對(duì)孢囊線蟲(chóng)具有抗性的大豆的制作方法
【專利說(shuō)明】對(duì)孢囊線蟲(chóng)具有抗性的大豆
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002] 本申請(qǐng)案要求2012年5月30日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)序列號(hào)61/653, 227的權(quán)益； 該臨時(shí)申請(qǐng)通過(guò)引用整體并入本文。
[0003] 關(guān)于由聯(lián)邦政府資助研究或研發(fā)的聲明
[0004] 本發(fā)明根據(jù)由美國(guó)國(guó)家科學(xué)基金會(huì)植物基因組研宄計(jì)劃頒發(fā)的授權(quán)號(hào)0820642 以及由美國(guó)國(guó)家科學(xué)基金會(huì)頒發(fā)的授權(quán)號(hào)DBI-O845196在政府支持下完成。政府對(duì)本發(fā)明 具有一定的權(quán)利。
[0005] 通過(guò)引用并入的材料
[0006] 序列表（其是本公開(kāi)的一部分）包括包含本發(fā)明的核苷酸和/或氨基酸序列的計(jì) 算機(jī)可讀形式。序列表的主題通過(guò)引用整體并入本文。 發(fā)明領(lǐng)域
[0007] 本公開(kāi)大體上涉及在大豆中賦予對(duì)線蟲(chóng)的抗性的方法。
[0008] 發(fā)明背景
[0009] 大豆孢囊線蟲(chóng)給美國(guó)大豆生產(chǎn)者造成超過(guò)十億美元的年產(chǎn)量損失且是全世界大 豆產(chǎn)區(qū)的持續(xù)性問(wèn)題。造成該產(chǎn)量損失的線蟲(chóng)大豆異皮線蟲(chóng)（Heteroderaglycines)的致 害性群體已在大多數(shù)已知抗性來(lái)源上被鑒定。但賦予對(duì)大豆孢囊線蟲(chóng)的抗性的大豆基因先 前未被克隆過(guò)。
[0010] 屬于異皮線蟲(chóng)屬（Heterodera)和球孢囊屬（Globodera)的孢囊線蟲(chóng)包括了在經(jīng) 濟(jì)上最重要類別的植物寄生線蟲(chóng)中的ー些。這些不同種屬的線蟲(chóng)通過(guò)在宿主根內(nèi)誘生專門 取食位點(diǎn)（合胞體）而作為強(qiáng)制定棲的內(nèi)寄生物在某些宿主植物上選擇性地取食。大豆 孢囊線蟲(chóng)（SCN)大豆異皮線蟲(chóng)（HeteroderaglycinesIchinohe)的宿主范圍限于豆科植 物和ー些雜草。其始終是大豆（大豆（Glycinemax(L.)Merr.))上經(jīng)濟(jì)上最重要的病原體 (Koenning和Wrather, 2010)。侵染性二齡幼蟲(chóng)（J2)在土壤中自卵孵化且利用空心ロ矛 (螫針）刺穿植物根以用機(jī)械方式對(duì)植物細(xì)胞壁穿孔并分泌細(xì)胞壁消化酶，從而促進(jìn)經(jīng)根 皮層到維管結(jié)構(gòu)附近的中柱鞘或內(nèi)胚層細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)迀移。一旦細(xì)胞被選擇用于取食，線 蟲(chóng)便將ー套效應(yīng)蛋白遞送到細(xì)胞中，導(dǎo)致該細(xì)胞轉(zhuǎn)化為獨(dú)特的高度代謝活性取食細(xì)胞?，F(xiàn) 已定棲的幼蟲(chóng)在其經(jīng)過(guò)被劃分為四個(gè)幼蟲(chóng)期（J1-J4)和性別二態(tài)性成蟲(chóng)生命期的25-30天 生命期長(zhǎng)大時(shí)從該細(xì)胞取食。經(jīng)雄性蟲(chóng)受精后，雌性成蟲(chóng)的子宮中留下數(shù)百個(gè)卵，且在其死 亡后形成允許卵在缺少宿主的情況下在土壌中存活數(shù)年的保護(hù)性孢囊。宿主植物遭受營(yíng)養(yǎng) 物損失以及通過(guò)維管結(jié)構(gòu)的輸送減少，表現(xiàn)為生長(zhǎng)較不旺盛和產(chǎn)量降低。
[0011] 其兩性融合的生活方式和獨(dú)特的生存策略使得用來(lái)控制SCN的當(dāng)前措施復(fù)雜化。 殺線蟲(chóng)劑的使用是受限制的且對(duì)大豆生產(chǎn)者亦無(wú)成本效益。用于控制SCN的當(dāng)前方法包括 非宿主作物輪作與抗病栽培品種的種植的組合。大豆育種者已成功研發(fā)出抗SCN栽培品 種。首批Rhg(對(duì)大豆孢囊線蟲(chóng)具有抗性）基因在1960年初被鑒定（Caldwell等人，1960 ; Matson和Williams, 1965)，且從此已發(fā)表了大量關(guān)于來(lái)自多種不同種質(zhì)來(lái)源的對(duì)SCN具 有潛在抗性的QTL(數(shù)量性狀基因座）的鑒定和定位的論文。在多種種質(zhì)來(lái)源中染色體 18 (rhgl)和染色體8 (Rhg4)上的QTL經(jīng)作圖是一致的（Concibido等人，2004)。在一些來(lái) 源（諸如PI88788)中，rhgl對(duì)于全面抗性來(lái)說(shuō)是足夠的且展示不完全顯性（Concibido等 人，2004)。在其它情況下，諸如大豆品種栽培品種（cv.)Forrest，對(duì)SCN的全面抗性既需要 rhgl又需要Rhg4,其中Rhg4展現(xiàn)顯性基因作用（Meksem等人，2001)。
[0012] 攜帯Rhg基因的植物展示宿主與寄生蟲(chóng)之間的不相容相互作用。雖然攜帯Rhg 基因的植物的根被侵染性J2穿透，但是取食細(xì)胞最終退化且大多數(shù)線蟲(chóng)在到達(dá)成蟲(chóng)階段 之前死亡（Endo, 1965 ;Riggs等人，1973)。大豆孢囊線蟲(chóng)的遺傳變異性是普遍的且在抗 性栽培品種上存活的線蟲(chóng)攜帯未確定的ror(在抗性宿主上的繁殖）等位基因（Dong和 Opperman, 1997)，從而由于大豆抗性單作而導(dǎo)致在這塊田地中的群體轉(zhuǎn)變（Niblack等人， 2008)。對(duì)SCN具有抗性的理解是有限的，因?yàn)榻?jīng)鑒定具有潛在SCN抗性QTL的基因尚未被 克?。∕elito等人，2010;Liu等人，2010)。 發(fā)明概要
[0013] 在本公開(kāi)的各個(gè)方面中提供對(duì)大豆孢囊線蟲(chóng)（SCN)具有抗性的大豆植物。
[0014] 本公開(kāi)的ー個(gè)方面提供對(duì)大豆孢囊線蟲(chóng)（SCN)具有抗性的轉(zhuǎn)基因大豆。所述抗 SCN大豆包括賦予抗性表型的絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶基因（GmSHMT)。在一些實(shí)施方案中， GmSHMT基因?qū)Υ蠖篂橥庠葱缘那矣纱颂峁㏒CN抗性。在一些實(shí)施方案中，GmSHMT基因?qū)Υ?豆為內(nèi)源性的且轉(zhuǎn)化增加了GmSHMT的表達(dá)，由此增加SCN抗性。
[0015] 在一些實(shí)施方案中，大豆植物用人工DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化，所述人工DNA構(gòu)建體包含以 下作為在5'到3'轉(zhuǎn)錄方向上可操作地相關(guān)聯(lián)的組件：?jiǎn)?dòng)子，其在大豆中起作用；多核苷 酸，其包含選自由以下組成的組的序列：（a)SEQIDN0:1或具有絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶活性 的與其95%相同的序列；(b)編碼SEQIDN0:2的多肽的核苷酸序列或具有絲氨酸羥甲基 轉(zhuǎn)移酶活性的與其95%相同的序列；（c)在嚴(yán)格條件下與SEQIDN0:1的核酸序列雜交的 核苷酸序列，其中所述多核苷酸編碼具有絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽，其中所述嚴(yán)格 條件包括在65°C下在包含6XSSC(0. 9M氯化鈉和0. 09M檸檬酸鈉）的溶液中孵育；及（d) 與（a)、（b)或（c)的所述多核苷酸序列互補(bǔ)的多核苷酸；及轉(zhuǎn)錄終止序列；其中該轉(zhuǎn)基因 大豆表現(xiàn)出增加的SCN抗性。
[0016] 在一些實(shí)施方案中，大豆植物是包含含有突變R130P和Y358N的GmSHMT等位基因 的具有大豆孢囊線蟲(chóng)（SCN)抗性的農(nóng)藝學(xué)優(yōu)良大豆栽培品種。在一些實(shí)施方案中，大豆植 物通過(guò)以下方式來(lái)制備：(a)使第一大豆植物與第二大豆植物雜交，其中第一和第二植物 共同地包含產(chǎn)生SCN抗性表型的含有突變R130P和Y358N的GmSHMT等位基因，且其中第一 和第二植物共同地包含能夠向所述植物的子代植物賦予農(nóng)藝學(xué)優(yōu)良特性的種質(zhì)；及（b)分 析由雜交所得的子代大豆植物的農(nóng)藝學(xué)優(yōu)良特性和SCN抗性；以及（c)選擇包含所述SCN 抗性表型和農(nóng)藝學(xué)優(yōu)良特性的至少第一子代植物以獲得期望的植物。
[0017] 本公開(kāi)的另一方面是本文所述任何抗SCN大豆植物的植物部分。
[0018] 本公開(kāi)的另一方面是人工DNA構(gòu)建體，其包括啟動(dòng)子，其在大豆中起作用；編碼具 有絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽的多核苷酸；及轉(zhuǎn)錄終止序列。
[0019] 本公開(kāi)的另一方面是增加大豆抗大豆孢囊線蟲(chóng)（SCN)的方法，其包括用本發(fā)明的 人工DNA構(gòu)建體來(lái)轉(zhuǎn)化植物。
[0020] 其它目標(biāo)和特征將在部分程度上顯而易見(jiàn)并且將在下文中部分地指出。
【附圖說(shuō)明】
[0021] 本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，下文所述附圖僅出于說(shuō)明目的。所述附圖并非意在以任 何方式限制本發(fā)明教導(dǎo)的范圍。
[0022] 圖1是說(shuō)明Rhg4基因的定位克隆的一系列圖式和序列表。圖IA顯不Rhg4基因座 的高密度遺傳圖譜。黑色水平線表示大約為300Kbp的Rhg4染色體區(qū)間。黑線下方的箭頭 指出每個(gè)DNA標(biāo)記的位置及其名稱。黑色水平線上方的數(shù)字表示每ー標(biāo)記相對(duì)于LRR-RLK 標(biāo)記（先前描述于Liu等人2011中的在Rhg4基因座處的LRR-RLK基因）的位置，其被指定 為'0'位。藍(lán)色箭頭表示Essex(E)或Williams82(W)與Forrest(F)之間的多態(tài)性等位 基因，紅色箭頭表示具有在雙重組體ExF74和FxW5093中出現(xiàn)的具有Forrest(F)等位基因 的DNA標(biāo)記，且綠色箭頭表示E、W和F之間的非多態(tài)性等位基因，其跨越大約IOOKbp的區(qū) 域。圖IB顯示通過(guò)使用GmSHMT探針篩選三個(gè)大豆BAC庫(kù)（HindIII庫(kù)、EcoRI庫(kù)和BamHI BAC庫(kù)；Meksem等人，2000)鑒定出BAC克隆 100B10。BAC克隆 100B10 涵蓋標(biāo)記LRR-RLK、 SHMT以及GmSHMT的部分序列（前兩個(gè)外顯子以及第二個(gè)內(nèi)顯子的一部分）。圖IC顯不 GmSHMT基因組DNA序列的基因模型。所述基因從起始密碼子到終止密碼子是2189bp且含 有三個(gè)外顯子（紅色框）和兩個(gè)內(nèi)顯子（黑色線）。黑色線上方的數(shù)字指示相對(duì)于起始密 碼子的第一個(gè)核苷酸的核苷酸位置。比較Forrest與Essex之間的GmSHMT基因序列以鑒 定出三個(gè)SNP(G389C、T1165A和G1473C)以及兩個(gè)InDel(在1384C位和1385T位處）。圖 ID顯示Forrest與Essex之間的預(yù)測(cè)GmSHMT蛋白質(zhì)序列的比較，其中用紅色突顯氨基酸差 異（R130P和Y358N)。
[0023] 圖2是展示通過(guò)突變分析對(duì)GmSHMT的功能驗(yàn)證的圖式、序列表和柱形圖。圖2A顯 示使用大豆栽培品種Forrest的EMS誘變?nèi)后w通過(guò)TILLING來(lái)篩選GmSHMT中的突變?；?因被劃分為3個(gè)TILLING區(qū)間（1、2和3)以供篩選。鑒定出兩個(gè)錯(cuò)義突變體F6266(E61K) 和F6756(M125I)。圖2B顯示包括來(lái)自Forrest的抗性野生型等位基因、來(lái)自供體親本 PI548402 (Peking)的抗性等位基因、F6266和F6756Forrest突變等位基因以及來(lái)自栽培品 種Essex和Williams82的易感性等位基因的GmSHMT序列的氨基酸比對(duì)。比對(duì)上方的數(shù)字 對(duì)應(yīng)于ForrestGmSHMT蛋白質(zhì)序列內(nèi)的氨基酸位置。箭頭表示在SCN抗性品系與易感性 品系之間不同的兩個(gè)氨基酸（R130P和Y358N)的位置以及通過(guò)EMS誘導(dǎo)的兩個(gè)新Forrest 等位基因中突變（E61K和M125I)的位置。圖2C顯示GmSHMTTILLING突變體的SCN表型。 與抗SCN栽培品種Forrest(野生型）和易感SCN的栽培品種Essex相比，E61K和M125I 突變兩者均產(chǎn)生了從抗性到中度易感性（在純合子突變品系中FI多20% )以及從抗性 (FI< 10% )到中度抗性（在雜合子突變品系中FI介于10%與20%之間）的轉(zhuǎn)變。
[0024] 圖3是示出以28個(gè)植物引種（PI)中的GmSHMT鑒定的單倍型的表。對(duì)總共81個(gè)大 豆品系（植物引種、地方栽培品種和優(yōu)良栽培品種）的SCN表型進(jìn)行評(píng)分且以rhgl和Rhg4 基因座進(jìn)行SNP基因分型（關(guān)于列表參見(jiàn)例如表1)。對(duì)此處所顯示的28個(gè)品系的GmSHMT 的編碼區(qū)測(cè)序。如果FI彡10%，則品系被分類為對(duì)SCN具有抗性（R)，且如果FI彡10%， 則品系被分類為對(duì)SCN具有易感性（S)。在Forrest中多態(tài)性位點(diǎn)是相對(duì)于起始密碼子的 第一個(gè)核苷酸定位。紅色框指示G到C以及T到A的轉(zhuǎn)變，所述轉(zhuǎn)變產(chǎn)生分別連接于SCN表型的氨基酸取代R130P和Y358N。
[0025] 圖4是展示通過(guò)VIGS、RNAi和互補(bǔ)對(duì)GmSHMT的功能驗(yàn)證的一系列圖形和圖像。圖 4A顯示使用病毒誘導(dǎo)的基因沉默使GmSHMT沉默的大豆根中的SCN繁殖。在經(jīng)BPMV(菜豆 莢斑點(diǎn)病毒（Beanpodmottlevirus))或含有SHMT基因序列片段的BPMV(BPMV-SHMT)接 種的抗SCNRILExF67和僅經(jīng)BPMV接種的易感SCN的RILExF63上測(cè)量線蟲(chóng)繁殖。菱形 表示單個(gè)根系統(tǒng)上孢囊的數(shù)目。毎次處理使用至少十二株植物。進(jìn)行四個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)，其 等顯示相似結(jié)果。給出來(lái)自ー個(gè)實(shí)驗(yàn)的代表性數(shù)據(jù)。不同字母表示在P〈〇. 0001下的顯著 差異。圖4B顯示在對(duì)照根和GmS