本發(fā)明涉及玻璃化凍存技術(shù)，尤其涉及一種1-磷酸鞘氨醇提高卵巢玻璃化凍存效果的方法。

背景技術(shù)：

離體的卵巢組織的體外培養(yǎng)及凍存可為由卵巢組織獲得雌性生殖干細(xì)胞及各級(jí)卵泡提供便利條件,使這些技術(shù)的開展不受時(shí)間及地點(diǎn)的限制。用于珍稀或?yàn)l危動(dòng)物的人工繁殖，畜牧良種的保存、培養(yǎng)和商業(yè)化生產(chǎn)，離體的卵巢組織便于研究卵細(xì)胞的發(fā)育機(jī)制，結(jié)合體外受精或者孤雌激活技術(shù)獲取大量胚胎干細(xì)胞用于科研，還助于建立卵子庫(kù)，為女性提供生殖保險(xiǎn)。

當(dāng)前離體卵巢組織主要是離體后直接培養(yǎng)，然后研究使用，但是由于野外條件限制或者培養(yǎng)條件不佳，不能為離體卵巢組織提供最佳的保存環(huán)境時(shí)，離體卵巢組織細(xì)胞就會(huì)凋亡，導(dǎo)致很多珍貴的離體卵巢組織材料不能得到很好的保存，就眼睜睜的看著珍稀的卵巢組織離體材料無可挽回的消失殆盡，如果能采取凍存方式保留離體卵巢組織，然后在合適條件下解凍，是保存、轉(zhuǎn)移一些珍貴卵巢組織的最佳方法。

離體卵巢組織經(jīng)過合適的方法凍存后，是可以保留卵巢生殖功能與內(nèi)分泌功能的，但是，當(dāng)前卵巢凍存解凍技術(shù)存在一個(gè)問題難題是，目前還沒有一種廉價(jià)、穩(wěn)定和安全的凍存解凍方法。卵巢中存在處于不同發(fā)育階段的各級(jí)卵泡，包括原始卵泡，初級(jí)卵泡，次級(jí)卵泡和竇卵泡，直接將卵巢組織凍存，然后解凍，并在體外培養(yǎng)，只有少數(shù)卵泡發(fā)育到排卵前卵泡，其他大部分卵泡會(huì)停止發(fā)育，形成閉鎖卵泡，這導(dǎo)致卵巢中的大部分卵泡在凍存過程中死亡，無法達(dá)到保留凍存卵巢生殖功能與內(nèi)分泌功能的效果。

現(xiàn)在有使用褪黑素、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，促紅細(xì)胞生成素等藥物對(duì)卵巢進(jìn)行干預(yù)的凍存方法，以提高凍存后卵巢內(nèi)卵泡的存活率，但多數(shù)是聯(lián)合使用，成本高昂。因此，需要更為簡(jiǎn)潔而有效的干預(yù)方法來確保凍存卵巢內(nèi)存活卵泡的數(shù)量。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種1-磷酸鞘氨醇提高卵巢玻璃化凍存效果的方法，1-磷酸鞘氨醇（sphingosine-1-phosphate, S1P）是細(xì)胞膜上鞘脂類的代謝產(chǎn)物之一，具有多種生物活性，如參與抗凋亡、免疫、炎癥和血管生成等過程。此外，S1P是細(xì)胞自身的代謝產(chǎn)物，沒有細(xì)胞毒性。在卵巢凍存解凍的過程中，使用S1P進(jìn)行干預(yù)，可以提高凍存后卵巢的存活率，較大程度的保留其生殖功能與內(nèi)分泌功能。

本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：

一種1-磷酸鞘氨醇提高卵巢玻璃化凍存效果的方法，包括以下步驟：

離體卵巢預(yù)培養(yǎng)：

將離體卵巢浸泡在培養(yǎng)液中，置于37℃，5% CO2條件下的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，得到預(yù)培養(yǎng)后的離體卵巢；所述培養(yǎng)液包括1-磷酸鞘氨醇；

離體卵巢預(yù)滲透平衡：

將預(yù)培養(yǎng)后的離體卵巢轉(zhuǎn)移至含滲透性保護(hù)劑的預(yù)滲透平衡液中滲透，得到預(yù)滲透平衡后的離體卵巢；所述預(yù)滲透平衡液包括包括1-磷酸鞘氨醇；

離體卵巢滲透平衡：

將預(yù)滲透平衡后的離體卵巢轉(zhuǎn)移至玻璃化凍存液中繼續(xù)滲透平衡，得到凍存液滲透后的離體卵巢；所述玻璃化凍存液包括包括1-磷酸鞘氨醇；

離體卵巢凍存：

將凍存液滲透后的離體卵巢轉(zhuǎn)移至液氮中放置至少24小時(shí)。

最優(yōu)的，1-磷酸鞘氨醇提高卵巢玻璃化凍存效果的方法，還包括以下步驟：

凍存卵巢初次解凍：

將凍存的卵巢從液氮中取出，放置于37℃預(yù)熱的含0.5 mol/L蔗糖的解凍液中，得到初次解凍的卵巢；所述解凍液中包括1-磷酸鞘氨醇；

凍存卵巢再次解凍：

將初次解凍的卵巢轉(zhuǎn)移至37℃預(yù)熱的含0.25 mol/L蔗糖的解凍液中，得到再次解凍的卵巢；所述解凍液中包括1-磷酸鞘氨醇；

凍存卵巢解凍：

將再次解凍的卵巢轉(zhuǎn)移至37℃預(yù)熱的含0.25 mol/L蔗糖的解凍液中，得到解凍的卵巢；所述解凍液中包括1-磷酸鞘氨醇；

凍存保護(hù)劑的洗脫：

將解凍的卵巢轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)液中以洗脫去蔗糖，得到洗脫后的卵巢；所述解凍液中包括1-磷酸鞘氨醇；

解凍卵巢的后培養(yǎng)：

將洗脫后的卵巢轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)液中，置于37℃，5% CO2條件下的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，得到解凍預(yù)培養(yǎng)后的卵巢；所述培養(yǎng)液包括1-磷酸鞘氨醇。

最優(yōu)的，所述1-磷酸鞘氨醇濃度為1～3μmol /l。

最優(yōu)的，所述1-磷酸鞘氨醇濃度為2μmol /l。

最優(yōu)的，所述離體卵巢是1mm×1mm×2mm大小。

最優(yōu)的，所述離體卵巢預(yù)培養(yǎng)步驟中，置于37℃，5% CO2條件下的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)時(shí)間為60分鐘；

最優(yōu)的，所述離體卵巢預(yù)滲透平衡步驟中，離體卵巢在含滲透性保護(hù)劑的預(yù)滲透平衡液滲透時(shí)間為8分鐘；所述離體卵巢滲透平衡步驟中，離體卵巢轉(zhuǎn)在玻璃化凍存液中繼續(xù)滲透平衡的時(shí)間為3.5分鐘；

最優(yōu)的，所述凍存卵巢初次解凍步驟中，放置于37℃預(yù)熱的含0.5 mol/L蔗糖的解凍液中的時(shí)間為10分鐘；所述凍存卵巢再次解凍步驟中，放置于37℃預(yù)熱的含0.25 mol/L蔗糖的解凍液中的時(shí)間為10分鐘；所述凍存卵巢解凍步驟中，放置于37℃預(yù)熱的含0.125 mol/L蔗糖的解凍液中的時(shí)間為10分鐘；所述凍存保護(hù)劑的洗脫步驟中，在培養(yǎng)液中以洗脫去蔗糖的時(shí)間為10分鐘。

最優(yōu)的，所述解凍卵巢的后培養(yǎng)步驟中，置于37℃，5% CO2條件下的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)時(shí)間為120分鐘。

最優(yōu)的，所述培養(yǎng)液是按照12%牛血清白蛋白5ml與基礎(chǔ)液45ml的比例混合，再添加1-磷酸鞘氨醇而成；

所述預(yù)滲透平衡液的是按照12%牛血清白蛋白10ml、乙二醇8.36ml與基礎(chǔ)液31.64ml的比例混合，再添加1-磷酸鞘氨醇而成；

所述玻璃化凍存液是按照乙二醇15.3ml、添加有15 g聚蔗糖的12%牛血清白蛋白10ml、蔗糖8.56 g與基礎(chǔ)液24.7ml的比例混合，再添加1-磷酸鞘氨醇而成；

所述含0.5 mol/L蔗糖的解凍液是按照蔗糖8.56 g、12%牛血清白蛋白10 ml與基礎(chǔ)液40ml的比例混合，再添加1-磷酸鞘氨醇而成；

所述含0.25 mol/L蔗糖的解凍液是將含0.5 mol/L蔗糖的解凍液加等體積的基礎(chǔ)液稀釋而成，再添加1-磷酸鞘氨醇而成；

所述含0.125 mol/L蔗糖的解凍液是將含0.5 mol/L蔗糖的解凍液加兩倍體積的基礎(chǔ)液稀釋而成，再添加1-磷酸鞘氨醇而成；

所述基礎(chǔ)液是按照DMEM粉5 g、F12 5.3g、硫酸鏈霉素0.1 g、4-羥乙基哌嗪乙磺酸2.38 g、 NaHCO3 2.38 g、二甲基亞砜10 ml、青霉素150 IU的比例混合，接著使用5.6% NaHCO3 溶液調(diào)整PH值到7.1～7.4，最后加1000ml三蒸水而成。

由上述技術(shù)方案可知，本發(fā)明提供了一種1-磷酸鞘氨醇提高卵巢玻璃化凍存效果的方法，1-磷酸鞘氨醇是細(xì)胞膜上鞘脂類的代謝產(chǎn)物之一，是細(xì)胞自身的代謝產(chǎn)物，沒有細(xì)胞毒性1-磷酸鞘氨醇干預(yù)后的卵巢經(jīng)過玻璃化凍存、解凍后有顯著高于對(duì)照的卵泡存活率，使經(jīng)過凍存解凍過程后的卵巢依舊保留生殖功能與內(nèi)分泌功能，對(duì)于凍存卵巢技術(shù)有很大的意義。

附圖說明

附圖1是各組卵巢形態(tài)學(xué)圖片。箭頭表示卵泡，PrF：原始卵泡； PF：初級(jí)卵泡； SF：次級(jí)卵泡； AF：竇卵泡； FA：閉鎖卵泡； Oo：卵母細(xì)胞； Gc：顆粒細(xì)胞； FT：卵泡膜。Scale bar = 50μm。

附圖2是各組卵巢TUNEL染色圖片。箭頭表示陽(yáng)性區(qū)域，即存在細(xì)胞凋亡的區(qū)域。Scale bar = 50μm。

附圖3是各組卵巢Bcl-2和Bax免疫組織化學(xué)染色結(jié)果。箭頭表示陽(yáng)性表達(dá)部位。Scale bar = 50μm。

附圖4是各組卵巢Bcl-2和Bax Western blot結(jié)果。* 表示與新鮮組組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.05)。# 表示與單純凍存組組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.05)。

附圖5是各組卵巢Foxl-2免疫組織化學(xué)染色結(jié)果。箭頭表示陽(yáng)性表達(dá)部位 Scale bar = 50μm。

附圖6是各組卵巢Foxl-2 Western blot結(jié)果。* 表示與新鮮組組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.05)。# 表示與單純凍存組組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.05)。

具體實(shí)施方式

接下來具體描述一下1-磷酸鞘氨醇提高卵巢玻璃化凍存效果的方法，需要注意的是凍存和解凍的各過程，要嚴(yán)格掌握時(shí)間，確保時(shí)間的準(zhǔn)確，確保濃度的準(zhǔn)確。因?yàn)檎麄€(gè)凍存過程需要滲透完全，所以本發(fā)明使用的是小鼠的卵巢，也就是本方法適用于小鼠卵巢大小的整個(gè)卵巢，或者更小的卵巢，如果凍存較大的卵巢，可以選擇將卵巢皮質(zhì)切割成小片后凍存。

實(shí)施例1：

離體卵巢預(yù)培養(yǎng)：

將離體卵巢浸泡在培養(yǎng)液中，置于37℃，5% CO₂條件下的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)60分鐘，得到預(yù)培養(yǎng)后的離體卵巢；培養(yǎng)液是按照12%牛血清白蛋白5ml與基礎(chǔ)液45ml的比例混合，再添加1-磷酸鞘氨醇至2μmol /l而成；其中基礎(chǔ)液是按照DMEM粉5 g、F12 5.3g、硫酸鏈霉素0.1 g、4-羥乙基哌嗪乙磺酸2.38 g、 NaHCO3 2.38 g、二甲基亞砜10 ml、青霉素150 IU的比例混合，接著使用5.6% NaHCO3 溶液調(diào)整PH值到7.1～7.4，最后加1000ml三蒸水而成。

離體卵巢預(yù)滲透平衡：

將預(yù)培養(yǎng)后的離體卵巢轉(zhuǎn)移至含滲透性低溫保護(hù)劑的預(yù)滲透平衡液中滲透8分鐘，得到預(yù)滲透平衡后的離體卵巢；所述預(yù)平衡液的是按照12%牛血清白蛋白10ml、乙二醇8.36ml與基礎(chǔ)液31.64ml的比例混合，再添加1-磷酸鞘氨醇至2μmol /l而成；其中基礎(chǔ)液是按照DMEM粉5 g、F12 5.3g、硫酸鏈霉素0.1 g、4-羥乙基哌嗪乙磺酸2.38 g、 NaHCO3 2.38 g、二甲基亞砜10 ml、青霉素150 IU的比例混合，接著使用5.6% NaHCO3 溶液調(diào)整PH值到7.1～7.4，最后加1000ml三蒸水而成。

離體卵巢滲透平衡：

將預(yù)滲透平衡后的離體卵巢轉(zhuǎn)移至玻璃化凍存液中繼續(xù)滲透平衡3.5分鐘，得到凍存液滲透后的離體卵巢；玻璃化凍存液是按照乙二醇15.3ml、添加有15 g聚蔗糖的12%牛血清白蛋白10ml、蔗糖8.56 g與基礎(chǔ)液24.7ml的比例混合，再添加1-磷酸鞘氨醇至2μmol /l而成；其中基礎(chǔ)液是按照DMEM粉5 g、F12 5.3g、硫酸鏈霉素0.1 g、4-羥乙基哌嗪乙磺酸2.38 g、 NaHCO3 2.38 g、二甲基亞砜10 ml、青霉素150 IU的比例混合，接著使用5.6% NaHCO3 溶液調(diào)整PH值到7.1～7.4，最后加1000ml三蒸水而成。

離體卵巢凍存：

將凍存液浸泡后的離體卵巢轉(zhuǎn)移至液氮中放置至少24小時(shí)。

凍存卵巢初次解凍：

將凍存的卵巢從液氮中取出，放置于37℃預(yù)熱的含0.5 mol/L蔗糖的解凍液中10分鐘，得到初次解凍的卵巢；含0.5 mol/L蔗糖的解凍液是按照蔗糖8.56 g、12%牛血清白蛋白10 ml與基礎(chǔ)液40ml的比例混合，再添加1-磷酸鞘氨醇至2μmol /l而成；其中基礎(chǔ)液是按照DMEM粉5 g、F12 5.3g、硫酸鏈霉素0.1 g、4-羥乙基哌嗪乙磺酸2.38 g、 NaHCO3 2.38 g、二甲基亞砜10 ml、青霉素150 IU的比例混合，接著使用5.6% NaHCO3 溶液調(diào)整PH值到7.1～7.4，最后加1000ml三蒸水而成。

凍存卵巢再次解凍：

將初次解凍的卵巢轉(zhuǎn)移至37℃預(yù)熱的含0.25 mol/L蔗糖的解凍液中10分鐘，得到再次解凍的卵巢；含0.25 mol/L蔗糖的解凍液是將含0.5 mol/L蔗糖的解凍液加等體積的基礎(chǔ)液稀釋，再添加1-磷酸鞘氨醇至2μmol /l而成，含0.5 mol/L蔗糖的解凍液是按照蔗糖8.56 g、12%牛血清白蛋白10 ml與基礎(chǔ)液40ml的比例混合，再添加1-磷酸鞘氨醇至2μmol /l而成；其中基礎(chǔ)液是按照DMEM粉5 g、F12 5.3g、硫酸鏈霉素0.1 g、4-羥乙基哌嗪乙磺酸2.38 g、 NaHCO3 2.38 g、二甲基亞砜10 ml、青霉素150 IU的比例混合，接著使用5.6% NaHCO3 溶液調(diào)整PH值到7.1～7.4，最后加1000ml三蒸水而成。

凍存卵巢解凍：

將再次解凍的卵巢轉(zhuǎn)移至37℃預(yù)熱的含0.125 mol/L蔗糖的解凍液中10分鐘，得到洗脫去保護(hù)劑的卵巢；含0.125 mol/L蔗糖的解凍液是將含0.5 mol/L蔗糖的解凍液加兩倍體積的基礎(chǔ)液稀釋，再添加1-磷酸鞘氨醇至2μmol /l而成，含0.5 mol/L蔗糖的解凍液是按照蔗糖8.56 g、12%牛血清白蛋白10 ml與基礎(chǔ)液40ml的比例混合，再添加1-磷酸鞘氨醇至2μmol /l而成；其中基礎(chǔ)液是按照DMEM粉5 g、F12 5.3g、硫酸鏈霉素0.1 g、4-羥乙基哌嗪乙磺酸2.38 g、 NaHCO3 2.38 g、二甲基亞砜10 ml、青霉素150 IU的比例混合，接著使用5.6% NaHCO3 溶液調(diào)整PH值到7.1～7.4，最后加1000ml三蒸水而成。

凍存保護(hù)劑的洗脫：

將解凍的卵巢轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)液中洗脫10分鐘，以洗脫去蔗糖，得到洗脫后的卵巢；培養(yǎng)液是按照12%牛血清白蛋白5ml與基礎(chǔ)液45ml的比例混合，再添加1-磷酸鞘氨醇至2μmol /l而成；其中基礎(chǔ)液是按照DMEM粉5 g、F12 5.3g、硫酸鏈霉素0.1 g、4-羥乙基哌嗪乙磺酸2.38 g、 NaHCO3 2.38 g、二甲基亞砜10 ml、青霉素150 IU的比例混合，接著使用5.6% NaHCO3 溶液調(diào)整PH值到7.1～7.4，最后加1000ml三蒸水而成。

解凍卵巢的后培養(yǎng)：

將洗脫去保護(hù)劑的卵巢轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)液中，置于37℃，5% CO₂條件下的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)120分鐘，得到解凍預(yù)培養(yǎng)后的卵巢；培養(yǎng)液是按照12%牛血清白蛋白5ml與基礎(chǔ)液45ml的比例混合，再添加1-磷酸鞘氨醇至2μmol /l而成；其中基礎(chǔ)液是按照DMEM粉5 g、F12 5.3g、硫酸鏈霉素0.1 g、4-羥乙基哌嗪乙磺酸2.38 g、 NaHCO3 2.38 g、二甲基亞砜10 ml、青霉素150 IU的比例混合，接著使用5.6% NaHCO3 溶液調(diào)整PH值到7.1～7.4，最后加1000ml三蒸水而成。

上述實(shí)施例是經(jīng)過了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，使用1-磷酸鞘氨醇干預(yù)的凍存、解凍的卵巢中，其卵泡的存活率明顯高于沒有1-磷酸鞘氨醇干預(yù)的凍存、解凍后卵巢中卵泡的存活率；細(xì)胞凋亡水平明顯低于沒有1-磷酸鞘氨醇干預(yù)的凍存、解凍后的卵巢；卵巢功能相關(guān)蛋白的表達(dá)水平明顯高于沒有1-磷酸鞘氨醇干預(yù)的凍存、解凍后的卵巢。以下是部分實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

實(shí)驗(yàn)一：S1P干預(yù)濃度和干預(yù)時(shí)間的確定。

S1P作為較新的生物活性物質(zhì)，用于組織細(xì)胞的凍存尚無統(tǒng)一的使用濃度，本發(fā)明人參考文獻(xiàn)后確定本技術(shù)S1P的使用濃度為2μmol/l；實(shí)驗(yàn)材料為4 周齡C57BL/6J雌性小鼠卵巢；在凍存前培養(yǎng)，玻璃化凍存的過程中以及解凍后培養(yǎng)環(huán)節(jié)，全程使用2μmol/l 的S1P干預(yù)。為了對(duì)比S1P的作用，使用新鮮組（無S1P干預(yù)，不凍存的成年小鼠卵巢），單純凍存組（無S1P干預(yù)，凍存的成年小鼠卵巢）作為對(duì)照組。

實(shí)驗(yàn)二：S1P干預(yù)對(duì)凍存卵巢內(nèi)卵泡數(shù)量的影響。

在卵巢中存在處于不同發(fā)育階段的各級(jí)卵泡，包括原始卵泡，初級(jí)卵泡，次級(jí)卵泡和竇卵泡，直接將卵巢組織凍存，然后解凍，并在體外培養(yǎng)，只有少數(shù)卵泡發(fā)育到排卵前卵泡，其他大部分卵泡會(huì)停止發(fā)育，形成閉鎖卵泡，這導(dǎo)致卵巢中的大部分卵泡在凍存過程中死亡，無法達(dá)到凍存卵巢并保留其生殖功能與內(nèi)分泌功能的效果。因此，對(duì)各級(jí)卵泡以及閉鎖卵泡數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)，是評(píng)價(jià)凍存后卵巢中的卵泡發(fā)育情況的最基本，最為直觀的方法。使用C57小鼠的卵巢為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，分為三組：S1P干預(yù)凍存組（玻璃化凍存全過程使用S1P干預(yù)的卵巢）、新鮮組（無S1P干預(yù)，不凍存的卵巢），單純凍存組（無S1P干預(yù)，凍存的卵巢），解凍的卵巢常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片厚度為5μm，每6張選取1張共10張切片進(jìn)行HE染色，在高倍鏡下每張切片選取5 個(gè)高倍視野，根據(jù)卵泡形態(tài)的正常與否進(jìn)行每高倍視野（high power field，HPF）的卵泡計(jì)數(shù)（個(gè)）。計(jì)數(shù)僅能看見細(xì)胞核的卵泡從而確保沒有竇前卵泡被重復(fù)計(jì)數(shù)。結(jié)果見表1。

從以上結(jié)果可以看出，與新鮮組比較，凍存的各組各級(jí)卵泡數(shù)量均有下降，說明凍存后卵泡會(huì)有一定的損失。在兩個(gè)凍存組中，單純凍存組卵泡數(shù)量最少，且閉鎖卵泡數(shù)量較多。S1P干預(yù)凍存組各級(jí)卵泡數(shù)量要好于單純凍存組。說明S1P對(duì)凍存卵巢中的卵泡具有一定的保護(hù)作用。參照?qǐng)D1所示，形態(tài)學(xué)圖片也顯示，與單純凍存組比較，S1P干預(yù)凍存組卵巢組織結(jié)構(gòu)相對(duì)完成正常，正常卵泡數(shù)量較多。

實(shí)驗(yàn)三：S1P干預(yù)對(duì)凍存卵巢內(nèi)細(xì)胞凋亡的影響。

在卵巢凍存及解凍過程中，存在細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。減少卵巢細(xì)胞的凋亡，將能有效提高卵巢的活性。我們使用TUNE法，檢測(cè)了各組凍存卵巢細(xì)胞凋亡情況，從圖2中可以看出，新鮮組細(xì)胞凋亡區(qū)域，即綠色染色區(qū)域，較三個(gè)凍存組少，在三個(gè)凍存組織，S1P干預(yù)凍存組細(xì)胞凋亡少于單純凍存組。從這個(gè)結(jié)果來看，S1P干預(yù)的凍存和解凍卵巢，細(xì)胞凋亡的數(shù)量少于不干預(yù)的卵巢，S1P具有對(duì)抗凍存和解凍過程中細(xì)胞凋亡作用。

實(shí)驗(yàn)四：S1P干預(yù)對(duì)凍存卵巢內(nèi)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax表達(dá)的影響。

在卵巢凍存及解凍過程中，細(xì)胞凋亡是造成卵巢活性減低的關(guān)鍵因素之一。我們使用免疫組織化學(xué)和Western blot方法，檢測(cè)了上述各組凍存解凍卵巢凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax的表達(dá)，其中Bcl-2是凋亡抑制因子，而Bax是凋亡促進(jìn)因子。Bcl-2和Bax免疫組織化學(xué)染色結(jié)果見圖3，Western blot結(jié)果見圖4。結(jié)果顯示Bcl-2蛋白表達(dá)與卵泡顆粒細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，新鮮組表達(dá)量高于兩個(gè)凍存組。在兩個(gè)凍存組中，S1P干預(yù)凍存組Bcl-2表達(dá)高于單純凍存組。Bax蛋白表達(dá)與卵泡顆粒細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，新鮮組Bax蛋白表達(dá)量最低，兩個(gè)凍融組Bax表達(dá)均增高，其中S1P干預(yù)凍存組Bax表達(dá)低于單純凍存組。這一結(jié)果說明，凍存和解凍全過程S1P的干預(yù)，可以提高抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，減少凋亡蛋白Bax的表達(dá)，從而減少卵泡中顆粒細(xì)胞的凋亡，提高凍存解凍卵巢的活性。

實(shí)驗(yàn)五：S1P干預(yù)對(duì)凍存卵巢功能分子Foxl-2表達(dá)的影響。

Foxl-2（Forkhead box protein L2，叉頭框蛋白L2）是維持卵巢功能方面發(fā)揮重要作用，發(fā)揮促進(jìn)卵泡的生長(zhǎng)，發(fā)育及抗凋亡等作用，其基因突變與卵巢早衰有關(guān)，目前是評(píng)估卵巢儲(chǔ)備功能的一項(xiàng)直接指標(biāo)。

我們使用免疫組織化學(xué)和Western blot方法，檢測(cè)了上述各組凍存解凍卵巢Foxl-2的表達(dá)，結(jié)果見圖5和圖6。圖5和圖6結(jié)果顯示，F(xiàn)oxl-2表達(dá)在卵泡的顆粒細(xì)胞中（細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中）。與新鮮組比較，兩個(gè)凍存組Foxl-2的表達(dá)減少。在兩個(gè)凍存組中，S1P干預(yù)凍存組Foxl-2的表達(dá)高于單純凍存組。該結(jié)果說明，凍存和解凍全過程S1P的干預(yù)，可以提高維持卵巢功能的重要分子Foxl-2的表達(dá)，促進(jìn)卵泡的發(fā)育和生長(zhǎng)，提高凍存解凍卵巢的活性。

綜上所述，S1P干預(yù)能使凍存卵巢中的多數(shù)卵泡保持正常的組織學(xué)形態(tài)，減少卵巢內(nèi)凋亡細(xì)胞的數(shù)量，促進(jìn)抗凋亡分子的表達(dá)和減少促凋亡分子的表達(dá)，同時(shí)提高維持卵巢功能分子Foxl-2的表達(dá)，促進(jìn)卵泡的發(fā)育和生長(zhǎng)。這些作用，可以提高卵巢在凍存中的抗損傷能力，從而提高凍存卵巢的活力，為后續(xù)的移植卵巢活力的保存和維持奠定基礎(chǔ)。因此，使用S1P體外干預(yù)凍存的卵巢，是保護(hù)凍存卵巢活力的有效的方法。

以下是本文中英文簡(jiǎn)寫的全稱和解釋說明。

S1P：sphingosine-1-phosphate，1-磷酸鞘氨醇，具有抗凋亡等作用。

TUNEL：TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling，最常用的細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法。

Bcl-2：B-cell lymphoma-2，B淋巴細(xì)胞瘤-2，具有抑制細(xì)胞凋亡的作用。

Bax：Bcl-2 Associated X Protein，Bcl-2相關(guān)X蛋白，具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡作用。

Foxl-2：Forkhead box protein L2，叉頭框蛋白L2，發(fā)揮促進(jìn)卵泡的生長(zhǎng)，發(fā)育及抗凋亡等作用。