專利名稱：：用于生產(chǎn)d－阿拉伯糖醇、d－木酮糖和木糖醇的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)D-阿拉伯糖醇、D-木酮糖和木糖醇的方法。D-阿拉伯糖醇和D-木酮糖作為生產(chǎn)木糖醇的原料是有用的，而木糖醇在食品工業(yè)、醫(yī)藥工業(yè)等領(lǐng)域中是有用的。預(yù)計在未來對木糖醇這種天然存在的糖醇的需求將會增加。木糖醇是一種有前途的低卡路里的甜味劑，這是因為與蔗糖相比它具有更低的卡路里但卻表現(xiàn)出與蔗糖相當?shù)奶鸲?。另外，由于其抗齲齒的特性，它可以用作預(yù)防齲齒的甜味劑。而且，由于木糖醇并不升高葡萄糖的水平，因此它可以用于在糖尿病治療中的流體療法。目前，木糖醇的工業(yè)生產(chǎn)主要依賴于如美國專利4，008，285中公開的D-木糖的氫化。用作原料的D-木糖是通過作為原料的植物材料(諸如樹木、稻草、玉米芯、燕麥殼以及其它富含木聚糖的材料)的水解獲得的。但是，這種由植物材料的水解生產(chǎn)的D-木糖具有相當昂貴的缺點，而這起因于高生產(chǎn)成本。例如，植物材料水解處理的低產(chǎn)率導(dǎo)致所生產(chǎn)的木糖醇純度低。因此，水解處理后必須通過離子交換處理除去用于水解的酸和染料，并且得到的D-木糖必須進一步進行結(jié)晶以除去其它的半纖維素糖類。為了獲得適合于食品的D-木糖，將需要進一步的純化。所述的離子交換處理和結(jié)晶處理導(dǎo)致生產(chǎn)成本的增加。為了解決這一問題，人們已經(jīng)期望開發(fā)出一種用于生產(chǎn)木糖醇的方法，該方法使用易于得到的原料并幾乎不產(chǎn)生廢物。因此，已經(jīng)開發(fā)了采用其它戊糖醇作為原料生產(chǎn)木糖醇的多種方法。所述易于得到的戊糖醇之一為D-阿拉伯糖醇。已經(jīng)開發(fā)出幾種采用D-阿拉伯糖醇作為原料生產(chǎn)木糖醇的方法。在《應(yīng)用微生物學(xué)》18(1969)1031-1035中已經(jīng)報道了一種方法，其中通過使用漢遜氏德巴利氏酵母ATCC20121的發(fā)酵由葡萄糖生產(chǎn)出D-阿拉伯糖醇，然后采用弱氧化醋桿菌轉(zhuǎn)化為D-木酮糖，并且通過季也蒙氏假絲酵母soya變種的作用將D-木酮糖轉(zhuǎn)化為木糖醇。此外，EP403392A(申請人RoquetteFreres)和EP421882A(申請人RoquetteFreres)公開了這樣的方法通過采用抗?jié)B透酵母進行發(fā)酵生產(chǎn)D-阿拉伯糖醇，然后通過采用屬于醋桿菌屬、葡糖桿菌屬或克雷白氏桿菌屬的細菌將D-阿拉伯糖醇轉(zhuǎn)化為D-木酮糖，通過葡萄糖(木糖)異構(gòu)酶的作用由D-木酮糖生成木糖和木酮糖的混合物，以及通過氫化將所產(chǎn)生的木糖和木酮糖的混合物轉(zhuǎn)化為木糖醇。還公開了木糖醇的生產(chǎn)方法，該方法包括預(yù)先濃縮木糖和木酮糖混合物中的木糖，并且通過氫化將濃縮的木糖轉(zhuǎn)化為木糖醇。另一方面，至于對D-阿拉伯糖醇而言，已知屬于畢赤氏酵母屬、漢遜氏酵母屬、德巴利氏酵母屬、接合糖酵母屬、糖酵母屬、假絲酵母屬、球擬酵母屬等的酵母菌株具有生產(chǎn)D-阿拉伯糖醇的能力。例如，日本專利出版物(Kokoku)47-20394/1972公開了一種通過采用屬于假絲酵母屬、糖酵母屬或球擬酵母屬的微生物將諸如甘油之類的糖轉(zhuǎn)化為D-阿拉伯糖醇的方法。此外，《加拿大微生物學(xué)雜志》31(1985)467-471描述了漢遜氏德巴利氏酵母的細胞在含有葡萄糖、L-阿拉伯糖等的培養(yǎng)基中在其穩(wěn)定期時積累阿拉伯糖醇，而《普通微生物學(xué)雜志》139(1993)1047-1054描述了當通過葡萄糖向許多酵母菌株施加滲透壓時，它們變得積累起甘油和D-阿拉伯糖醇。順便指出，在有關(guān)通過葡萄酒酵母生產(chǎn)糖醇的研究中，已經(jīng)報道了當將葡萄汁用作發(fā)酵底物時，幾種酵母菌株生產(chǎn)出D-阿拉白糖醇(《Chem.Mikrobiol.Technol.Lebensm.》10，19-24(1986))。例如，經(jīng)證實通過美極梅奇酵母由183g／L的底物葡萄糖生產(chǎn)出5g／L的D-阿拉伯糖醇。在這種情況下，剩余葡萄糖的量為73g／L，因此就消耗的葡萄糖而言的重量產(chǎn)率是極低的、即約為2％。首先，這些研究的目的并不在于生產(chǎn)D-阿拉伯糖醇，而且檢測僅僅是定性地測量葡萄酒中存在的如D-阿拉伯糖醇這樣的糖醇的來源。因此，它們根本沒有公開D-阿拉伯糖醇有效生產(chǎn)方法的概念。此外，在不采用通氣或攪拌的相對厭氧的條件下進行葡萄酒釀造中葡萄汁的發(fā)酵，從而在需氧條件下通過培養(yǎng)屬于梅奇酵母屬的酵母菌株可以有效地生產(chǎn)D-阿拉伯糖醇尚未為人所知。本發(fā)明的一個目的在于提供一種有效生產(chǎn)D-阿拉伯糖醇的方法，以及通過使用該方法來生產(chǎn)D-木酮糖和木糖醇的方法。為了實現(xiàn)以上提及的目的，本發(fā)明的發(fā)明人針對D-阿拉伯糖醇的生產(chǎn)能力測試了多種微生物并就生產(chǎn)條件進行了試驗。結(jié)果，他們發(fā)現(xiàn)當在需氧條件下培養(yǎng)屬于梅奇酵母屬(Metschnikowia)的微生物時，從諸如葡萄糖之類的可發(fā)酵的糖生產(chǎn)并積累了顯著量的D-阿拉白糖醇，從而完成了本發(fā)明。也就是說，本發(fā)明提供了一種用于生產(chǎn)D-阿拉伯糖醇的方法，該方法包括在需氧條件下在含有糖作為主要碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)屬于梅奇酵母屬并具有D-阿拉伯糖醇產(chǎn)生能力的微生物，以便在該培養(yǎng)基中產(chǎn)生D-阿拉伯糖醇。作為糖，可以提到葡萄糖。作為屬于梅奇酵母屬的微生物，可以提到魯考弗氏梅奇酵母、二尖梅奇酵母、Metschnikowialunata和佐貝列氏梅奇酵母。本發(fā)明還提供了一種用于生產(chǎn)D-木酮糖的方法，該方法包括下列步驟在需氧條件下在含有糖作為主要碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)屬于梅奇酵母屬并具有D-阿拉伯糖醇產(chǎn)生能力的微生物，以便在該培養(yǎng)基中產(chǎn)生D-阿拉伯糖醇，向該培養(yǎng)基中接種具有由D-阿拉伯糖醇產(chǎn)生D-木酮糖能力的微生物，并且在培養(yǎng)基中培養(yǎng)該微生物以產(chǎn)生D-木酮糖。本發(fā)明進一步提供了一種用于生產(chǎn)木糖醇的方法，該方法包括下列步驟在需氧條件下在含有糖作為主要碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)屬于梅奇酵母屬并具有D-阿拉伯糖醇產(chǎn)生能力的微生物以便在該培養(yǎng)基中產(chǎn)生D-阿拉伯糖醇，向該培養(yǎng)基中接種具有由D-阿拉伯糖醇產(chǎn)生D-木酮糖能力的微生物，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)該微生物以產(chǎn)生D-木酮糖，使得具有將D-木酮轉(zhuǎn)化為木糖醇能力的微生物作用于所述含有D-木酮糖的培養(yǎng)基，并且收集所產(chǎn)生的木糖醇。根據(jù)本發(fā)明，通過采用屬于梅奇酵母屬的微生物菌株的發(fā)酵可以有效地生產(chǎn)D-阿拉伯糖醇。此外，通過使用所述D-阿拉伯糖醇作為原料可以生產(chǎn)D-木酮糖或木糖醇。此后，將會詳細地解釋本發(fā)明。對屬于梅奇酵母屬的微生物并不作特別的限制，而只要它具有由諸如葡萄糖之類的糖產(chǎn)生D-阿拉伯糖醇的能力?？梢蕴岬降睦缬忻罉O梅奇酵母、二尖梅奇酵母、魯考弗氏梅奇酵母、Metschnikowialunata、佐貝列氏梅奇酵母、澳洲梅奇酵母、Metschnikowiaagaveae、Metschnikowiagruessii、夏威夷梅奇酵母、克里斯氏梅奇酵母等。在這些當中，美極梅奇酵母、魯考弗氏梅奇酵母、二尖梅奇酵母、Metschnikowialunata和佐貝列氏梅奇酵母是優(yōu)選的。作為具體的菌株，可以提到美極梅奇酵母ATCC18406、魯考弗氏梅奇酵母ATCC18407、二尖梅奇酵母ATCC24179、MetschnikowialunataATCC22033、佐貝列氏梅奇酵母ATCC22302以及美極梅奇酵母FERMBP-7161。這些菌株可以從美國典型培養(yǎng)物保藏中心獲得，地址為12301Parklawn道，Rockville，馬里蘭州20852，美國。美極梅奇酵母FERMBP-7161最初于1998年1月16日保藏在國際貿(mào)易與工業(yè)部工業(yè)科學(xué)與技術(shù)局的國立生物科學(xué)與人體技術(shù)研究所(郵政編碼305-8566，1-3Higashi1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，日本)，保藏號為FERMP-16592，并于2000年5月15日遵照布達佩斯條約將該菌株由原始保藏轉(zhuǎn)換為國際保藏，而且已經(jīng)以保藏號FERMBP-7161進行了保藏。通過在需氧條件下在含有糖作為主要碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)以上提及的這樣一種屬于梅奇酵母屬的微生物，便可以在該培養(yǎng)基中產(chǎn)生D-阿拉伯糖醇。雖然可以使用一種屬于梅奇酵母屬的微生物，但也可以同時使用任意的兩種或多種這樣的微生物。在本發(fā)明中，通常使用液體培養(yǎng)基作為培養(yǎng)基。對糖并不作特別的限制，只要當在需氧條件下將其用于培養(yǎng)屬于梅奇酵母屬的微生物時產(chǎn)生D-阿拉伯糖醇即可。例如，可以提到的有葡萄糖、果糖、蔗糖等。至于這些糖在培養(yǎng)基中的量，希望以5-40g/dl范圍內(nèi)的量來使用它們。在培養(yǎng)過程中可以逐步加入糖。作為氮源，可以使用可被微生物利用的氮化合物，例如硫酸銨、酵母提取物、胨、麥芽提取物、酪蛋白氨基酸、玉米漿等。此外，作為加入培養(yǎng)基中的無機鹽，例如可以使用如硫酸鎂、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀和氫氧化鉀之類的鹽。再者，當需要時，可以加入為微生物生長所需的各種有機物質(zhì)和無機物質(zhì)、以及通常使用的表面活性劑和消泡劑。當需要時，還可以添加培養(yǎng)基組分，如氮源、天然鹽和其它營養(yǎng)物。在需氧條件下培養(yǎng)本發(fā)明屬于梅奇酵母屬的微生物。術(shù)語“需氧條件”意指在比靜置培養(yǎng)中得到的濃度高的培養(yǎng)基中的氧濃度下進行培養(yǎng)。優(yōu)選控制氧的濃度，以便在整個培養(yǎng)期中溶氧濃度應(yīng)當表示為正值，并且更優(yōu)選控制該濃度以便氧的分壓應(yīng)當為0.05至0.1個大氣壓。這樣的氧濃度可以通過攪拌培養(yǎng)基、滲透、通氣等來達到。例如通過將在30℃下在含有2g／dlD-葡萄糖、1g／dl酵母提取物、1g／dl麥芽提取物和2g/dl瓊脂、pH7.0的斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)了24小時的細胞直接接種到生產(chǎn)培養(yǎng)基中，或者通過接種已經(jīng)通過預(yù)培養(yǎng)分別獲得的種子培養(yǎng)肉湯，實現(xiàn)了屬于梅奇酵母屬的微生物的接種。例如通過將一白金環(huán)在斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)的上述細胞接種到無菌的培養(yǎng)肉湯中(所述培養(yǎng)肉湯含有5g／dl葡萄糖、0.3g/dl酵母提取物、0.15g／dl硫酸銨、0.1g／dl磷酸二氫鉀、0.3g／dl磷酸氫二鉀、0.1g硫酸鎂七水合物以及2.5g／dl碳酸鈣(獨立滅菌)，pH5-7)并且在30-34℃的溫度下將它們培養(yǎng)12-24小時，制備出種子培養(yǎng)肉湯。主要培養(yǎng)物的培養(yǎng)溫度應(yīng)當在屬于梅奇酵母屬的微生物能夠生長的范圍內(nèi)。即通常在25-37℃的溫度范圍內(nèi)進行培養(yǎng)，其中優(yōu)選在30-34℃的范圍內(nèi)。此外，通常將培養(yǎng)基的pH控制在3-9的范圍內(nèi)，優(yōu)選4-7。雖然培養(yǎng)期可能隨所用培養(yǎng)基的種類和作為培養(yǎng)基主要碳源的糖濃度發(fā)生變化，但它通常為大約12小時至10天。優(yōu)選當將培養(yǎng)基中的營養(yǎng)源利用到最大程度并且培養(yǎng)基中產(chǎn)生的D-阿拉伯糖醇的積累量達到最大值時，結(jié)束本發(fā)明的培養(yǎng)。通過采用如高效液相層析這樣的公知技術(shù)，可以迅速地測定培養(yǎng)肉湯中產(chǎn)生的D-阿拉伯糖醇的量?？梢砸猿Ｒ?guī)的方式從培養(yǎng)肉湯中收集如上所述在培養(yǎng)肉湯中積累的D-阿拉伯糖醇，或者當將D-阿拉伯糖醇用作將要轉(zhuǎn)化為另一種物質(zhì)的底物時，可以在培養(yǎng)肉湯中使用它。當需要時，通過在該領(lǐng)域中常用的眾所周知的技術(shù)(如過濾、離心、真空濃縮、離子交換或吸附層析、溶劑萃取、蒸餾和結(jié)晶)的適當組合，從培養(yǎng)肉湯中收集D-阿拉伯糖醇。例如，通過過濾或離心從培養(yǎng)肉湯中除去細胞，用活性炭處理培養(yǎng)基以除去色素物質(zhì)等，通過使用離子交換樹脂去離子，并且在真空下濃縮以生成糖漿。然后，可以用醇提取糖漿，從提取物中可以沉積出晶體并從醇中進行重結(jié)晶以獲得純凈的晶體。通過使用如上所述在培養(yǎng)基中產(chǎn)生和積累的或者收集的D-阿拉伯糖醇作為原料，可以生產(chǎn)D-木酮糖或木糖醇。也就是說，通過使具有由D-阿拉伯糖醇產(chǎn)生D-木酮糖能力的微生物作用于D-阿拉伯糖醇或含有D-阿拉伯糖醇的培養(yǎng)肉湯，可以生產(chǎn)D-木酮糖。例如，正如在《應(yīng)用微生物學(xué)》18，1031-1035(1969)中所述的那樣，通過使弱氧化醋桿菌作用于D-阿拉伯糖醇，可以將由發(fā)酵產(chǎn)生的D-阿拉伯糖醇轉(zhuǎn)化為D-木酮糖。另一方面，正如EP403392A和EP421882A中所述的那樣，通過使醋桿菌屬的細菌、葡糖桿菌屬的細菌或克雷白氏桿菌屬的細菌作用于D-阿拉伯糖醇，可以將由發(fā)酵產(chǎn)生的D-阿拉伯糖醇轉(zhuǎn)化為D-木酮糖。作為這類細菌菌株的一個具體的例子，可以提到氧化葡糖桿菌ATCC621菌株。作為具有將D-阿拉伯糖醇轉(zhuǎn)化為D-木酮糖能力的其它微生物，可以提到的有屬于下列屬的微生物無色桿菌屬、土壤桿菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬、節(jié)桿菌屬、金桿菌屬、固氮桿菌屬、短桿菌屬、棒狀桿菌屬、腸桿菌屬、歐文氏桿菌屬、黃桿菌屬、微球菌屬、摩根氏菌屬、諾卡氏菌屬、游動球菌屬、變形菌屬、丙酸桿菌屬、假單胞菌屬、紅球菌屬、芽孢八疊球菌屬、葡萄球菌屬、弧菌屬、馬杜拉放線菌屬、放線菌屬、北里孢菌屬、鏈霉菌屬、氣單胞菌屬、金桿菌屬、芽孢桿菌屬、埃希氏桿菌屬、微桿菌屬、沙雷氏菌屬、沙門氏菌屬以及黃單胞菌屬。通過把以上提到的具有將D-阿拉伯糖醇轉(zhuǎn)化為D-木酮糖能力的這樣一種微生物接種到其中產(chǎn)生了D-阿拉白糖醇的梅奇酵母屬酵母的培養(yǎng)肉湯中或者接種到從中除去了梅奇酵母屬酵母細胞的這樣一種培養(yǎng)肉湯中，并且培養(yǎng)所述的微生物，也可以生產(chǎn)D-木酮糖。此外，通過使具有將D-木酮糖轉(zhuǎn)化為木糖醇能力的微生物作用于如上所述產(chǎn)生的D-木酮糖，可以生產(chǎn)木糖醇。作為具有將D-木酮糖轉(zhuǎn)化為木糖醇能力的微生物，季也蒙氏假絲酵母soya變種(《應(yīng)用微生物學(xué)》18，1031-1035(1969))已是公知的。再者，通過使得用木糖醇脫氫酶基因轉(zhuǎn)化的并具有提供還原本領(lǐng)能力的微生物作用于D-木酮糖，也可以生產(chǎn)木糖醇。本文所用的術(shù)語“提供還原本領(lǐng)的能力”意指以足以使由木糖醇脫氫酶(D-木酮糖還原酶)催化的D-木酮糖至木糖醇之還原反應(yīng)進行的量來提供NADH(還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸)的能力。作為具有所述能力的微生物的具體例子，可以提到埃希氏桿菌屬的細菌，如大腸桿菌。另一方面，正如EP403392A和EP421882A中公開的那樣，通過使葡萄糖異構(gòu)酶(木糖異構(gòu)酶)作用于D-木酮糖，可以將所產(chǎn)生的D-木酮糖轉(zhuǎn)化為D-木糖，然后可以使所產(chǎn)生的D-木糖氫化以轉(zhuǎn)化成木糖醇。此外，通過使用屬于葡糖桿菌屬或醋桿菌屬的并具有將D-阿拉伯糖醇轉(zhuǎn)化為木糖醇能力的微生物，由通過使用梅奇酵母屬酵母生產(chǎn)的D-阿拉伯糖醇生產(chǎn)木糖醇也是有可能的(WO99/20782)。用于由D-阿拉伯糖醇生產(chǎn)D-木酮糖或木糖醇的方法并不局限于以上提到的那些，并且可以采用任何公知的方法。此外，甚至一種迄今尚未公知的方法也可以用于本發(fā)明。下面，參照下列實施例將更加具體地解釋本發(fā)明。實施例1D-阿拉伯糖醇的生產(chǎn)通過使用美極梅奇酵母ATCC18406菌株、二尖梅奇酵母ATCC24179菌株、魯考弗氏梅奇酵母ATCCl8407菌株、MetschnikowialunataATCC22033菌株、佐貝列氏梅奇酵母ATCC22302菌株以及美極梅奇酵母FERMBP-7161菌株作為屬于梅奇酵母屬的微生物，生產(chǎn)D-阿拉伯糖醇。在30℃下，在含有2g／dlD-葡萄糖、1g／dl酵母提取物、1g／dl麥芽提取物和2g／dl瓊脂、pH7.0的斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)前面提到的每一種菌株24小時，將一白金環(huán)的細胞接種到包含于500-ml坂口燒瓶中的20ml種子培養(yǎng)基中(5g／dlD-葡萄糖、0.3g／dl酵母提取物、0.15g硫酸銨、0.1g／dl磷酸二氫鉀、0.3g／dl磷酸氫二鉀、0.1g／dl硫酸鎂七水合物以及2.5g／dl碳酸鈣(獨立滅菌)，pH7.0，在120℃下滅菌20分鐘)，并于30℃下在120rpm下振蕩培養(yǎng)18小時。把獲得的培養(yǎng)基用作種子培養(yǎng)肉湯。把l毫升種子培養(yǎng)肉湯接種到包含于500-ml坂口燒瓶中的20ml主要培養(yǎng)基中(10g／dlD-葡萄糖、0.5g／dl酵母提取物、0.15g／dl硫酸銨、0.1g／dl磷酸二氫鉀、0.3g／dl磷酸氫二鉀、0.1g／dl硫酸鎂七水合物以及2.5g／dl碳酸鈣(獨立滅菌)，pH7.0，在120℃下滅菌20分鐘)，并于30℃下在120rpm下振蕩培養(yǎng)。定期地測定培養(yǎng)肉湯中生成的D-阿拉伯糖醇和剩余的D-葡萄糖的濃度。對D-阿拉伯糖醇濃度的測定而言，通過離心從每次培養(yǎng)肉湯收集的部分中除去細胞，將上清液適當?shù)叵♂尣⑦M行高效液相層析以測定出D-阿拉伯糖醇的濃度。通過采用ShodexSugarSC1211作為層析柱，以含有12.5mg／L硝酸鈣和12.5mg／LEDTA的50％(v/v)乙腈作流動相，在60℃的柱溫和0.8ml/min的流速下，進行高效液相層析。分析結(jié)果如表1所示。表1通過梅奇酵母屬的酵母由D-葡萄糖發(fā)酵生產(chǎn)D-阿拉伯糖醇<tablesid="table1"num="001"><table>菌株在時刻時的糖濃度(g/dl)培養(yǎng)時間(小時)積累的D-阿拉伯糖醇的濃度(g/dl)剩余的糖(g/dl)美極梅奇酵母ATCC184069.5541.30.0魯考弗氏梅奇酵母ATCC184079.5542.10.0二尖梅奇酵母ATCC241799.5542.60.0MetschnikowialunataATCC220339.5542.70.0佐貝列氏梅奇酵母ATCC223029．5300.72.7美極梅奇酵母FERMBP-71619.5301.70.0</table></tables>如表1所示，通過所有使用的梅奇酵母屬的酵母菌株都生成了D-阿拉伯糖醇，并且基于消耗糖的重量產(chǎn)率(生成的D-阿拉伯糖醇的重量與消耗糖的重量之比)達到了最大值28％。通過離心從如上所述獲得的各種培養(yǎng)肉湯中除去細胞，通過分別采用陽離子交換樹脂和陰離子交換樹脂從培養(yǎng)肉湯中連續(xù)地除去陽離子和陰離子。在真空下濃縮得到的溶液，以便基本完全地除去水分，并用乙醇提取。使提取物結(jié)晶，并使該晶體從乙醇中重結(jié)晶以獲得純的D-阿拉伯糖醇的晶體。實施例2D-木酮糖的生產(chǎn)以與實施例1相同的方式，通過使用MetschnikowialunataATCC22033菌株獲得含有D-阿拉伯糖醇的培養(yǎng)肉湯，并且通過離心從該培養(yǎng)肉湯中除去細胞以獲得含2.7g/dlD-阿拉伯糖醇的培養(yǎng)肉湯。將以上氧化葡糖桿菌的培養(yǎng)肉湯以5％的濃度接種到上面提到的含D-阿拉伯糖醇的培養(yǎng)肉湯中，并在30℃下振蕩培養(yǎng)。在17個小時后，結(jié)束培養(yǎng)并通過離心除去細胞。結(jié)果，由接種時2.5g／dl的D-阿拉伯糖醇獲得了2.3g／dl的D-木酮糖(產(chǎn)率92％)。實施例3木糖醇的生產(chǎn)(1)制備用木糖醇脫氫酶基因轉(zhuǎn)化的大腸桿菌在來源于摩氏摩根氏菌ATCC25829的木糖醇脫氫酶基因公知的核苷酸序列(DDBJ/GenBank／EMBL登記號為L34345)的基礎(chǔ)上，合成出具有如序歹列表中SEQIDNOS1和2所示核苷酸序列的寡核苷酸。在通常的條件下，通過采用合成的寡核苷酸作引物并以所述菌株的基因組DNA作模板來進行PCR。結(jié)果，擴增出含木糖醇脫氫酶基因的大約1.2kb的DNA片段。通過瓊脂旨糖凝膠電泳分離并收集該DNA片段，用EoRI和BanHI消化該片段的兩端，并連接到pUC18(TakaraShuzo)的EcoRI和BamHI消化產(chǎn)物上。用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，并選出含木糖醇脫氫酶基因的轉(zhuǎn)化菌株。如果克隆的片段含有木糖醇脫氫酶基因的話，那么在lac啟動子的控制下，將以帶有l(wèi)acZ’基因的融合基因來表達所述的基因。如下測定出轉(zhuǎn)化菌株的木糖醇脫氫酶活性。通過超聲處理破碎在L培養(yǎng)基(1％胰化蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.5％NaCl)中過夜培養(yǎng)的細胞，并將上清液用作粗酶溶液。在30℃下，在1ml反應(yīng)混合物中反應(yīng)1分鐘，其中反應(yīng)混合物含有100mM甘氨酸緩沖液(pH9.5)、100mM木糖醇、2mMNAD以及100μl粗酶溶液。基于340nm下吸光度的增加來檢測NADH或NADPH的生成。把在上述條件下在1分鐘里氧化1μmol的木糖醇以產(chǎn)生1μmolNADH的酶活性定義為1個單位。結(jié)果，在轉(zhuǎn)化菌株中觀察到3.9U/mg的木糖醇脫氫酶活性，而在用作對照的大腸桿菌JM109(宿主菌株)中卻沒有觀察到所述的酶活性。因此，經(jīng)證實轉(zhuǎn)化的菌株具有木糖醇脫氫酶基因。(2)采用以木糖醇脫兌氫酶基因轉(zhuǎn)化的大腸桿菌生產(chǎn)木糖醇將以上獲得的轉(zhuǎn)化菌株接種到包含于體積為500-ml的燒瓶的50ml培養(yǎng)基(pH6.0)中，所述培養(yǎng)基含有0.5g/dl酵母提取物、0.5g/dl胨、0.5g/dl牛肉膏、0.5g/dl硫酸銨、0.1g/dl磷酸二氫鉀、0.3g/dl磷酸氫二鉀、0.05g/dl硫酸鎂七水合物、0.001g/dl硫酸亞鐵七水合物、0.001g/dl硫酸錳n水合物、1g/dl甘油以及2g/dl碳酸鈣(獨立滅菌)，并在30℃下振蕩培養(yǎng)3小時。向該培養(yǎng)物中以1mM的最終濃度加入異丙基-β-D-硫代半乳吡喃糖苷(IPTG)，并且進一步培養(yǎng)4小時。把如上所述獲得的培養(yǎng)肉湯以5％的最終濃度加入實施例2中得到的含D-木酮糖的氧化葡糖桿菌培養(yǎng)上清液中，并以1g/dl的最終濃度再加入D-葡萄糖。然后，在30℃下進行振蕩培養(yǎng)。結(jié)果，通過24小時的培養(yǎng)，從培養(yǎng)開始時2.2g/dl的D-木酮糖獲得了2.1g/dl的木糖醇(產(chǎn)率95％)。序列表&lt;110&gt;Ajinomoto有限公司&lt;120&gt;用于生產(chǎn)D-阿拉伯糖醇、D-木酮糖和木糖醇的方法&lt;130&gt;OP951&lt;141&gt;2000-06-&lt;150&gt;JP11-178514&lt;151&gt;1999-06-24&lt;160&gt;2&lt;170&gt;PatentIn2．0版&lt;210&gt;1&lt;211&gt;26&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;&lt;223&gt;人工序列的描述引物&lt;400&gt;1cgggaattcgatatcattttaatgaa26&lt;210&gt;2&lt;211&gt;29&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;&lt;223&gt;人工序列的描述引物&lt;400&gt;2ggcggatccgcagtcaataccggcataga29權(quán)利要求1．一種用于生產(chǎn)D-阿拉伯糖醇的方法，該方法包括在需氧條件下在含有糖作為主要碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)屬于梅奇酵母屬并具有D-阿拉伯糖醇產(chǎn)生能力的微生物以便在該培養(yǎng)基中產(chǎn)生D-阿拉伯糖醇的步驟。2．根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述的糖為葡萄糖。3．根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述的屬于梅奇酵母屬的微生物選自美極梅奇酵母、魯考弗氏梅奇酵母、二尖梅奇酵母、Metschnikowialunata和佐貝列氏梅奇酵母。4．一種用于生產(chǎn)D-木酮糖的方法，該方法包括下列步驟在需氧條件下在含有糖作為主要碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)屬于梅奇酵母屬并具有D-阿拉伯糖醇產(chǎn)生能力的微生物，以便在該培養(yǎng)基中產(chǎn)生D-阿拉伯糖醇；以及向該培養(yǎng)基中接種具有由D-阿拉伯糖醇產(chǎn)生D-木酮糖能力的微生物，并且培養(yǎng)該微生物，以便在該培養(yǎng)基中產(chǎn)生D-木酮糖。5．一種用于生產(chǎn)木糖醇的方法，該方法包括下列步驟在需氧條件下在含有糖作為主要碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)屬于梅奇酵母屬并具有D-阿拉伯糖醇產(chǎn)生能力的微生物，以便在該培養(yǎng)基中產(chǎn)生D-阿拉伯糖醇；向該培養(yǎng)基中接種具有由D-阿拉伯糖醇產(chǎn)生D-木酮糖能力的微生物，培養(yǎng)該微生物以便在該培養(yǎng)基中產(chǎn)生D-木酮糖；以及使得具有將D-木酮糖轉(zhuǎn)化為木糖醇能力的微生物作用于所述含有D-木酮糖的培養(yǎng)基，并且收集所產(chǎn)生的木糖醇。全文摘要通過以下步驟生產(chǎn)木糖醇:在需氧條件下在含有糖作為主要碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)屬于梅奇酵母屬并具有D－阿拉伯糖醇產(chǎn)生能力的微生物(例如美極梅奇酵母、魯考弗氏梅奇酵母、二尖梅奇酵母、Metschnikowialunata和佐貝列氏梅奇酵母),以便在該培養(yǎng)基中產(chǎn)生D－阿拉伯糖醇,向該培養(yǎng)基中接種具有由D－阿拉伯糖醇產(chǎn)生D－木酮糖能力的微生物,在培養(yǎng)基中培養(yǎng)該微生物以產(chǎn)生D－木酮糖,然后使得具有將D－木酮糖轉(zhuǎn)化為木糖醇能力的微生物作用于所述含有D－木酮糖的培養(yǎng)基,并且收集所產(chǎn)生的木糖醇。文檔編號C12N15/53GK1284564SQ00122728公開日2001年2月21日申請日期2000年6月24日優(yōu)先權(quán)日1999年6月24日發(fā)明者野崎博之,鈴木俊一,竹內(nèi)園子,津吉直子,橫關(guān)健三申請人:味之素株式會社