專利名稱：生產(chǎn)水稻雜種細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)水稻雜種細(xì)胞和植株的方法，本發(fā)明用于育種水稻。
近年來，許多著作報(bào)道了一種整個(gè)植株由一種靠細(xì)胞融合制備的細(xì)胞再生。借助這些方法，能夠獲得遠(yuǎn)緣關(guān)系的植物雜交，這種雜交過去一直是不可能的。另外，通過這些方法，能獲得親本細(xì)胞質(zhì)的結(jié)合或交換(雜化)，但迄今這在普通雜交育種技術(shù)中是不能進(jìn)行的。
不象普通的回交育種那樣，需要經(jīng)過一段長的時(shí)間周期，該雜化能在短時(shí)間周期內(nèi)進(jìn)行，因此在育種植物的領(lǐng)域中正在對(duì)這種雜交技術(shù)進(jìn)行深入的研究。
然而，至今只有在有限數(shù)量的植物種例如煙草、胡羅卜和土豆中得到成功的雜種。
水稻是重要的作物，因而需要培育出帶有改進(jìn)特征的稻植物。然而至今，仍然不能獲得稻的雜種甚至稻的體細(xì)胞雜交。
因此，本發(fā)明的目的是提供一種生產(chǎn)水稻雜種細(xì)胞和植株的方法。
通常，為了獲得雜種，至少應(yīng)解決三個(gè)問題，即應(yīng)當(dāng)選擇1)破壞親本原生質(zhì)的核質(zhì)的條件，2)用來鈍化其它親本原生質(zhì)的細(xì)胞質(zhì)的條件，3)用于融合原生質(zhì)的條件。這些條件對(duì)每個(gè)植物種都是獨(dú)特的，因此，對(duì)于每個(gè)植物種需要適當(dāng)?shù)剡x擇這些條件。
本發(fā)明人為了得到這些條件，經(jīng)過深入研究，發(fā)現(xiàn)，通過X射線的照射能破壞水稻原生質(zhì)的核質(zhì)而不損壞原生質(zhì)的生命力;通過用特殊試劑處理原生質(zhì)能夠鈍化水稻原生質(zhì)的細(xì)胞質(zhì)而不損壞原生質(zhì)的生命力;融合這樣處理的原生質(zhì)以產(chǎn)生雜種水稻細(xì)胞，進(jìn)而完成本發(fā)明。
也就是說，本發(fā)明提供一種生產(chǎn)水稻雜種細(xì)胞的方法，它包括以下步驟對(duì)在細(xì)胞質(zhì)中含有第一有用基因的第一水稻原生質(zhì)進(jìn)行X射線照射，以選擇性地只破壞核質(zhì);用碘乙酰胺、若丹明6G或iodoacetage處理在核質(zhì)中含有第二有用基因的第二水稻原生質(zhì)，以選擇性地鈍化細(xì)胞質(zhì);融合被處理過的第一和第二原生質(zhì)以形成雜種細(xì)胞，該雜種細(xì)胞只具有含有第一有用基因的細(xì)胞質(zhì)和具有含有第二有用基因的核質(zhì)。
根據(jù)本發(fā)明，首先提供一種獲得水稻雜種細(xì)胞的方法。據(jù)此，可在短時(shí)間周期內(nèi)培育具有改進(jìn)特性的水稻植物而不采用需要長時(shí)間周期的普通回交育種。


圖1示出了對(duì)水稻原生質(zhì)進(jìn)行X射線照射的劑量和從照射的原生質(zhì)中再生的集群量之間的關(guān)系。
圖2示出了處理水稻原生質(zhì)用的碘乙酰胺的濃度和從照射的原生質(zhì)中再生的集群量之間的關(guān)系。
圖3示出了處理水稻原生質(zhì)用的若丹明6G的濃度和從照射的原生質(zhì)中再生的集群量之間的關(guān)系。
以下為最佳實(shí)施例的詳細(xì)描述。
這里術(shù)語“雜種細(xì)胞”指一個(gè)原生質(zhì)(亞原生質(zhì))的一部分和一個(gè)亞原生質(zhì)或一個(gè)全原生質(zhì)的融合產(chǎn)物。
如上所述，本發(fā)明的方法包括下列步驟選擇性地破壞第一原生質(zhì)的核質(zhì)，選擇性地鈍化第二原生質(zhì)的細(xì)胞質(zhì)和融合這樣處理的第一和第二原生質(zhì)。現(xiàn)在將分別描述這些步驟。
Ⅰ.核質(zhì)的描述在本發(fā)明的方法中，通過對(duì)稻原生質(zhì)進(jìn)行X射線照射來破壞在細(xì)胞質(zhì)中具有有用基因的第一水稻原生質(zhì)的核質(zhì)。水稻原生質(zhì)自身可由普通公知技術(shù)的方法來制備(例如Fujimura等，植物組織培養(yǎng)通訊，2(2)74～75)。在第一原生質(zhì)的細(xì)胞質(zhì)中含有的有用基因例如可以是雄性不育性蜃印Ｍü庖徊街璞匭脛瞥鲅竊?，灾J竊手校酥時(shí)黃蘋刀Ａ裊蘇５南赴?，灾k羆咽凳├?，诊冑pü緣駒市∫航蠿射線照射來實(shí)現(xiàn)，該稻原生質(zhì)懸浮液例如置于皮氏培養(yǎng)皿中，并具有不高于108/ml最好是106～4×107/ml的種群密度。以軟X射線作為X射線，對(duì)原生質(zhì)進(jìn)行照射，劑量以90～250Krad為好，最佳為120～150Krad，例如通過將具有20～200KV的電壓和3～20mA的電能施以商用的X射線管來獲得這一劑量。通過這一操作，可獲得在一定時(shí)間周期內(nèi)保持其生理特性而防止細(xì)胞分裂的稻亞原生質(zhì)。
Ⅱ細(xì)胞質(zhì)的鈍化在這一步驟中，在核質(zhì)中含有有用基因的第二稻原生質(zhì)用碘乙酰胺，若丹明6G或用iodoacetage來處理，以鈍化原生質(zhì)的細(xì)胞質(zhì)。在核質(zhì)中含有的有用基因例如可以是一種給予稻粒香味的基因，一種給予植物抗寒性的基因和一種給予植物高產(chǎn)的基因。這里細(xì)胞質(zhì)的鈍化指的是破壞細(xì)胞器或鈍化細(xì)胞質(zhì)中的細(xì)胞器的復(fù)制。在最佳實(shí)例中，可通過將原生質(zhì)懸浮于高滲溶液例如具有碘乙酰胺、若丹明6G或iodoacetage的0.3～0.5M濃度的葡萄糖溶液中來進(jìn)行該項(xiàng)處理。在該溶液中的碘乙酰胺或iodoacetage的濃度大約為10～30mM，若丹明6G的濃度大約為0.1～0.5mM。在最佳實(shí)例中，為了只獲得較理想的雜種，用16～30mM，最好用25～30mM碘乙酰胺來處理原生質(zhì)。該處理最好在4℃～30℃，10分鐘～30分鐘內(nèi)進(jìn)行。在該懸浮液中的這些原生質(zhì)的種群密度最好不高于108/ml，最佳為106～4×107/ml，在這項(xiàng)處理完成后，用相同的溶液但不含有碘乙酰胺，若丹明6G或iodoacetage來沖洗這些原生質(zhì)。由于沖洗這些原生質(zhì)通常是借助離心力來進(jìn)行，所以通常將原生質(zhì)懸浮于一個(gè)離心管中。該沖洗通常需要進(jìn)行幾次例如4次。
通過這種操作，可獲得具有正常核質(zhì)和已鈍化的細(xì)胞質(zhì)的原生質(zhì)。雖然原生質(zhì)的細(xì)胞質(zhì)被鈍化了，但是這樣處理的原生質(zhì)仍然保留了與其他原生質(zhì)融合的這種能力。
Ⅲ.細(xì)胞融合在這一步驟中，將按步驟Ⅰ破壞了核質(zhì)的原生質(zhì)和按步驟Ⅱ鈍化了細(xì)胞質(zhì)的原生質(zhì)融合。根據(jù)公知的聚乙二醇法或電融合法(EF)，可獲得這種細(xì)胞融合。特別在最佳實(shí)施例中，細(xì)胞融合可由下列方法進(jìn)行1)聚乙二醇法將按步驟Ⅰ的X射線處理的原生質(zhì)和按步驟Ⅱ處理的原生質(zhì)混合，這要通過混合兩者的原生質(zhì)懸浮液來實(shí)現(xiàn)。在每個(gè)懸浮液中，原生質(zhì)的種群密度最好為106～2×107/ml。另外，經(jīng)X射線處理的原生質(zhì)與經(jīng)試劑處理的原生質(zhì)數(shù)量比率最好為1∶1～5∶1。向這樣得到的原生質(zhì)混合懸浮液加入聚乙二醇(平均分子重量最好為1500～9000，具有最好為20～50%重量濃度)。聚乙二醇的容量最好可與懸浮液的容量相同。在室溫下將這樣得到的混合液保留例如5～15分鐘。此后，通過離心去除聚乙二醇，并且通過離心用具有例如0.4M波度的葡萄糖溶液沖洗融合的原生質(zhì)，例如沖洗三次。
2)電融合法用與上述的聚乙二醇法相同的方式混合按步驟Ⅰ的X射線處理的原生質(zhì)和按步驟Ⅱ處理的原生質(zhì)。然后將混合的懸浮液置于細(xì)胞融合裝置的一對(duì)平行電極之間，再通過依次應(yīng)用所述的下列電激ⅰ)～ⅲ)來電激這些原生質(zhì)。
ⅰ)0.75～2.0mHz，120～200V/cm的高頻，處理時(shí)間3～10秒ⅱ)0.75～2.0mHz，200～400V/cm的高頻，處理時(shí)間0.1～0.3秒ⅲ)2000～3500V/cm的矩形波或衰減波，處理時(shí)間10～300微秒1～3次在應(yīng)用ⅰ)～ⅲ)的電壓之后，在室溫下將原生質(zhì)懸浮液保留一般是15～20分鐘，隨后進(jìn)行沖洗。
通過上述這些步驟，可獲得稻雜種細(xì)胞。在上述融合操作后通過用兩種熒光著色劑，例如熒光素異硫氰酸鹽和若丹明異硫氰酸鹽對(duì)原生質(zhì)進(jìn)行檢查，可證實(shí)，用聚乙二醇法或EF法，有30%的原生質(zhì)形成雜種細(xì)胞。
從這樣制備的雜種細(xì)胞中能再生整個(gè)水稻植株。從雜種細(xì)胞再生整個(gè)植株可以借助與一般原生質(zhì)再生整個(gè)植株相同的方法進(jìn)行，從原生質(zhì)中再生整個(gè)植株的方法已經(jīng)建立，并在Fujimura等(Supra)中描述過，相應(yīng)參見美國專利申請(qǐng)第06/865519號(hào)(或歐州專利申請(qǐng)第86106889.8號(hào)加拿大專利申請(qǐng)第509543號(hào)或中國專利申請(qǐng)第86103448號(hào))。在通常的水土適應(yīng)后，再生的稻植物可以生長在溫室中。
現(xiàn)在將通過例子描述本發(fā)明，這些例子只以舉例為目的而示出，并不應(yīng)當(dāng)以任何受限制的方式來理解。
實(shí)施例1根據(jù)Fujimura等(1985，Supra)描述的方法，原生質(zhì)從稻的懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中分離出來(稻品種Sasanishiki，以其美味著稱)。對(duì)原生質(zhì)進(jìn)行各種劑量X射線照射。經(jīng)照射的原生質(zhì)根據(jù)Fujimura等(1985，Supra)進(jìn)行培養(yǎng)。經(jīng)照射14天之后，檢查再生的集群量，結(jié)果見
圖1所示。在
圖1中，橫坐標(biāo)代表X射線的總劑量，且縱坐標(biāo)代表經(jīng)X射線照射后14天內(nèi)再生的集群量。
如下所述，對(duì)原生質(zhì)進(jìn)行X射線照射將原生質(zhì)懸浮于酶液中，以達(dá)到2×107/ml的種群密度，以便防止細(xì)胞的再生，其中，該酶液按重量計(jì)含有4%的纖維素酶onozuka RS(Yakult Honshe有限公司)，1%的Macerozyme R-10(Yakult Honshe有限公司)，0.5%硫酸葡萄糖鉀(Meito Sangyou有限公司)，0.5%氯化鈣冰合物和0.4M甘露糖醇(PH5.5)。將兩毫升的懸浮液置于60毫米直徑的皮氏培養(yǎng)皿中，并且對(duì)該懸浮液進(jìn)行X射線照射，通過將100KV，4mA的電能應(yīng)用到X射線管來產(chǎn)生X射線。X射線的劑量通過改變照射的時(shí)間來改變。每分鐘的劑量為2Krad。
通過這個(gè)實(shí)驗(yàn)，可證明為了防止稻原生質(zhì)的細(xì)胞分裂，必須用不低于90Krad，最好不低于120Krad的X射線照射原生質(zhì)，這要比煙草(15Krad)或胡羅卜(60Krad)所需要的X射線的劑量大得多。
另一方面，通過用顯微鏡觀察經(jīng)X射線照射的原生質(zhì)，觀察活的原生質(zhì)流動(dòng)，直到經(jīng)不高于250Krad的X射線劑量的照射后一天為止，或直到經(jīng)不高于150Krad的X射線劑量的照射后5天為止。
從這一觀察，可以看到，如果用90～250Krad，最好為120～150Krad劑量的X射線來照射稻原生質(zhì)的話，雖然防止了細(xì)胞分裂，但原生質(zhì)的生理活性在一定的時(shí)間周期內(nèi)保持在相當(dāng)高的水平。
從這些可證明，如上所述的核質(zhì)被破壞的亞原生質(zhì)適于作親本來制備稻雜種。
實(shí)施例2根據(jù)Fujimura等(1985，Supra)所描述的方法，將原生質(zhì)從稻懸浮的細(xì)胞培養(yǎng)中分離出來(稻品種Sasanishiki)，將原生質(zhì)懸浮于含有不同量的碘乙酰胺的0.4M葡萄糖中以達(dá)到2×107/ml的種群密度，在25℃下保持15分鐘。在該項(xiàng)處理后，用0.4M葡萄糖液沖洗原生質(zhì)4次。
根據(jù)Fujimura等(1985，Supra)所描述的方法培養(yǎng)這樣處理的原生質(zhì)。根據(jù)該處理，經(jīng)14天后檢查再生的集群量，結(jié)果見圖2。圖2中，橫坐標(biāo)表示碘乙酰胺的濃度，縱坐標(biāo)表示再生的集群量。
通過這一實(shí)驗(yàn)所示，必須用含有不低于10mM濃度的碘乙酰胺來處理稻原生質(zhì)，這比用于煙草或土豆所需的濃度高得多。
另一方面，用顯微鏡觀察處理過的原生質(zhì)，通過這一觀察表明，當(dāng)用含有10～30mM濃度的iodoacetage處理原生質(zhì)時(shí)，可防止細(xì)胞分裂而且原生質(zhì)保持其正常的細(xì)胞結(jié)構(gòu)直到經(jīng)過處理后至少兩天為止，并且通過用熒光素雙醋酸鹽(FDA)對(duì)原生質(zhì)進(jìn)行著色，表明該原生質(zhì)也保持了其生理活性。如果用含有不低于35mM濃度的iodoacetage處理原生質(zhì)的話，那么在處理中將毀壞原生質(zhì)的結(jié)構(gòu)。
根據(jù)這些可證明用含有10～30mm最好為16～30mM濃度的碘乙酰胺處理原生質(zhì)所獲得的亞原生質(zhì)(防止了細(xì)胞分裂并且能生存一定的時(shí)間周期)適于作親本以制備稻雜種。
實(shí)施例3根據(jù)Fujimura等(1985，Supra)所述的方法，從稻的懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中分離出原生質(zhì)(稻品種Sasanishiki)。將原生質(zhì)懸浮于含有不同量的若丹明6G的0.4M葡萄糖中以達(dá)到2×107/ml的種群密度，在25℃下保持15分鐘。在該項(xiàng)處理后，用0.4M葡萄糖液沖洗原生質(zhì)4次。
根據(jù)Fujimura等(1985，Supra)所描述的方法，培養(yǎng)這樣處理的原生質(zhì)。根據(jù)該項(xiàng)處理，14天后檢查再生集群量。結(jié)果見圖3。在圖3中橫坐標(biāo)表示若丹明6G的濃度，縱坐標(biāo)表示再生集群量。
通過該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)表明，必須用不低于0.1mM濃度的若丹明6G來處理稻原生質(zhì)。
另一方面，用顯微鏡觀察處理過的原生質(zhì)，通過觀察表明，當(dāng)用含有0.1～0.5mM濃度的若丹明6G處理原生質(zhì)時(shí)，細(xì)胞分裂被防止了，而原生質(zhì)保留其正常的細(xì)胞結(jié)構(gòu)直到經(jīng)該項(xiàng)處理后至少兩天為止，并且通過用熒光素雙醋酸鹽(FDA)對(duì)原生質(zhì)進(jìn)行著色表明，該原生質(zhì)也保留了其生理活性。如果用含有不低于1mM濃度的若丹明6G處理原生質(zhì)的話，則在處理中將毀壞原生質(zhì)的結(jié)構(gòu)。
從這些實(shí)驗(yàn)可證明，通過用含有0.1～0.5mM濃度的若丹明6G處理原生質(zhì)可獲得稻亞原生質(zhì)，其細(xì)胞分裂被阻止，且能生存一定的時(shí)間周期，可適于作親本用來制備稻雜種。
實(shí)施例4根據(jù)Fujimura等(1985，Supra)所描述的方法，從稻的懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中分離出原生質(zhì)(稻品種MT-CMA5)，根據(jù)線粒體DNA(K.Kadowaki等，JapanJ.Breed，36，333-339，(1986))的電泳圖，已經(jīng)證實(shí)，這種所用的懸浮培養(yǎng)細(xì)胞具有ChinsuraBoroⅡ型的細(xì)胞質(zhì)雄性不育因子，用125Krad劑量的X射線按實(shí)例1所述的方式處理這些原生質(zhì)來獲得其核質(zhì)被破壞的亞原生質(zhì)。
另一方面，根據(jù)Fujimura等(1985，Supra)描述的方法，從稻的懸浮培養(yǎng)細(xì)胞(稻品種Sasanishiki)中分離出原生質(zhì)，用30mM的碘乙酰胺處理原生質(zhì)，在25℃下保持15分鐘，以獲得不再具有分裂能力的亞原生質(zhì)。
這樣獲得的MT-CMAS亞原生質(zhì)和Sasanishiki亞原生質(zhì)分別懸浮于0.4M葡萄糖中，以達(dá)到2×107/ml的種群密度，將該懸浮液用1∶1的比率混合，把混合的懸浮液置于細(xì)胞融合裝置的一對(duì)平行電極之間，且按下列順序?qū)﹄姌O施以電能1)1MHz的高頻，150V/cm，處理時(shí)間5秒;
2)1MHz的高頻，250V/cm，處理時(shí)間0.1秒;
3)2500V/cm的矩形波，處理時(shí)間50微秒。
在進(jìn)行這項(xiàng)電處理之后，將懸浮液在4℃下保留15分鐘，然后用0.4M葡萄糖液立即沖洗細(xì)胞，這樣得到的原生質(zhì)在一個(gè)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，該培養(yǎng)基成份為R2酸鹽(Ohira，K，K，Ojima，A.Fujimura，1973，植物細(xì)胞生理(PlantCellPhysiol)，14∶1113-1121)，B5維生素(Gamborg，OIL.，R.A.Miller，K.Ojima，1968，Exp.CellRes.，50∶151-158)，0.4M的蔗糖和1ppm的2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)(PH4.5)，溫度為27℃，如Fujimura等(1985，Supra)所述。
開始培養(yǎng)兩周以后，形成細(xì)胞群。該細(xì)胞群轉(zhuǎn)移到生長培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基成份為R2酸鹽，B5維生素，0.2M葡萄糖，1ppm的2，4-D和0.25ppm的BA(6-芐(基)腺嘌呤)(PH5.0)，并且在27℃下，在該培養(yǎng)基中培養(yǎng)兩周。然后細(xì)胞群轉(zhuǎn)移到不同的培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基成份為Nb酸鹽(Chu，C-C，1978，關(guān)于植物組織培養(yǎng)的專題論叢(ProceedingofSymposiumonPlantTissueCulture)，P.43～50，科學(xué)出版社，北京)，B5維生素，3%的重量的蔗糖，1ppm的NAA(萘乙酸)，2ppm的BA和1%的瓊脂(PH5.5)，并且在27℃下培養(yǎng)兩周，以再生整個(gè)植株。然后使植株適應(yīng)水土，并在溫室中生長以成熟。在開花的時(shí)候，進(jìn)行自花粉和異花傳粉和異花授粉以形成稻粒。
通過檢查這樣再生的稻植物，在用原始的“Sasanishiki”進(jìn)行授粉之后，根據(jù)植株的外觀和稻粒的質(zhì)量，這些稻植物顯然是Sasanishiki。然而失去了花粉的生育力。通過線粒體DNA的電泳圖檢查雄性不育的類型，結(jié)果證明，顯然線粒體來源于“MT-CMA5”。這些結(jié)果清楚地表明，再生稻植株具有“Sasanishiki”的核質(zhì)，同時(shí)又有“MT-CMA5”細(xì)胞質(zhì)的雜種稻植物。
實(shí)施例5根據(jù)Fujimura等(1985，Supra)所描述的方法，原生質(zhì)從稻(品種MT-CMA5)的懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中分離出來，已經(jīng)證實(shí)，根據(jù)線粒體DNA(K.Mignouna等，TheorApplGenet.，74666-669(1987))的電泳圖，該懸浮培養(yǎng)細(xì)胞具有WA型細(xì)胞雄性不育因子。這些原生質(zhì)用150Krad劑量的X射線按實(shí)施例1中所述的方式進(jìn)行處理，以獲得其核質(zhì)被破壞的亞原生質(zhì)。
另一方面，根據(jù)Fujimura等(1985，Supra)所述的方法，原生質(zhì)從稻(品種Nihonbare)的懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中分離出來。用25mM的聚乙酰胺處理原生質(zhì)，在25℃下保持15分鐘，以獲得不再有分裂能力的亞原生質(zhì)。
這樣獲得的MT-CMA9亞原生質(zhì)和Sasanishiki亞原生質(zhì)分別懸浮于0.4M葡萄糖中以達(dá)到2×107/ml的種群密度。這樣獲得的懸浮液按1∶1的比率進(jìn)行混合。向混合的懸浮液加入等容量的重量百分比為40%的聚乙二醇溶液(平均分子重量為7800～9000)，這樣得到的混合物被保留15分鐘，然后用0.4M葡萄糖溶液沖洗細(xì)胞3次。
按實(shí)施例4的方法從這樣獲得的融合細(xì)胞中再生整個(gè)稻植株。然后使該植株適應(yīng)水土，并在溫室中生長以成熟。在開花的時(shí)候，進(jìn)行自花傳粉和異花授粉以形成稻粒。
通過檢查這樣再生的稻植物，在用原始的Nihonbare授粉之后，根據(jù)植株外觀和稻粒的質(zhì)量來看，這些植物顯然是“Nihonbare”，然而失去了花粉的生育力。由線粒體DNA的電泳圖檢查雄性不育性的類型，結(jié)果表明，線粒體顯然來源于“MT-CMA9”，這些結(jié)果清楚地表明，再生稻植物是具有“Nihonbare的核質(zhì)，同時(shí)又具有“MT-CMA9”細(xì)胞質(zhì)的雜種稻植物。
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)稻雜種的方法，包括下列步驟用90～250Krad劑量的X射線對(duì)在細(xì)胞質(zhì)中含有第一有用基因的第一稻原生質(zhì)進(jìn)行照射，以選擇性地只破壞原生質(zhì)的核質(zhì)；用大約10～30mM的碘乙酰胺，大約0.1～0.5mM的若丹時(shí)6G或大約10～30mM的iodoacetage來處理有核質(zhì)中含有第二有用基因的第二稻原生質(zhì)以選擇性地鈍化細(xì)胞質(zhì)；融合處理的第一和第二原生質(zhì)以形成只具有含第一有用基因的核質(zhì)和只具有含有第二有用基因的細(xì)胞質(zhì)的雜種細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征為X射線為軟X射線。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征為X射線的劑量為100～150Krad。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征為用16～30mM濃度的碘乙酰胺處理第二原生質(zhì)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其特征為用25～30mM濃度的碘乙酰胺處理第二原生質(zhì)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征為用聚乙二醇法雜交第一和第二原生質(zhì)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征為，用電融合法雜交第一和第二原生質(zhì)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征為當(dāng)進(jìn)行融合處理時(shí)，經(jīng)處理的第二原生質(zhì)與經(jīng)處理的第一原生質(zhì)的數(shù)量比例為1∶1～1∶5。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征為，第二有用基因?yàn)樾坌圆挥颉?br> 10.生駒又種參锏姆椒?，包括从权利要?的方法獲得的雜種細(xì)胞中再生整個(gè)植株。
11.根據(jù)權(quán)利要求1的方法生產(chǎn)的雜交稻細(xì)胞。
12.根據(jù)權(quán)利要求10的方法生產(chǎn)的稻雜種植物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種生產(chǎn)稻雜種的方法，該方法包括下列步驟對(duì)在細(xì)胞質(zhì)中含有的第一有用基因的第一稻原生質(zhì)進(jìn)行X射線照射，以選擇性地只破壞其核質(zhì)；用大約10—30mM的碘乙酰胺、大約為0.1～0.5mM若丹明6G或大約為10～30mMiodoacetage處理核質(zhì)中含第二有用基因的第二稻原生質(zhì)以選擇性地鈍化細(xì)胞質(zhì)；融合經(jīng)處理的第一和第二原生質(zhì)以形成只具有含第一有用基因的核質(zhì)和只具有含第二有用基因的細(xì)胞質(zhì)的雜種細(xì)胞。
文檔編號(hào)A01H1/00GK1036037SQ89101628
公開日1989年10月4日 申請(qǐng)日期1989年2月2日 優(yōu)先權(quán)日1988年2月2日
發(fā)明者赤木宏宋, 坂本正弘, 滕村達(dá)人 申請(qǐng)人:三井東圧化學(xué)株式會(huì)社