:3527310363；Baneyx(2004)Protein ExpressionTechnologies,Taylor&Francis,ISBN-10:0954523253)〇
[0118] 本文所述定義及方法被提供來更好地定義本公開并且在本公開的實踐中指導(dǎo)本 領(lǐng)域技術(shù)人員。除非另外說明，否則術(shù)語應(yīng)按照相關(guān)技術(shù)領(lǐng)域的一般技術(shù)人員的常規(guī)用法 來理解。
[0119] 在一些實施方案中，用來描述并要求本公開某些實施方案的表達成分的量、性質(zhì) (諸如分子量）、反應(yīng)條件等的數(shù)字應(yīng)被理解為在ー些情況下由術(shù)語"約"所修飾。在ー些 實施方案中，術(shù)語"約"用來指示數(shù)值包括為確定該值所采用的裝置或方法的平均值的標(biāo)準(zhǔn) 偏差。在一些實施方案中，所撰寫說明書和所附權(quán)利要求書中所列出的數(shù)值參數(shù)是近似值， 其可端視カ圖通過具體實施方案獲得的所需性質(zhì)而變化。在一些實施方案中，各數(shù)值參數(shù) 應(yīng)按照所報道的有效數(shù)字的數(shù)值并采用一般的舍入技術(shù)來解釋。盡管本公開的ー些實施方 案的寬范圍所列出的數(shù)值范圍和參數(shù)是近似值，但在具體實施例中所列出的數(shù)值被盡可能 精確地報道。在本公開ー些實施方案中所展示的數(shù)值可能含有由在其各自的測試測量中發(fā) 現(xiàn)的標(biāo)準(zhǔn)偏差所必然產(chǎn)生的某些誤差。本文中數(shù)值范圍的引用僅意在充當(dāng)個別地提及落在 該范圍內(nèi)的每ー單獨值的便捷方法。除非本文另外說明，否則將每個單獨的數(shù)值并入說明 書中，如同其在本文中單獨列舉一般。
[0120] 在一些實施方案中，除非另外說明，否則在描述具體實施方案的背景下（尤其在 下文某些權(quán)利要求中的背景下）使用的術(shù)語"ー個/種（a)"、"ー個/種（an)"及"該/所 述（the)"和類似所指物可被理解為包括単數(shù)和復(fù)數(shù)。在一些實施方案中，除非明確指出僅 是指替代方案或替代方案是互斥的，否則如本文中（包括權(quán)利要求書）所使用的術(shù)語"或" 用于意指"和/或"。
[0121] 術(shù)語"包含"、"具有"和"包括"是開放式系動詞。這些動詞中一者或多者的任 何形式或時態(tài)（諸如"包含（comprises) "、"包含（comprising) "、"具有（has) "、"具有 (having) "、"包括（includes)"和"包括（including)"）也是開放式的。例如，"包含"、"具 有"或"包括"一個或多個步驟的任何方法不限于僅擁有該ー個或更多個步驟且也可涵蓋其 它未列出的步驟。類似地，"包含"、"具有"或"包括" 一個或多個特征的任何組合物或裝置 不限于僅擁有該ー個或多個特征且可涵蓋其它未列出的特征。
[0122] 除非本文另外指出或者上下文明顯矛盾，否則本文描述的所有方法可以任何合適 的順序進行。除非聲明，否則任何和所有實例的使用或針對本文某些實施方案所提供的示 例性語言（例如，"諸如"）僅旨在更好地闡明本發(fā)明且并非對本發(fā)明的范圍構(gòu)成限制。說 明書中的語言不應(yīng)理解為指出任何未要求保護的實施本公開的必需要素。
[0123] 本文所公開的本公開的替代要素或?qū)嵤┓桨傅姆纸M不應(yīng)理解為限制。每ー組成員 可単獨地或與該組中其它成員或本文中存在的其它要素進行任何組合來提及和要求保護。 出于方便性或?qū)＠缘脑?，組中ー個或多個成員可包括在組中或從組中刪除。當(dāng)進行任 一此納入或刪除時，認(rèn)為說明書含有所修改的組，由此實現(xiàn)隨附權(quán)利要求中所用所有馬庫 什組的書面說明。
[0124]本申請中引用的所有出版物、專利、專利申請以及其它參考文獻出于所有目的通 過引用以其整體并入本文中，該引用的程度如同將每ー単獨的出版物、專利、專利申請或其 它參考文獻出于所有目特定地且單獨地指出通過引用以其整體并入一般。本文對參考文獻 的引用不應(yīng)被理解為承認(rèn)這些是本公開的現(xiàn)有技木。
[0125] 已詳細(xì)描述了本公開，將顯而易見的是，在不背離所附權(quán)利要求書中所定義的本 公開范圍的情況下，修改、變化和等效實施方案是可能的。此外，應(yīng)理解，本公開中的所有實 施例被提供作為非限制性實施例。 實施例
[0126] 提供以下非限制性實施例來進ー步說明本公開。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，下文實 施例中公開的技術(shù)表示由本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在本公開實踐中發(fā)揮良好作用的技術(shù)，且因此可視 為構(gòu)成本發(fā)明實踐模式的實施例。然而，鑒于本公開，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，可在不背離 本公開的精神和范圍的情況下在公開的具體實施方案中進行諸多改變，并且仍獲得類似或 相似的結(jié)果。
[0127] 實施例1 :植物引種（PI)在RHG4和RHGl基因座處的單倍型分析
[0128] 對總計81個大豆品系（植物引種、地方品種和優(yōu)良栽培品種）的SCN表型以及在 rhgl和Rhg4基因座處的基因分型SNP進行評分。如果FI< 10%，則品系被分類為對SCN 具有抗性（R)，且如果FI彡10%，則品系被分類為對SCN具有易感性（S)。大豆品系在Rhg4 基因座處進行基因分型時使用DNA標(biāo)記Sat_162、SHMT和SUB1，且在rhgl基因座處時使用 DNA標(biāo)記560、570和Satt309(參見例如，表1)。
[0129] 表1 :植物引種（PI)在Rhg4和rhgl基因座處的單倍型分析。
[0130]
【主權(quán)項】
1. 一種對大豆孢囊線蟲（SCN)具有抗性的轉(zhuǎn)基因大豆，所述大豆植物用人工DNA構(gòu)建 體轉(zhuǎn)化，所述人工DNA構(gòu)建體包含以下在5'至3'轉(zhuǎn)錄方向上作為可操作地相關(guān)聯(lián)的組分： 啟動子，其在大豆中起作用； 多核苷酸，其包含選自由以下組成的組的序列 (a) SEQ ID NO: 1或與其95%相同的序列，其中所述多核苷酸編碼具有絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn) 移酶活性的多肽，或其功能片段； (b) 編碼具有絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶活性的SEQ ID N0:2或與其95%相同的序列的多肽 的核苷酸序列，或其功能片段； (c) 在嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO: 1的核酸序列雜交的核苷酸序列，其中所述多核苷 酸編碼具有絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽，其中所述嚴(yán)格條件包括在65°C下在包含6X SSC (0. 9M氯化鈉和0. 09M檸檬酸鈉）的溶液中孵育，或其功能片段；以及 (d) 與（a)、（b)或（c)的所述多核苷酸序列互補的多核苷酸，或其功能片段；以及 轉(zhuǎn)錄終止序列； 其中所述轉(zhuǎn)基因大豆展現(xiàn)增加的SCN抗性。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因大豆，其中所述多核苷酸包含SEQ ID NO: 1的序列。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因大豆，其中所述多核苷酸包含與SEQ ID NO: 195%相 同的序列，其中所述多核苷酸編碼具有絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因大豆，其中所述多核苷酸包含編碼SEQ ID NO: 2的多 狀的序列。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因大豆，其中所述多核苷酸包含編碼與SEQ ID N0:295%相同且具有絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽的序列。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因大豆，其中SEQ ID NO: 2的130位是脯氨酸或SEQ ID NO:2的358位是天冬酰胺。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項所述的轉(zhuǎn)基因大豆，其中所述啟動子包括誘導(dǎo)型啟動子 或組織特異性啟動子。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項所述的轉(zhuǎn)基因大豆，其中所述啟動子包括線蟲誘導(dǎo)型啟 動子。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項所述的轉(zhuǎn)基因大豆，其中所述啟動子包括SEQ ID N0:4 的序列或其功能片段。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項所述的轉(zhuǎn)基因大豆，其包括與非轉(zhuǎn)化對照相比至少約 90%、至少約94%、至少約98%、至少約100%、至少約105 %或至少約110 %的谷物產(chǎn)率。
11. 根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項所述的轉(zhuǎn)基因大豆，其中增加的SCN抗性包括與非 轉(zhuǎn)化對照相比對SCN的易感性降低至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、 至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約100%、至少約200%、至少 約300%、至少約400%、至少約500%、至少約600%、至少約700%、至少約800%、至少約 900 %或至少約1000%。
12. -種具有大豆孢囊線蟲（SCN)抗性的農(nóng)藝學(xué)優(yōu)良大豆品種的植物，其包含含有突 變R130P和Y358N的GmSHMT等位基因。
13. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的植物，其通過包括以下步驟的方法來制備： (a) 將第一與第二大豆植物雜交，其中所述第一和第二植物共同地包含含有突變 R130P和Y358N的GmSHMT等位基因，從而產(chǎn)生SCN抗性表型，且其中所述第一和第二植物共 同地包含能夠賦予所述植物的子代植物農(nóng)藝學(xué)優(yōu)良特性的種質(zhì)；以及 (b) 測定由所述雜交產(chǎn)生的子代大豆植物的農(nóng)藝學(xué)優(yōu)良特性和SCN抗性；以及 (c) 選擇包含所述SCN抗性表型和農(nóng)藝學(xué)優(yōu)良特性的至少第一子代植物以獲得根據(jù)權(quán) 利要求12所述的植物。
14. 一種根據(jù)權(quán)利要求1-13中任一項所述的植物的植物部分。
15. -種人工DNA構(gòu)建體，其包含以下在5'至3'轉(zhuǎn)錄方向上作為可操作地相關(guān)聯(lián)的組 分： 啟動子，其在大豆中起作用； 多核苷酸，其包含選自由以下組成的組的序列 (a) SEQ ID NO: 1或與其95%相同的序列，其中所述多核苷酸編碼具有絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn) 移酶活性的多肽，或其功能片段； (b) 編碼具有絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶活性的SEQ ID N0:2或與其95%相同的序列的多肽 的核苷酸序列，或其功能片段； (c) 在嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO: 1的核酸序列雜交的核苷酸序列，其中所述多核苷 酸編碼具有絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽，其中所述嚴(yán)格條件包括在65°C下在包含6X SSC (0. 9M氯化鈉和0. 09M檸檬酸鈉）的溶液中孵育，或其功能片段；以及 (d) 與（a)、（b)或（c)的所述多核苷酸序列互補的多核苷酸，或其功能片段；以及 轉(zhuǎn)錄終止序列。
16. -種增加大豆的大豆孢囊線蟲（SCN)的方法，其包括： 用人工DNA構(gòu)建體來轉(zhuǎn)化植物，所述人工DNA構(gòu)建體包含以下在5'至3'轉(zhuǎn)錄方向上 作為可操作地相關(guān)聯(lián)的組分： 啟動子，其在大豆中起作用； 多核苷酸，其包含選自由以下組成的組的序列 (a) SEQ ID NO: 1或與其95%相同的序列，其中所述多核苷酸編碼具有絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn) 移酶活性的多肽，或其功能片段； (b) 編碼具有絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶活性的SEQ ID N0:2或與其95%相同的序列的多肽 的核苷酸序列，或其功能片段； (c) 在嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO: 1的核酸序列雜交的核苷酸序列，其中所述多核苷 酸編碼具有絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽，其中所述嚴(yán)格條件包括在65°C下在包含6X SSC (0. 9M氯化鈉和0. 09M檸檬酸鈉）的溶液中孵育，或其功能片段；以及 (d) 與（a)、（b)或（c)的所述多核苷酸序列互補的多核苷酸，或其功能片段；以及 轉(zhuǎn)錄終止序列； 其中所述轉(zhuǎn)基因大豆與不含DNA構(gòu)建體的植物相比展現(xiàn)增加的SCN抗性。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種對大豆孢囊線蟲(SCN)具有抗性的轉(zhuǎn)基因大豆或其部分，其包括編碼絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶蛋白(例如，GmSHMT)的人工DNA構(gòu)建體。本發(fā)明還提供含有突變R130P和Y358N的GmSHMT等位基因以及研究和育種方法及包含這些的組合物。
【IPC分類】C12N5-04, A01H1-00, A01H5-00
【公開號】CN104640439
【申請?zhí)枴緾N201380033848
【發(fā)明人】K.梅克塞姆, 劉世名, P.K.肯多思, M.G.米楚姆
【申請人】南伊利諾伊大學(xué)評議會, 密蘇里大學(xué)學(xué)監(jiān)
【公開日】2015年5月20日
【申請日】2013年5月30日
【公告號】WO2013181411A1