dá)。目前，國(guó)內(nèi)外e-防御素的制備以合成為主，造價(jià)昂貴且不能保證多肽的生物學(xué)活性。流行性感冒病毒(influenzavirus,簡(jiǎn)稱(chēng)流感病毒)是流行性感冒(influenza,簡(jiǎn)稱(chēng)流感)的病原體。流感一直是人類(lèi)急性呼吸道傳染病的主要疾病之一，20世紀(jì)發(fā)生的4次全球性流感大流行給個(gè)人和社會(huì)造成無(wú)法估量的損失。而從1997年至今禽流感的肆虐更給人們敲醒了警鐘。世界衛(wèi)生組織(WHO)警告，一場(chǎng)全球性的流感大流行將會(huì)導(dǎo)致200萬(wàn)-700萬(wàn)人喪命。最近幾年高致病性禽流感(Avianinfluenza)在亞洲肆虐之后，以十分驚人速度在世界傳播，蔓延至歐洲諸國(guó)，導(dǎo)致暴發(fā)地區(qū)蒙受巨大經(jīng)濟(jì)損失。目前治療流感有四種抗病毒藥物，但世衛(wèi)組織披露流感病毒(H1N1)在18個(gè)國(guó)家已發(fā)現(xiàn)突變體，可以抵制最好的抗病毒藥物達(dá)菲(Tamiflu)的作用。流感病毒容易突變，流感疫苗的制備非常耗費(fèi)時(shí)間，而且流感疫苗的開(kāi)發(fā)速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)跟不上流感病毒易突變發(fā)生的步伐。因此，不斷開(kāi)發(fā)新型的抗流感藥物勢(shì)在必行。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供制備重組鼠e-防御素i多肽的新方法，并證明鼠防御素i多肽對(duì)流行性感冒病毒具有抑制作用，以便開(kāi)發(fā)出一類(lèi)治療或預(yù)防流行性感冒的新型藥物。本發(fā)明所述重組鼠P-防御素1基因(/zz^-7)巳在GenBank注冊(cè)，注冊(cè)號(hào)AA065510,其cDNA堿基序列如序列表中SEQIDNO.1所述。本發(fā)明所述重組鼠0-防御素l多肽(mBD-l)，其制備方法為由序列表中SEQIDno.i所述的鼠e-防御素i基因與原核載體構(gòu)建原核重組質(zhì)粒，再將原核重組質(zhì)粒在工程菌中表達(dá)、分離純化，并采用腸激酶酶切，具體步驟依次如下(1)通過(guò)RT-PCR反應(yīng)，獲得/fflZ-7基因；(2)將上述擴(kuò)增的頂^-/基因片段插入到原核載體構(gòu)建原核重組質(zhì)粒，再將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至感受態(tài)細(xì)菌中進(jìn)行培養(yǎng)，然后篩選出含有正確插入片段的克??；(3)利用PCR擴(kuò)增和限制性內(nèi)切酶酶切圖譜分析重組質(zhì)粒，并進(jìn)行DNA序列分析；(4)將正確克隆原核重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入工程菌中進(jìn)行表達(dá)，分離純化表達(dá)的多肽即獲得重組鼠e-防御素i多肽；(5)采用sodiumdodecylsulfatepolyacrylamidegelelectrophoresis(SDS-PAGE)和Westernblot鑒定重組鼠p-防御素l多肽的正確性；(6)采用腸激酶酶切釋放出成熟有活性的重組鼠e-防御素1多肽。原核載體為pGEX-4T-1、pGEX-4T、pET32a(+)中的一種。本發(fā)明所述重組鼠0-防御素1多肽(mBD-1)，還可以由序列表中SEQIDNO.1所述的鼠P-防御素l基因與真核載體構(gòu)建真核重組質(zhì)粒，將真核重組質(zhì)粒在細(xì)胞中表達(dá)獲得，制備真核重組質(zhì)粒的具體步驟依次如下(1)通過(guò)RT-PCR反應(yīng)，獲得;z^Z-/基因；(2)將上述擴(kuò)增的/^"-/基因片段插入到真核載體構(gòu)建真核重組質(zhì)粒，再將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至感受態(tài)細(xì)菌中進(jìn)行培養(yǎng)，然后篩選出含有正確插入片段的克隆；(3)利用PCR擴(kuò)增和限制性內(nèi)切酶酶切圖譜分析重組質(zhì)粒，并進(jìn)行DNA序列分析。真核載體為pIRES2-EGFP、pcDNA3.1/mys-HisA、pcDNA3.1(+)中的一種。本發(fā)明通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明重組鼠g-防御素1多肽(mBD-1)可以直接抑制流感病毒包膜與宿主細(xì)胞膜的融合；具有趨化中性粒細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞到炎癥部位，提高CD8+T細(xì)胞參與調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的特性(見(jiàn)實(shí)施例3及圖14);raBD-l成熟肽對(duì)流感病毒攻擊的小鼠很好的發(fā)揮了其抗病毒作用，減弱了肺部受損傷的程度，與對(duì)照組相比，提高了生存率(見(jiàn)實(shí)施例4及圖16-17)。病理切片顯示，治療組與未治療組比較，治療組無(wú)明顯病理改變，未治療組可見(jiàn)肺間質(zhì)性充血水腫，有較多淋巴細(xì)胞，單核細(xì)胞浸潤(rùn)，致使肺泡間隔明顯增寬，肺泡壁組織發(fā)生變性壞死，(見(jiàn)實(shí)施例4及圖15)。綜上所述，重組鼠e-防御素l多肽(mBD-l)具有臨床應(yīng)用前景，可在研制治療或預(yù)防流行性感冒病毒所致疾病的新型藥物中應(yīng)用。本發(fā)明具有以下有益效果1、由于重組鼠0-防御素l多肽(mBD-1)抗流感病毒可直接抑制流感病毒包膜與宿主細(xì)胞膜的融合，使得流感病毒不能產(chǎn)生抗藥性，因而比其它抗流感病毒藥物具有更大的優(yōu)越性，為流感的治療提供了一類(lèi)療效好的新藥品。2、實(shí)驗(yàn)表明，重組鼠P-防御素1多肽能直接阻斷流感病毒對(duì)呼吸系統(tǒng)細(xì)胞的吸附，具有直接的抗流感病毒活性；具有趨化中性粒細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞到炎癥部位，提高CD8+T細(xì)胞參與調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的特性。3、本發(fā)明所提供的重組鼠防御素1多肽的制備方法不僅易于獲得純度高的產(chǎn)品，而且相對(duì)于現(xiàn)有的合成方法可縮短制備時(shí)間，降低成本，有利于工業(yè)化生產(chǎn)。圖1為本發(fā)明所述鼠3-防御素1的原核載體pET32a(+)的結(jié)構(gòu)示意圖。圖2為本發(fā)明所述鼠防御素l的原核重組質(zhì)粒pET32a(+)/mBDl的結(jié)構(gòu)示意圖。圖3為本發(fā)明所述鼠e-防御素1的真核載體pcDNA3.1(+)的結(jié)構(gòu)示意圖。圖4為本發(fā)明所述鼠3-防御素1的真核重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/mBDl的結(jié)構(gòu)示意圖。圖5為本發(fā)明所述鼠防御素1的原核重組質(zhì)粒pET32a(+)/mBDl的測(cè)序圖。圖6為本發(fā)明所述鼠e-防御素1的真核重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/mBDl的測(cè)序圖。圖7為本發(fā)明所述鼠e-防御素1的cDNA序列和多肽序列，圖中，cDNA序列中的139-252為原核重組質(zhì)粒所含序列，其對(duì)應(yīng)的下劃線部分為mBD-l成熟肽序列；cDNA序列中的43-252為真核重組質(zhì)粒所含序列，其對(duì)應(yīng)部分包括mBD-1的前信號(hào)肽和成熟肽序列。圖8為原核重組質(zhì)粒pET32a(+)/mBDl的酶切鑒定圖譜。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，在約150bp處出現(xiàn)一條條帶，與預(yù)期產(chǎn)物大小相符，圖中泳道2為陰性對(duì)照；泳道3為pET32a(+)質(zhì)粒；泳道4為pET32a(+)/mBDl質(zhì)粒A^/I和J力ol雙酶切產(chǎn)物；泳道l、5為DNAMarkerDL2000,人-EC0T14IDigestionMarker。圖9為真核重組質(zhì)粒pcDNA3.l(+)/mBDl的酶切鑒定圖譜。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，在約230bp處出現(xiàn)一條條帶，與預(yù)期產(chǎn)物大小相符，圖中泳道2為pcDNA3.1(+)真核載體；泳道3為pcDNA3.1(+)/mBDl質(zhì)粒I和J力oI雙酶切產(chǎn)物；泳道1，4為DNAMarkerDL2000，入-EC0T141DigestionMarker。圖10為純化的融合蛋白TrxA-mBDl及用腸激酶酶切釋放成熟肽mBD-1的SDS-PAGE電泳結(jié)果圖，在21.2kDa處出現(xiàn)一條條帶，與預(yù)期融合蛋白的分子量相符，表明融合蛋白誘導(dǎo)成功；在4.07kDa處有一條條帶，與成熟肽mBD-1的分子量相符，表明腸激酶很好切開(kāi)了融合蛋白并完全釋放出成熟肽mBD-1;圖中，泳道1為純化的融合蛋白TrxA-mBDl，泳道3為超濾純化的mBD-1，泳道4為腸激酶切TrxA-mBDl后混合物，泳道5為腸激酶切TrxA-mBDl穿柱液，泳道2、6為超低分子量蛋白Marker。圖11為Western-blot鑒定圖，在21.2kDa處有融合蛋白的目的條帶，在4.07kDa處有成熟mBD-1多肽的目的條帶，表明成功獲得了融合蛋白TrxA-mBDl和成熟mBD-1多肽；泳道l為融合蛋白TrxA-mBDl，泳道3為成熟mBD-1多肽，泳道2為超低分子量蛋白Marker。圖12為真核重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/mBDl在MDCK細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)的免疫熒光鑒定圖，放大倍數(shù)X200，圖中，A為轉(zhuǎn)染pcDNA3.l(+)/mBDl質(zhì)粒的MDCK光學(xué)片，B為轉(zhuǎn)染pcDNA3.l(+)/mBDl質(zhì)粒的MDCK熒光片，C為轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)真核載體的MDCK光學(xué)片，D為轉(zhuǎn)染pcDNA3，1(+)真核載體的MDCK熒光片。圖13為細(xì)胞上清流感病毒滴度比較圖，圖中，A為MDCK細(xì)胞，B為MDCK/pcDNA，C為MDCK/mBDl。圖14為CD8+T呢細(xì)胞的比較圖，圖中，A為PBS對(duì)照組(病毒攻擊和未攻擊)，B為真核載體pcDNA3.1(+)組(病毒攻擊和未攻擊)，C為真核重組質(zhì)粒pCDNA3.l(+)/raBDl(病毒攻擊和未攻擊)。圖15為小鼠肺部病理切片(HE染色)圖，圖中，A為mBD-1高劑量組；B為病毒唑組；C為mBD-1變性蛋白組；D為PBS對(duì)照組。圖16為肺指數(shù)抑制率比較圖，圖中，A為mBD-1變性蛋白組，B為mBD-1低劑量組；C為mBD-1中劑量組，D為mBD-1高劑量組，E為病毒唑組。圖17為小鼠的生存率比較圖，圖中，A為病毒唑組，B為mBD-1高劑量組，C為mBD-1中劑量組，D為mBD-1低劑量組，E為mBD-1變性蛋白組，F(xiàn)為PBS對(duì)照組。具體實(shí)施例方式實(shí)施例l:重組鼠e-防御素l多肽(mBD-1)的制備1、獲取小鼠/n5Z-7基因(1)用Trizol試劑(購(gòu)自Invitrogen公司)按以下步驟提取小鼠肺總RNA1)無(wú)菌條件下取小鼠肺組織100mg。2)力卩l(xiāng)mlTrizol。3)勻漿(要徹底，后轉(zhuǎn)至EP管，組織勻漿量〉100mg時(shí)分裝，lml/每EP管)。4)顛倒混勻10下，室溫靜置5min。5)加氯仿l/5體積(0.2ml)(必須按總體積的1/5)。6)顛倒混勻10下，室溫靜置5min。7)4°C，離心12000g，15min。8)轉(zhuǎn)上層水相(約400ul)于另一1.5mlEP管中。9)加等體積異丙醇(約400ixl)，混勻室溫靜置10rain。10)4'C，離心12000g，10min。11)棄上清。12)加冰預(yù)冷的75%乙醇lml，用二乙基焦磷酰胺(diethylpyrocarbonate，DEPC)水配。13)4°C，離心7500g，5min。14)棄上清，超凈臺(tái)內(nèi)空氣干燥5-10min(不能完全干燥)。15)溶于DEPC水中至20u1(10u1-20ul,可在55-60。C水中，〈10min助溶)。(2)單鏈cDNA的合成1)在冰上預(yù)混下列溶液，充分混勻并高速離心35s后將反應(yīng)物置PCR儀中，70。C孵育5min;試劑體積(叱)總腿201igo(dT)18primer(0.5Pg/J11)1DEPC-treatedwater92)從PCR儀中取出反應(yīng)物，置冰上冷卻，離心3~5s;3)再依次加入下列溶液，充分混勻并離心35s，將反應(yīng)物置PCR儀中，37'C孵育5min;<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>4)于冰盒上給反應(yīng)管內(nèi)加反轉(zhuǎn)錄酶1叱，充分混勻并離心35s，將反應(yīng)物置PCR儀42。C孵育60min、70。C孵育10min;5)從PCR儀中取出反應(yīng)物，置冰上冷卻，離心35s，收集反應(yīng)液待用。(3)cDNA的PCR反應(yīng)1)反應(yīng)體系如下<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>2)PCR擴(kuò)增引物上游引物5，-gcgggtaccgacgacgacgacaagGATCAATACAAATGCCTTC-3，(5'端設(shè)有A^2l酶切位點(diǎn)，并在酶切位點(diǎn)后加上了編碼腸激酶的序列及保護(hù)堿基下游引物5，-gcgetcgagTCAGCTCTTACAACAGTTGGGCT-3，(5，端設(shè)有iTwI酶切位點(diǎn)加保護(hù)堿基，含終止密碼子TGA)3)PCR反應(yīng)條件94。C預(yù)變性4min，94。C變性30s、58。C復(fù)性40s、72。C延伸40s，30個(gè)循環(huán)，72°C延伸10min。(4)擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析2、原核載體的預(yù)處理原核載體選用pET32a(+)(Novagen公司)(1)用限制性內(nèi)切酶^/7I及X力oI雙酶切原核載體pET32a(+)(見(jiàn)圖1)，反應(yīng)體積20nl(其中含有I酶1^1、J力oI酶lpl、10XMbuffer22^1、pET32a(+)原核載體DNA10^1、ddH206pl)，37。C過(guò)夜(限制性內(nèi)切酶均購(gòu)自TaKaRa公司)；(2)反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)的紫外燈下，按膠回收試劑盒(購(gòu)自O(shè)mega公司)的說(shuō)明回收大片段。3、/^"-/基因與1^732&(+)原核載體的連接及轉(zhuǎn)化(1)將上述步驟中所獲得的載體片段及插入片段粗略定量后，按插入片段載體分子摩爾比=13:1的連接反應(yīng)原則進(jìn)行連接實(shí)驗(yàn)；(2)反應(yīng)體系如下，整個(gè)反應(yīng)過(guò)程在T4DNA連接酶(購(gòu)自TaKaRa公司)作用下在PCR儀中16。C反應(yīng)過(guò)夜。連接反應(yīng)時(shí)應(yīng)分別設(shè)立無(wú)插入片段和無(wú)載體的對(duì)照管。使上述擴(kuò)增的基因片段插入到pET32a(+)原核載體中，所構(gòu)建的重組原核質(zhì)粒pET32a(+)/mBDl見(jiàn)圖2。試劑體積(pi)ddH20810Xbuffer2譜-7DNA6pET32a(+)原核載體DNA2T棚Aligase2TotalVolume20(3)將連接產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109(Takara公司)的感受態(tài)細(xì)胞(按《分子克隆操作指南》自制)。連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化方法主要步驟如下1)取連接產(chǎn)物8ul加入感受態(tài)細(xì)胞50ul置于1.5mlEp管中，陰性對(duì)照為感受態(tài)細(xì)胞50ul置于1.5mlEp管中。2)置于冰上30min。3)42。C循環(huán)水浴90s。4)快速將管轉(zhuǎn)至冰浴中，冷卻l-2min。5)加0.3mlS0C培養(yǎng)基(10mlS0C+50ul2mol/LMgCl2)，置于冰上。6)37°C，50rpm振搖lh。7)取50y1轉(zhuǎn)化細(xì)胞+5n10.lg/mlAmp，均勻涂布于含Amp的平板，置37。C孵箱培養(yǎng)過(guò)夜。4、PCR擴(kuò)增和限制性內(nèi)切酶酶切圖譜分析重組質(zhì)粒，并進(jìn)行DNA序列分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物獲得大小約150bp(理論值141bp)的目的條帶；原核重組質(zhì)粒(pET32a(+)/mBDl)酶切鑒定結(jié)果見(jiàn)圖8,圖8顯示，在約150bp處出現(xiàn)一條條帶，與預(yù)期產(chǎn)物大小相符；原核重組質(zhì)粒測(cè)序(上海英俊公司)結(jié)果見(jiàn)圖5，圖5表明，所構(gòu)建的原核表達(dá)質(zhì)粒不僅含有完整的/^"-7序列，而且閱讀框架也正確無(wú)誤，目的序列測(cè)序結(jié)果提交GenBank進(jìn)行核酸BLAST比對(duì)，結(jié)果顯示所克隆的m^Z-7基因與本實(shí)施例引物設(shè)計(jì)所用的//7^-/基因序列完全相同，沒(méi)有堿基突變，原核重組質(zhì)粒中所含堿基序列如SEQIDNO.1所述。5、重組原核mBD-1融合蛋白(TrxA-mBDl)的誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定將鑒定正確的原核重組質(zhì)粒pET32a(+)/mBDl轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)菌株(Novagen公司)，即重組菌為BL21(DE3)/pET32a/mBDl，異丙基P硫代半乳糖(IPTG)誘導(dǎo)重組質(zhì)粒的表達(dá)采用優(yōu)化條件2XYT(胰化蛋白胨16g/l,酵母提取物10g/l，NaCl5g/l)培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為34'C,在菌體對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期添加終濃度為的0.4raMIPTG,誘導(dǎo)后6h表達(dá)終止發(fā)酵。SDS-PAGE、Western-blot鑒定pET32a-mBDl融合蛋白的表達(dá)情況。將變性后的蛋白質(zhì)marker和重組mBD-1多肽在5%的濃縮膠和15%的分離膠中進(jìn)行SDS-PAGE電泳。電泳完備后，進(jìn)行Western-blot鑒定，將凝膠上的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上，電轉(zhuǎn)移后的膜用封閉液(約5%的PBST脫脂奶粉)室溫?fù)u床震搖封閉處理lh;再加入mBD-1多克隆抗體(兔抗-mBDl，Santa公司產(chǎn)品)應(yīng)用液，4'C過(guò)夜；充分洗滌后再加入酶標(biāo)二抗(羊抗兔IgG)，室溫?fù)u床震搖作用lh;充分洗滌后加底物顯色。Western-blot鑒定結(jié)果見(jiàn)圖11，圖11顯示，pET32a-mBDl融合蛋白分子質(zhì)量約21.2kD，表明成功獲得了融合蛋白TrxA-mBDl。6、融合蛋白TrxA-mBDl的純化原核載體pET-32a(+)N端帶有6個(gè)連續(xù)組氨酸殘基(6XHisTag)的識(shí)別位點(diǎn)，所表達(dá)的融合蛋白可以用金屬螯合親和層析方法純化，并且洗脫后仍能保持其活性，所以采用鎳離子親和層析柱純化融合蛋白。具體步驟如下(1)重組菌BL21(DE3)/pET32/mBDl菌體超聲破碎(功率:300W;超聲時(shí)間5s;間隔時(shí)間5S;工作次數(shù)20次；冰浴10min;重復(fù)4次)，離心收集可溶蛋白；(2)融合蛋白的純化用HisTrapFFCrude純化柱(GE公司)和AKTApurifier蛋白純化儀(B0X-900)，采用親和層析從中分離目標(biāo)融合蛋白。先將親和柱用30mM咪唑平衡液平衡，至基線走平約3CV后，lml/min進(jìn)樣可溶蛋白進(jìn)行吸附，再用平衡液(30mM咪唑)洗柱子約3CV后，用洗脫液(300mM咪唑)進(jìn)行洗脫，收集被洗脫的目標(biāo)蛋白(TrxA-mBDl)。將收集的樣品在5%的濃縮膠和15%的分離膠中進(jìn)行SDS-PAGE分析，電泳結(jié)果見(jiàn)圖IO，圖10顯示，在21.2kDa處出現(xiàn)一條條帶，與預(yù)期融合蛋白的分子量相符。7、成熟raBD-1多肽的釋放以TrxA-mBDl為底物(100ug/ml)，加入6His純化標(biāo)簽?zāi)c激酶(廣東中大南海海洋生物公司)。酶切條件25°C，20MmTris-HCL，100MmNaCL，pH8.0，16h。以SDS-PAGE電泳酶切產(chǎn)物，酶切結(jié)果見(jiàn)圖IO，圖10顯示，在約4.OkDa處有一條條帶，與成熟肽mBD-l的分子量(理論值4.07KD)相符，表明腸激酶很好切開(kāi)了TrxA-mBDl融合蛋白并完全釋放出成熟的mBD-l多肽。成熟mBD-1多肽的序列見(jiàn)圖7中的下劃線部分。實(shí)施例2:小鼠3-防御素l(mBD-l)真核重組質(zhì)粒的構(gòu)建1、獲取小鼠iH5Z-7基因與實(shí)施例1的操作相同。與實(shí)施例1的不同點(diǎn)是PCR擴(kuò)增引物及酶切位點(diǎn)。上游引物5'-GCGGMTTCATGAAAACTCATTACTTTCTCCTGG-3'(5'端設(shè)有I酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基)下游引物5'-GCGCTCGAGTCAGCTCTTACAACAGTTGGGCT-3，(5'端設(shè)有J力oI酶切位點(diǎn)加保護(hù)堿基，含終止密碼子TGA)2、真核載體的預(yù)處理真核載體選用pCDNA3.1(+)(購(gòu)自Invitrogen公司)(1)用限制性內(nèi)切酶fcMI及J力oI雙酶切真核載體pcDNA3.1(+)，反應(yīng)體積20pl(其中含有￡C0/PI酶lpl、勘I酶lpl、10XMbuffers2pl、pcDNA3.1(+)真核載體lOpl、ddH206pl)，37。C過(guò)夜；(2)反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)的紫外燈下，按膠回收試劑盒的說(shuō)明書(shū)操作回收大片段。3、/^Z-7基因與pCDNA3.1(+)真核載體的連接及轉(zhuǎn)化(1)反應(yīng)體系如下試齊!j體積(pi)ddH20810Xbuffer2譜-7腿6pCDNA3.1(+)真核載體DNA2T4匿ligase2TotalVolume20(2)將連接產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109的感受態(tài)細(xì)胞，步驟同原核重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化。4、PCR擴(kuò)增和限制性內(nèi)切酶酶切圖譜分析重組質(zhì)粒，并進(jìn)行DNA序列分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物獲得大小約230bp的目的條帶；重組質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果見(jiàn)圖9，圖9顯示，在約230bp處出現(xiàn)一條帶，與預(yù)期產(chǎn)物大小相符(理論值228bp);重組質(zhì)粒測(cè)序(上海英俊公司)結(jié)果見(jiàn)圖6。圖6表明所構(gòu)建的真核重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/mBDl不僅含有歷A"-7序列，而且閱讀框架也正確無(wú)誤，目的序列測(cè)序結(jié)果提交GenBank進(jìn)行核酸BLAST比對(duì)，結(jié)果顯示所克隆的7基因與本實(shí)施例引物設(shè)計(jì)所用的/z^Z-7基因序列完全相同，沒(méi)有堿基突變，真核重組質(zhì)粒中所含堿基序列如SEQIDNO.l所述。5、真核重組質(zhì)粒在MDCK(犬腎細(xì)胞)中的表達(dá)(1)在轉(zhuǎn)染前24h，將MDCK細(xì)胞(北京博大泰克公司)接種于六孔培養(yǎng)板中，每孔細(xì)胞約1X106，置于37'C5%C02孵箱培養(yǎng)。(2)待細(xì)胞長(zhǎng)滿至約80-90%融合后，分別以pcDNA3.1(+)真核載體、pcDNA3.1(+)/mBDl真核重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染犬腎細(xì)胞MDCK,具體操作按Wisegen公司GenEscortI基因轉(zhuǎn)染試劑盒中的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。(3)對(duì)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞按每孔600ug/mL的G418進(jìn)行穩(wěn)定篩選，直到未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的MDCK細(xì)胞全部死亡。以濃度400ug/mLG4l8繼續(xù)維持培養(yǎng)30d。將篩選出的陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，獲得穩(wěn)定表達(dá)pcDNA3.1(+)/mBDl、pcDNA3.1(+)細(xì)胞株，依次命名為MDCK/mBDl、MDCK/pcDNA，并對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行凍存和免疫熒光法鑒定。鑒定結(jié)果見(jiàn)圖12，鑒定結(jié)果顯示經(jīng)免疫熒光染色后在倒置熒光顯微鏡下可觀察到重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞有較強(qiáng)的紅色熒光，而對(duì)照組均未見(jiàn)有紅色熒光出現(xiàn)，證實(shí)穩(wěn)定篩選得到的MDCK/mBDl細(xì)胞株含有y^Z-7基因，并能正確表達(dá)。實(shí)施例3:體外抗流感病毒實(shí)驗(yàn)1、流感病毒TCID50的測(cè)定流感病毒選用A/PR/8/34株(HlNl)，由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制研究所國(guó)家流感中心提供。(1)于感染病毒前，將培養(yǎng)瓶中的MDCK細(xì)胞用0.25%的胰酶消化，分至24孔板中，用含10%小牛血清及抗生素的生長(zhǎng)液培養(yǎng)成單層細(xì)胞。(2)將制備好的流感病毒懸液用無(wú)菌PBS作系列10倍稀釋準(zhǔn)備感染MDCK細(xì)胞。(3)將24孔板中的生長(zhǎng)液吸出，用無(wú)菌PBS沖洗兩次，盡量除去牛血清，因牛血清中含有流感病毒的非特異性抑制素，會(huì)影響流感病毒的復(fù)制。(4)滴加稀釋病毒于細(xì)胞表面，輕輕晃動(dòng)平板使加入的病毒溶液均勻地鋪在細(xì)胞表面上。每個(gè)稀釋度做四個(gè)復(fù)孔，每孔滴加病毒約50uL。(5)將感染細(xì)胞置于5%0)2培養(yǎng)箱中。37。C培養(yǎng)48h后，觀察細(xì)胞病變。以引起細(xì)胞病變的最低稀釋度計(jì)算出每個(gè)樣本的病毒滴度，以TCID50表示(郭元吉，《流行性感冒病毒及其實(shí)驗(yàn)技術(shù)》)。TCID50的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。表1TCID50的測(cè)定結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><formula>formulaseeoriginaldocumentpage14</formula>TCID5(^高于50%死亡的病毒最高稀釋度的對(duì)數(shù)+距離比例=4+0.767=4.7672、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染MDCK/mBDl細(xì)胞的抗流感病毒感染(1)分別培養(yǎng)MDCK/mBDl(實(shí)施例2制備)、MDCK/pcDNA(實(shí)施例2制備)、MDCK，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)7080%瓶底面積時(shí)，棄培養(yǎng)液。(2)每種細(xì)胞做四個(gè)復(fù)？L，每孔加入lOOu110TCID50流感病毒。感染培養(yǎng)基(無(wú)血清DMEM，0.3%牛血清白蛋白，10mMH印es，100u/ml青霉素，100Pg/ml鏈霉素)，室溫孵育lh。(3)每孔加入含4ug/ml胰酶的感染培養(yǎng)基，37'C，5XC02培養(yǎng)48h。(4)在倒置顯微鏡下觀察各孔MDCK細(xì)胞感染情況。(5)用高壓滅菌的EP管分別收集各孔培養(yǎng)液，再分別進(jìn)行血凝實(shí)驗(yàn)(操作見(jiàn)表2)，檢測(cè)各孔細(xì)胞培養(yǎng)液中流感病毒滴度，病毒滴度的倒數(shù)值取lg見(jiàn)表3并以表3中的數(shù)據(jù)作圖(見(jiàn)圖13)。數(shù)據(jù)用ANOVA統(tǒng)計(jì)，計(jì)算P值，以a=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。表2流感病毒的血凝試驗(yàn)<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>表3細(xì)胞上清病毒滴度倒數(shù)的lg(7)比較<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>用單因素方差統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析可知，MDCK/mBDl與MDCK/pcDNA及MDCK細(xì)胞比較有顯著性差異，而MDCK/pcDNA與MDCK細(xì)胞之間比較無(wú)差異。表明MDCK/mBDl具有抗流感病毒的作用，見(jiàn)圖13。3、流式細(xì)胞儀測(cè)定CD8+T細(xì)胞選取1618g雌性BALB/c小鼠(SPF級(jí)，四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，用真核重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/mBDl免疫共接種2次，間隔2周，雙側(cè)股四頭肌注射pcDNA3.1(+)/mBDl質(zhì)粒，每側(cè)50uL(1ug/"L)，共100PL，同時(shí)設(shè)真核載體pcDNA3.1(+)組及PBS對(duì)照組，每組10只。(1)細(xì)胞的準(zhǔn)備采用密度梯度離心法提取小鼠的脾細(xì)胞(1)無(wú)菌取脾臟，至200目不銹鋼網(wǎng)上邊研磨邊加2－3ml冷PBS沖洗；(2)取2mlNycoPrepTM分離液(Oslo,Norway,Axis-Shield公司)，將2－3ml脾細(xì)胞懸液緩慢小心的加到NycoPrepTM1.077A分離液上；(3)室溫2000rpm，離心20min；(4)小心吸取中間白膜層，冷PBS1800rpm離心，洗1－2遍；(5)將細(xì)胞懸起，用RPMI1640將容積恢復(fù)至1ml.計(jì)數(shù)細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度5×106/ml。(2)流式細(xì)胞儀器測(cè)定對(duì)免疫細(xì)胞的影響按BDPharmingen公司的CD8＋T間接標(biāo)記染色方案操作，流式細(xì)胞儀(BDFACSAria)檢測(cè)并記錄結(jié)果，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表4，表5表4各組CD8＋T％均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>表5CD8＋T％3×2析因設(shè)計(jì)方差分析表<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>析因設(shè)計(jì)方差分析表明重組質(zhì)粒pCDNA3.1(+)/mBD1組與空質(zhì)粒pCDNA3.1(+)組，PBS組比較CD8＋T％細(xì)胞數(shù)目，P<0.01,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而空質(zhì)粒pCDNA3.1(+)組與PBS組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明pCDNA3.1(+)/mBD1免疫的動(dòng)物有提高CD8＋T細(xì)胞參與調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的特征，見(jiàn)圖14.實(shí)驗(yàn)例4小鼠體內(nèi)抗流感病毒實(shí)驗(yàn)1、小鼠分組病毒攻擊與mBDl多肽的治療(1)A/PR/8/34(HlNl)對(duì)BALB/c小鼠的半數(shù)致死量(LDs。)測(cè)定(金奇主編，《醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)》)取出流感病毒A/PR/8/34株(H1N1)培養(yǎng)液，用滅菌PBS將病毒從l(T開(kāi)始連續(xù)10倍稀釋至10—8，冰浴待用。選取1618g雌性BALB/c小鼠，每組6只，每個(gè)稀釋度為一組，共8組48只。用乙醚使小鼠全身麻醉后，每只小鼠滴鼻20uL相應(yīng)的流感病毒稀釋液。接種流感病毒后，觀察并記錄小鼠死亡情況。凡在實(shí)驗(yàn)的第一個(gè)24h內(nèi)死亡的為非特異性死亡，不予統(tǒng)計(jì)。每天觀察，直至感染后21d，計(jì)算死亡百分率和LD50,其結(jié)果見(jiàn)表6。表6LD50的測(cè)定結(jié)果病毒稀釋度接種數(shù)活鼠死鼠累計(jì)數(shù)死亡比死亡率(％)活鼠死鼠10—'61511616/1794.1210-262431111/1478.5710-3624577/1258.3310—4633833/1127.2710—56601400/1401066602000/200io-76602600/26010-86603200/320距離比例=_高于濕死亡的百分?jǐn)?shù)一50-=58.33一5()=0.27高于50%死亡的百分?jǐn)?shù)-低于50%死亡的百分?jǐn)?shù)58.33-27.27LD5(^高于50%死亡的病毒最高稀釋度的對(duì)數(shù)+距離比例=3+0.27=3.27，即將所用的病毒懸液稀釋成10—327時(shí)，可使小鼠鼻腔內(nèi)滴入后有50%的死亡。(2)攻擊與治療實(shí)驗(yàn)BALB/c雌性小鼠，1618g，70只，隨機(jī)分為mBD-1多肽高劑量組(330Pg/只)，中劑量組(165Pg/只)，低劑量組(55Pg/只)，病毒唑治療組(1.5rag/只)，陰性對(duì)照組(變性的mBD-l(330Pg/只)，處理方法為加入終濃度20%的e-巰基乙醇，搖動(dòng)lh，超濾)，PBS空白對(duì)照組以及高劑量(330Pg/只)不被流感病毒攻擊組(用于檢測(cè)重組mBD-l多肽是否有致敏反應(yīng))，每組10只。mBD-l多肽為實(shí)施例l制備的成熟多肽。各組動(dòng)物用20XLD50A/PR/8/34(H1N1)病毒懸液通過(guò)滴鼻法攻擊小鼠(50ii1/只)。2h后腹腔注射高、中、低劑量mBD-l多肽，變性的mBD-l多肽及病毒唑，12h補(bǔ)加一次，共治療7天。2、治療效果檢測(cè)(1)肺部病毒滴度檢測(cè)①肺的采集于病毒攻擊后第3d，將隨機(jī)選取的4只動(dòng)物眼球采血放血后，頸椎脫臼處死小鼠。將鼠浸入消毒液(3%來(lái)蘇兒或1%。新潔爾滅)內(nèi)消毒510min。取出用大頭針固定在小塊木板上，腹部朝上，用碘酒消毒胸、腹部皮膚。在無(wú)菌條件下，用無(wú)菌小鑷子將腹部皮膚夾起，用消毒剪剪開(kāi)皮膚至頸部，鈍性剝離皮下組織與肌肉，把皮膚往兩側(cè)翻開(kāi)暴露出胸部，用另一把消毒小剪刀往兩側(cè)肋骨各剪一刀，把肋骨和胸骨往上翻開(kāi)，然后另一把無(wú)菌鑷子從肺與氣管連結(jié)處放入，把整個(gè)肺托出。②肺組織的病理切片及懸液制備將右側(cè)肺中葉浸入4%多聚甲醛，保存在4'C準(zhǔn)備制作病理切片。左側(cè)肺葉在砂網(wǎng)上研磨，然后加入lml滅菌的生理鹽水，配成10%的懸液，用吸管吸入試管中,1500rpm，離心10mm，除去雜質(zhì)和細(xì)胞碎片，收上清即為肺的懸液。用血凝素凝集實(shí)驗(yàn)檢測(cè)肺懸液中流感病毒效價(jià)(作法同實(shí)施例3)。③檢測(cè)結(jié)果肺部病毒滴度比較見(jiàn)下表7。表7肺部病毒滴度倒數(shù)的lg(X)比較<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>/2=7.680/M).001用單因素方差統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析可知，mBD-l高劑量組與病毒唑組之間無(wú)顯著性差異，而mBD-l高劑量組與PBS、mBD-l變性、mBD-1低劑量組之間比較有顯著性差異；PBS、mBD-l變性和mBD-1低劑量組之間無(wú)明顯的差異；mBD-1高劑量組與中劑量組無(wú)顯著性差異。表明mBD-l高劑量和中劑量組有抗流感病毒的作用。小鼠肺組織切片用HE染色顯示，其圖片見(jiàn)圖15，圖15表明對(duì)照組小鼠肺組織鏡下可見(jiàn)肺間質(zhì)性充血水腫，有較多淋巴細(xì)胞，單核細(xì)胞浸潤(rùn)，致使肺泡間隔明顯增寬，肺泡壁組織發(fā)生變性壞死，而實(shí)驗(yàn)組mBD-1高劑量組和病毒唑組小鼠無(wú)明顯病理改變。(2)對(duì)小鼠肺指數(shù)和肺抑制率影響的檢測(cè)①肺稱(chēng)重將取出的各組肺組織放入無(wú)菌平皿中，用滅菌生理鹽水把肺清洗23次，摘除氣管、肺門(mén)淋巴結(jié)等組織，用滅菌的吸水紙吸干表面水分，稱(chēng)重。②按以下公式算出各組的肺指數(shù)和肺指數(shù)抑制率肺指數(shù)=個(gè)=，,(mg;x100%小鼠體重(mg)吐+匕敝袖生n啦—對(duì)照組平均肺指數(shù)一實(shí)驗(yàn)組平均肺指數(shù)腳/肺固制率--對(duì)照群柳市指數(shù)-x脇肺指數(shù)和肺指數(shù)抑制率見(jiàn)表8。表8mBD-l多肽對(duì)小鼠肺指數(shù)和肺指數(shù)抑制率的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>用單因素方差統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析肺指數(shù)的比較，mBD-l高劑量、病毒唑組與mBD-1低劑量、raBD-l變性多肽組和PBS組之間有顯著性差異(p<0.05)。mBD-1高劑量組獲得了41.7%肺抑制率，略低于病毒唑(51,0%)，中劑量組和低劑量組分別為34.4%和21.8%(見(jiàn)圖16)。表明mBD-1高劑量組具有較強(qiáng)的抗流感病毒作用，減弱了肺部受損傷的程度，mBD-1中劑量組和mBD-1低劑量組也有一定程度的抗流感病毒作用。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)表明，mBD-l高劑量病毒未攻擊組未出現(xiàn)過(guò)敏反應(yīng)，說(shuō)明mBD-1高劑量沒(méi)有毒性。(4)小鼠生存率的比較在流感病毒攻擊后，mBD-l高劑量、中劑量和病毒唑組小鼠無(wú)明顯流感癥狀，在第5天開(kāi)始體重輕微下降，有輕微寒戰(zhàn)和活動(dòng)力下降，第11天左右均逐漸恢復(fù)正常。mBD-l低劑量組、mBD-l變性蛋白組和對(duì)照組小鼠在第5天開(kāi)始出現(xiàn)體重明顯下降，寒戰(zhàn)，食欲下降。各實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠的存活情況見(jiàn)圖17，從圖17可以看出，在14天時(shí)，mBD-l高劑量組的小鼠生存率為66.7%，mBD-1中劑量組的小鼠生存率為50.0%,病毒唑組的小鼠生存率為83.3%,表明mBD-1高劑量組和中劑量組均具有較強(qiáng)的抗流感病毒作用。SEQUENCELISTING<iio>四川大學(xué)<120>鼠P-防御素1的重組質(zhì)粒、多肽及其用途與制備方法<160>1<170〉Patentlnversion3.2<210>1〈211〉444<212>腿<213>小鼠〈400〉1tttcacatcctctctgcactctggaccctggctgccaccactatgaaaactcattacttt60ctcctggtgatgatatgttttcttttctccc卿tgg鄉(xiāng)caggtgUggcattctcaca120agtcttggactcaatacaaatgccttcaac8tgg3ggattctgtctccgc180tccagctgcccatctaatacgg犯cctgtagcccaactgt240gacagtagttgcsta犯ggaCg鄉(xiāng)g3tgg300tagtgttttaataaatgaaatgtttttgaagtttatttacatcatatc犯gata犯tttt360atttctctgtttsgaeLgagcaatttttttttgggctt卿3C3卿ggtg420agaaa^tccagaacatctgcctgg44權(quán)利要求1、鼠β-防御素1的原核重組質(zhì)粒，其特征在于由序列表中SEQIDNO.1所述的鼠β-防御素1基因與原核載體構(gòu)建而成。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的鼠P-防御素1的原核重組質(zhì)粒，其特征在于原核載體為pGEX-4T-l、pGEX-4T、pET32a(+)中的一種。3、鼠防御素i的原核重組質(zhì)粒所表達(dá)的重組鼠e-防御素1多肽在制備治療或預(yù)防流行性感冒病毒所致疾病的藥物中的應(yīng)用。4、鼠3-防御素1的真核重組質(zhì)粒，其特征在于由序列表中SEQIDNO.1所述的鼠P-防御素1基因與真核載體構(gòu)建而成。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的鼠e-防御素1的真核重組質(zhì)粒，其特征在于真核載體為pIRES2-EGFP、pcDNA3.1/mys-HisA、pcDNA3.1(+)中的一種。6、鼠e-防御素1的真核重組質(zhì)粒在制備治療或預(yù)防流行性感冒病毒所致疾病的藥物中的應(yīng)用。7、一種重組鼠e-防御素l多肽的制備方法，其特征在于依次包括以下步驟(1)通過(guò)RT-PCR反應(yīng)，獲得鼠P-防御素l基因；(2)將上述擴(kuò)增的鼠e-防御素i基因片段插入到原核載體構(gòu)建原核重組質(zhì)粒，再將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至感受態(tài)細(xì)菌中進(jìn)行培養(yǎng)，然后篩選出含有正確插入片段的克隆；(3)利用PCR擴(kuò)增和限制性內(nèi)切酶酶切圖譜分析重組質(zhì)粒，并進(jìn)行DNA序列分析；(4)將正確克隆原核重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入工程菌中進(jìn)行表達(dá)，分離純化表達(dá)的多肽即獲得重組鼠6-防御素l多肽；(5)采用SDS-PAGE和Westernblot鑒定重組鼠P-防御素1多肽的正確性；(6)采用腸激酶酶切釋放出成熟有活性的重組鼠防御素l多肽。8、根據(jù)權(quán)利要求7所述的重組鼠P-防御素1多肽的制備方法，其特征在于原核載體為pGEX-4T-1、pGEX-4T、pET32a(+)中的一種。9、一種鼠e-防御素l真核重組質(zhì)粒的制備方法，其特征在于依次包括以下步驟(1)通過(guò)RT-PCR反應(yīng)，獲得鼠日-防御素l基因；(2)將上述擴(kuò)增的鼠e-防御素i基因片段插入到真核載體構(gòu)建真核重組質(zhì)粒，再將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至感受態(tài)細(xì)菌中進(jìn)行培養(yǎng)，然后篩選出含有正確插入片段的克隆；(3)利用PCR擴(kuò)增和限制性內(nèi)切酶酶切圖譜分析重組質(zhì)粒，并進(jìn)行DNA序列分析。10、根據(jù)權(quán)利要求9所述的鼠e-防御素l真核重組質(zhì)粒的制備方法，其特征在于真核載體為pIRES2-EGFP、pcDNA3.1/mys-HisA、pcDNA3.1(+)中的一種。全文摘要本發(fā)明通過(guò)基因工程技術(shù)構(gòu)建鼠β-防御素1基因(mBD-1)的原核重組質(zhì)粒和真核重組質(zhì)粒，將原核重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入工程菌進(jìn)行誘導(dǎo)高效表達(dá)鼠β-防御素1多肽(mBD-1)并進(jìn)行表達(dá)產(chǎn)物的提取、純化和腸激酶酶切釋放出成熟有活性的mBD-1。本發(fā)明通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明了mBD-1多肽和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染真核重組質(zhì)粒的MDCK細(xì)胞株具有抗流感病毒的作用，以便開(kāi)發(fā)出一類(lèi)治療或預(yù)防流行性感冒的新型藥物。文檔編號(hào)A61K48/00GK101353668SQ20081004447公開(kāi)日2009年1月28日申請(qǐng)日期2008年5月29日優(yōu)先權(quán)日2008年5月29日發(fā)明者艷馮,鞏天祥,燕李,虹李,李婉宜,李明遠(yuǎn),遠(yuǎn)楊,楊偉民,滟江,王保寧,王月玲申請(qǐng)人:四川大學(xué)