專利名稱：抗家禽病毒病的作物及其生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗家禽病毒病的作物及其生產(chǎn)方法，更具體地說，涉及一種抗家禽禽流感、新城疫和傳染性法氏囊病三種病毒病其中的任意一種、二種或者三種的玉米、水稻、小麥、大豆、油菜作物及其生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
在現(xiàn)有技術(shù)中，用植物作表達(dá)載體來表達(dá)外源蛋白已有不少報道，但將家禽病毒抗原于植物體上表達(dá)尚未見報道。目前的預(yù)防技術(shù)中，禽流感(AI)、新城疫(ND)和傳染性法氏囊病(IBD)的免疫有用死苗的，也有用弱毒苗的。但現(xiàn)有的免疫技術(shù)有諸多不完善因素一是生產(chǎn)疫苗的廠家具有散毒的危險，二是弱毒苗具有“返祖”現(xiàn)象，更重要的是人為的傳播了其他疾病，給病毒病的根除帶來極大的困難。三是滅活苗和弱毒苗免疫的程序復(fù)雜，成本較高，免疫不確實(shí)。因此，要徹底地控制和消滅此病，必須開發(fā)一種安全、高效、低廉的替代品。研究表明AIV的結(jié)構(gòu)蛋白HA、NDV的結(jié)構(gòu)蛋白F、IBDV的結(jié)構(gòu)蛋白VP2攜有各自病毒典型的抗原決定簇，可誘發(fā)IgA/IgG的產(chǎn)生，兩者均可保護(hù)試驗(yàn)或本體動物抵抗強(qiáng)毒攻擊。
技術(shù)內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種抗家禽禽流感、新城疫和傳染性法氏囊病三種病毒病的其中的任意一種、二種或者三種的玉米、水稻、小麥、大豆、油菜作物及其生產(chǎn)方法。
為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案1、一種抗家禽禽流感、新城疫和傳染性法氏囊病三種病毒病中的一種、二種或三種疾病的作物，包括玉米、水稻、小麥、大豆和油菜等，其特征在于它們完整地表達(dá)了禽流感病毒，新城疫病毒和傳染性法氏囊病毒中的任意一種、二種或三種病毒的抗原并可使家禽產(chǎn)生有效免疫力，用以表達(dá)的免疫原性蛋白基因?yàn)榍萘鞲胁《镜闹饕庖咴缘鞍谆蚣碒A基因ttgaattcttgaattcatggaaagaacagtgcttcttcttgcaacagtcagtcttgttaaaagtgatcagatttgcattggttaccatgcaaacaactcgacagagcaggttgacacaataatggaaaagaatgttactgttacacatgcccaagacatactggaaaggacacacaacgggaagctctgcgatctaaatggagtgaagcctctcattttgagggattgtagtgtagctggatggctcctcggaaaccctatgtgtgacgaattcatcaatgtgccggaatggtcttacatagtggagaaggccagtccagccaatgacctctgttatccagggaatttcaacgactatgaagaactgaaacacctattgagcagaataaaccattttgagaaaattcagatcatccccaaaagttcttggtccaatcatgatgcctcatcaggggtgagctcagcatgtccataccttgggaggtcctcctttttcagaaatgtggtatggcttatcaaaaagaacagtgcatacccaacaataaagaggagctacaataataccaaccaagaagatcttttggtactgtggggggttcaccatcctaatgatgcggcagagcagacaaagctctatcaaaatccaaccacctacatttccgttggaacatcaacactgaaccagagattggttccagaaatagctactagacccaaagtaaacgggcaaagtggaagaatggagttcttctggacaattttaaagccgaatgatgccatcaatttcgagagtaatggaaatttcattgctccagaatatgcatacaaaattgtcaagaaaggggactcaacaattatgaaaagtgaattggaatatggtaactgcaacaccaagtgtcaaactccaatgggggcgataaactctagtatgccattccacaacatacaccccctcaccatcggggaatgccccaaatatgtgaaatcaaacagattagtccttgcgactggactcagaaatacccctcaaagagagagaagaagaaaaaagagaggactatttggagctatagcaggttttatagagggaggatggcagggaatggtagatggttggtatgggtaccaccatagcaatgagcaggggagttgctactctgcagacaaagaatccactcaaaaggcaatagatggagtcaccaataaggtcaactcgatcattaacaaaatgaacactcagtttgaggccgttggaagggaatttaataacttggaaaggaggatagagaatttaaacaagaagatggaagacggattcctagatgtctggacttacaatgctgaacttctggttctcatggaaaatgagagaactctcgactttcatgactcaaatgtcaagaacctttacgacaaggtccgactacagcttagggataatgcaaaggagctgggtaatggttgtttcgaattctatcacaaatgtgataatgaatgtatggaaagtgtaaaaaacggaacgtatgactacccgcagtattcagaagaagcaagactaaacagagaggaaataagtggagtaaaattggaatcaatgggaacttaccaaatactgtcaatttattcaacagtggcgagttccctagcactggcaatcatggtagctggtctatctttatggatgtgctccaatggatcgttacaatgcagaatttgcatttaaatttgtgagttcagattgtagttaaaaacaccctgacgtcgagacgtacc新城疫病毒的主要免疫原性蛋白基因即F基因ttgaattcatgggccccaaatcttctaccaatgtcccagcacctctgatgctgaccgtcaggattgcgctggcactgagctgtgtccgtctgacaaattctctcgatggaaggcctcttgcagctgcagggattgtagtaacgggagacaaagcagtcaacatatacacctcatctcagacagggtcaataatagtcaagttactcccaaatatgcctaaggataaagaggcgtgtgcaaaagccccgttggaggcatacaacaggacactgactgctttgctcaccccccttggtgattctatccgcaggatacaagagtctgcgactacgtccggaggaaggaggcagagacgctttataggtgccattatcggcagtgtagctcttggggttgccacagctgcccagataacagcagcctcagctctgatacaagccaaccagaatgctgccaacatcctccggcttaaagagagcattgctgcaactaatgaagctgtacatgaagtcactgacggattatcgcaactagcagtggcagttgggaagatgcagcagtttgttaatgaccagtttaataacacagctcaggaattggactgtataaaaattacacagcaggttggtgtagaactcaacctgtacctaactgaattgactacagtattcgggccacaaatcacttcccctgccttaactcagctgactatccaggcgctttacaatctagctggtggtaagatggattatttgttgactaagttaggtgttgggaacaaccaactcagctcattaatcggtagcggcttgatcaccggtaaccctattctgtacgattcacagactcaactcttaggtatacaggtaactttaccctcagtcggtaacctaaataatatgcgtgctacctacttggagaccttgtctgtaagcacaaccaagggatttgcctcagcacttgtcccaaaagtggtgacacaggtcgggtctgtgatagaggaacttgacacctcatactgtgtagagaccgatttggatttatattgtacaagaatagtgacattccctatgtctcctggtatttattcctgtctgagcggtaatacatcagcttgcatgtattcaaagactgaaggtgcacttactacgccatatatgactatcaagggctcagttattgccaattgcaagataacaacatgcagatgtgcagaccctccgggtatcatatcgcaaaattatggagaagctgtgtctctaatagataggcactcatgcaatgtcttatccttagacgggataactttgaggctcagtggagaatttgacgtaacttatcaaaagaatatctcaatattagattctcaggtaatagtgacaggcaatctcaatatctcaactgaacttgggaatgtcaacaactcgataagtaatgctttggataagttagaggaaagcaatagcaaacttgacaaagtcaatgtcaagctgaccggcacgtctgctctcattacctatatagttttaactatcatatctcttgtttgtggtatacttagcctggttctagcatgctatctgatgtataagcaaaaggcgcaacaaaagaccttattatggcttgggaataataccctaaatcagatgagggccactacaagaatctgaacacagagacgtccc法氏囊病毒的主要免疫原性蛋白基因即VP2基因ttgaattcatgacaaacctgcaagatcaaacccaacagattgttccgttcatacggagccttctgatgccaacaaccggaccggcgtccattccggacgacaccctggagaagcacactctcaggtcagagacctcgacctacaatttgactgtgggggacacagggtcagggctaattgcctttttccctggattccctggctcaattgtgggtgctcactacacactgcagagcaatgggaactacaagttcgatcagatgctcctgactgcccagaacctaccggccagctacaactactgcaggctagtgagccggagtctcacagtaaggtcaagcacactccctggtggcgtttatgcactaaacggcaccataaacgccgtgaccttccaaggaagcctgagtgaactgacagatgttagctacaatggattgatgtctgcaacagccaacatcaacgacaaaattgggaacgtcctagtaggggaaggggtcaccgtcctcagcttacccacatcatatgatcttgggtatgtgagacttggtgaccccatacccgctatagggcttgacccaaaaatggtagcaacatgtgacagcagtgacaggcccagagtctacactataactgcagccgatgattaccaattctcatcacaataccaacaaggtggggtaacgatcacactgttctcagccaacattgatgccatcacaagcctcagcgttgggggagagcttgtgtttaaaacaagcgtccacagccttgtactgggcgccaccatctaccttataggctttgatgggactgcggtaatcactagagctgtagccgcaaacaatgggctgacgaccggcatcgacaatcttatgccattcaatcttgtgattccaaccaacgagataacccagccgatcacatccatcaaactggagatagtgacctccaggagtggtggtcaggcaggggatcagatgtcatggtcggcaagtgggagcctagcagtgacgatccatggtggcaactatccaggggccctccgtcccgtcacactagtagcctacgaaagagtggcaacaggatctgtcgttacgctcgccggggtgagcaacttcgagctgatcccaaatcctgaactagcaaagaacctggttacggaatacggccgatttgacccaggggccatgaactacacaaaattgatactgagtgatggggaccgtcttggcatcaagaccgtctggccaacaagggagtacacagactttcgtgagtacttcatggaggtggccgacctcaactctcccctgaagattgcaggagcatttggcttcaaagacataatccgggccataagggacgtccc上述三序列通過植物反應(yīng)器表達(dá)出各自的重組蛋白，并形成三級結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明較好的技術(shù)方案是實(shí)施過程中，進(jìn)行基因重組和重組蛋白的制備，在生產(chǎn)過程中將上述三種病毒的主要免疫原基因(1)插入質(zhì)粒載體采用分子生物學(xué)的方法提抽病毒的核酸RNA，用含啟動子和終止子，針對不同病毒所設(shè)計的三對特異性引物擴(kuò)增出各自相應(yīng)的完整免疫原基因，片段兩端為內(nèi)切酶位點(diǎn)(XbaI和salI)，用相應(yīng)的內(nèi)切酶切表達(dá)載體和目的片段，T4連接酶連接重組，構(gòu)建各自的重組質(zhì)粒；(2)將上述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入植物玉米、水稻、小麥、大豆和油菜中進(jìn)行表達(dá)，獲得轉(zhuǎn)基因植物的種子將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌C58C1菌株細(xì)胞系，于含卡那霉素的LB中培養(yǎng)，離心收集細(xì)胞，于含蔗糖和L6-BA的MS培養(yǎng)液中重懸，再將培養(yǎng)好的植物莖葉浸入含根癌農(nóng)桿菌細(xì)胞的重懸液中真空浸潤，用水沖洗，存放至成熟，用含MS、蔗糖和MES的GM和卡那霉素的瓊脂凝膠篩選轉(zhuǎn)基因種子；或者用重組質(zhì)粒包裹金彈，采用基因轟擊的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化，獲得分別單抗禽流感、新城疫或傳染性法氏囊病的轉(zhuǎn)基因種子。將分別攜有單抗禽流感、新城疫或傳染性法氏囊病的轉(zhuǎn)基因種子培育至待授粉植株時，采用傳統(tǒng)的雜交方法將單抗禽流感、新城疫或傳染性法氏囊病的植株進(jìn)行兩兩雜交或者三者雜交，獲得同時抗禽流感、新城疫或傳染性法氏囊病三種病毒病中的任意兩種或者對三種疾病同時具有抵抗作用的轉(zhuǎn)基因種子；(3)取種子種入土壤，獲得可作為飼料原料的植物根、莖、葉、果實(shí)或種子。
在實(shí)施本發(fā)明的過程中，將三種病毒(禽流感病毒，新城疫病毒、傳染性法氏囊病毒)分別置9日齡雞胚繁殖一代后，從尿囊液中提取各個病毒的RNA，RT-PCR擴(kuò)增出各自的完整免疫愿蛋白基因。
上述三序列通過植物反應(yīng)器表達(dá)出各自的重組蛋白，并形成三級結(jié)構(gòu)，用含重組活性蛋白的作物作飼料，給家禽進(jìn)食兩周以后，可起到預(yù)防三種疾病其中的任意一種、或其中的任意二種或者三種疾病的作用。
在實(shí)施本發(fā)明的過程中，抗家禽疾病的作物的生產(chǎn)包括用特異的引物獲得各個目的基因、基因重組、重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化植物，免疫方法包括用含重組蛋白的作物制作飼料并飼喂家禽。病毒的RNA從接種雞胚或雞體組織中抽提，用反轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增基因，在引物中導(dǎo)入了內(nèi)切酶位點(diǎn)(XbaI和SalI)和起始子及終止子，將各個病毒的主要免疫原基因克隆至表達(dá)載體中，將重組的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入植物中進(jìn)行表達(dá)，待轉(zhuǎn)基因植物種子成熟后獲得分別單抗禽流感、新城疫或傳染性法氏囊病的轉(zhuǎn)基因種子?；蛘哂弥亟M質(zhì)粒包裹金彈，采用基因轟擊的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化，獲得分別單抗禽流感、新城疫或傳染性法氏囊病的轉(zhuǎn)基因種子。將分別攜有單抗禽流感、新城疫或傳染性法氏囊病的轉(zhuǎn)基因種子培育至待授粉植株時，采用傳統(tǒng)的雜交方法將單抗禽流感、新城疫或傳染性法氏囊病的植株進(jìn)行兩兩雜交或者三者雜交，獲得同時抗禽流感、新城疫或傳染性法氏囊病三種病毒病中的任意兩種或者對三種疾病同時具有抵抗作用的轉(zhuǎn)基因種子。后將抗各種病毒的種子播種，成熟后用作家禽飼料原料。用作轉(zhuǎn)基因的植物可以是玉米、水稻、大豆、小麥、油菜等。轉(zhuǎn)基因植物經(jīng)過培育后，其根、莖、葉、果實(shí)或種子中含有三各種病毒其中的任意一種病毒、或其中的任意二種病毒或者三種病毒同時含有的外源免疫原性蛋白，并可經(jīng)ELISA法和Western blot法檢測確證。
實(shí)施過程中，將植物種子種于小杯中，在4℃暗室中放置48小時使其同步發(fā)芽。后轉(zhuǎn)至生長室20℃曝光16小時，用雙蒸水，偶而用礦物質(zhì)水澆灌。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌細(xì)胞系(Agrobacteriumtumefaciens cell line)(C58C1株)，在LB(Luri-Bertani)培養(yǎng)液中(含卡那霉素50mg/ml)培養(yǎng)離心收集細(xì)胞，于200ml MS(murashige和Skoog)培養(yǎng)液(2.35g/l)(含5％蔗糖和10g/L的6-BA(6-芐氨基嘌吟6-benzilaminopurine中重懸。待植物6-7周齡時，倒置培養(yǎng)杯將植物浸入含根癌農(nóng)桿菌細(xì)胞(Agrobacterium)的重懸液中，真空5×106mpa。浸潤滲透15分鐘，用水沖洗后放于生長室中直至成熟。在培養(yǎng)皿中用含GM(4.7g/lMS、1％蔗糖和0.5g/LMES(嗎啉乙烷磺酸morpholine ethane sulfonicacid)和50mg/ml卡那霉素的瓊脂凝膠(8g/lPH5.7)中篩選轉(zhuǎn)基因種子。兩周后，將轉(zhuǎn)基因植物移至土壤中培育成熟即可分別單抗禽流感、新城疫或傳染性法氏囊病的轉(zhuǎn)基因種子。或者用重組質(zhì)粒包裹金彈，采用基因轟擊的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化，經(jīng)過培育和Southern blot檢測確認(rèn)后獲得分別單抗禽流感、新城疫或傳染性法氏囊病的轉(zhuǎn)基因種子。
將分別攜有單抗禽流感、新城疫或傳染性法氏囊病的轉(zhuǎn)基因種子培育至待授粉植株時，采用傳統(tǒng)的雜交方法將單抗禽流感、新城疫或傳染性法氏囊病的植株進(jìn)行兩兩雜交或者三者雜交，獲得同時抗禽流感、新城疫或傳染性法氏囊病三種病毒病中的任意兩種或者對三種疾病同時具有抵抗作用的轉(zhuǎn)基因種子。
轉(zhuǎn)基因植物的根、莖、葉、果實(shí)和種子中含有三個病毒其中的任意一種病毒、或其中的任意二種病毒或者三種病毒同時含有的相應(yīng)的外源基因，經(jīng)PCR檢測確證，所含外源蛋白可經(jīng)ELISA和Western blot檢測確證。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下明顯的優(yōu)點(diǎn)一是生產(chǎn)技術(shù)簡單，二是作物中的重組蛋白具有免疫原性，可誘發(fā)家禽產(chǎn)生抗體抵抗家禽禽流感、新城疫和傳染性法氏囊病病毒的其中的任意一種疾病、或其中的任意二種疾病或者對三種疾病同時具有抵抗作用，家禽進(jìn)食含上述作物的飼料兩周后，用104ID50相應(yīng)病毒攻毒，免疫小雞的保護(hù)率為100％，而對照組則全部死亡，因而技術(shù)效果好。
將植物的種子植入小杯中，于4℃暗室中放置48小時使其同步發(fā)芽，其后轉(zhuǎn)移至生長室20℃曝光16小時，用雙蒸水，偶爾用礦物質(zhì)水澆灌。待植物6-7周齡時，倒置培養(yǎng)杯將植物莖葉浸入含根癌農(nóng)桿菌細(xì)胞的重懸液中，真空度5×106mpa浸潤滲透15分鐘，用水沖洗后放入生長室中直至成熟。在培養(yǎng)皿中，用含GM(4.7g/lMS、1％蔗糖和0.5g/lMES)和50mg/ml濃度卡那霉素的瓊脂膠凝(8g/lPH5.7)中篩選轉(zhuǎn)基因植株。兩周后，將轉(zhuǎn)基因植物移至土壤中培養(yǎng)成熟即可獲得抗禽流感的轉(zhuǎn)基因種子?；蛘哂弥亟M質(zhì)粒包裹金彈，采用基因轟擊的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化，經(jīng)過培育和Southern blot檢測確認(rèn)后獲得抗禽流感的轉(zhuǎn)基因種子。
各個轉(zhuǎn)基因植物的根、莖、葉、果實(shí)或種子中所含禽流感的外源基因HA，可經(jīng)其的PCR檢測引物檢測存在。
各個轉(zhuǎn)基因植物的根、莖、葉、果實(shí)或種子中所含的外源蛋白HA，經(jīng)ELISA和Western blot檢測其存在，陽性對照為空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的植物抽提物中混有人工合成的位于HA蛋白中的一些抗原決定簇的多肽(10ug/ml)，陰性對照為空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的植物抽提物。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因植物的根、莖、葉、果實(shí)或種子中含有外源蛋白HA，能夠與蛋白中相應(yīng)的抗原多肽血清發(fā)生明顯的反應(yīng)。在Western blot檢測中，用抗HA的血清可檢測到特異性的條帶，分子量為30-150KDa，得出與ELISA相同的檢測結(jié)果。
用ELISA和Western blot檢測各個抗禽流感的轉(zhuǎn)基因植物免疫小雞后血清中抗AIV的相應(yīng)抗體的存在，ELISA檢測結(jié)果顯示小雞血清中含有抗禽流感病毒抗體，具有特異性的抗相應(yīng)多肽和AIV的特性；Western blot檢測結(jié)果顯示用相應(yīng)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的轉(zhuǎn)基因植物的抽提物免疫小雞獲得的混合血清，同相應(yīng)的抗多肽血清一樣具有特異性的反應(yīng)帶。家禽進(jìn)食含上述作物的飼料兩周后，用104ID50相應(yīng)的禽流感病毒攻毒，免疫小雞的保護(hù)率為100％，而對照組則全部死亡。
實(shí)施例2抗新城疫作物用小雞或雞胚繁殖新城疫病毒，采用分子生物學(xué)方法抽提病毒的核酸RNA，用含啟動子和終止子的特定引物擴(kuò)增出F的完整基因，片段兩端含有內(nèi)切酶位點(diǎn)XbaI和SalI，用相應(yīng)的內(nèi)切酶酶切表達(dá)載體和目的片段，T4連接酶連接重組，構(gòu)建重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌細(xì)胞系(C58C1株)，于LB培養(yǎng)液(含卡那霉素50mg/ml)培養(yǎng)，離心收集細(xì)胞，于200mlMS培養(yǎng)液(2.35g/l濃度)(含5％蔗糖和10g/l6-BA)中重懸。
將植物的種子植入小杯中，于4℃暗室中放置48小時使其同步發(fā)芽，其后轉(zhuǎn)移至生長室20℃曝光16小時，用雙蒸水，偶爾用礦物質(zhì)水澆灌。待植物6-7周齡時，倒置培養(yǎng)杯將植物莖葉浸入含根癌農(nóng)桿菌細(xì)胞的重懸液中，真空度5×106mpa浸潤滲透15分鐘，用水沖洗后放入生長室中直至成熟。在培養(yǎng)皿中，用含GM(4.7g/lMS、1％蔗糖和0.5g/lMES)和50mg/ml濃度卡那霉素的瓊脂膠凝(8g/lPH5.7)中篩選轉(zhuǎn)基因植株。兩周后，將轉(zhuǎn)基因植物移至土壤中培養(yǎng)成熟即可獲得抗新城疫的轉(zhuǎn)基因種子?；蛘哂弥亟M質(zhì)粒包裹金彈，采用基因轟擊的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化，經(jīng)過培育和Southern blot檢測確認(rèn)后獲得抗新城疫的轉(zhuǎn)基因種子。
各個轉(zhuǎn)基因植物的根、莖、葉、果實(shí)或種子中所的外源基因F，可經(jīng)PCR檢測引物檢測存在。
各個轉(zhuǎn)基因植物的根、莖、葉、果實(shí)或種子中所含的外源蛋白F，經(jīng)ELISA和Western blot檢測其存在，陽性對照為空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的植物抽提物中混有人工合成的位于F蛋白中的一些抗原決定簇的多肽(10ug/ml)，陰性對照為空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的植物抽提物。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因植物的根、莖、葉、果實(shí)或種子中含有外源蛋白，能夠與F蛋白中相應(yīng)的抗原多肽血清發(fā)生明顯的反應(yīng)。在Western blot檢測中，用抗F的血清可檢測到特異性的條帶，分子量為30-150KDa，得出與ELISA相同的檢測結(jié)果。
用ELISA和Western blot檢測各個轉(zhuǎn)基因植物免疫小雞后血清中抗NDV的相應(yīng)抗體的存在，ELISA檢測結(jié)果顯示小雞血清中含有抗新城疫病毒的抗體，具有特異性的抗相應(yīng)多肽和NDV的特性；Western blot檢測結(jié)果顯示用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的轉(zhuǎn)基因植物的抽提物免疫小雞獲得的混合血清，同相應(yīng)的抗多肽血清一樣具有特異性的反應(yīng)帶。家禽進(jìn)食含上述作物的飼料兩周后，用104ID50新城疫病毒攻毒，免疫小雞的保護(hù)率為100％，而對照組則全部死亡。
實(shí)施例3抗傳染性法氏囊病作物用小雞或雞胚繁殖傳染性法氏囊病病毒，采用分子生物學(xué)方法抽提病毒的核酸RNA，用含啟動子和終止子的的特定引物擴(kuò)增出VP2的完整基因，片段兩端含有內(nèi)切酶位點(diǎn)XbaI和SalI，用相應(yīng)的內(nèi)切酶酶切表達(dá)載體和目的片段，T4連接酶連接重組，構(gòu)建重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌細(xì)胞系(C58C1株)，于LB培養(yǎng)液(含卡那霉素50mg/ml)培養(yǎng)，離心收集細(xì)胞，于200mlMS培養(yǎng)液(2.35g/l濃度)(含5％蔗糖和10g/l6-BA)中重懸。
將植物的種子植入小杯中，于4℃暗室中放置48小時使其同步發(fā)芽，其后轉(zhuǎn)移至生長室20℃曝光16小時，用雙蒸水，偶爾用礦物質(zhì)水澆灌。待植物6-7周齡時，倒置培養(yǎng)杯將植物莖葉浸入含根癌農(nóng)桿菌細(xì)胞的重懸液中，真空度5×106mpa浸潤滲透15分鐘，用水沖洗后放入生長室中直至成熟。在培養(yǎng)皿中，用含GM(4.7g/lMS、1％蔗糖和0.5g/lMES)和50mg/ml濃度卡那霉素的瓊脂膠凝(8g/lPH5.7)中篩選轉(zhuǎn)基因植株。兩周后，將轉(zhuǎn)基因植物移至土壤中培養(yǎng)成熟即可獲得抗傳染性法氏囊病病毒的轉(zhuǎn)基因種子?；蛘哂弥亟M質(zhì)粒包裹金彈，采用基因轟擊的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化，經(jīng)過培育和Southern blot檢測確認(rèn)后獲得抗傳染性法氏囊病的轉(zhuǎn)基因種子。
各個轉(zhuǎn)基因植物的根、莖、葉、果實(shí)或種子中所含相應(yīng)的外源基因VP2，可經(jīng)的PCR檢測引物檢測存在。
各個轉(zhuǎn)基因植物的根、莖、葉、果實(shí)或種子中所含的外源蛋白VP2，經(jīng)ELISA和Western blot檢測其存在，陽性對照為空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的植物抽提物中混有人工合成的位于VP2中的一些抗原決定簇的多肽(10ug/ml)，陰性對照為空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的植物抽提物。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因植物的根、莖、葉、果實(shí)或種子中含有外源蛋白，能夠與VP2蛋白中相應(yīng)的抗原多肽血清發(fā)生明顯的反應(yīng)。在Western blot檢測中，用抗VP2的血清可檢測到特異性的條帶，分子量為30-150KDa，得出與ELISA相同的檢測結(jié)果。
用ELISA和Western blot檢測轉(zhuǎn)基因植物免疫小雞后血清中抗IBDV的相應(yīng)抗體的存在，ELISA檢測結(jié)果顯示小雞血清中含有抗IBDV的抗體，具有特異性的抗相應(yīng)多肽和IBDV的特性；Western blot檢測結(jié)果顯示用相應(yīng)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的轉(zhuǎn)基因植物的抽提物免疫小雞獲得的混合血清，同相應(yīng)的抗多肽血清一樣具有特異性的反應(yīng)帶。家禽進(jìn)食含上述作物的飼料兩周后，用104ID50IBDV攻毒，免疫小雞的保護(hù)率為100％，而對照組則全部死亡。
實(shí)施例4抗禽流感、新城疫和傳染性法氏囊病三種病毒中任意二種或者同時抗三種病毒疾病的作物將上述分別攜有單抗禽流感、新城疫或傳染性法氏囊病的轉(zhuǎn)基因種子培育至待授粉植株時，采用傳統(tǒng)的雜交方法將單抗禽流感、新城疫或傳染性法氏囊病的植株進(jìn)行兩兩雜交或者三者雜交，獲得同時抗禽流感、新城疫或傳染性法氏囊病三種病毒病中的任意兩種或者對三種疾病同時具有抵抗作用的轉(zhuǎn)基因種子。
各個轉(zhuǎn)基因植物的根、莖、葉、果實(shí)或種子中所含相應(yīng)的外源基因，均可經(jīng)相應(yīng)的PCR檢測引物檢測存在。
各個轉(zhuǎn)基因植物的根、莖、葉、果實(shí)或種子中所含的外源蛋白HA、F和VP2，經(jīng)ELISA和Western blot檢測其存在，陽性對照為空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的植物抽提物中混有人工合成的位于HA、F和VP2中的一些抗原決定簇的多肽(10ug/ml)，陰性對照為空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的植物抽提物。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因植物的根、莖、葉、果實(shí)或種子中含有外源蛋白，能夠與HA、F和VP2蛋白中相應(yīng)的抗原多肽血清發(fā)生明顯的反應(yīng)。在Western blot檢測中，用抗HA、F和VP2的血清可檢測到特異性的條帶，分子量為30-150KDa，得出與ELISA相同的檢測結(jié)果。
用ELISA和Western blot檢測轉(zhuǎn)基因植物免疫小雞后血清中抗AIV、NDV和IBDV的相應(yīng)抗體的存在，ELISA檢測結(jié)果顯示小雞血清中含有抗AIV、NDV和IBDV的抗體，具有特異性的抗相應(yīng)多肽和AIV、NDV和IBDV的特性；Western blot檢測結(jié)果顯示用相應(yīng)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的轉(zhuǎn)基因植物的抽提物免疫小雞獲得的混合血清，同相應(yīng)的抗多肽血清一樣具有特異性的反應(yīng)帶。家禽進(jìn)食含上述作物的飼料兩周后，用104ID50相應(yīng)的病毒攻毒，免疫小雞的保護(hù)率為100％，而對照組則全部死亡。
權(quán)利要求
1.一種抗家禽禽流感、新城疫和傳染性法氏囊病三種病毒病中的一種、二種或三種疾病的作物，包括玉米、水稻、小麥、大豆和油菜等，其特征在于它們完整地表達(dá)了禽流感病毒，新城疫病毒和傳染性法氏囊病毒中的任意一種、二種或三種病毒的抗原并可使家禽產(chǎn)生有效免疫力，用以表達(dá)的免疫原性蛋白基因?yàn)?1)禽流感病毒的主要免疫原性蛋白基因即HA基因ttgaattcttgaattcatggaaagaacagtgcttcttcttgcaacagtcagtcttgttaaaagtgatcagatttgcattggttaccatgcaaacaactcgacagagcaggttgacacaataatggaaaagaatgttactgttacacatgcccaagacatactggaaaggacacacaacgggaagctctgcgatctaaatggagtgaagcctctcattttgagggattgtagtgtagctggatggctcctcggaaaccctatgtgtgacgaattcatcaatgtgccggaatggtcttacatagtggagaaggccagtccagccaatgacctctgttatccagggaatttcaacgactatgaagaactgaaacacctattgagcagaataaaccattttgagaaaattcagatcatccccaaaagttcttggtccaatcatgatgcctcatcaggggtgagctcagcatgtccataccttgggaggtcctcctttttcagaaatgtggtatggcttatcaaaaagaacagtgcatacccaacaataaagaggagctacaataataccaaccaagaagatcttttggtactgtggggggttcaccatcctaatgatgcggcagagcagacaaagctctatcaaaatccaaccacctacatttccgttggaacatcaacactgaaccagagattggttccagaaatagctactagacccaaagtaaacgggcaaagtggaagaatggagttcttctggacaattttaaagccgaatgatgccatcaatttcgagagtaatggaaatttcattgctccagaatatgcatacaaaattgtcaagaaaggggactcaacaattatgaaaagtgaattggaatatggtaactgcaacaccaagtgtcaaactccaatgggggcgataaactctagtatgccattccacaacatacaccccctcaccatcggggaatgccccaaatatgtgaaatcaaacagattagtccttgcgactggactcagaaatacccctcaaagagagagaagaagaaaaaagagaggactatttggagctatagcaggttttatagagggaggatggcagggaatggtagatggttggtatgggtaccaccatagcaatgagcaggggagttgctactctgcagacaaagaatccactcaaaaggcaatagatggagtcaccaataaggtcaactcgatcattaacaaaatgaacactcagtttgaggccgttggaagggaatttaataacttggaaaggaggatagagaatttaaacaagaagatggaagacggattcctagatgtctggacttacaatgctgaacttctggttctcatggaaaatgagagaactctcgactttcatgactcaaatgtcaagaacctttacgacaaggtccgactacagcttagggataatgcaaaggagctgggtaatggttgtttcgaattctatcacaaatgtgataatgaatgtatggaaagtgtaaaaaacggaacgtatgactacccgcagtattcagaagaagcaagactaaacagagaggaaataagtggagtaaaattggaatcaatgggaacttaccaaatactgtcaatttattcaacagtggcgagttccctagcactggcaatcatggtagctggtctatctttatggatgtgctccaatggatcgttacaatgcagaatttgcatttaaatttgtgagttcagattgtagttaaaaacaccctgacgtcgagacgtacc(2)新城疫病毒的主要免疫原性蛋白基因即F基因ttgaattcatgggccccaaatcttctaccaatgtcccagcacctctgatgctgaccgtcaggattgcgctggcactgagctgtgtccgtctgacaaattctctcgatggaaggcctcttgcagctgcagggattgtagtaacgggagacaaagcagtcaacatatacacctcatctcagacagggtcaataatagtcaagttactcccaaatatgcctaaggataaagaggcgtgtgcaaaagccccgttggaggcatacaacaggacactgactgctttgctcaccccccttggtgattctatccgcaggatacaagagtctgcgactacgtccggaggaaggaggcagagacgctttataggtgccattatcggcagtgtagctcttggggttgccacagctgcccagataacagcagcctcagctctgatacaagccaaccagaatgctgccaacatcctccggcttaaagagagcattgctgcaactaatgaagctgtacatgaagtcactgacggattatcgcaactagcagtggcagttgggaagatgcagcagtttgttaatgaccagtttaataacacagctcaggaattggactgtataaaaattacacagcaggttggtgtagaactcaacctgtacctaactgaattgactacagtattcgggccacaaatcacttcccctgccttaactcagctgactatccaggcgctttacaatctagctggtggtaagatggattatttgttgactaagttaggtgttgggaacaaccaactcagctcattaatcggtagcggcttgatcaccggtaaccctattctgtacgattcacagactcaactcttaggtatacaggtaactttaccctcagtcggtaacctaaataatatgcgtgctacctacttggagaccttgtctgtaagcacaaccaagggatttgcctcagcacttgtcccaaaagtggtgacacaggtcgggtctgtgatagaggaacttgacacctcatactgtgtagagaccgatttggatttatattgtacaagaatagtgacattccctatgtctcctggtatttattcctgtctgagcggtaatacatcagcttgcatgtattcaaagactgaaggtgcacttactacgccatatatgactatcaagggctcagttattgccaattgcaagataacaacatgcagatgtgcagaccctccgggtatcatatcgcaaaattatggagaagctgtgtctctaatagataggcactcatgcaatgtcttatccttagacgggataactttgaggctcagtggagaatttgacgtaacttatcaaaagaatatctcaatattagattctcaggtaatagtgacaggcaatctcaatatctcaactgaacttgggaatgtcaacaactcgataagtaatgctttggataagttagaggaaagcaatagcaaacttgacaaagtcaatgtcaagctgaccggcacgtctgctctcattacctatatagttttaactatcatatctcttgtttgtggtatacttagcctggttctagcatgctatctgatgtataagcaaaaggcgcaacaaaagaccttattatggcttgggaataataccctaaatcagatgagggccactacaagaatctgaacacagagacgtccc(3)法氏囊病毒的主要免疫原性蛋白基因即VP2基因ttgaattcatgacaaacctgcaagatcaaacccaacagattgttccgttcatacggagccttctgatgccaacaaccggaccggcgtccattccggacgacaccctggagaagcacactctcaggtcagagacctcgacctacaatttgactgtgggggacacagggtcagggctaattgcctttttccctggattccctggctcaattgtgggtgctcactacacactgcagagcaatgggaactacaagttcgatcagatgctcctgactgcccagaacctaccggccagctacaactactgcaggctagtgagccggagtctcacagtaaggtcaagcacactccctggtggcgtttatgcactaaacggcaccataaacgccgtgaccttccaaggaagcctgagtgaactgacagatgttagctacaatggattgatgtctgcaacagccaacatcaacgacaaaattgggaacgtcctagtaggggaaggggtcaccgtcctcagcttacccacatcatatgatcttgggtatgtgagacttggtgaccccatacccgctatagggcttgacccaaaaatggtagcaacatgtgacagcagtgacaggcccagagtctacactataactgcagccgatgattaccaattctcatcacaataccaacaaggtggggtaacgatcacactgttctcagccaacattgatgccatcacaagcctcagcgttgggggagagcttgtgtttaaaacaagcgtccacagccttgtactgggcgccaccatctaccttataggctttgatgggactgcggtaatcactagagctgtagccgcaaacaatgggctgacgaccggcatcgacaatcttatgccattcaatcttgtgattccaaccaacgagataacccagccgatcacatccatcaaactggagatagtgacctccaggagtggtggtcaggcaggggatcagatgtcatggtcggcaagtgggagcctagcagtgacgatccatggtggcaactatccaggggccctccgtcccgtcacactagtagcctacgaaagagtggcaacaggatctgtcgttacgctcgccggggtgagcaacttcgagctgatcccaaatcctgaactagcaaagaacctggttacggaatacggccgatttgacccaggggccatgaactacacaaaattgatactgagtgatggggaccgtcttggcatcaagaccgtctggccaacaagggagtacacagactttcgtgagtacttcatggaggtggccgacctcaactctcccctgaagattgcaggagcatttggcttcaaagacataatccgggccataagggacgtccc
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的作物的生產(chǎn)方法，其特征在于進(jìn)行基因重組和重組蛋白的制備，在生產(chǎn)過程中將上述三種病毒的主要免疫原基因(1)插入質(zhì)粒載體采用分子生物學(xué)的方法提抽病毒的核酸RNA，用含啟動子和終止子，針對不同病毒所設(shè)計的三對特異性引物擴(kuò)增出各自相應(yīng)的完整免疫原基因，片段兩端為內(nèi)切酶位點(diǎn)(Xba I和salI)，用相應(yīng)的內(nèi)切酶切表達(dá)載體和目的片段，T4連接酶連接重組，構(gòu)建各自的重組質(zhì)粒；(2)將上述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入植物玉米、水稻、小麥、大豆和油菜中進(jìn)行表達(dá)，獲得轉(zhuǎn)基因植物的種子將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌C58C1菌株細(xì)胞系，于含卡那霉素的LB中培養(yǎng)，離心收集細(xì)胞，于含蔗糖和L6-BA的MS培養(yǎng)液中重懸，再將培養(yǎng)好的植物莖葉浸入含根癌農(nóng)桿菌細(xì)胞的重懸液中真空浸潤，用水沖洗，存放至成熟，用含MS、蔗糖和MES的GM和卡那霉素的瓊脂凝膠篩選分別單抗禽流感、新城疫或傳染性法氏囊病的轉(zhuǎn)基因種子，或者用重組質(zhì)粒包裹金彈，采用基因轟擊的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化，將分別攜有單抗禽流感、新城疫或傳染性法氏囊病的轉(zhuǎn)基因種子培育至待授粉植株時，采用傳統(tǒng)的雜交方法將單抗禽流感、新城疫或傳染性法氏囊病的植株進(jìn)行兩兩雜交或者三者雜交，獲得同時抗禽流感、新城疫或傳染性法氏囊病三種病毒病中的任意兩種或者對三種疾病同時具有抵抗作用的轉(zhuǎn)基因種子；(3)取種子種入土壤，獲得可作為飼料原料的植物根、莖、葉、果實(shí)或種子。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗禽流感、新城疫和傳染性法氏囊病三種家禽病毒病中的一種、二種或三種的作物及生產(chǎn)方法,作物中的活性抗原蛋白是由病毒RNA反轉(zhuǎn)錄獲得并可編碼相應(yīng)HA、F和VP2蛋白的全DNA序列,為作物的根、莖、葉和種子中形成的立體結(jié)構(gòu)的總和,通過將HA、F和VP2全基因插入質(zhì)粒載體、重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入植物中表達(dá)、對三種病毒分別具有抵抗作用的植株兩兩雜交或者三個植株同時雜交,不同轉(zhuǎn)基因種子種入土壤獲得可作為飼料原料的作物及將含重組活性蛋白的飼料飼喂家禽等過程,有效地解決了免疫用飼料糧食的生產(chǎn)和家禽三種疾病的免疫問題,具有生產(chǎn)簡單、免疫操作方便和對家禽保護(hù)力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),廣泛適用于各類家禽的飼養(yǎng)免疫。
文檔編號A01H1/00GK1333370SQ0112535
公開日2002年1月30日 申請日期2001年8月16日 優(yōu)先權(quán)日2001年8月16日
發(fā)明者鐘安清, 秦智鋒 申請人:深圳市三方圓信息技術(shù)有限公司