專利名稱：抗除草劑的嵌合基因的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及能夠使植物對于3，5-二鹵代-4-羥基芐腈類除草劑具有抗性的一種新的嵌合基因，以及涉及用該基因轉(zhuǎn)化植物細胞的方法和由這類細胞再生的轉(zhuǎn)化植物。
業(yè)已知道，第229，042號歐洲專利申請揭示了通過將一種編碼可專一地降解這類除草劑的腈水解酶的基因?qū)胫参锏幕蚪M，從而產(chǎn)生對上述除草劑，尤其是對3，5-二溴-4-芐腈或溴苯腈具有抗性的植物。盡管該技術取得了有效的結果，但為了增加成功的機會和增強經(jīng)濟效果，它還需要進行改進，尤其是在植物中的表達水平和相應的植物抗這些除草劑的能力方面。
在本說明書中，“植物”可理解為能進行光合作用的任何分化型多細胞有機體，“植物細胞”意指來自植物的、能夠形成不分化的組織(如胼胝體或胚胎)或分化的組織(如植物的部分或植物或種子)的任何細胞。
本發(fā)明的目的是滿足這種需要。
本發(fā)明涉及能夠使植物對3，5-二鹵代-4-羥基芐腈類除草劑具有抗性的嵌合基因，它包括至少一種使植物對這類除草劑產(chǎn)生抗性的腈水解酶的基因，一種外源啟動子或者，一個多聚腺苷化信號區(qū)，其中啟動子來源于在植物細胞中自然表達的基因，它選自由花椰菜鑲嵌病毒(CaMV35S)的35SRNA的啟動子和向日葵(Helianthusannuus)核酮糖-1，5-雙磷酸羧酶/加氧酶(RubisCO)的小亞基(SSU)的啟動子所組成的組。
本發(fā)明的嵌合基因的啟動子來源于在植物中自然表達的基因，即非植物型，如病毒型，諸如花椰菜鑲嵌病毒(CaMV35S)，或者較佳地是植物型，如單子葉或雙子葉植物，尤其是向日葵(Helianthusannuus)核酮糖-1，5-二磷酸羧酶/加氧酶(RubisCO)的小亞基。單獨地或結合地使用這些啟動子都是可能的。其選擇依賴于所要轉(zhuǎn)化的單或雙子葉植物的性質(zhì)。因此，使用用于雙子葉植物轉(zhuǎn)化的向日葵小亞基RubisCO更好。
每個啟動子按下列方法獲得(1)花椰菜鑲嵌病毒(CaMV35S)的35SRNA的啟動子該啟動子的分離如Odell等人(1985)所述。含有轉(zhuǎn)錄啟始位點上游約850bp(堿基對)的克隆(PJ05-2)被選出用以上述構造。將分離到的EcoRⅠ-HindⅢ片段，用Klenoa聚合酶將其末端補平，并克隆到載體pUC19的HincⅡ位點上(Yannishperron等人，1985)中。用XbaⅠ和PstⅠ消化該克隆，用噬菌體T4聚合酶處理所得到的片段以使其末端補平(blunt)。將該片段克隆進用SmaⅠ和XbaⅠ酶切并用Klenow聚合酶處理的pUC19Cm(Buckley，1985)中，由此而得到的克隆命名為pRPA-BLI45。將用Klenow聚合酶處理的3′末端AccⅠ位點，與位于該啟動子下游片段中用Klenow聚合酶處理過的EcoRⅠ位點相連接，重新形成EcoRⅠ位點并由此而獲得順序，從轉(zhuǎn)錄啟始位點開始呈如下形式ACACGCTGACAAGCTGACTCAGCTAGAGTCGAATTCEcoRⅠ2)向日葵(Helianthusannuus)核酮糖-1，5-雙磷酸羧酶/加氧酶(RubisCO)的小亞基的啟動子。
含有該啟動子的基因已經(jīng)由Wacksmon等人(1987)分離出來了。將含有該基因啟動子的EcoRⅠ片段克隆進mp18，該啟動子的3′部分直接處于該載體的多聚接頭(linker)的上游。然后，用BstXⅠ線性化并用Bal31核酸外切酶處理該克隆。先用SalⅠ，然后用Klenow聚合酶處理由此所獲得的片段的混合物，最后，在低的DNA濃度下進行連接。對經(jīng)過該操作而得到的克隆測序，選擇具有位于所推定的轉(zhuǎn)錄啟始位點下游的下列順序的一種……5′ATTGGATTC3′…將ClaⅠ接頭(ATCGAT)引入該克隆的PstⅠ位點。這樣，通過用Klenow聚合酶處理該CalⅠ位點，并將其與位于該啟動子下游的片段上的用Klenow聚合酶處理過的EcoRⅠ位點相連接，重新形成了EcoRⅠ位點，并由此得到從所推定的轉(zhuǎn)錄啟始位點起呈下列形式的順序ATTGGATTCTCGACCATCGAATTCEcoRⅠ本發(fā)明的另一個特點是，嵌合基因含有位于編碼基因和啟動子之間的非轉(zhuǎn)譯的中間區(qū)(接頭)，它可從包含下列接頭的組中選擇-一方面，pUC19的接頭，通過克隆而修飾，并具有下列順序GAATTCGAGCTCGGTACCCCATGGEcoRⅠNcoⅠ-另一方面，玉米RubisCO的小亞基的非轉(zhuǎn)譯區(qū)，該區(qū)來源于由Lebrun等人(1987)所描述的與該基因相應的cDNA。它是一種具有下列順序的EcoRⅠ-NcoⅠ片段GAATTCCCAGCAAGCAAGCAGCGAGTEcoRⅠACATACATACTAGGCAGCCAGGCAG
CCATGNcoⅠ-另一方面，向日葵RubisCO的小亞基的非轉(zhuǎn)譯區(qū)該區(qū)來自于由Waksman和Freyssinet(1987)所分離的cDNA。該區(qū)尚未如此分離過，它總是被發(fā)現(xiàn)在向日葵RubisCO的轉(zhuǎn)移肽的前面。該順序如下GAATTCCGAAAGACAAAGATTATCGEcoRⅠTAATGMet本發(fā)明的嵌合基因選擇性地包含一個多聚腺苷化區(qū)或位點，它們可以是，例如1)pTi37(Bevan等人，1983)的藍曙紅合成酶基因的多聚腺苷化位點。該位點包含于260bp的MboⅠ片段(Fraley等人，1983，PCT專利申請，No，84/02913)中，為了將BamHⅠ和EcoRⅠ位點分別引入5′和3′端，該片段已用Klenow聚合酶處理，并克隆入M13mp18的SmaⅠ位點。由Vignaradiata核酸酶處理BamHⅠ位點，并克隆到pUC19的用Klenow聚合酶處理過的SalⅠ位點?，F(xiàn)在，該片段在其5′末端含有HindⅢ位點，它可以連接到腈水解酶基因的3′末端。
2)玉米RubisCO的小亞基的基因的多聚腺苷化位點該位點被分離成如Lebrun等人(1987)所述基因的540個bp的SmaⅠ-BglⅡ片段的形式。將一個ClaⅠ接頭(ATCGAT)引入SmaⅠ位點。在用ClaⅠ酶切和用Klenow聚合酶填補后，將該片段克隆進用PstⅠ酶切并用噬菌體T4聚合酶處理及BamHⅠ再酶切的pUC19中。該操作可將HindⅢ位點引入至多聚腺苷化位點的5′末端。所得到的順序如下5′AAGCTTGCATGCCCGATGGGCAG…HindⅢ1/SmaⅠ本發(fā)明的又一個特點是，嵌合基因可以選擇性地和較佳地包含在中間區(qū)和腈水解酶基因之間的轉(zhuǎn)移肽編碼區(qū)，該編碼區(qū)可選自包含玉米RubisCO的小亞基和向日葵小亞基的轉(zhuǎn)移肽編碼區(qū)的組中。在天然的基因中轉(zhuǎn)移肽的作用是可使RubisCO小亞基進入葉綠體的基質(zhì)中。在它們被引入上述中間區(qū)和腈水解酶的結構基因之間的情況下，它們也應當同樣地將腈水解酶直接引入該基質(zhì)中1)玉米RubisCO小亞基的轉(zhuǎn)移肽該片段來自與Lebrun等人(1987)所描述的基因相應的cDNA。它是141個bp的Nco SphⅠ片段，NcoⅠ位點覆蓋轉(zhuǎn)譯啟始密碼子和SphⅠ位點即轉(zhuǎn)移肽的切割位點。通過用噬菌體T4聚合酶處理該片段的SphⅠ末端，將其與用Klenow聚合酶處理的腈水解酶基因的NcoⅠ末端相連接，重新構造了一個順序，它允許在葉綠體的基質(zhì)中產(chǎn)生未經(jīng)修飾的腈水解酶。
2)向日葵RubisCO小亞基的轉(zhuǎn)移肽該片段來自由Waksman和Freyssinet(1987)所分離出來的cDNA。該順序最初在轉(zhuǎn)移肽的切割位點上不具有SphⅠ位點。該順序在此處是如下形式的5′CAATGCATGAAG3′通過定向誘變將帶星號的A進行AC置換，由此形成了一個SphⅠ位點。為了進行該操作，可采用Zoller和Smith(1984)的方法。將270bp的EcoRⅠ-SalⅠ片段克隆進M13mp19am4。從M13mp19衍生的該載體在基因4，在5327堿基位置上具有琥珀(ambre)突變，在不具有抑制這種類型突變的抑制基因的菌株中不能增殖。純化這個重組噬菌體的單鏈形式后，用三種寡核苷酸分別進行雜交。這種磷酸化的寡核苷酸的順序如下SphⅠ1∶5′GTTCAATGCATGCAGGTGTGGCCAC3′2∶5′AAGAGTCTGTCCATCAC3′3∶5′GTAAAACGACGGCCAGT3′它們分別產(chǎn)生如下的可能性1在轉(zhuǎn)移肽的切割位點上片段突變，2琥珀突變的矯正3.誘變片段上游順序的引物Klenow聚合酶在四種核苷酸存在下和噬菌體T4連接酶同時作用后，將獲得的混合物轉(zhuǎn)化到菌株HB2154中，然后涂布在含菌株HB2151平板(Carter等人，1985)上。為了驗證該結構，將所得到的克隆中具有附加的SphⅠ位點的那些克隆進行測序，其中之一被用于形成嵌合基因。在轉(zhuǎn)移肽的切割位點的地方，現(xiàn)在順序如下5′CAATGCATGC該片段的使用與用與編碼玉米RubisCO小亞基的轉(zhuǎn)移肽的片段的方法相同。
嵌合基因的構建根據(jù)


圖1-4的途徑，用上述的元素而進行。這樣所形成的不同的基因被安置于1或2種載體中，每一個構建產(chǎn)物都給予一個參考號。這樣所產(chǎn)生的不同的載體在下面表1中描述表1含有抗溴苯腈的嵌合基因的不同的TDNAs的構建
所用的載體產(chǎn)生顯示于
圖1-4中的載體pRPA-BL-142和pRPA-BL-150Aα1的不同的嵌合結構通過Agrobacteriumtumefacients轉(zhuǎn)移系統(tǒng)而引入植物中。為此目的而構造的轉(zhuǎn)移載體具有下列的性質(zhì)-從pBR322衍生的復制和轉(zhuǎn)移起點，-用于細菌篩選的基因，如對慶大霉素的抗性基因，-從λ-噬菌體中衍生的一個COS位點，-pTiA6TDNA的左右邊緣，-選擇性地，諸如抗卡那霉素的真核選擇基因，-選擇性地，含有pUC18的lacα互補基因的片段。
pRPA-BL-142的構建(
圖1-4)首先，將pTiA6的左TDNA的右邊緣和左邊緣(
圖1)進行克隆 -右邊緣將在Barker等人(1983)的計數(shù)系統(tǒng)中從13774延伸到16202的BamHⅠ-EcoRⅠ片段克隆進pGEM1(PromegaBiotech)中相應的位點，得到pBL-17。用NruⅠ(14276和14475)和EcoRⅠ(16202)酶切該質(zhì)粒，并用Klemow聚合酶處理，將NruⅠ位點與補平的EcoRⅠ位點連接，在14276處重新產(chǎn)生了EcoRⅠ位點，得到質(zhì)粒pBL-19。
-左邊緣將在Barke等人(1983)的系統(tǒng)中從602延伸到3390的HindⅢ片段克隆到pGEM1中相應的位點，得到pBL-21，其中，左邊緣是在多聚接頭相對的一邊。用AccⅠ(1161-2687)消化該質(zhì)粒，并在連接前用Klenow聚合酶處理。所得到的質(zhì)粒pBL-26含有插入于HindⅢ和XbaⅠ位點之間的從602延伸到1161的片段。
TDNA的形成通過將pBL-19的EcoRⅠ-BamHⅠ片段插入pBL-26中相應的位點，則重新形成了具有pTiA6的右邊緣和左邊緣(以它們的天然的方向)的TDNA。所得到的質(zhì)粒命名為pBL-70。
將TDNA引入pBR322(圖2)用HindⅢ酶切pBL-70后，用Klenow聚合酶處理該位點，并用EcoRⅠ再酶切該質(zhì)粒。將所得到的片段克隆進用Pru-Ⅱ-，EcoRⅠ酶切的pBR322。所得到的克隆命名為pRPA-BL-112。
抗慶大霉素的基因的克隆(圖3)從pPH1J1Ⅰ(Hirsh和Bringer，1984)中得到抗慶大霉素的基因。用BamHⅠ和HindⅢ消化該質(zhì)粒，將收集的片段克隆進用同樣的酶切的pUC19。在氨芐青霉素+慶大霉素上選擇后，分離出幾個含有2.45kbp(千堿基對)片斷的克隆。選出來進行隨后的操作的克隆被命名為pRPA-BL-133。在該克隆的BamHⅠ位點，插入從pHC79(Hohn和Collins，1980)中分離出來并含有入-噬菌體的COS位點的1.6kbpBglⅡ片段。將該片段雙向插入，就能獲得pRPA-BL-134和pRPA-BL-135兩個克隆。綜合載體的制備(圖3)為了將上述不同的部分結合在一個且是共同的載體上，用SmaⅠ和HindⅢ消化pRPA-BL-134和pRPA-BL-135，并用Klenow聚合酶處理含有抗慶大霉素的基因和λ-噬菌體的COS位點的插入部分。用PstⅠ和EcoRⅠ消化質(zhì)粒pRPA-BL-112并用噬菌體T4聚合酶處理。將兩個片段連接起來，選擇同時具有抗慶大霉素，COS位點，TDNA和pBR322復制起點的克隆。質(zhì)粒pRPA-BL-134產(chǎn)生出pRPA-BL-141和pRPA-BL-142，而pRPA-BL-135則產(chǎn)生出pRPA-143和pRPA-144。pRPA-BL-142被選出以將欲轉(zhuǎn)移的嵌合基因?qū)胫参镏小Ｓ蛇@個載體，就得到了含有標記基因NOS-NPTⅡ-NOS(圖4)的結構。用XbaⅠ消化質(zhì)粒pRPA-BL-142，并通過Vignaradiata核酸酶的作用處理其末端。而pEND4K(Klee等人，1985)則用EcoRⅠ消化并用Klenow聚合酶處理。分離含有卡那霉素的嵌合基因的1，6kbp的片段，并將其插入pRPA-BL-142。這種連接產(chǎn)物被命名為pRPA-BL-150A，它被選出進行隨后的操作。為了便于克隆該載體，含有分離自pUC18(Yannish-Perron等人，1985)的lacα-互補基因的并用噬菌體T4聚合酶處理過的HacⅡ片段被插入用Vignaradiata核酸酶處理過的BamHⅠ位點。所獲得的二種載體被命名為pRPA-BL-150Aα1和pRPA-BL-150Aα2。pRPA-BL-150Aα1是用作為將基因?qū)胫参锏幕A載體。
pRPA-BL-142和pRPA-BL-150Aα1的應用這些載體本身在土壤桿菌屬(Agrobacterium)中不能維持。為了達到維持的目的，必須將它們通過簡單的重組而整合于在該細菌中的質(zhì)粒中。這可以通過一種片段(如位于cosmids，如pVK102等上)，或用于具有這些順序的pBR322的片段而進行。對于菌株GV3850(Zambryski等人，1983)的Ti質(zhì)粒來說就是這種情況，該質(zhì)粒也是pRPA-BL-142和pRPA-BL-150Aα1的宿主。使用pBR322的復制起點，就可通過Ditte等人(1980)所描述的三部系統(tǒng)將這些質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到土壤桿菌屬(Agrobacterium)中。
植物材料的轉(zhuǎn)化為了測試這些嵌合基因的功效，后者根據(jù)下面所描述的過程而轉(zhuǎn)移到植物中A-轉(zhuǎn)化過程1.煙草將載體導入攜帶cosmidpTVK291(Komari等人，1986)的土壤桿菌EHA101(Hood等人，1987)的非致癌基因菌株中。轉(zhuǎn)化技術是采用Horsh等人(1985)的過程。下面將描述再生工業(yè)煙草PBD6(來源SETA，法國)的過程。
從人工培養(yǎng)葉中再生煙草PBD6是在含有30克蔗糖/升的Murashige和Skoog(MS)基礎培養(yǎng)基中進行的。人工培養(yǎng)葉是從栽培于暖房或離體培養(yǎng)的植物中得到的，轉(zhuǎn)化是根據(jù)三個連續(xù)階段的葉盤技術(Science1985，V01，227，1229-1231頁)進行的。
第一階段包括在含有0.05mgNAA和2mg/lBAP的MS+30克蔗糖的培養(yǎng)基上15天的苗的誘導。
第二階段要使在第一階段中所長成的苗繼續(xù)長大，它是在不含任何激素的MS+30克蔗糖/升的培養(yǎng)基中進行10天。
第三階段要使苗逐個地移出，并長根。長根培養(yǎng)基含有鹽、維生素和糖，稀釋二倍。它不含激素。10-15天后，將植入的苗移到土壤中。
激素平衡的測定通過測試25種激素平衡BAP0.2-0.5-1-1.5-2和NAA-0.5-0.05，觀察到1.5和2mg/l的BAP和0.05和0.1mg/l的NAA，可獲得最佳的再生頻率。采用0.05NAA和2mg/lBAP的混合物。
2.其它的雙子葉植物采用攜帶與用表2所列的植物材料相應載體相關的cosmidpTVK291的土壤桿菌A281的致癌基因菌株轉(zhuǎn)化表2中所列出的雙子葉植物。
B-抗溴苯腈性的測定1.煙草抗性的離體測定是在以辛鹽形式存在的溴苯腈(20mg/l)的存在下，通過測定胼胝體的生長而進行的，在體內(nèi)則是以10倍于大田處理時所用的劑量的溴苯腈或碘苯腈噴灑葉子而進行的。所得到的結果概括于表1a中。
2.其它雙子葉植物抗性的離體測定是在每升培養(yǎng)基10mg溴苯腈(以辛鹽的形式)存在下，測定胼低體的生長而進行的。在所有的情況下，結果均呈陽性(表2)。
表1a經(jīng)轉(zhuǎn)化的煙草對于溴苯腈的抗性
權利要求
1.一種能夠使植物對3，5-二鹵代-4-羥基芐腈類除草劑具有抗性的嵌合基因，其特征在于它包括至少一種可編碼抗這類除草劑的基因，一種外源啟動子和，選擇性地，一個多聚腺苷化信號區(qū)，其中啟動子來自于在植物細胞中自然表達的基因，它選自包括花椰菜鑲嵌病毒(Ca MV 35 S)的35S RNA的啟動子和向日葵(Helianthus annuus)核酮糖-1，5-雙磷酸羧酶/加氧酶(Rubis CO)的小亞基(ssu)的啟動子的組。
2.如權利要求1所述的嵌合基因，其特征在于它包括位于啟動子和編碼抗除草劑的基因之間的非轉(zhuǎn)譯中間區(qū)(接頭)，所說的區(qū)選自由通過克隆而修飾的pUC19的非轉(zhuǎn)譯區(qū)，玉米Rubis CO的小亞基的非轉(zhuǎn)譯區(qū)和向日葵Rubis CO的小亞基的非轉(zhuǎn)譯區(qū)組成的組。
3.如權利要求1或2所述的嵌合基因，其特征在于它還含有位于中間區(qū)和抗除草劑的編碼區(qū)之間的一個能夠?qū)⒌鞍踪|(zhì)引入欲轉(zhuǎn)化的植物的葉綠體中的轉(zhuǎn)移肽的編碼區(qū)。
4.如權利要求3所述的嵌合基因，其特征在于所述的轉(zhuǎn)移肽編碼區(qū)是玉米Rubis CO的小亞基的轉(zhuǎn)移肽編碼區(qū)。
5.如權利要求3所述的嵌合基因，其特征在于所述的轉(zhuǎn)移肽編碼區(qū)是向日葵Rubis CO的小亞基的轉(zhuǎn)移肽編碼區(qū)。
6.如權利要求1-5所述的嵌合基因，其特征在于所述的多聚腺苷化區(qū)來自于藍曙紅合成酶基因。
7.如權利要求1-5所述的嵌合基因，其特征在于所述的多聚腺苷區(qū)來自于玉米Rubis CO的小亞基的基因。
8.如權利要求1-7所述的嵌合基因，其特征在于所述的基因能編碼抗溴苯腈或碘苯腈或它們的一種衍生物，鹽或酯。
9.一種可以將植物轉(zhuǎn)化成抗3，5-二鹵代-4-羥基芐腈類除草劑植物的載體，其特征在于它包括權利要求1-8任一項所述的嵌合基因。
10.如權利要求9所述的載體，其特征在于它是由質(zhì)粒所組成的。
11.一種微生物，其特征在于它含有根據(jù)權利要求1-8任一項所述的嵌合基因。
12.一種含有抗3，5-二鹵代-4-羥基芐腈類除草劑的基因的植物細胞，其特征在于它通過權利要求1-8之一所述的基因整合而獲得。
13.一種被轉(zhuǎn)化的植物或植物的一部分，其特征在于它是通過如權利要求12所述的植物細胞的再生獲得的。
14.一種經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物種子，其特征在于它是從如權利要求13所述的植物而獲得的。
15.一種采用3，5-二鹵代-4-羥基芐腈類除草劑選擇性地控制植物生長中野草的方法，其特征在于是將除草劑施用于如權利要求13和14中所述的一種經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物。
16.如權利要求1-8之一所述的嵌合基因的使用，其特征在于將嵌合基因作為植物細胞，胼胝體，植物的部分或植物的選擇標記。
全文摘要
本發(fā)明涉及使植物對除草劑具有抗性的基因。使植物對3，5-二鹵代-4-羥基芐腈類除草劑具有抗性的嵌合基因，它包括至少一種能編碼抗這類除草劑的基因，一種外來啟動子和選擇性地，一個多聚腺苷化信號區(qū)，其中啟動子來自于在植物細胞中自然表達的基因，它選自由花椰菜鑲嵌病毒(Ca MV 35 S)的35S RNA的啟動子和向日葵(Helianthus annuus)核酮糖-1，5-雙磷酸羧酶/加氧酶(Rubis CO)的小亞基(SSU)的啟動子所組成的組及其農(nóng)業(yè)上的應用。
文檔編號A01H5/00GK1036038SQ89101778
公開日1989年10月4日 申請日期1989年3月23日 優(yōu)先權日1988年3月23日
發(fā)明者伯納德·雷諾克斯, 伯納德·佩利西耶, 米歇爾·勒布倫 申請人:羅納-普朗克農(nóng)業(yè)化學公司