以及將GmSHMT等位基因引入農(nóng)藝學(xué)優(yōu)良大豆植物中的方 法。因此，本發(fā)明允許產(chǎn)生組合有這些賦予SCN抗性的GmSHMT等位基因與商業(yè)意義產(chǎn)量和 農(nóng)藝學(xué)優(yōu)良遺傳背景的植物。使用本發(fā)明方法，例如在具有商業(yè)意義產(chǎn)量和SCN抗性的新 品種的生產(chǎn)中，可將賦予SCN表型的基因座引入所需大豆遺傳背景中。
[0100] 標(biāo)記輔助滲入涉及將由ー個(gè)或多個(gè)標(biāo)記界定的染色體區(qū)域從ー個(gè)種質(zhì)轉(zhuǎn)移到另 一個(gè)種質(zhì)。該方法中的初始步驟是通過基因作圖來定位性狀，這是通過連鎖分析確定ー個(gè) 基因相對(duì)于其它基因和遺傳標(biāo)記的位置的方法。連鎖作圖的基本原則是，兩個(gè)基因在染色 體上越靠近，它們越有可能被一起遺傳。簡單地說，雜交通常在兩個(gè)遺傳上相容但相對(duì)于所 研究的性狀不同的親本之間進(jìn)行。遺傳標(biāo)記則可被用來追蹤在來自雜交的后代（通常為回 交（BCl)、F2或重組自交群體）中所研究性狀的分離。
[0101] 術(shù)語數(shù)量性狀基因座或QTL用來描述基因組中顯示對(duì)于表型具有數(shù)量或加性效 應(yīng)的區(qū)域。Rhg4基因座（其含有GmSHMT等位基因）代表示例性QTL，因?yàn)镚mSHMT等位基 因產(chǎn)生SCN抗性。本文鑒定出針對(duì)非轉(zhuǎn)基因GmSHMT等位基因的遺傳標(biāo)記，所述遺傳標(biāo)記 使得能夠用農(nóng)藝學(xué)優(yōu)良植物培育包含GmSHMT等位基因的大豆植物，并選擇出遺傳了突變 GmSHMT等位基因的后代。因此，本發(fā)明允許使用分子工具將這些QTL與所需農(nóng)藝特性組合。
[0102] 標(biāo)記輔助育種的方法為業(yè)內(nèi)熟知。因此，除非在本文中另有說明，否則本公開的方 法可根據(jù)此類方法進(jìn)行。
[0103] 研究工具
[0104] SHMT基因可用來發(fā)現(xiàn)或表征相關(guān)（相互作用）基因或用來鑒定或進(jìn)ー步表征關(guān)于 SCN抗性的級(jí)聯(lián)。SHMT作為對(duì)抗SCN抗性信號(hào)傳導(dǎo)通路的一部分的發(fā)現(xiàn)提供了對(duì)此復(fù)雜宿 主-病原體相互作用的新穎見解。本文所報(bào)道的見解可用來辨別SHMT與代謝之間的關(guān)系。
[0105] 在一些實(shí)施方案中，SHMT基因可用于基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、生物信息學(xué)或統(tǒng)計(jì)建 模方法以探明或分離在介導(dǎo)大豆對(duì)SCN的疾病抗性中具有直接或間接作用的候選基因或 編碼的蛋白質(zhì)或其它分子。在一些實(shí)施方案中，SHMT基因可用于基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、生 物信息學(xué)或統(tǒng)計(jì)建模方法以探明或分離在介導(dǎo)大豆對(duì)SCN(例如，對(duì)線蟲或任何中介物）的 相容或不相容反應(yīng)中具有直接或間接作用的候選基因或編碼的蛋白質(zhì)或其它分子。由此提 供多種可發(fā)現(xiàn)或表征與SCN抗性有關(guān)連的相關(guān)（相互作用）基因的方法。
[0106] 除了Hslp^ (甜菜中甜菜孢囊線蟲（H.schachtii)的抗性基因，其編碼具有不完 善的富含亮氨酸的重復(fù)序列的282-aa跨膜蛋白（Cai等人，1997))以外，迄今鑒定的所有 其它線蟲抗性基因均屬于典型NB-LRR(核苷酸結(jié)合位點(diǎn)，富含亮氨酸的重復(fù)序列）類植物 抗性基因（Milligan等人，1998;vanderVossin等人，2000;Ernst等人，2002;Paal等 人，2004)。相反地，SHMT是在ー碳葉酸代謝中具有關(guān)鍵作用的代謝酶。盡管該酶具有多種 催化活性，但它的主要作用之一是催化絲氨酸與四氫葉酸（THF)向甘氨酸與5, 10-亞甲基 THF(MTHF)的可逆轉(zhuǎn)化以供應(yīng)ー碳単元用于重新合成嘌呤、胸苷酸和甲硫氨酸，此暗示了其 在DNA合成及細(xì)胞的甲基化反應(yīng)中的重要性。
[0107]SHMT為ー種在自然界中普遍存在的酶，其是跨界結(jié)構(gòu)上保守的。除綠豆 SHMT(Sukanya等人，1991)以外，迄今所表征的所有其它SHMT均需要5'-磷酸吡哆醛（PLP) (維生素B6的活性形式）。已確定了來自多種生物體（包括人、兔、小鼠和大腸桿菌）的 SHMT的3-D結(jié)構(gòu)（Renwick等人，1998 ;Scarsdale等人，2000)。二聚體SHMT主要見于原核 生物中，而真核生物的SHMT形成二聚體的二聚體。
[0108] 擬南芥屬（Arabidopsis)具有七個(gè)編碼預(yù)測線粒體、質(zhì)體或細(xì)胞質(zhì)定位的酶 的SHMT家族成員，其等在植物發(fā)育期間展現(xiàn)器官特異性表達(dá)模式（McClung等人，2000 ; Moreno等人，2004)。SHMTl在葉、莖和花中高度表達(dá)，且在根中是不可檢測的，與其作為光 呼吸線粒體家族成員的作用一致（Moreno等人，2004)。在線粒體中，甘氨酸經(jīng)甘氨酸脫羧 酶復(fù)合物（GDC)脫羧以形成MTHF。SHMTl然后將ー碳單元從MTHF轉(zhuǎn)移到甘氨酸用于產(chǎn)生 絲氨酸，其經(jīng)再循環(huán)進(jìn)入葉綠體卡爾文（Calvin)循環(huán)。SHMTl中潛伏無效等位基因的擬南 芥屬植物矮小且萎黃，并且在產(chǎn)生后代之前死亡。另外，展現(xiàn)降低的SHMTl活性的擬南芥屬 EMS突變體不能提供有效的防御反應(yīng)來限制活體營養(yǎng)型和死體營養(yǎng)型葉面病原體的侵襲， 這突顯了光呼吸途徑在植物抵抗病原體中的重要性。然而，植物胞質(zhì)SHMT和ー碳通量在細(xì) 胞質(zhì)中的作用尚不十分清楚。也未得知一個(gè)區(qū)室中的一碳通量如何變化可影響其它區(qū)室中 的ー碳通量。在植物的質(zhì)體和線粒體中核苷酸合成的區(qū)室化表明，細(xì)胞質(zhì)中的一碳通量可 偏重于高半胱氨酸重新甲基化為蛋氨酸以及在主動(dòng)產(chǎn)生甲基化化合物（諸如木質(zhì)素和生 物堿）的細(xì)胞類型中高度活躍（Christensen和MacKenzie，2006)。
[0109] 在建立后數(shù)天，在攜帯Rhg基因的植物中誘生的取食細(xì)胞因已被描述為過敏反應(yīng) (HR)(植物中局部程序性細(xì)胞死亡（PCD)的ー種形式）的事件而開始退化，從而抵御入侵的 病原體。該機(jī)制可能歸因于所述植物激活HR樣PCD以殺死喂養(yǎng)細(xì)胞，致使線蟲饑餓并死亡 或者線蟲死亡發(fā)生在HR樣PCD激活之前。響應(yīng)于SCN的取食部位局部壞死是抗性大豆栽 培品種間的共同主題，但壞死的時(shí)機(jī)及合胞體退化視抗性來源而變化（Acedo等人，1984)。 大量組織學(xué)研宄已證明，大豆中與合胞體退化相關(guān)的細(xì)胞變化包括次生細(xì)胞壁物質(zhì)的沉積 和脂質(zhì)樣小球的形成（Endo, 1965 ;Riggs等人，1973 ;Acedo等人，1984)。在抗性大豆與易 感大豆中合胞體轉(zhuǎn)錄圖譜的比較分析已確認(rèn)，増加的防御相關(guān)基因表達(dá)與凋亡細(xì)胞死亡以 及在抗性植物中形成的合胞體中的植物過敏反應(yīng)相關(guān)（Kandoth等人，2011)。
[0110] EssexSHMT以及ForrestSHMT的生物化學(xué)分析可用來更具體地判定所觀察氨基 酸差異可如何改變GmSHMT功能來促成針對(duì)SCN的抗性。本文證據(jù)表明，改變?nèi)~酸代謝或許 是大豆對(duì)SCN的抗性的促成因素，這提供了對(duì)該農(nóng)藝學(xué)重要的病害系統(tǒng)的分子基礎(chǔ)的新見 解。
[0111] 活性生物體抑制
[0112] 葉酸（維生素B)對(duì)于線蟲的健康至關(guān)重要。如果SHMT的表達(dá)或其調(diào)控正在影響 植物組織中的葉酸途徑，則它可能會(huì)影響線蟲對(duì)該植物組織取食。假設(shè)線蟲可從大豆植物 本身獲取葉酸或其前體或衍生物。進(jìn)ー步假設(shè)SHMT基因或基因產(chǎn)物可干擾線蟲的葉酸途 徑。
[0113] 在人類中，SHMT中的突變已被與眾多種疾病狀態(tài)相聯(lián)系，包括成人淋巴細(xì)胞性白 血病（Skibola等人，2002)、心血管疾?。↙im等人，2005)和神經(jīng)管缺陷（Heil等人，2001)。 考慮SHMT在為多個(gè)葉酸途徑供應(yīng)ー碳単元中的重要性不足為怪。因SHMT蛋白表達(dá)、穩(wěn)定 性或活性發(fā)生改變所致的一碳單元的利用率降低可以模仿葉酸缺乏。葉酸對(duì)于維持DNA完 整性和穩(wěn)定性是必不可少的，細(xì)胞缺乏此種重要的B族維生素會(huì)導(dǎo)致DNA前體失衡以及DNA 的合成與修復(fù)發(fā)生改變。因此，已顯示葉酸缺乏介導(dǎo)多種惡性腫瘤（Kim，2003年）。在葉酸 足夠的情況下，胸苷酸合成酶利用MTHF作為甲基供體將dUMP(單磷酸脫氧尿苷酸）轉(zhuǎn)化為 嘧啶核苷酸dTMP(單磷酸脫氧胸苷酸）。然而，如果在葉酸缺乏的情況下MTHF是有限的，則 該反應(yīng)被阻斷，升高的dUMP水平導(dǎo)致尿嘧啶錯(cuò)誤參入到DNA中，導(dǎo)致鏈斷裂以及染色體畸 變。已顯示此類細(xì)胞變化誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物中的細(xì)胞凋亡（Novakovic等人，2006)。葉酸缺乏 也會(huì)改變正常DNA甲基化。低MTHF水平導(dǎo)致高半胱氨酸轉(zhuǎn)化為蛋氨酸所需的5-甲基THF 的利用率降低。蛋氨酸的減少消耗S-腺苷甲硫氨酸匯集物，此致使DNA以及其它細(xì)胞化合 物的低甲基化，從而導(dǎo)致不適當(dāng)?shù)幕虮磉_(dá)以及其它細(xì)胞異常。
[0114]SHMT和一碳葉酸代謝在植物中的作用遠(yuǎn)沒有在酵母和哺乳動(dòng)物中特征明顯，盡管 如此，在這些生物體之間顯著差異已得到認(rèn)可（綜述于Christensen和MacKenzie，2006 中）。在酵母和哺乳動(dòng)物中，一碳葉酸代謝是在線粒體區(qū)室和細(xì)胞質(zhì)區(qū)室之間分開進(jìn)行。相 比之下，在植物中一碳葉酸代謝是在細(xì)胞質(zhì)區(qū)室、質(zhì)體區(qū)室和線粒體區(qū)室之間分開進(jìn)行。與 此區(qū)室化一致，已鑒定出ー碳葉酸酶（包括SHMT)的細(xì)胞質(zhì)、線粒體和質(zhì)體同種型。這些觀 察結(jié)果表明，這些酶的代謝作用以及這些生物體間的ー碳通量有可能存在差異。
[0115] 經(jīng)本文鑒定并證明在大豆對(duì)SCN的抗性中發(fā)揮作用的GmSHMT被預(yù)測為胞質(zhì)酶。發(fā) 育中合胞體的LCM-微陣列分析（Ithal等人，2007)和本文所述啟動(dòng)子-GUS分析指示在易 感SCN的大豆栽培品種中形成的取食細(xì)胞中GmSHMT上調(diào)。孢囊線蟲誘生的取食細(xì)胞經(jīng)歷基 因表達(dá)的急劇變化，細(xì)胞器増殖，且它們成為代謝非常活躍的營養(yǎng)物匯點(diǎn)。作為在不存在有 絲分裂情況下反復(fù)多輪DNA合成（S卩，核內(nèi)復(fù)制）的結(jié)果，合胞體含有多個(gè)大的變形蟲樣細(xì) 胞核，并且已證明，阻斷DNA合成對(duì)合胞體的建立和發(fā)育產(chǎn)生不利影響（deAlmeidaEngler 等人，2011)。合胞體的轉(zhuǎn)錄和的代謝概況研究證明氨基酸、DNA和次生細(xì)胞壁生物合成的 速率增加（Ithal等人，2007 ;Hofmann等人，2010)。因此，可預(yù)測合胞體的發(fā)育和維持高度 需要葉酸ー碳代謝。
[0116] 計(jì)算分析預(yù)測，F(xiàn)orrestSHMT中的突變可能對(duì)其活性產(chǎn)生不利影響，這可能最終 導(dǎo)致葉酸缺乏，特別是在對(duì)一碳代謝有較高需要的細(xì)胞類型中。線蟲的營養(yǎng)需求也可能影 響在發(fā)育中合胞體中的葉酸代謝。盡管對(duì)植物寄生線蟲的營養(yǎng)需求沒有明確定義，但假定 同其它動(dòng)物一祥，它們從其飲食中獲取葉酸。已顯示葉酸缺乏誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的細(xì)胞 凋亡（Novakovic等人，2006)，可能最終導(dǎo)致HR樣PCD或線蟲饑餓。然而，在含有功能Essex GmSHMT的遺傳背景中通過轉(zhuǎn)化對(duì)應(yīng)于ForrestGmSHMT抗性等位基因的全長基因組克隆能 夠恢復(fù)抗性也證明了其中觸發(fā)抗性必須發(fā)生宿主-病原體識(shí)別事件的模型。
[0117] 本文所述利用分子生物學(xué)方案的組合物和方法可根據(jù)各種此項(xiàng)技術(shù)已知 的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)（參見，例如，Sambrook和Russel(2006)CondensedProtocolsfrom MolecularCloning:ALaboratoryManual，CoidspringHarborLaboratory Press,ISBN-10:0879697717;Ausubel等人（2002)ShortProtocolsinMolecular Biology，第 5 版，CurrentProtocols,ISBN-10:0471250929;Sambrook和Russel(2001) MolecularCloning:ALaboratoryManual,第 3 片反，ColdSpringHarborLaboratory Press,ISBN-10: 0879695773 ;Elhai，J?和Wolk，C.P.1988.MethodsinEnzymology 167,747-754 ;Studier(2005)ProteinExprPurif. 41 (1)，207 - 234;Gellissen編 輯，（2005)ProductionofRecombinantProteins:NovelMicrobialandEukaryotic ExpressionSystems,Wiley-VCH,ISBN-10