專利名稱：用磁穩(wěn)定流化床培養(yǎng)貼壁依賴性動物細(xì)胞生產(chǎn)病毒的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，特別是涉及一種用磁穩(wěn)定流化床培養(yǎng)貼壁依賴性動物細(xì)胞生產(chǎn)病毒的方法。
動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)在現(xiàn)代生物技術(shù)及醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)中具有越來越重要的意義，已用于生產(chǎn)乙肝、乙腦、狂犬等病毒進(jìn)而制備疫苗。
磁穩(wěn)定流化床(Magnetically stabilized fluidized bed)是給普通流化床加上磁場，流化床中的顆粒也有磁性。顆粒在磁場中形成鏈，液體通過流化床時顆粒層均勻膨脹，液體呈活塞流動。磁穩(wěn)定流化床既有普通流化床的壓降和流化特性，又有填充床的液體流動和固液接觸特性。此外，通過調(diào)節(jié)磁場強度，可以調(diào)節(jié)磁穩(wěn)定流化床的液體流速上限，因而磁穩(wěn)定流化床操作范圍寬、適應(yīng)面廣。磁穩(wěn)定流化床中固體顆粒相對靜止，消除了顆粒間的碰撞和摩擦，同時磁穩(wěn)定流化床中的顆粒密度可達(dá)40％(體積分率)以上，僅略低于填充床，比用于動物細(xì)胞培養(yǎng)的氣升式反應(yīng)器高1-2個數(shù)量級。因此，如果將微載體做成磁性顆粒，用磁穩(wěn)定流化床培養(yǎng)動物細(xì)胞，有望將細(xì)胞密度提高1-2個數(shù)量級，從而提高反應(yīng)器生產(chǎn)病毒的能力。
磁穩(wěn)定流化床由于具有獨特的優(yōu)點，已在生化工程中得到了多方面的應(yīng)用。在固定化生物反應(yīng)器方面，正如文獻(xiàn)《生物技術(shù)與生物工程》(Biotech.Bioeng.1981,23,2561-2567)一文所述的將脲酶與四氧化三鐵顆粒共包埋于聚甲基丙烯酸甲酯中，在外加磁場作用下，液體流速達(dá)24厘米/分鐘而顆粒層仍保持穩(wěn)定，同期轉(zhuǎn)化率可與填充床相比。文獻(xiàn)《化工學(xué)報》1988(1),120-126所述的以含磁粉的聚甲基丙烯酸甲酯為載體，包埋熱帶假絲酵母，在恒定磁場中用于含酚廢水的處理，提高了反應(yīng)速度，使單位體積反應(yīng)器的降解量明顯增加。文獻(xiàn)《生物技術(shù)進(jìn)展》(Biotech.Prog.,1990,6,452-457)所述的將磁穩(wěn)定流化床應(yīng)用于固定化植物細(xì)胞的培養(yǎng)，將細(xì)胞與磁粉共包埋制成磁性顆粒，生產(chǎn)次生代謝物，以培養(yǎng)基為流化基質(zhì)，培養(yǎng)基循環(huán)充氧，消除了因顆粒碰撞造成的損失。而對用磁穩(wěn)定流化床培養(yǎng)動物細(xì)胞生產(chǎn)病毒至今未見報道。
本發(fā)明的目的在于克服運用微載體培養(yǎng)動物細(xì)胞生產(chǎn)病毒時，微載體顆粒在反應(yīng)器中的互相碰撞，提高微載體的裝填密度，減少細(xì)胞的損傷，提高動物細(xì)胞培養(yǎng)的密度進(jìn)而提高反應(yīng)器生產(chǎn)病毒的效率，提供一種用磁穩(wěn)定流化床培養(yǎng)貼壁依賴性動物細(xì)胞生產(chǎn)病毒的方法。
本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的在普通的液固流化床中加上縱向磁場，流化床內(nèi)裝有磁敏性微載體。細(xì)胞培養(yǎng)基或病毒培養(yǎng)基從下端進(jìn)入流化床，從上端離開；離開的培養(yǎng)基可以經(jīng)過充氧后全部返回入口，實現(xiàn)批式培養(yǎng)；也可以部分返回或不返回，以實現(xiàn)灌注培養(yǎng)。磁場用Helmholtz線圈實現(xiàn)，線圈內(nèi)通直流電。磁場方向包括向上和向下，磁場可以是均勻磁場，也可以是有梯度的自上而下增強的磁場。床體下端有濾網(wǎng)，以防止顆粒泄露；濾網(wǎng)下有支撐板；支撐板下有液體分布板，使液體均勻分布；床體下端為錐形底，以消除流化床的死角，該錐角為40°-120°；濾網(wǎng)、分布板和支撐板的材質(zhì)以能蒸汽滅菌且不污染培養(yǎng)液為準(zhǔn)，如陶瓷或不銹鋼。床體上端面有接種口。床體上端有顆粒入口，用以加入磁敏性微載體顆粒。床體上端面或側(cè)壁有開孔，用來安裝傳感器(如測定溫度、溶液酸堿度的pH值范圍、溶解氧范圍)。床體上下端有滅菌蒸汽的出入口。
本發(fā)明所用磁穩(wěn)定流化床培養(yǎng)貼壁依賴性動物細(xì)胞生產(chǎn)病毒的方法如下(1)在磁場關(guān)閉的狀態(tài)下，清洗磁穩(wěn)定流化床動物細(xì)胞和病毒培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)的所有容器、管路；在啟動磁穩(wěn)定流化床動物細(xì)胞和病毒培養(yǎng)系統(tǒng)的控制裝置之前設(shè)定細(xì)胞培養(yǎng)所需的溶液pH值范圍、溶解氧范圍及反應(yīng)溫度。
(2)將磁敏性微載體預(yù)處理后由微載體加入口加入到磁穩(wěn)定流化床中，然后由滅菌蒸汽入口向系統(tǒng)內(nèi)通入蒸汽滅菌，或在通入蒸汽前加入緩沖液至浸沒磁敏性微載體再通入蒸汽滅菌；所述的緩沖液為磷酸緩沖液?；?qū)⒋琶粜晕⑤d體單獨滅菌后在無菌環(huán)境下加入到已經(jīng)滅菌的磁穩(wěn)定流化床中；其中磁敏性微載體的加入量按視體積計為磁穩(wěn)定流化床工作體積的10％～95％，磁敏性微載體的矯頑力低于200安培/米，粒徑為50μm～2mm，濕比重為1.1～2.5g/cm3，磁穩(wěn)定流化床的液體表觀流速為5厘米/分鐘～25厘米/分鐘，磁場強度為3～100mT；滅菌時遵循一定的次序，保證所有容器、管路、元件及微載體都充分滅菌。
(3)冷卻后將磁穩(wěn)定流化床內(nèi)的液體由排水口排出；經(jīng)過微孔濾膜由磁穩(wěn)定流化床培養(yǎng)基入口向磁穩(wěn)定流化床內(nèi)注入細(xì)胞培養(yǎng)基至浸沒磁敏性微載體但不超過磁穩(wěn)定流化床的工作體積的95％，浸泡磁敏性微載體適當(dāng)時間。
(4)由磁穩(wěn)定流化床的接種口加入已制備好的細(xì)胞種子液。
(5)經(jīng)過氣體過濾裝置由磁穩(wěn)定流化床的滅菌蒸汽入口通入能使磁敏性微載體懸浮的無菌空氣或富氧空氣，持續(xù)5秒鐘以上，使磁敏性微載體顆粒懸浮并與液體充分混合，然后開啟磁場，停止通氣，20-30分鐘后關(guān)閉磁場——通氣——開啟磁場——停止通氣；以后每隔20-30分鐘重復(fù)關(guān)閉磁場——通氣——開啟磁場——停止通氣的過程，直至細(xì)胞在磁敏性微載體上貼壁完全；其中的通氣是指前述的經(jīng)過氣體過濾裝置通入能使磁敏性微載體懸浮的無菌空氣或富氧空氣并持續(xù)5秒鐘以上；經(jīng)過微孔濾膜補足細(xì)胞培養(yǎng)基使之充滿充氧裝置和管路。
(6)啟動磁穩(wěn)定流化床動物細(xì)胞和病毒培養(yǎng)系統(tǒng)的控制裝置和充氧裝置，讓細(xì)胞培養(yǎng)基循環(huán)，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)過程；根據(jù)實際操作的需要，經(jīng)過微孔濾膜連續(xù)或分批補充新鮮細(xì)胞培養(yǎng)基，定時取樣分析，直至達(dá)到所需的細(xì)胞密度或預(yù)定的培養(yǎng)時間；關(guān)閉磁穩(wěn)定流化床動物細(xì)胞和病毒培養(yǎng)系統(tǒng)的控制裝置和充氧裝置，停止細(xì)胞培養(yǎng)基的循環(huán)；在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，每隔2-12小時將磁場關(guān)閉一下，再重新開啟。
(7)將磁穩(wěn)定流化床培養(yǎng)系統(tǒng)中的細(xì)胞培養(yǎng)基排出，經(jīng)過微孔濾膜由培養(yǎng)基入口加入洗滌液至充滿培養(yǎng)系統(tǒng)，用洗滌液浸泡培養(yǎng)系統(tǒng)或使洗滌液在培養(yǎng)系統(tǒng)中循環(huán)一定時間，對磁穩(wěn)定流化床動物細(xì)胞和病毒培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行洗滌，然后排出洗滌液；根據(jù)培養(yǎng)過程的需要決定洗滌液的配方和洗滌次數(shù)1-5次或更多次；設(shè)定病毒培養(yǎng)過程所需的溶液pH值范圍、溶解氧范圍、反應(yīng)溫度；經(jīng)過微孔濾膜加入病毒培養(yǎng)基至浸沒貼有細(xì)胞的磁敏性微載體但不超過磁穩(wěn)定流化床的工作體積的95％；啟動磁穩(wěn)定流化床動物細(xì)胞和病毒培養(yǎng)系統(tǒng)的溫度控制裝置，接入種毒；關(guān)閉磁場，經(jīng)過氣體過濾裝置由磁穩(wěn)定流化床的滅菌蒸汽入口通入能使貼有細(xì)胞的磁敏性微載體懸浮的無菌空氣或富氧空氣，持續(xù)5秒鐘以上，使貼有細(xì)胞的磁敏性微載體顆粒懸浮并與液體充分混合，然后開啟磁場，停止通氣，20-30分鐘后關(guān)閉磁場——通氣——開啟磁場——停止通氣；以后每隔20-30分鐘重復(fù)關(guān)閉磁場——通氣——開啟磁場——停止通氣的過程，直至病毒在細(xì)胞上吸附完全；其中的通氣是指前述的經(jīng)過氣體過濾裝置通入能使貼有細(xì)胞的磁敏性微載體懸浮的無菌空氣或富氧空氣并持續(xù)5秒鐘以上；經(jīng)過微孔濾膜補足病毒培養(yǎng)基使之充滿充氧裝置和管路；啟動磁穩(wěn)定流化床動物細(xì)胞和病毒培養(yǎng)系統(tǒng)的溶解氧控制裝置、pH控制裝置和充氧裝置，讓病毒培養(yǎng)基循環(huán)；適時將磁穩(wěn)定流化床培養(yǎng)基出口流出的液體切換至收獲液出口至收獲液儲罐，連續(xù)或分批收獲病毒，并同時經(jīng)過微孔濾膜補充病毒培養(yǎng)基，直至病毒收獲結(jié)束；關(guān)閉相應(yīng)的管路。
(8)經(jīng)過微孔濾膜由磁穩(wěn)定流化床培養(yǎng)基入口泵入無菌水將磁穩(wěn)定流化床內(nèi)的殘液由上端收獲液出口頂出至收獲液儲罐，或由下端的培養(yǎng)基入口將殘液直接放至收獲液儲罐，或?qū)堃河膳潘谂懦?；關(guān)閉磁場，向系統(tǒng)內(nèi)通入蒸汽滅菌；將貼有細(xì)胞的磁敏性微載體由收獲液出口或微載體加入口水洗排出進(jìn)行后處理，培養(yǎng)過程完成。
所述的病毒培養(yǎng)基是指適合病毒增殖的培養(yǎng)基。
本發(fā)明為了提高動物細(xì)胞培養(yǎng)的密度和反應(yīng)器的效率，所使用的用于動物細(xì)胞培養(yǎng)的磁敏性微載體既要對磁場有響應(yīng)，又要適于細(xì)胞的貼壁、生長，還不能有磁粉的泄露，以免污染培養(yǎng)液和傷害細(xì)胞。
用于動物細(xì)胞培養(yǎng)的磁敏性微載體是核殼式結(jié)構(gòu)，內(nèi)核為磁敏核，磁敏核由磁粉和包裹磁粉的高分子聚合物構(gòu)成，殼層為適于細(xì)胞貼壁、生長的基質(zhì)。
所用磁粉的平均粒徑為0.1-5微米，所說的磁粉為γ-Fe(OH)2、γ-Fe2O3或Fe3O4。所說的高分子聚合物可由常用的可經(jīng)懸浮聚合形成球狀顆粒的單體、引發(fā)劑和交聯(lián)劑制備，其中單體包括可經(jīng)懸浮聚合形成球狀顆粒的單體，如苯乙烯系列，如苯乙烯、對乙烯基甲苯、間乙烯基甲苯或α-甲基苯乙烯，和甲基丙烯酸甲酯。引發(fā)劑包括懸浮聚合常用的引發(fā)劑，如過氧化苯甲酰(BPO)或偶氮二異丁腈(AIBN)。交聯(lián)劑包括懸浮聚合常用的交聯(lián)劑，如二乙烯基苯和異氰尿酸三烯丙酯。殼層基質(zhì)包括適合不同種類的細(xì)胞貼壁和生長的基質(zhì)，如明膠、葡聚糖等。
上述微載體的制備是將聚合單體、交聯(lián)劑、引發(fā)劑和磁粉按一定比例混合均勻進(jìn)行聚合，以明膠溶液為分散劑，經(jīng)懸浮聚合得到含磁粉的顆粒，經(jīng)洗滌、烘干后得所需磁核；將磁核與殼層基質(zhì)混合，懸浮于甲苯液中，使裹有明膠的磁核充分分散，之后降溫、交聯(lián)、還原、洗滌，得磁敏性微載體。所制得的微載體可以進(jìn)一步進(jìn)行包括DEAE修飾或衍生化的表面修飾，以改變其電荷分布、親水性等。
制備出的磁敏性微載體的平均粒徑為50微米～2毫米，濕比重1.1-2.5g/cm3，磁粉含量為30％-50％(wt)。微載體具有剛性致密結(jié)構(gòu)。殼核式結(jié)構(gòu)的微載體，其殼層為有利于細(xì)胞貼壁、生長的基質(zhì)，這種結(jié)構(gòu)既使微載體對磁場有響應(yīng)，又隔絕了磁粉與細(xì)胞的直接接觸，還防止了在培養(yǎng)基中磁粉的泄露、污染培養(yǎng)液和對細(xì)胞的傷害，培養(yǎng)結(jié)果表明適于Vero細(xì)胞貼壁生長。
本發(fā)明所用的其它附屬裝置包括培養(yǎng)基儲罐、收獲液儲罐、滅菌裝置、充氧裝置、溫度控制裝置、溶液pH值控制裝置、溶解氧控制裝置及必要的連接管路。培養(yǎng)基儲罐、收獲液儲罐和滅菌裝置為常規(guī)設(shè)計。充氧裝置是為了向培養(yǎng)基供氧，它連接在培養(yǎng)基的循環(huán)途中，可以直接向充氧裝置內(nèi)的液體通入富氧空氣或無菌空氣，或在充氧裝置內(nèi)采用氣體交換膜向培養(yǎng)基供氧，由溶解氧傳感器和溶解氧控制裝置控制供氧的通氣量。溫度控制裝置和溶液pH值控制裝置(包括傳感器)可選購商品設(shè)備。溫度控制方式有多種，對小型磁穩(wěn)定流化床可以在下端安裝冷卻棒和加熱棒，冷卻棒為套管結(jié)構(gòu)，內(nèi)通冷水；加熱棒可以是套管結(jié)構(gòu)，內(nèi)通熱水或蒸汽，或采用電熱絲加熱。溫度控制也可以采用水夾套控制溫度的方式。對大型磁穩(wěn)定流化床，可以在磁穩(wěn)定流化床內(nèi)壁安裝縱向排管，也可以用水夾套，或安裝多根冷卻棒和加熱棒，也可以在培養(yǎng)基循環(huán)途中安裝換熱器?？刂迫芤簆H值范圍的關(guān)鍵是避免溶液中的酸或堿過濃，對大型磁穩(wěn)定流化床可以采用噴淋的方式。最方便的控制方式是將控制元件全部安裝在充氧裝置上，這樣既可以簡化流化床主體的結(jié)構(gòu)，又可以避免局部的溫度過高以及酸或堿濃度的過高對細(xì)胞的傷害，其控制方式可以采用上述的各種方法，取決于充氧裝置的規(guī)模、制造工藝、成本和控制策略。
磁穩(wěn)定流化床所用的材質(zhì)，以能滅菌、不污染培養(yǎng)基、不損傷細(xì)胞、易加工為宜。對小型磁穩(wěn)定流化床，罐體可以用玻璃，頂蓋、接口、附屬管路、濾網(wǎng)、分布板等可用不銹鋼。對大型磁穩(wěn)定流化床可以都采用不銹鋼材質(zhì)。
對小型磁穩(wěn)定流化床，罐體上端不需要擴大段。對大型磁穩(wěn)定流化床，上端最好接有擴大段，以減少顆粒的夾帶。擴大段的內(nèi)徑為主體內(nèi)徑的1.0-2.0倍，高度為主體內(nèi)徑的0.5-3.0倍，擴大段下部錐段的錐角為40°-120°。
磁穩(wěn)定流化床截面的形狀為圓形、方形等。以圓形最佳，因為可以充分利用磁場的均勻部分，而且床內(nèi)的壁效應(yīng)最小。
磁穩(wěn)定流化床的高徑比為1∶1-20∶1，內(nèi)徑為1厘米-100厘米。
本發(fā)明使用磁敏性微載體，顆粒相對靜止，消除了顆粒間的碰撞和摩擦，提高了微載體的裝填密度，減少了細(xì)胞的損傷，磁敏性微載體的體積分率可以達(dá)到40％以上，從而提高了細(xì)胞培養(yǎng)的密度和單位磁穩(wěn)定流化床體積生產(chǎn)病毒的能力。用本發(fā)明的培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)Vero細(xì)胞(非洲綠猴腎細(xì)胞)生產(chǎn)乙腦病毒，使用自制的磁敏性微載體，細(xì)胞密度達(dá)到108個細(xì)胞/ml以上，遠(yuǎn)高于用攪拌式或氣升式反應(yīng)器所達(dá)到的細(xì)胞密度，病毒收獲液中病毒滴度達(dá)到8.5TCID50。
下面結(jié)合附圖及實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的說明。


圖1．本發(fā)明的磁穩(wěn)定流化床動物細(xì)胞和病毒培養(yǎng)系統(tǒng)示意圖；圖2．本發(fā)明的磁穩(wěn)定流化床結(jié)構(gòu)示意圖。1．流化床主體2．濾網(wǎng)3．支撐板4．液體分布板5．培養(yǎng)基入口6．滅菌蒸汽入口 7．排水8．培養(yǎng)基出口 9．廢棄培養(yǎng)基出口 10．壓力平衡口11．排氣口 12．微載體加入口13．接種口14．Helmholtz線圈15．充氧裝置16．充氧裝置的培養(yǎng)基入口17．充氧裝置的培養(yǎng)基出口18．富氧空氣或純氧入 19．溶液pH值傳感器 20．溶解氧傳感器21．溫度傳感器 22．控制裝置 23．酸或堿儲罐24．控溫執(zhí)行機構(gòu)25．富氧空氣或純氧源 26．恒流泵 27．空氣過濾器28．氣路閥門29．液面 30．新鮮培養(yǎng)基 31．蒸汽 32．空氣圖2是本發(fā)明磁穩(wěn)定流化床結(jié)構(gòu)示意圖。培養(yǎng)基從下端進(jìn)入流化床，從上端離開。磁穩(wěn)定流化床1內(nèi)裝有磁敏性微載體，用Helmholtz線圈14加上縱向磁場。磁穩(wěn)定流化床主體1的上部為錐形擴大段，目的是使液體離開顆粒層后速度降低，減少顆粒夾帶；磁穩(wěn)定流化床主體1的下部為錐形，以消除死角；磁穩(wěn)定流化床主體1的下端有濾網(wǎng)2，以防止顆粒泄露；濾網(wǎng)2下有支撐板3，以支撐濾網(wǎng)2；支撐板3下有液體分布板4，使液體均勻分布；濾網(wǎng)2、支撐板3和液體分布板4的材質(zhì)以能蒸汽滅菌且不污染培養(yǎng)液為準(zhǔn)，如陶瓷或不銹鋼。磁穩(wěn)定流化床主體1的下端設(shè)有5、6、7三個接口，5是培養(yǎng)基入口，6是滅菌蒸汽入口，7是排水口。磁穩(wěn)定流化床擴大段的側(cè)面設(shè)有8、9兩個接口，8是培養(yǎng)基出口，9是含病毒的收獲液出口(去收獲液儲罐)。磁穩(wěn)定流化床的上端面設(shè)有蒸汽或空氣的排氣口11，設(shè)有微載體加入口12，用以加入微載體顆粒，設(shè)有接種口13，手工接種時可用12作接種口。
磁穩(wěn)定流化床的結(jié)構(gòu)和操作工藝參數(shù)如下磁穩(wěn)定流化床主體內(nèi)徑10厘米，高50厘米；擴大段內(nèi)徑15厘米，高15厘米；擴大段與主體的連接部分高5厘米；主體下端的錐部高4厘米；培養(yǎng)的細(xì)胞為137代Vero細(xì)胞，擬收獲的產(chǎn)物是乙腦病毒；細(xì)胞培養(yǎng)基為添加8％胎牛血清的M199培養(yǎng)基，病毒培養(yǎng)基為添加1％人血清白蛋白的MEM培養(yǎng)基；所用的微載體的粒徑為100μm-150μm，矯頑力為20安培/米，濕比重為1.3g/cm3；用氧氣鋼瓶供氧；磁場的磁感應(yīng)強度為12mT；床內(nèi)的表觀液速為15厘米/分鐘；細(xì)胞接種密度為5×106個細(xì)胞/ml；培養(yǎng)細(xì)胞時溫度設(shè)定為37℃，溶液pH值設(shè)定為7.0，溶解氧設(shè)定為30％空氣飽和度；種毒滴度為8.0TCID50，接毒量為1∶100；培養(yǎng)病毒時溫度設(shè)定為37℃，溶液pH值設(shè)定為7.3，溶解氧設(shè)定為30％空氣飽和度。
(1)在磁場關(guān)閉的狀態(tài)下，清洗磁穩(wěn)定流化床動物細(xì)胞和病毒培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)的所有容器、管路；設(shè)定細(xì)胞培養(yǎng)所需的溶液pH值范圍、溶解氧范圍及反應(yīng)溫度；(2)將1.6公斤磁敏性微載體用溶液pH值7.0的磷酸緩沖液于37℃溶脹3小時，用磷酸緩沖液洗三次，然后由12號口加入磁穩(wěn)定流化床，再加入1升pH值7.0的磷酸緩沖液。向系統(tǒng)內(nèi)通入滅菌蒸汽，滅菌30分鐘；
(3)系統(tǒng)冷卻后將磁穩(wěn)定流化床內(nèi)的液體由7號口排出；經(jīng)微孔濾膜由5號口向磁穩(wěn)定流化床內(nèi)注入細(xì)胞培養(yǎng)基2升，浸泡磁敏性微載體12小時；(4)由13號口加入已制備好的Vero細(xì)胞懸液(種子液)；(5)經(jīng)過微孔濾膜由6號口按0.2升/分鐘的流量通入氧氣3分鐘，使顆粒懸浮并與液體充分混合，然后開啟磁場，停止通氣；每隔半小時重復(fù)“關(guān)閉磁場——通氣——開啟磁場——停止通氣”的過程，至接種后3小時；其中的“通氣”是指前述的“經(jīng)過微孔濾膜由6號口按0.2升/分鐘的流量通入氧氣3分鐘”；經(jīng)過微孔濾膜補足細(xì)胞培養(yǎng)基使充滿充氧裝置和管路；(6)啟動控制裝置和充氧裝置，讓細(xì)胞培養(yǎng)基循環(huán)；12小時后開始連續(xù)補充新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)基，同時棄去等量的由培養(yǎng)基出口流出的細(xì)胞培養(yǎng)基；培養(yǎng)基補充速率每隔12小時遞增一次，依次為10ml/分鐘、15ml/分鐘、20ml/分鐘、30ml/分鐘、40ml/分鐘、60ml/分鐘、80ml/分鐘、120ml/分鐘、160ml/分鐘。接入細(xì)胞120小時后停止補充細(xì)胞培養(yǎng)基，關(guān)閉磁穩(wěn)定流化床動物細(xì)胞和病毒培養(yǎng)系統(tǒng)的控制裝置和充氧裝置，停止細(xì)胞培養(yǎng)基的循環(huán)；在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，每隔6小時將磁場關(guān)閉一下，再重新開啟；此時細(xì)胞密度為1.2×108個細(xì)胞/ml；(7)將磁穩(wěn)定流化床培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)的細(xì)胞培養(yǎng)基排空，用Earle’s液洗滌系統(tǒng)2次，再用MEM洗滌系統(tǒng)1次；洗滌過程為注入洗滌液體將系統(tǒng)充滿并使洗滌液體在磁穩(wěn)定流化床內(nèi)以10cm/分鐘的速度循環(huán)2分鐘，停止循環(huán)并排空，然后將磁場關(guān)閉5秒再開啟。設(shè)定病毒培養(yǎng)過程所需的溶液pH值范圍、溶解氧范圍、反應(yīng)溫度；經(jīng)微孔濾膜由5號口向磁穩(wěn)定流化床內(nèi)注入病毒培養(yǎng)基2升，啟動磁穩(wěn)定流化床動物細(xì)胞和病毒培養(yǎng)系統(tǒng)的溫度控制裝置，由接種口接入乙腦病毒的種毒；關(guān)閉磁場，經(jīng)過微孔濾膜由6號口按0.2升/分鐘的流量通入氧氣3分鐘，使顆粒懸浮并與液體充分混合，然后開啟磁場，停止通氣；每隔25分鐘重復(fù)前述的“關(guān)閉磁場——通氣——開啟磁場——停止通氣”的過程至接毒后24小時，然后補足病毒培養(yǎng)基使充滿充氧裝置和管路；啟動磁穩(wěn)定流化床動物細(xì)胞和病毒培養(yǎng)系統(tǒng)的溶解氧控制裝置、pH控制裝置和充氧裝置，讓病毒培養(yǎng)基循環(huán)；接入種毒72小時后開始經(jīng)過微孔濾膜連續(xù)補充新鮮的病毒培養(yǎng)基，同時由9號口收獲等量的流出液體(含病毒)至收獲液儲罐。病毒培養(yǎng)基的補充速率為20ml/分鐘，連續(xù)收獲病毒。接入種毒72小時后停止收獲病毒。關(guān)閉相應(yīng)的管路。收獲液的病毒滴度為8.5TCID50。
(8)將磁穩(wěn)定流化床內(nèi)的殘液由5號口排至收獲液儲罐；關(guān)閉磁場，向系統(tǒng)內(nèi)通入滅菌蒸汽滅菌；將微載體由12號口水洗排出，進(jìn)行后處理；培養(yǎng)過程結(jié)束。
權(quán)利要求
1．一種用磁穩(wěn)定流化床培養(yǎng)貼壁依賴性動物細(xì)胞生產(chǎn)病毒的方法，其特征在于該方法的步驟為(1)在磁場關(guān)閉的狀態(tài)下，清洗磁穩(wěn)定流化床動物細(xì)胞和病毒培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)的所有容器、管路；在啟動磁穩(wěn)定流化床動物細(xì)胞和病毒培養(yǎng)系統(tǒng)的控制裝置之前設(shè)定細(xì)胞培養(yǎng)所需的溶液pH值范圍、溶解氧范圍及反應(yīng)溫度；(2)將磁敏性微載體預(yù)處理后由微載體加入口加入到磁穩(wěn)定流化床中，然后由滅菌蒸汽入口向系統(tǒng)內(nèi)通入蒸汽滅菌；或在通入蒸汽前加入緩沖液至浸沒磁敏性微載體再通入蒸汽滅菌，所述的緩沖液為磷酸緩沖液；或?qū)⒋琶粜晕⑤d體單獨滅菌后在無菌環(huán)境下加入到已經(jīng)滅菌的磁穩(wěn)定流化床中；其中磁敏性微載體的加入量按視體積計為磁穩(wěn)定流化床工作體積的10％～95％，磁敏性微載體的矯頑力低于200安培/米，粒徑為50μm～2mm，濕比重為1.1～2.5g/cm3，磁穩(wěn)定流化床的液體表觀流速為5厘米/分鐘～25厘米/分鐘，磁場強度為3～100mT；(3)冷卻后將磁穩(wěn)定流化床內(nèi)的液體由排水口排出；經(jīng)過微孔濾膜由磁穩(wěn)定流化床培養(yǎng)基入口向磁穩(wěn)定流化床內(nèi)注入細(xì)胞培養(yǎng)基至浸沒磁敏性微載體但不超過磁穩(wěn)定流化床的工作體積的95％，浸泡磁敏性微載體適當(dāng)時間；(4)由磁穩(wěn)定流化床的接種口加入已制備好的細(xì)胞種子液；(5)經(jīng)過氣體過濾裝置由磁穩(wěn)定流化床的滅菌蒸汽入口通入能使磁敏性微載體懸浮的無菌空氣或富氧空氣，持續(xù)5秒鐘以上，使磁敏性微載體顆粒懸浮并與液體充分混合，然后開啟磁場，停止通氣，20-30分鐘后關(guān)閉磁場——通氣——開啟磁場——停止通氣；以后每隔20-30分鐘重復(fù)關(guān)閉磁場——通氣——開啟磁場——停止通氣的過程，直至細(xì)胞在磁敏性微載體上貼壁完全；其中的通氣是指前述的經(jīng)過氣體過濾裝置通入能使磁敏性微載體懸浮的無菌空氣或富氧空氣并持續(xù)5秒鐘以上；經(jīng)過微孔濾膜補足細(xì)胞培養(yǎng)基使之充滿充氧裝置和管路；(6)啟動磁穩(wěn)定流化床動物細(xì)胞和病毒培養(yǎng)系統(tǒng)的控制裝置和充氧裝置，讓細(xì)胞培養(yǎng)基循環(huán)，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)過程；根據(jù)實際操作的需要，經(jīng)過微孔濾膜連續(xù)或分批補充新鮮細(xì)胞培養(yǎng)基，定時取樣分析，直至達(dá)到所需的細(xì)胞密度或預(yù)定的培養(yǎng)時間；關(guān)閉磁穩(wěn)定流化床動物細(xì)胞和病毒培養(yǎng)系統(tǒng)的控制裝置和充氧裝置，停止細(xì)胞培養(yǎng)基的循環(huán)；在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，每隔2-12小時將磁場關(guān)閉一下，再重新開啟；(7)將磁穩(wěn)定流化床培養(yǎng)系統(tǒng)中的細(xì)胞培養(yǎng)基排出，經(jīng)過微孔濾膜由培養(yǎng)基入口加入洗滌液至充滿培養(yǎng)系統(tǒng)，用洗滌液浸泡培養(yǎng)系統(tǒng)或使洗滌液在培養(yǎng)系統(tǒng)中循環(huán)一定時間，對磁穩(wěn)定流化床動物細(xì)胞和病毒培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行洗滌，然后排出洗滌液；設(shè)定病毒培養(yǎng)過程所需的溶液pH值范圍、溶解氧范圍、反應(yīng)溫度；經(jīng)過微孔濾膜加入病毒培養(yǎng)基至浸沒貼有細(xì)胞的磁敏性微載體但不超過磁穩(wěn)定流化床的工作體積的95％；啟動磁穩(wěn)定流化床動物細(xì)胞和病毒培養(yǎng)系統(tǒng)的溫度控制裝置，接入種毒；關(guān)閉磁場，經(jīng)過氣體過濾裝置由磁穩(wěn)定流化床的滅菌蒸汽入口通入能使貼有細(xì)胞的磁敏性微載體懸浮的無菌空氣或富氧空氣，持續(xù)5秒鐘以上，使貼有細(xì)胞的磁敏性微載體顆粒懸浮并與液體充分混合，然后開啟磁場，停止通氣，20-30分鐘后關(guān)閉磁場——通氣——開啟磁場——停止通氣；以后每隔20-30分鐘重復(fù)關(guān)閉磁場——通氣——開啟磁場——停止通氣的過程，直至病毒在細(xì)胞上吸附完全；其中的通氣是指前述的經(jīng)過氣體過濾裝置通入能使貼有細(xì)胞的磁敏性微載體懸浮的無菌空氣或富氧空氣并持續(xù)5秒鐘以上；經(jīng)過微孔濾膜補足病毒培養(yǎng)基使之充滿充氧裝置和管路；啟動磁穩(wěn)定流化床動物細(xì)胞和病毒培養(yǎng)系統(tǒng)的溶解氧控制裝置、pH控制裝置和充氧裝置，讓病毒培養(yǎng)基循環(huán)；適時將磁穩(wěn)定流化床培養(yǎng)基出口流出的液體切換至收獲液出口至收獲液儲罐，連續(xù)或分批收獲病毒，并同時經(jīng)過微孔濾膜補充病毒培養(yǎng)基，直至病毒收獲結(jié)束；關(guān)閉相應(yīng)的管路；(8)經(jīng)過微孔濾膜由磁穩(wěn)定流化床培養(yǎng)基入口泵入無菌水將磁穩(wěn)定流化床內(nèi)的殘液由上端收獲液出口頂出至收獲液儲罐，或由下端的培養(yǎng)基入口將殘液直接放至收獲液儲罐，或?qū)堃河膳潘谂懦?；關(guān)閉磁場，向系統(tǒng)內(nèi)通入蒸汽滅菌；將貼有細(xì)胞的磁敏性微載體由收獲液出口或微載體加入口水洗排出進(jìn)行后處理，培養(yǎng)過程完成。
2．如權(quán)利要求1所述的用磁穩(wěn)定流化床培養(yǎng)貼壁依賴性動物細(xì)胞生產(chǎn)病毒的方法，其特征在于所述的病毒培養(yǎng)基是指適合病毒增殖的培養(yǎng)基。
3．如權(quán)利要求1所述的用磁穩(wěn)定流化床培養(yǎng)貼壁依賴性動物細(xì)胞生產(chǎn)病毒的方法，其特征在于所述的步驟(7)中的洗滌次數(shù)為1-5次。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用磁穩(wěn)定流化床培養(yǎng)貼壁依賴性動物細(xì)胞生產(chǎn)病毒的方法。將培養(yǎng)系統(tǒng)和經(jīng)預(yù)處理的微載體清洗、滅菌后,注入細(xì)胞培養(yǎng)基浸泡微載體適當(dāng)時間;接種,讓細(xì)胞在微載體上貼壁,讓培養(yǎng)基循環(huán)、充氧,廢棄部分培養(yǎng)基同時補充新鮮培養(yǎng)基,進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)過程。更換病毒培養(yǎng)基,接入種毒;讓病毒在細(xì)胞上吸附完全;讓培養(yǎng)基循環(huán),適時將磁穩(wěn)定流化床培養(yǎng)基出口流出的液體切換至收獲液出口至收獲液儲罐,連續(xù)或分批收獲病毒。用本發(fā)明培養(yǎng)Vero細(xì)胞生產(chǎn)乙腦病毒,細(xì)胞密度達(dá)到10
文檔編號C12N7/00GK1303924SQ00100230
公開日2001年7月18日 申請日期2000年1月10日 優(yōu)先權(quán)日2000年1月10日
發(fā)明者叢威, 呂秀菊, 高紅亮, 歐陽藩 申請人:中國科學(xué)院化工冶金研究所