專利名稱：檢測含有唾液酸的莢膜糖的聚合化程度的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含有細(xì)菌莢膜糖，特別是載體偶聯(lián)糖的疫苗的分析和質(zhì)量控制領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
含有與載體蛋白相偶聯(lián)的莢膜糖的免疫原為本領(lǐng)域所熟知。偶聯(lián)將T細(xì)胞不依賴性抗原轉(zhuǎn)變?yōu)門細(xì)胞依賴性抗原，從而提高了記憶應(yīng)答并產(chǎn)生保護(hù)性免疫力，原型偶聯(lián)疫苗是b型流感嗜血桿菌(Hib)[例如，參見參考文獻(xiàn)1的第14章]。自Hib疫苗以來，開發(fā)了保護(hù)性抗腦膜炎奈瑟球菌(Neisseriameningitidis)(腦膜炎球菌)和肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)(肺炎球菌)的偶聯(lián)糖疫苗。其它(微)生物的感興趣偶聯(lián)疫苗有無乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)(B族鏈球菌)[2]、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)[3]和金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[4]。
除了利用全長莢膜糖，也可選擇水解步驟后產(chǎn)生的所需大小的寡核苷酸[例如參考文獻(xiàn)5]，有報導(dǎo)說用中等鏈長寡糖制成的偶聯(lián)物提高了免疫原性[例如參考文獻(xiàn)6和7]。三種已批準(zhǔn)的人用腦膜炎奈瑟球菌血清群C偶聯(lián)疫苗中，MenjugateTM[8]和MeningitecTM以寡糖為基礎(chǔ)，而NeisVac-CTM利用全長多糖。因此檢測寡糖長度(例如，檢測聚合度，或“DP”，即鏈中重復(fù)單元的數(shù)目)可用于間接評估免疫原性。
當(dāng)疫苗中含有寡糖片段時，生產(chǎn)和投放市場(release)的質(zhì)量控制需要寡糖具有明確的長度，并且各批之間此長度應(yīng)一致。因此，DP也可用于質(zhì)量控制，歐洲藥品質(zhì)量理事會(European Directorate for Quality of Medicines)(EDQM)為偶聯(lián)Hib疫苗制定了官方授權(quán)管制放行(Official Control Authority BatchRelease)(OCABR)，其專門要求遞交關(guān)于生產(chǎn)期間所用糖的DP與分子大小分布數(shù)據(jù)。
DP也可用于監(jiān)測疫苗穩(wěn)定性。糖抗原在室溫易于解聚[9、10]，導(dǎo)致免疫原性降低和疫苗異質(zhì)性增加。可通過跟蹤儲存期間DP隨時間的(變化情況)來監(jiān)測這種改變。
可采用許多方法檢測寡糖合并物(pool)中的平均DP，在一些情況中，方法的選擇取決于所分析的糖。已報道采用例如比色法和/或酶法分析Hib與腦膜炎球菌血清群A和C的寡糖[5、11、12]，但本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在腦膜炎球菌血清群W135和Y(“MenW135”和“MenY”)糖中存在糖苷鍵意味著不能用這些技術(shù)。
雖然以前已描述了檢測偶聯(lián)物疫苗中MenA和MenC糖DP的方法[例如，參考文獻(xiàn)5和13]，但仍需要可應(yīng)用于血清群W135和Y的糖的方法。因此，本發(fā)明的目的是改進(jìn)評估糖DP的方法，特別是提供可用于腦膜炎球菌血清群W135和Y糖DP的檢測方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了一種可用于檢測腦膜炎球菌血清群W135和Y莢膜糖DP的方法。因此，本發(fā)明提供一種檢測莢膜糖聚合度的方法，其特征在于該糖來自腦膜炎球菌血清群W135或血清群Y。該方法由于包括了色譜分離步驟而易于執(zhí)行。在含有大小不同的莢膜糖群的組合物中，本發(fā)明提供一種檢測平均DP的方法。
該方法通常包括水解糖以釋放組成單糖，并根據(jù)單糖進(jìn)行分析。因此，本發(fā)明提供一種檢測腦膜炎球菌血清群W135或血清群Y莢膜糖聚合度的方法，該方法包括以下步驟(i)水解該糖得到含有單糖亞基的糖水解物；(ii)定量測定水解物中的單糖亞基，其中步驟(ii)的定量結(jié)果用于計算出聚合度。
該方法在水解之前一般包括對該糖的末端殘基(可在還原端或非還原端)進(jìn)行化學(xué)修飾，從而在水解為單糖后可鑒別該末端殘基與非末端殘基。因此，本發(fā)明提供一種檢測腦膜炎球菌血清群W135或血清群Y莢膜糖聚合度的方法，該方法包括以下步驟(i)修飾該糖的末端單糖亞基產(chǎn)生修飾的末端單糖；(ii)水解該糖產(chǎn)生含單糖亞基，包括修飾的末端單糖的糖水解產(chǎn)物；(iii)定量測定水解產(chǎn)物中的單糖亞基；(iv)定量測定水解產(chǎn)物中修飾的末端單糖；和(v)利用步驟(ii)和(iv)的定量測定結(jié)果來計算出聚合度。
一般地說，該方法適用于含有一種以上不同類型單糖亞基和包含末端唾液酸殘基的任何糖。該方法的優(yōu)點是只根據(jù)對糖中唾液酸殘基的定量測定而無需分析任何其它類型單糖來提供DP信息。因此，本發(fā)明提供了一種檢測莢膜糖聚合度的方法，其中(a)所述糖含有唾液酸單糖亞基和非唾液酸單糖亞基；(b)所述糖含有末端唾液酸單糖亞基；和(c)該方法包括以下步驟(i)修飾該糖的末端唾液酸亞基產(chǎn)生修飾的末端唾液酸亞基；(ii)水解該糖產(chǎn)生含有唾液酸亞基，包括修飾的末端唾液酸亞基的糖水解差別物；(iii)定量測定水解產(chǎn)物中的唾液酸亞基，包括修飾的末端唾液酸亞基；和(iv)利用步驟(iii)的定量測定結(jié)果來計算出聚合度。
本發(fā)明的優(yōu)選方法是根據(jù)對糖中末端唾液酸殘基的還原，然后比較總唾液酸與還原唾液酸的摩爾比計算DP。因此，本發(fā)明提供一種檢測莢膜糖聚合度的方法，其中(a)所述糖含有唾液酸單糖亞基和非唾液酸單糖亞基；(b)所述糖含有末端唾液酸單糖亞基；和(c)該方法包括以下步驟(i)還原該末端唾液酸單糖亞基產(chǎn)生還原的唾液酸單糖亞基；(ii)水解該糖產(chǎn)生含有單糖亞基的水解產(chǎn)物；(iii)測定水解產(chǎn)物中總(即，還原的與非還原的)唾液酸與還原唾液酸之比率。
就含有大小不同的莢膜糖群的組合物而言，本發(fā)明提供檢測這些糖平均聚合度的方法，其中(a)所述糖含有唾液酸單糖亞基和非唾液酸單糖亞基；(b)所述糖含有末端唾液酸單糖亞基；和(c)該方法包括以下步驟(i)還原該末端唾液酸單糖亞基產(chǎn)生還原的唾液酸單糖亞基；(ii)水解該糖產(chǎn)生含有單糖亞基的糖水解產(chǎn)物；(iii)測定水解產(chǎn)物中總(即，還原的與非還原的)唾液酸與還原唾液酸之比率。該組合物可包含不含有末端唾液酸單糖亞基的糖。
已報道了分析聚唾液酸糖長度與組成的方法[14]，該方法中氧化和/或還原末端殘基，然后用神經(jīng)氨酸酶消化該糖釋放其唾液酸單糖亞基。然而，所述的此現(xiàn)有技術(shù)只用于單由唾液酸(包括N-乙?；?神經(jīng)氨酸、N-乙醇?；?神經(jīng)氨酸和脫氨基唾液酸)構(gòu)成的糖，在技術(shù)上限于可酶切為單糖的糖。相反，本發(fā)明方法可處理包含非唾液酸單糖的糖，并且無需(但不排除)采用酶水解。
本發(fā)明人也發(fā)現(xiàn)可用于檢測腦膜炎球菌血清群C莢膜糖DP的方法。該方法同樣是基于對末端唾液酸殘基的還原，并以相同方式計算DP。一般來說，該方法適用于含有α2→9相連唾液酸殘基的任何糖。該方法優(yōu)點是不涉及酶解聚。因此，本發(fā)明提供檢測莢膜糖聚合度的方法，其中(a)所述糖含有α2→9相連的唾液酸單糖亞基；(b)所述糖含有末端唾液酸單糖亞基；和(c)該方法包括以下步驟(i)還原該末端唾液酸單糖亞基產(chǎn)生還原的唾液酸單糖亞基；(ii)水解該糖產(chǎn)生含有單糖亞基的水解產(chǎn)物；(iii)測定水解產(chǎn)物中總(即，還原的與非還原的)唾液酸與還原唾液酸之比率。
就含有大小不同的莢膜糖群的組合物而言，本發(fā)明提供檢測這些糖平均聚合度的方法，其中(a)所述糖含有α2→9相連的唾液酸單糖亞基；(b)這些糖含有末端唾液酸單糖亞基；和(c)該方法包括以下步驟(i)還原該末端唾液酸單糖亞基產(chǎn)生還原的唾液酸單糖亞基；(ii)水解這些糖產(chǎn)生含有單糖亞基的水解產(chǎn)物；(iii)測定水解產(chǎn)物中總(即，還原的與非還原的)唾液酸與還原唾液酸之比率。
已報道了分析聚唾液酸糖的長度與組成的方法[14]，該方法中氧化和/或還原末端殘基，然后用神經(jīng)氨酸酶消化該糖釋放其唾液酸單糖亞基。然而，所述的此現(xiàn)有技術(shù)只能用于由α2→8相連唾液酸構(gòu)成的糖，在技術(shù)上限于可酶切為單糖的糖。相反，本發(fā)明方法涉及α2→9相連的唾液酸，優(yōu)點是不采用酶水解，一般用化學(xué)(例如，酸)水解。
測定血清群C糖長度的方法已知[5]，此方法通過比較總唾液酸和高碘酸鹽處理MenC糖所產(chǎn)生的甲醛之比來測定DP。此現(xiàn)有技術(shù)和方法涉及修飾聚合物的非還原末端，而不涉及產(chǎn)生唾液醇(sialitol)。
含有唾液酸殘基和非唾液酸殘基的莢膜糖在一些實施方案中，本發(fā)明提供含有唾液酸單糖亞基和非唾液酸單糖亞基的糖的分析方法。更具體地說，所述糖優(yōu)選由重復(fù)單元構(gòu)成，這些重復(fù)單元由唾液酸單糖亞基和非唾液酸單糖亞基構(gòu)成。
感興趣的兩種具體的糖是腦膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)血清群W135和Y的莢膜糖。這些糖天然在其還原末端含有唾液酸殘基，在其非還原末端含有葡萄糖或半乳糖。這些血清群天然糖中的唾液酸是N-乙?；窠?jīng)氨酸或“NeuNAc”。
血清群W135糖是由唾液酸-半乳糖二糖單元組成的聚合物。其7和9位唾液酸的O-乙酰化(水平)不同[15]。該結(jié)構(gòu)如

圖1所示，書寫為→4)-D-Neup5Ac(7/9OAc)-α-(2→6)-D-Gal-α-(1→。
除了二糖重復(fù)單元含有葡萄糖而非半乳糖外，血清群Y糖與血清群W135糖類似(參見圖3)。其7和9位唾液酸的O-乙?；?水平)不同[15]。該結(jié)構(gòu)如圖2所示，書寫為→4)-D-Neup5Ac(7/9OAc)-α-(2→6)-D-Glc-α-(1→。
在其它實施方案中，本發(fā)明提供含有(α2→9)相連唾液酸的糖的分析方法。血清群C莢膜糖是(α2→9)相連的在7和/或8位唾液酸O-乙?；?不同)的均聚物。
血清群C、W135和Y的莢膜不同于具有(α1→6)相連的N-乙?；?D-甘露糖胺-1-磷酸均聚物的血清群A(莢膜)和具有(α2→8)相連的唾液酸均聚物的血清群B(莢膜)。
聚合度糖的聚合度定義為該糖中重復(fù)單元的數(shù)目。因此，均聚物的聚合度與單糖單元的數(shù)目相同。而雜聚物的聚合度是整個鏈長中單糖單元的數(shù)目除以最小重復(fù)單元中單糖單元的數(shù)目，例如(Glc-Gal)10的DP是10而非20，而(Glc-Gal-Neu)10的DP是10而非30。
在具有相同基本重復(fù)結(jié)構(gòu)但長度不同的糖混合物中(例如，在長的多糖的部分水解產(chǎn)物中)，通常是檢測群體的平均DP而非檢測各分子的DP。如果糖的大小范圍太大使測定平均值沒有意義，則可在分離后(例如，按糖的大小分離后)檢測混合物各組分的DP。總體上，本發(fā)明可用于檢測含有混合長度的糖組合物的平均DP。
還原末端唾液酸單糖亞基本發(fā)明用于分析含有末端唾液酸殘基的糖。具體地說，本發(fā)明用于分析在還原末端含有唾液酸殘基的糖。
可采用任何合適的化學(xué)(方法)來還原末端唾液酸殘基，一般包括使糖與還原劑一起溫育。可采用常規(guī)分析確定任何給定還原劑和任何給定糖的合適條件。
優(yōu)選的還原劑是可在堿性條件下還原末端唾液酸殘基的硼氫化鈉(NaBH4)。此還原(反應(yīng))的產(chǎn)物有時稱為唾液醇[16]。一般在37℃與NaBH4溫育2小時足夠。在堿性條件下還原后，優(yōu)選(例如)加入溫和的酸性乙酸銨中和組合物。
水解糖產(chǎn)生糖水解產(chǎn)物末端唾液酸殘基還原后，糖分解成其組成單糖單元?；\統(tǒng)地說，可通過化學(xué)(方法)或酶(方法)解聚糖產(chǎn)生單糖。然而，如果沒有可進(jìn)行給定切割的酶，則必需采用化學(xué)途徑。
糖的化學(xué)水解一般包括在該領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)條件下用酸或堿處理。將莢膜糖解聚為其組成單糖的條件是本領(lǐng)域已知的。血清群W135和Y糖優(yōu)選酸水解。利用TFA(三氟乙酸)的酸水解可用于水解所有的血清群C、W135和Y，血清群C的溫育溫度宜略低以免其唾液酸降解(90℃而非100℃)。典型的TFA處理包括加入終濃度為2M的TFA，然后加熱至90-100℃，90分鐘。為分析總糖含量，可在80℃用100mM HCl處理2小時來水解血清群C糖[17]。其它典型的水解條件包括升溫(例如，70-80℃)用毫摩爾濃度的弱酸(例如乙酸)處理。
本發(fā)明采用可用于切割血清群C中α2→9連接鍵的酶。然而，這些酶通常需要這些糖在水解前脫-O-乙?；?，因此如果要維持O-乙?；痆15]，優(yōu)選用化學(xué)(方法)水解糖。酶水解作用緩慢時也優(yōu)選化學(xué)水解。但一般買不到可用于切割血清群W135和Y糖的酶。
雖然在上文中本發(fā)明就制備和分析含單糖亞基的水解產(chǎn)物作了定義，本發(fā)明也可應(yīng)用于含有二糖、三糖、四糖等莢膜糖片段的水解產(chǎn)物，但制備單糖水解產(chǎn)物更容易。提供二糖、三糖、四糖等糖的均質(zhì)群，即控制只有一種待定量測定化合物的水解條件的難度遠(yuǎn)大于簡單地完全解聚，即得到單糖。
解聚后，可利用，例如真空干燥器干燥糖水解產(chǎn)物。
測定總唾液酸與還原唾液酸的比例水解得到含有原始糖的單糖亞基的糖水解產(chǎn)物。在所述糖同時含有唾液酸亞基和非唾液酸亞基的實施方案中，水解產(chǎn)物含有唾液酸和非唾液酸單糖；在所述糖是唾液酸均聚物的實施方案中，水解產(chǎn)物只含有唾液酸；在兩種情況中，唾液酸單糖組分可以是修飾形式(例如，還原形式)?？衫迷摻M分測定原始糖的DP。例如，如果混合物中十分之一的唾液酸殘基是修飾的殘基并且糖的最小重復(fù)單位只含有唾液酸殘基，則該原始糖的DP是10。
可根據(jù)分子的數(shù)目(例如，摩爾數(shù))、分子量、比例或濃度來測定各單糖的含量。為簡化比例的計算，特別是當(dāng)組成的單糖分子量不同，通常采用摩爾數(shù)，但可利用任何這些測量值互換以確定混合物的單糖含量。為定量檢測，可將分析結(jié)果與含量已知的某具體糖的標(biāo)準(zhǔn)品相比較。
優(yōu)選將解聚的混合物完全水解為單糖。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)有時會發(fā)生不完全水解得到存在二糖片段(即，MenW135的Gal-NeuNAc和MenY的Glc-NeuNAc)的混合物。例如，發(fā)現(xiàn)90℃用TFA處理MenW135或MenY糖產(chǎn)生單糖和二糖的混合物，而將水解溫度升至100℃基本上只產(chǎn)生單糖。即使90℃也不希望不完全水解，但現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)如果需要技術(shù)人員可修改具體的水解方法以確保完全水解，例如通過升高溫度等。
定量測定唾液酸單糖的方法是本領(lǐng)域熟知的。這些方法可以是直接或間接的(例如，它們可包括衍生單糖，然后分析與原始單糖含量的相關(guān)性)。優(yōu)選的方法能在其它單糖存在時分析唾液酸，從而無需在分析前將唾液酸與其它單糖分開。此外，這些方法可用于偶聯(lián)糖，從而無需在去偶聯(lián)后分開載體和糖。一種這樣的方法是一般采用脈沖電流分析檢測(PAD)的陰離子色譜，特別是高效陰離子交換色譜(HPAEC)[18，19]。HPAEC-PAD系統(tǒng)由DionexTMCorporation(Sunnyvale，CA)提供，例如BioLCTM系統(tǒng)，該系統(tǒng)利用諸如PA1[直徑10μm的聚苯乙烯基質(zhì)，與二乙烯基苯交聯(lián)度為2％，用500nm MicroBead季銨功能化的乳膠凝聚(交聯(lián)度5％)]或PA10[直徑10μm的乙基乙烯基苯基質(zhì)，與二乙烯基苯交聯(lián)度為55％，用460nm MicroBead雙功能季銨離子凝聚(交聯(lián)度5％)]柱。這些系統(tǒng)能定量分析混合物中的每種糖而無需衍生或在分析前分離。就糖類分析而言，在加入該柱前需要濾去其它化合物，DionexTM生產(chǎn)了用于此目的的預(yù)填裝捕獲柱和保護(hù)柱(guard)，例如用于除去氨基酸的氨基酸捕獲柱和硼酸鹽捕獲柱等。
定量測定解聚混合物中唾液酸單糖的另一方法是核磁共振法(NMR)。然而，為便于使用和高靈敏度，優(yōu)選本發(fā)明的色譜法。然而，在本發(fā)明的一些實施方案中，無論選擇何種方法，重要的是要能鑒別還原唾液酸和非還原唾液酸。這可包括它們各自的獨特信號，或者可包括一種獨特的信號和一種組合信號，這兩種給定信號之間的差異提供了所需信息。
定量測定唾液酸單糖的另一種方法是比色法[80]。此方法特別可用于TFA酸水解后定量測定非還原性唾液酸。
一旦測定了修飾和非修飾的(例如，還原和非還原的)唾液酸的相對含量后，則不難得到原始糖的DP。
除了定量測定水解產(chǎn)物中的唾液酸外，本發(fā)明方法也涉及定量測定可衍生自與唾液酸相同的糖或衍生自其它糖的其它單糖(例如，葡萄糖或半乳糖)。這些檢測方法可用于檢測DP以外的參數(shù)或者可用作DP測定的一部分，例如作為驗證或代替檢測總唾液酸，特別是當(dāng)唾液酸和其它單糖的摩爾含量如在W135和Y糖中那樣相同時。
本發(fā)明的方法一般是破壞性的。因此，不能對全部組合物實施該方法，更常見是采取感興趣組合物的樣品，然后分析該樣品。
偶聯(lián)物本發(fā)明可用于分析疫苗，特別是含有偶聯(lián)糖的疫苗中糖的含量。共價偶聯(lián)可通過將糖從T-細(xì)胞不依賴性抗原轉(zhuǎn)變?yōu)門-細(xì)胞依賴性抗原而引發(fā)免疫記憶來提高糖的免疫原性。偶聯(lián)對兒科疫苗特別有用，它是熟知的技術(shù)[例如，參考文獻(xiàn)20-29所總結(jié)的]?？蓪⑻侵苯优c載體相連[30，31]，但通常利用接頭或間隔臂，例如己二酸、β-丙酰胺[32]、硝基苯基-乙胺[33]、鹵代酰鹵(haloacylhalide)[34]、糖苷鍵[35]、6-氨基己酸[36]、ADH[37]、C4-C12組分[38]等。
偶聯(lián)物中的載體蛋白通常是細(xì)菌毒素或類毒素，例如白喉類毒素或破傷風(fēng)類毒素。CRM197白喉毒素衍生物[39-41]是MenjugateTM和MeningitecTM中的載體蛋白，而破傷風(fēng)類毒素用于NeisVacTM中。白喉類毒素用作MenactraTM中的載體。其它已知的載體蛋白包括腦膜炎奈瑟球菌外膜蛋白[42]、合成的肽[43，44]、熱激蛋白[45，46]、百日咳蛋白[47，48]、細(xì)胞因子[49]、淋巴因子[49]、激素[49]、生長因子[49]、含各種病原體衍生抗原的多種人CD4+T細(xì)胞表位的人工蛋白[50]、流感嗜血桿菌的D蛋白[51，52]、肺炎球菌表面蛋白PsPA[53]、鐵攝取蛋白[54]、艱難梭菌(C.difficile)的毒素A或B[55]等。組合物可利用一種以上載體蛋白以(例如)降低載體抑制的風(fēng)險，一種載體蛋白可攜帶多種糖抗原[56]。偶聯(lián)物的糖∶蛋白之比(w/w)一般在1∶5(即，蛋白過量)和5∶1(即糖過量)之間。除偶聯(lián)物之外，組合物還可含有游離載體蛋白[57]。
本發(fā)明特別可用于在偶聯(lián)前為產(chǎn)生該偶聯(lián)物需要確保選擇大小正確糖鏈的階段。
本發(fā)明使得可核查或監(jiān)測偶聯(lián)前全長多糖片段化的進(jìn)展(情況)。當(dāng)需要特定長度(長度范圍)的寡糖時，重要的是多糖片段化不應(yīng)太過分從而使解聚超過所需程度(例如，結(jié)束時產(chǎn)生了單糖)。本發(fā)明通過隨時間檢測平均鏈長從而可監(jiān)測此部分解聚的進(jìn)展(情況)。因此，本發(fā)明提供了檢測組合物中糖聚合度的方法，包括以下步驟(a)開始解聚組合物中的糖；和在隨后的一個或多個時間點，(b)如上所述檢測糖的DP。在最初一輪實驗中，通常在幾個時間點檢測DP以確定隨時間的進(jìn)展(情況)，但在建立標(biāo)準(zhǔn)條件后，一般在驗證目的所設(shè)定的時間點檢測DP。一旦DP達(dá)到所需水平，則該方法可包括額外步驟(c)例如通過洗滌、分離、冷卻等終止解聚。該方法也可包括在任選用化學(xué)方法活化后將解聚的糖與載體蛋白相偶聯(lián)的下一步驟。
本發(fā)明也能在片段化后選擇所需長度的寡糖鏈。因此，本發(fā)明提供用于制備糖偶聯(lián)物而選擇糖的方法，包括以下步驟(a)獲得含不同聚合度各種多糖片段的混合物的組合物；(b)將該混合物分離為次級混合物(sub-mixture)；(c)采用上述方法測定一種或多種次級混合物的DP；和(d)利用步驟(d)的結(jié)果選擇一種或多種次級混合物用于偶聯(lián)。該方法包括在步驟(a)之前使多糖片段化，或者可以從已制備的混合物開始。這些片段可以是相同多糖的片段，例如相同血清群多糖的片段。在步驟(d)之后，該方法可包括用任選的化學(xué)方法活化后與載體蛋白相偶聯(lián)的步驟。
為引入能與載體反應(yīng)的官能團(tuán)，一般在偶聯(lián)之前用化學(xué)方法活化糖。但糖活化的條件可導(dǎo)致水解，因此活化后須檢查DP。在恰當(dāng)?shù)牡胤叫g(shù)語“糖”應(yīng)包括活化的糖。此外，本發(fā)明提供制備活化糖用于制備糖偶聯(lián)物的方法，包括以下步驟(a)獲得某種糖；(b)化學(xué)方法活化該糖以引入能與載體蛋白反應(yīng)的官能團(tuán)；和(c)如上所述檢測步驟(b)產(chǎn)物的DP。該方法可包括其它步驟(d)使活化的糖與載體蛋白(其本身可以是已活化的)反應(yīng)產(chǎn)生糖偶聯(lián)物。該方法可包括在步驟(a)之前使多糖片段化，或者可以從已制備的混合物開始。
本發(fā)明也可在偶聯(lián)后使用。偶聯(lián)后，可以三種方式利用本發(fā)明來分析組合物第一，可在例如不同偶聯(lián)物混合之前，或者疫苗投放(市場)之前檢測組合物中總糖的DP(為管理或質(zhì)控目的)；第二，可檢測組合物中游離的未偶聯(lián)糖的DP，例如檢查不完全偶聯(lián)，或監(jiān)測游離糖隨時間變化的增加來追蹤偶聯(lián)物水解(情況)；第三，可為同樣的原因檢測組合物中偶聯(lián)糖的DP。第一和第三種方式需要在分析前將糖從偶聯(lián)物中釋放。然而，在糖偶聯(lián)涉及還原末端唾液酸殘基的反應(yīng)或修飾從而使該殘基不再能還原的情況中，本發(fā)明只可用于末端唾液酸可以再生(或還原的末端唾液酸可以直接再生)的糖。
為分別評估偶聯(lián)的與未偶聯(lián)的糖，必須使它們分離?？捎酶鞣N方法使水性組合物中的游離(即，未偶聯(lián)的)糖與偶聯(lián)糖相分離。偶聯(lián)反應(yīng)可改變糖的各種化學(xué)和物理參數(shù)，可利用這些差異來分離。例如，可采用大小分離使游離和偶聯(lián)糖相分離，因為偶聯(lián)的物質(zhì)因載體蛋白而具有較大的分子量。超濾是優(yōu)選的大小分離方法。作為替代方案，如果偶聯(lián)物吸附到佐劑上，則離心可使吸附的偶聯(lián)物(沉淀物)與水解后解吸的游離糖(上清液)相分離。
本發(fā)明提供分析糖偶聯(lián)物的方法，包括以下步驟(a)處理糖偶聯(lián)物以從載體上釋放糖；和(b)如上所述檢測所釋放糖的DP。本發(fā)明提供分析糖偶聯(lián)物組合物的方法，包括以下步驟(a)使組合物中未偶聯(lián)糖與偶聯(lián)糖相分離；和(b)如上所述檢測未偶聯(lián)糖和/或偶聯(lián)糖的DP。
本發(fā)明也提供投放疫苗為醫(yī)生所用的方法，包括以下步驟(a)制備含有莢膜糖偶聯(lián)物的疫苗，此疫苗中該糖含有唾液酸單糖亞基和非唾液酸單糖亞基；(b)如上所述分析該疫苗中糖的DP；和如果步驟(b)的結(jié)果表明DP可為臨床應(yīng)用所接受，則(c)投放該疫苗為醫(yī)生所用。可對包裝好的疫苗，或者包裝前的散裝疫苗實施步驟(b)。
混合糖本發(fā)明可分析含唾液酸的腦膜炎球菌莢膜糖組合物的DP。這些組合物也可含其它莢膜糖(例如，腦膜炎奈瑟球菌血清群A的莢膜糖，流感嗜血桿菌b的莢膜糖)，只要這些糖不含有可干擾總體分析的唾液酸。當(dāng)組合物中多種糖含有唾液酸殘基時，可采用參考文獻(xiàn)58所述的原理來區(qū)分不同糖。
腦膜炎球菌血清群A的莢膜糖是(α1→6)-連接的N-乙?；?D-甘露糖胺-1-磷酸的均聚物，其C3和C4位部分O-乙酰化。用封閉基團(tuán)取代此乙酰基可防水解[10]，這種修飾的糖仍是本發(fā)明意義內(nèi)的血清群A糖。
Hib莢膜糖是核糖、核糖醇和磷酸的聚合物。該糖稱為“PRP”(聚-3-β-D-核糖-(1，1)-D-核糖醇-5-磷酸)。
除莢膜糖以外的糖組分本發(fā)明所分析的組合物優(yōu)選不含有游離形式的唾液酸(不是莢膜糖水解所產(chǎn)生的任何背景單糖)。然而，如果存在唾液酸，則有兩種通用方法來盡量降低或避免干擾問題。第一，可檢測游離唾液酸的初始水平，然后從解聚混合物檢測的水平中扣除。第二，可在分析前將游離唾液酸從組合物中除去，例如采用過濾或透析?？捎贸瑸V膜來除去低分子量組分。
非糖組分除了分析組合物中的糖，該方法可包括分析其它組分或性質(zhì)，例如每種糖或偶聯(lián)物的重量克分子滲透濃度、pH、聚合度、蛋白質(zhì)含量(特別是載體蛋白)、鋁含量、洗滌劑含量、防腐劑含量等。
本發(fā)明提供制備疫苗組合物的方法，包括根據(jù)本發(fā)明分析糖的DP步驟，和測定組合物pH的步驟，然后任選將組合物的pH調(diào)節(jié)至所需值，例如6-8之間，或約7的步驟。
本發(fā)明也提供制備疫苗組合物的方法，包括以下步驟(a)提供如上所述經(jīng)DP-分析的莢膜糖；(b)將經(jīng)DP-分析的莢膜糖與一種或多種載體蛋白相偶聯(lián)；(c)任選分析該散裝疫苗的pH和/或其它性質(zhì)；和如果步驟(c)的結(jié)果表明該散裝疫苗可為臨床應(yīng)用所接受，則(d)將該散裝疫苗制備并包裝為人用疫苗。步驟(c)可包括評估最低糖濃度，評估未偶聯(lián)偶聯(lián)糖之比等。步驟(d)可包括包裝成單位劑型或多劑型，例如裝入小瓶或注射器中。用于注射的典型人用劑量體積是0.5ml。
本發(fā)明也提供制備疫苗組合物的方法，包括以下步驟(a)提供如上所述經(jīng)DP-分析的血清群W135和/或Y的莢膜糖；(b)將經(jīng)DP-分析的莢膜糖與一種或多種載體蛋白相偶聯(lián)產(chǎn)生偶聯(lián)糖；和(c)混合該偶聯(lián)糖與一種或多種其它抗原，例如以下抗原-腦膜炎奈瑟球菌血清群C莢膜糖抗原。
-腦膜炎奈瑟球菌血清群A莢膜糖抗原。
-腦膜炎奈瑟球菌血清群B蛋白質(zhì)抗原。
-腦膜炎奈瑟球菌血清群B微泡囊[59]、“天然OMV”[60]、細(xì)胞泡或外膜泡囊[例如，參考文獻(xiàn)61到66等]的制劑。
-b型流感嗜血桿菌糖抗原。
-肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)的抗原，例如多價偶聯(lián)糖抗原[例如，見參考文獻(xiàn)67到69]。
-甲肝病毒抗原，例如滅活的病毒[例如，70，71]。
-乙肝病毒抗原，例如表面和/或核心抗原[例如，71，72]。
-百日咳博德特菌(Bordetella pertussis)抗原，例如百日咳博德特菌的百日咳全毒素(PT)和絲狀血凝素(“FHA”)，任選與百日咳桿菌粘附素(pertactin)和/或凝集原2和3聯(lián)用[例如，參考文獻(xiàn)73和74]?？梢岳冒偃湛燃?xì)胞抗原。
-白喉抗原，例如白喉類毒素[參考文獻(xiàn)75的第3章]，例如CRM197突變體[例如，76]。
-破傷風(fēng)抗原，例如破傷風(fēng)類毒素[參考文獻(xiàn)75的第4章]。
-脊髓灰質(zhì)炎抗原[例如，77，78]，例如IPV。
這類抗原可吸附到鋁鹽佐劑上(例如，氫氧化鋁或磷酸鋁)。優(yōu)選含有任何其它糖抗原作為偶聯(lián)物。
批次間的一致性就人用疫苗制備而言，偶聯(lián)的糖應(yīng)在偶聯(lián)前(例如，糖和載體蛋白)、偶聯(lián)后、配制后與混合后進(jìn)行質(zhì)量控制。DP檢測的現(xiàn)有技術(shù)不涉及血清群W135和Y糖。然而，現(xiàn)在采用本發(fā)明可對此兩種血清群進(jìn)行DP檢測，并且可聯(lián)用血清群A和CDP檢測的方法。此外，本發(fā)明方法可靠而一致，從而可正確比較不同批次的混合A/C/W135/Y偶聯(lián)物，而這利用現(xiàn)有技術(shù)方法不可能。因此，可制備、檢驗不同批次的混合偶聯(lián)疫苗，然后選擇一致的批次投放市場應(yīng)用，而棄去異常批次。
本發(fā)明提供兩批疫苗，其中(a)這兩批疫苗均含有(i)腦膜炎奈瑟球菌血清群A莢膜糖偶聯(lián)物，(ii)腦膜炎奈瑟球菌血清群C莢膜糖偶聯(lián)物，(iii)腦膜炎奈瑟球菌血清群W135莢膜糖偶聯(lián)物，(iv)腦膜炎奈瑟球菌血清群Y莢膜糖偶聯(lián)物；(b)第一批中血清群A糖的DP是A1和第二批中血清群A糖的DP是A2；(c)第一批中血清群C糖的DP是C1和第二批中血清群C糖的DP是C2；(d)第一批中血清群W135糖的DP是W1和第二批中血清群W135糖的DP是W2；(e)第一批中血清群Y糖的DP是Y1和第二批中血清群Y糖的DP是Y2；(f)A1/A2、C1/C2、W1/W2和Y1/Y2各自的比例在0.90和1.10之間，優(yōu)選各自比例在0.95和1.05之間。
(f)所述比例可以根據(jù)所比較各批的一份樣品，但通常是根據(jù)各批的多份樣品的平均值(例如平均值)而定。因此，對兩批可取多個樣品，可多次檢測每份樣品的A1、A2、C1、C2、W1、W2、Y1和Y2，然后計算出每批的平均值，用該平均值計算出所需比例。
可分別制備每批(或每組)疫苗。例如，可分別混合同一種散裝偶聯(lián)物或混合分別制備的一種散裝偶聯(lián)物來制備不同的兩批。同一散裝混合物的不同樣品不是不同的批次，因為這些樣品不會發(fā)生制備不同偶聯(lián)物的混合物時所產(chǎn)生差異而導(dǎo)致的批次間差異。
除了上述(a)到(f)所述的特征外，該兩批(疫苗)的特征還在于(g)第一批中未偶聯(lián)的血清群A糖濃度是A3；(h)第二批中血清群A未偶聯(lián)糖濃度是A4；(i)第一批中未偶聯(lián)的血清群C糖濃度是C3；(j)第二批中未偶聯(lián)的血清群C糖濃度是C4；(k)第一批中未偶聯(lián)的血清群W135糖濃度是W3；如果適用，(1)第二批中未偶聯(lián)的血清群W135糖濃度是W4；(m)第一批中未偶聯(lián)的血清群Y糖濃度是Y3；(n)第二批中未偶聯(lián)的血清群Y糖濃度是Y4；(o)A3/A4、C3/C4、W3/W4和Y3/Y4的各自比例在0.90和1.10之間，優(yōu)選各自比例在0.95和1.05之間。
通用術(shù)語術(shù)語“含有”包括“包括”以及“包含”，例如“含有”X的組合物可排他性地由X組成或者可以包括其它的物質(zhì)，例如X+Y。
詞“基本上”不排除“完全”，例如“基本上不含”Y的組合物可以是完全不含Y。如果需要，詞“基本上”可從本發(fā)明的定義中省去。
與數(shù)值x相關(guān)的術(shù)語“約”表示，例如x±10％。
應(yīng)該理解糖環(huán)可存在開環(huán)和閉環(huán)形式，雖然本文的結(jié)構(gòu)式顯示了閉環(huán)形式，但本發(fā)明也包括開環(huán)形式。
附圖簡述圖1和2顯示了腦膜炎球菌血清群W135(11)和Y(2)莢膜糖的結(jié)構(gòu)式。圖3顯示了血清群W135和Y(莢膜糖)之間的差異。
圖4和5顯示了MenY糖在大小分離之前(4)和之后(5)的色譜圖。
圖6和7顯示了MenW135(6)和MenY(7)糖的ESI圖譜。
圖8顯示了MenW135 DP3糖基于其1H NMR圖譜的結(jié)構(gòu)。圖9顯示了MenY DP4糖的結(jié)構(gòu)。
圖10到12顯示了唾液酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的等度洗脫分布。
圖13顯示了MenY寡糖的梯度洗脫分布。
圖14顯示了唾液醇的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
圖15顯示了用HPAEC-PAD檢測MenW135(□)和MenY(◇)的DP在解聚期間降低。圖16和17顯示在同一過程中，在時間0點(A)MenW135(16)和MenY(17)與最終混合物(B)相比短寡聚物增加。
圖18顯示了MenC DP5的ESI圖譜，圖19顯示了MenC DP5的HPAEC分析。
圖20是MenW135寡糖的梯度洗脫分布圖。左軸顯示以nC(表示)的電流檢測值；右軸顯示洗脫劑(100mM乙酸鈉+20mM NaOH)％。
圖21顯示了MenW135寡糖的又一梯度洗脫分布。圖21A顯示標(biāo)準(zhǔn)樣品，圖21B顯示MenW135糖。
本發(fā)明的實施方式制備標(biāo)準(zhǔn)寡糖溶液采用參考文獻(xiàn)79所述的方法制備純化的血清群W135和Y莢膜多糖(CPS)。它們以0.01M乙酸配制的10mg/ml溶液提供。為水解CPS，將它們加熱至70-80℃，持續(xù)一段時間。水解期間，采集溶液樣品供分析，提取后使樣品冷卻并中和。此水解所得片段具有末端唾液酸殘基而非末端葡萄糖或半乳糖殘基。然后根據(jù)大小和電荷量在Q-瓊脂糖柱上進(jìn)行離子交換色譜純化這些寡糖。為(進(jìn)行)初始標(biāo)準(zhǔn)化，采用改進(jìn)的Svennerholm方法[80]檢測唾液酸含量，讀取564nm吸光值。分離特定的諸組分，用NMR、電噴霧質(zhì)譜和HPAEC分析寡糖的HPAEC分析利用裝在Dionex DX-500色譜系統(tǒng)上的CarpoPacPA100或IonPac AS11柱(均是4×250mm)，所述系統(tǒng)裝配了GP40泵、ED40檢測器和AS3500自動進(jìn)樣器。分離采用1.0ml/分鐘的流速，在室溫下進(jìn)行。
PA100柱利用以下洗脫劑A)500mM乙酸鈉+100mM氫氧化鈉和B)100mM氫氧化鈉。先用10％A(15分鐘)進(jìn)行初步等度洗脫，然后用10％到100％A液進(jìn)行線性梯度洗脫，50分鐘。AS11柱利用以下洗脫劑A)100mM氫氧化鈉和B)水，用5％到100％A液進(jìn)行線性梯度洗脫，50分鐘。
用脈沖電化學(xué)檢測器(ED40)以脈沖電流模式用金工作電極和Ag/AgCl參比電極監(jiān)測洗脫液。采用以下設(shè)置施加三相-電位波形E1＝0.05V；t1＝400ms；E2＝0.75v；t2＝200ms；E3＝-0.15V；t3＝400ms。在施加E1期間對200ms到400ms進(jìn)行積分。用PeakNet數(shù)據(jù)還原軟件(Dionex)積分和處理得到的色譜數(shù)據(jù)。
CarboPac PA100 HPAEC得到了MenW135和MenY寡糖的分布圖。通過比較純化的與合并的寡糖色譜圖對二圖譜進(jìn)行校正，同時用ESI-MS特征鑒定純化的寡糖使色譜圖中的峰數(shù)目與洗脫寡糖的DP相關(guān)連。
用裝配有電噴霧離子源的Micromass ZQ-4000質(zhì)譜分析儀進(jìn)行ESI質(zhì)譜測定。用以異丙醇/水50/50(v/v)稀釋的碘化鈉(2g/l)和碘化銫(50mg/l)校正該儀器。毛細(xì)管電壓是3kV，錐電壓是60V。將樣品溶解于50％(v/v)乙腈水溶液+0.1％甲酸中，以10μl/分鐘流速注射。以200到2000m/z掃描范圍以正離子模式記錄圖譜。
圖4和5顯示MenY寡糖混合物在Q-瓊脂糖(柱)分離之前(圖4)和之后(圖5)的HPAEC色譜圖(PA100柱)。對約38分鐘峰的ESI分析證實其是DP為4的MenY寡糖(圖7)。對MenW135進(jìn)行了類似的實驗，圖6顯示了DP3寡糖的ESI圖譜。
在ESI分析中，一種分子在該圖譜中可顯示多個分子離子(峰)，各峰對應(yīng)于具有不同O-乙?；〈哪阁w分子和加鈉離子。在樣品分析期間因存在一定量的鈉可出現(xiàn)加鈉離子(峰)，這常見于寡糖的質(zhì)譜中觀。此外，母體分子可攜帶數(shù)量不同的正電荷，因此取決于O-乙?；〈⒓尤氲拟c和正電荷的數(shù)目，寡糖可產(chǎn)生許多不同的正離子。因此，圖6和7中有大量正離子。
在圖6中，700-800與1400-1526m/z之間的各峰分別對應(yīng)于加入的鈉陽離子和O-乙酰基所產(chǎn)生的雙電荷與單電荷離子。它們分配為與三聚寡糖(MenW135 DP3)質(zhì)量相對應(yīng)的以下單一同位素質(zhì)量

aMW計算器(MassLynx software)從單一同位素質(zhì)量計算的理論離子；bO-乙?；〈臄?shù)目；c作為反離子的鈉的數(shù)目。
在圖7中，900-1100和1800-2000m/z之間各峰分別對應(yīng)于加入鈉陽離子和O-乙?；a(chǎn)生的雙電荷與單電荷離子。它們分配為與三聚寡糖(MenY DP4)質(zhì)量相對應(yīng)的以下單一同位素質(zhì)量


將凍干的寡糖溶解于750μL 99.9％D2O(AldrichTM)中得到10-15mM濃度的溶液來制備NMR樣品。每次實驗用5mm WilmadTMNMR試管。NMR圖譜以298K記錄在裝有5mm TBI三共振雜核探針和BGU單元的BrukerTMNMR Spectrometer Avance DRX 600MHz上。用Bruker XWINNMR 3.0軟件獲取和處理數(shù)據(jù)。獲取1H標(biāo)準(zhǔn)圖譜的條件是收集6000Hz的整個波譜窗口經(jīng)4次掃描和10秒延后松弛的32k數(shù)據(jù)點。應(yīng)用0.1Hz線性拓寬功能和參比4.79ppm處單-氘化水后，將1H NMR圖譜經(jīng)傅立葉轉(zhuǎn)換。進(jìn)行13C和2D NMR實驗(雙量子過濾的COSY和HSQC)來指定寡糖的1H圖譜。
通過與公開數(shù)據(jù)[81]作比較和兩維質(zhì)子-質(zhì)子COSY和質(zhì)子-碳HSQC相關(guān)譜指定腦膜炎球菌W135和Y寡糖的質(zhì)子NMR圖譜。除了質(zhì)子化學(xué)位移之外，同核與雜核偶聯(lián)常數(shù)提供了豐富的結(jié)構(gòu)信息。W135(圖8)和MenY(圖9)寡糖的高分辨率NMR圖譜顯示相對尖銳的信號，從而可具體確定Gal/Glc部分的端基異構(gòu)質(zhì)子和NeuNAc部分的H3eq/axNeuNAc的峰分配。這些峰位于圖譜中不與其它信號疊加從而可能使線性分辨率復(fù)雜化的區(qū)域。通過該擴展圖譜可確定信號的質(zhì)子化學(xué)位移


1H NMR圖譜證實了糖鏈的分子結(jié)構(gòu)，相同性和完整性，顯示樣品的DP值是DPMenW135＝3；DPMenY＝4。
因此，Q-瓊脂糖柱能通過DP分辨寡糖，ESI和NMR分析證實這些寡糖標(biāo)準(zhǔn)品是MenW135 DP3；和MenY DP4?？刹捎帽景l(fā)明方法分析這些標(biāo)準(zhǔn)品。
DP的色譜分析調(diào)整寡糖樣品使之在100μl中含有0.5mg/ml唾液酸。用10mM NaOH配制的100μl，40mM NaBH4溶液處理這些樣品。樣品于37℃在封閉的螺帽蓋試管中加熱2小時。為終止反應(yīng)，用10μl，5M pH 6.0乙酸銨處理樣品，并在室溫下維持30分鐘。加入200μl甲醇，然后在真空下用裝有冷凝捕獲器(Savant SC110)的Speed Vac濃縮器干燥1小時。
用100μl Milli-Q水和100μl 4M TFA(終濃度2M)重建樣品，100℃加熱90分鐘。然后用裝有兩個冷凝捕獲器(Savant SC110)的Speed Vac濃縮器干燥水解產(chǎn)物1小時。
為進(jìn)行HPAEC-PAD分析，將樣品溶解于1.0ml Milli-Q脫氣水中，然后過濾(0.22μm)。用同樣的Dionex系統(tǒng)分析水解產(chǎn)物，但使用配有BorateTrap保護(hù)柱的Carbopac PA1柱(4×250mm)。此柱和保護(hù)柱比PA100和AS11柱更適合分析單糖。一些實驗利用50mM乙酸鈉+20mM氫氧化鈉作等度洗脫，其它實驗利用以下洗脫劑作梯度洗脫A)100mM乙酸鈉+20mM氫氧化鈉和B)20mM氫氧化鈉，從10％到70％A液梯度洗脫(曲線7)。如上所述分析洗脫液。
此裝置可鑒別唾液酸和唾液醇，獲得各自的定量測定結(jié)果。利用總(即，還原的和非還原的)唾液酸與還原唾液酸之比計算出起始寡糖的DP。
對于初步測試，制備2.0μg/ml純唾液酸(Sigma，Steinheim，德國)的標(biāo)準(zhǔn)溶液并如上所述經(jīng)NaBH4還原。通過HPAEC用等度洗脫分析各時間點的樣品。在37℃用0.04M NaBH4處理2小時使標(biāo)準(zhǔn)品中的唾液酸完全還原。圖10顯示了0點時間的樣品，圖11顯示了2小時的樣品，保留時間從8.5降低至4.7-5.0。
唾液醇的不可分辨的非對映異構(gòu)體導(dǎo)致產(chǎn)生了圖11中的雙峰[14]。在100℃用2M TFA處理唾液酸標(biāo)準(zhǔn)品90分鐘能除去該雙峰(圖12)，從而得到可用于唾液醇定量的單峰。就去除的效率和簡易程度而言[82-84]，已知TFA水解適合于糖切割，已用于分析幾種糖疫苗[82]。因此，利用TFA進(jìn)行糖酸水解有三個目的-唾液酸的有效水解、有效去除和去除唾液醇的分解峰。
如上所述處理預(yù)計DP范圍在3-5之間MenY寡糖樣品，但色譜洗脫的等度條件沒能良好分離唾液醇的峰。因此用梯度洗脫代替，得到的色譜圖如圖13所示。唾液醇和唾液酸的保留時間分別為19.3和29.8分鐘。采用同一方法分析了預(yù)計DP范圍在3-5之間的MenW135寡糖樣品(圖20)。在19.33分鐘觀察到唾液醇，在29.77分鐘觀察到唾液酸。
為有助于定量分析圖13和圖20的色譜圖，根據(jù)濃度已知的唾液酸和唾液醇制作了標(biāo)準(zhǔn)曲線。該標(biāo)準(zhǔn)曲線采用了0.5、1.0、2.0、4.0和6.0μg/ml的唾液酸或唾液醇。檢測器的線性反應(yīng)圖見圖14。
通過與這些標(biāo)準(zhǔn)曲線相比較，可定量MenW135和MenY樣品中唾液醇和唾液酸的含量。例如，MenW135洗脫液中19.33分鐘峰下面的面積(圖20)計算為44914068。參比該標(biāo)準(zhǔn)曲線，唾液醇的濃度計算為7.96μg/ml。在一式兩份的實驗中，觀察到的濃度為8.05μg/ml。兩次分析得到的平均值為8.005μg/ml。由于樣品在分析前稀釋了10倍，原始平均唾液醇濃度為80.05μg/ml。比色法檢測總唾液酸得到的濃度為241.09μg/ml。鑒于唾液酸和唾液醇之間微小的質(zhì)量差異，將這些濃度轉(zhuǎn)換為摩爾濃度(事實上，此質(zhì)量差異極小以致于不轉(zhuǎn)換為摩爾濃度也得到了優(yōu)秀的近似值)，摩爾比計算為3(即，DP＝3)。從兩個不同的一式兩份分析結(jié)果計算出的比例如下

利用三種不同的硼酸鹽前置捕獲柱分析一式四份的一種MenW135樣品評估了唾液醇檢測方法的可重復(fù)性。結(jié)果如下

*分別檢測，一式兩份分析因此，這些結(jié)果顯示了良好的可重復(fù)性(CV％＜2％)。
將0.01M乙酸配制的全長MenY或MenW135CPS的10mg/ml溶液加熱至70-80℃。在水解期間，取樣測定平均DP來追蹤反應(yīng)進(jìn)程，多達(dá)6小時?？焖倮鋬鰳悠罚S持于-20℃，然后用IonPac AS11柱進(jìn)行一式兩份的分析。結(jié)果如下


因此，DP檢測顯示DP隨時間推移逐步降低(圖15)。如圖16(MenW315)和17(MenY)所示，其中16A/17A在時間0點，16B/17B在6小時后，用IonPac AS11色譜分析顯示了在酸水解期間低分子量寡糖含量如何隨時間增加，從而證實已得到解聚。
血清群W135樣品制備血清群W135的莢膜糖。在制備期間，用本文所述方法檢測其DP。圖21B顯示了此糖100倍稀釋液的色譜圖，圖21A顯示了6μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)品。兩種情況中均用100mM乙酸鈉加20mM NaOH洗脫，在30分鐘期間10％洗脫緩沖液線性上升至30％洗脫緩沖液，最后跳躍至100％洗脫緩沖液，10分鐘。
唾液醇標(biāo)準(zhǔn)品顯示在16.383分鐘洗脫；樣品中，在16.350分鐘有峰。
下文顯示同一樣品兩次不同分析與五種標(biāo)準(zhǔn)品的分析特性以及計算出的唾液醇濃度

根據(jù)分析(a)和(b)的平均值，該樣品中有3.339μg/ml唾液醇。按初始稀釋度校正，初始唾液醇濃度為333.9μg/ml?？偼僖核釞z測為5732.6μg/ml，DP值為17.2。
血清群C分析如前文[5]所述獲得純化的MenC DP5寡糖。以正離子模式進(jìn)行ESI MS分析。質(zhì)譜見圖18，明顯有三組主要的離子。對最高強度(856-941m/z)的峰仔細(xì)檢查表明這些峰對應(yīng)于帶雙電荷的五糖，而1733-1826m/z的峰對應(yīng)于帶單電荷的五糖，二者的O-乙?；〈妥鳛榉措x子的鈉的數(shù)目不同。
用本發(fā)明的色譜方法測定了MenC DP5寡糖的DP，色譜圖的分析見圖19。分別分析了這些寡糖的四種分離物，結(jié)果如下

結(jié)論糖分子的大小在設(shè)計前述偶聯(lián)疫苗中重要[6，7]，中等鏈長的寡糖顯示較好的免疫原性。(本發(fā)明)顯示了用酸水解啟動莢膜多糖的初步解聚[79]后中等大小MenW135和MenY寡糖的制備、分離和特征鑒定。本發(fā)明提供了測定這些寡糖聚合度的新型色譜方法，經(jīng)NMR和ESI-MS分析證實這些方法顯示了良好的精密度和精確性。此外，該方法也可用于測定血清群C寡糖的DP。
其它實驗性細(xì)節(jié)見參考文獻(xiàn)85。
應(yīng)理解只通過實施例對本發(fā)明進(jìn)行了描述，可作出一些改進(jìn)而仍屬于本發(fā)明的范圍和構(gòu)思內(nèi)。
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權(quán)利要求
1.一種檢測莢膜糖聚合度的方法，其中(a)所述糖含有α2→9相連的唾液酸單糖亞基；(b)所述糖含有末端唾液酸單糖亞基；和(c)該方法包括以下步驟(i)還原該末端唾液酸單糖亞基產(chǎn)生還原的唾液酸單糖亞基；(ii)水解該糖產(chǎn)生含單糖亞基的水解產(chǎn)物；(iii)測定水解產(chǎn)物中總唾液酸與還原唾液酸之比。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，使所述糖與還原劑一起溫育來還原所述末端唾液酸殘基。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述還原劑是硼氫化鈉。
4.如權(quán)利要求1到3中任一項所述的方法，其特征在于，通過化學(xué)方法或酶方法進(jìn)行所述水解步驟。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，采用酸水解。
6.如以上任一項權(quán)利要求所述的方法，其特征在于，所述莢膜多糖是大小不同的莢膜糖群體，本發(fā)明提供這些糖的平均聚合度。
7.一種檢測莢膜糖聚合度的方法，其中(a)所述糖含有唾液酸單糖亞基和非唾液酸單糖亞基；(b)所述糖含有末端唾液酸單糖亞基；和(c)該方法包括以下步驟(i)修飾該糖的末端唾液酸亞基產(chǎn)生修飾的末端唾液酸亞基；(ii)水解該糖產(chǎn)生含有唾液酸亞基，包括修飾的末端唾液酸亞基的糖水解產(chǎn)物；(iii)定量測定水解產(chǎn)物中的唾液酸亞基，包括修飾的末端唾液酸亞基；和(iv)利用步驟(iii)的定量測定結(jié)果計算出聚合度。
8.一種檢測組合物中糖聚合度的方法，包括以下步驟(a)開始解聚該組合物中的糖；和在隨后的一個或多個時間點，(b)用以上任一項權(quán)利要求所述方法檢測糖的DP。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，還包括在經(jīng)任選的化學(xué)方法活化后使解聚的糖與載體蛋白相偶聯(lián)的步驟。
10.一種檢測莢膜糖聚合度(DP)的方法，其特征在于，所述糖來自腦膜炎球菌血清群W135或血清群Y。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于所述方法包括以下步驟(i)水解該糖產(chǎn)生含有單糖亞基的糖水解產(chǎn)物；(ii)定量測定水解產(chǎn)物中的單糖亞基，其中利用步驟(ii)的定量結(jié)果計算出聚合度。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟(i)修飾該糖的末端單糖亞基產(chǎn)生修飾的末端單糖；(ii)水解該糖產(chǎn)生含有單糖亞基，包括修飾的末端單糖的糖水解產(chǎn)物；(iii)定量測定水解產(chǎn)物中的單糖亞基；(iv)定量測定水解產(chǎn)物中修飾的末端單糖；和(v)利用步驟(ii)和(iv)的定量測定結(jié)果計算出聚合度。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，步驟(i)中所述的修飾是還原末端唾液酸殘基，步驟(iii)中定量測定的單糖是總唾液酸，和通過比較總唾液酸和還原唾液酸之比來計算DP。
14.一種分析包含糖與載體的糖偶聯(lián)物的方法，包括以下步驟；(a)處理該糖偶聯(lián)物從載體釋放出糖；和(b)采用以上權(quán)利要求中任一項所述的方法檢測所釋放糖的DP。
15.一種制備疫苗組合物的方法，包括以下步驟(a)提供采用以上權(quán)利要求1到13中任一項所述方法計算出DP的莢膜糖；(b)將經(jīng)DP-分析的糖與一種或多種載體蛋白相偶聯(lián)；(c)任選分析該散裝疫苗的pH和/或其它性質(zhì)；和如果步驟(c)的結(jié)果表明該散裝疫苗可為臨床應(yīng)用所接受，則(d)將該散裝疫苗制備并包裝為人用疫苗。
16.兩批疫苗，其中(a)兩批疫苗均含有(i)腦膜炎奈瑟球菌血清群A莢膜糖偶聯(lián)物，(ii)腦膜炎奈瑟球菌血清群C莢膜糖偶聯(lián)物，(iii)腦膜炎奈瑟球菌血清群W135莢膜糖偶聯(lián)物，(iv)腦膜炎奈瑟球菌血清群Y莢膜糖偶聯(lián)物；(b)第一批中血清群A糖的DP是A1，第二批中血清群A糖的DP是A2；(c)第一批中血清群C糖的DP是C1，第二批中血清群C糖的DP是C2；(d)第一批中血清群W135糖的DP是W1，第二批中血清群W135糖的DP是W2；(e)第一批中血清群Y糖的DP是Y1，第二批中血清群Y糖的DP是Y2；(f)A1/A2、C1/C2、W1/W2和Y1/Y2各自的比例在0.90和1.10之間。
全文摘要
聚合度(DP)是分析糖抗原，特別是偶聯(lián)糖的重要參數(shù)。本發(fā)明提供可用于檢測莢膜糖，具體說是腦膜炎球菌糖，例如血清群W135和Y莢膜糖DP的方法。優(yōu)選方法根據(jù)糖末端唾液酸殘基的還原，然后比較總唾液酸與還原唾液酸的摩爾比來計算DP。
文檔編號A61K39/095GK101039962SQ200580021069
公開日2007年9月19日 申請日期2005年5月23日 優(yōu)先權(quán)日2004年5月21日
發(fā)明者A·巴多蒂 申請人:啟龍有限公司