專利名稱：卵巢組織異體發(fā)育的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種卵巢組織異體發(fā)育的方法。
背景技術(shù)：
卵巢是雌性生殖系統(tǒng)的功能性器官，主要生理作用為產(chǎn)生卵母細(xì)胞和分泌雌性激素，這對(duì)維持雌性動(dòng)物生殖能力和正常的生理活動(dòng)至關(guān)重要。在當(dāng)前國(guó)家推行人與自然的和諧發(fā)展理念的時(shí)刻，卵巢資源的開發(fā)和利用對(duì)于人與自然的和諧具有重要影響。目前，全世界有1/4的哺乳動(dòng)物面臨著瀕臨滅絕。因此，卵巢組織資源的開發(fā)和利用對(duì)于現(xiàn)代畜牧業(yè)的遺傳育種、新品種培育和瀕臨滅絕野生動(dòng)物的保護(hù)具有著重要的意義。腎臟是動(dòng)物機(jī)體泌尿系統(tǒng)的重要成員，具有血液供應(yīng)豐富和代謝旺盛等特點(diǎn)，另外，腎臟在免疫學(xué)上屬于免疫盲區(qū)，免疫排斥最小，非常適合各種異體組織的寄生和發(fā)育。卵巢組織作為重要的遺傳資源載體借助腎臟生理環(huán)境將具有重要的應(yīng)用價(jià)值。小鼠作為一種重要的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物已為人類的生命健康和生命科學(xué)的發(fā)展做出了重要的貢獻(xiàn)。小鼠具有生長(zhǎng)速度快、繁殖力高、飼養(yǎng)簡(jiǎn)單和操作成本低等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)于大熊貓、華南虎、雪豹等瀕臨滅絕的野生動(dòng)物或優(yōu)秀的家畜個(gè)體，如果這些動(dòng)物的幼子或成體由于疾病或老年衰老等原因出現(xiàn)死亡時(shí)，取出剛剛死亡時(shí)動(dòng)物的卵巢，借助腎包膜下移植能夠有效實(shí)現(xiàn)遺傳資源的保護(hù)和開發(fā)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種卵巢組織異體發(fā)育的方法。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是卵巢組織異體發(fā)育的方法，包括以下步驟
(1)移植卵巢組織的準(zhǔn)備
頸椎脫白處死新生小鼠，分離出新生小鼠的卵巢組織，放入預(yù)熱的含青霉素與鏈霉素的PBS液中清洗后，臨時(shí)培養(yǎng)于37°C預(yù)熱的組織培養(yǎng)液中；所述組織培養(yǎng)液的成分為PBS液+10% FBS+ 100 U/ml 青霉素 + 100 mg/ml 鏈霉素；
(2)卵巢組織的移植
受體母鼠移植程序?yàn)槭荏w小鼠麻醉后，對(duì)受體小鼠兩側(cè)背部剪毛，酒精背部消毒，置受體小鼠于熱臺(tái)上，使其 背部向上；在小鼠左側(cè)背腹部開口，摘除卵巢，拉出腎臟，將腎臟暴露于體外，在腎臟被膜打開一個(gè)開口，揭起腎臟被膜，將卵巢組織塊移植入腎被膜下，把腎臟送入腹腔，噴灑青鏈霉素粉末，縫合傷口 ；右側(cè)腹部開口，摘除另一側(cè)卵巢，噴灑青鏈霉素粉末，縫合傷口 ；
受體公鼠移植程序?yàn)樾∈蠼?jīng)麻醉后，酒精消毒，置于熱臺(tái)上，腹部向上，輕壓腹部使睪丸下降至陰囊；剪開陰囊，摘除雙側(cè)睪丸，噴灑青鏈霉素粉末后，縫合傷口 ；翻動(dòng)小鼠使其背部向上，剪去背毛，左側(cè)背腹部開口，拉出腎臟，將腎臟暴露于體外，在腎臟被膜打開一個(gè)開口，揭起腎臟被膜，將卵巢組織塊植入被膜下，把腎臟送入腹腔，噴灑青鏈霉素粉末，縫合傷口 ；
(3)卵巢組織的收獲
卵巢組織移植后的第28天，頸椎脫白處死受體小鼠，背側(cè)剖開腹腔，取出腎臟，在含青霉素與鏈霉素的磷酸鹽緩沖液中清洗后，于37 °C預(yù)熱的所述組織培養(yǎng)液中分離出卵巢組織移植物，機(jī)械法分離卵母細(xì)胞及各級(jí)卵泡，經(jīng)計(jì)數(shù)后于體外培養(yǎng)；
(4)卵母細(xì)胞的成熟
對(duì)于收獲的卵母細(xì)胞，將其在a -MEM培養(yǎng)液中清洗后，置于卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)液中進(jìn)行成熟培養(yǎng)16小時(shí)，培養(yǎng)條件為37° C、5% C02、100%濕度；所述卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)液的組成成分為 a -MEM + 10IU/ml PMSG + 10IU/ml hCG+ 10ng/ml EGF + 5% FBS。作為優(yōu)選，步驟(I)中所述PBS液含有100 U/ml青霉素+ 100 mg/ml鏈霉素。作為優(yōu)選,所述受體小鼠為無(wú)特定病原體小鼠。本發(fā)明的有益效果是
采用受體小鼠的腎臟作為卵巢組織移植發(fā)育的載體，將異體卵巢組織移植在受體小鼠的腎包膜下，使卵巢組織借助腎包膜同腎臟表面緊密結(jié)合，該移植方法具有不破壞腎臟組織、對(duì)腎臟和受體小鼠損害最小，及操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，因此，卵巢組織的異體發(fā)育方法對(duì)于挖掘遺傳資源開展現(xiàn)代畜牧業(yè)的遺傳育種、新品種培育和瀕臨滅絕野生動(dòng)物的保護(hù)具有著重要的意義。


下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。圖I是本發(fā)明卵巢組織異體發(fā)育的方法實(shí)施例的卵丘細(xì)胞擴(kuò)展的成熟卵母細(xì)胞形態(tài)。圖2是本發(fā)明卵巢組織異體發(fā)育的方法實(shí)施例的排出第一極體的成熟卵母細(xì)胞形態(tài)。
具體實(shí)施方式
I試驗(yàn)材料與方法 I. I試驗(yàn)動(dòng)物
試驗(yàn)小鼠為SPF級(jí)，供體卵巢組織為新生小鼠的卵巢組織，腎包膜移植受體小鼠為7周齡成年小鼠。試驗(yàn)組一為新生小鼠的卵巢組織移植到17只受體母鼠；試驗(yàn)組二為新生小鼠的卵巢組織移植到17只受體公鼠。1.2試驗(yàn)方法
I.2. I移植卵巢組織的準(zhǔn)備
頸椎脫臼處死新生小鼠，分離出新生小鼠的卵巢組織，放入預(yù)熱的含雙抗(100 U/ml青霉素+ 100 mg/ml鏈霉素)的PBS液中清洗后，臨時(shí)培養(yǎng)于37°C預(yù)熱的PBS液+ 10% FBS(fetal bovine serum) + 100 U/ml青霉素+ 100 mg/ml鏈霉素的組織培養(yǎng)液中。1.2.2卵巢組織的移植
受體母鼠移植程序?yàn)槭褂脻舛葹?0mg/ml戊巴比妥鈉，受體小鼠按每克體重6微升進(jìn)行腹腔注射，麻醉后對(duì)受體小鼠兩側(cè)背部剪毛，使用75%酒精進(jìn)行背部消毒，置受體小鼠于熱臺(tái)上，使其背部向上。在小鼠左側(cè)背腹部開口約5mm，將眼科鑷置于酒精燈上方灼燒至紅熱后迅速摘除卵巢，輕輕拉出腎臟，將腎臟暴露于體外，在腎臟被膜打開一個(gè)開口，輕柔揭起腎臟被膜，將卵巢組織塊移植入腎被膜下，把腎臟送入腹腔，噴灑雙抗粉末，縫合傷口。右側(cè)腹部開口約5mm，用摘除另一側(cè)卵巢，噴灑青鏈霉素粉末，縫合傷口。受體公鼠移植程序?yàn)樾∈蠼?jīng)麻醉后，噴灑75%酒精消毒，置于熱臺(tái)上，腹部向上，輕壓腹部使睪丸下降至陰囊。剪開陰囊，將眼科鑷子置于酒精燈上方灼燒至紅熱后摘除雙側(cè)睪丸，噴灑青鏈霉素粉末后，縫合傷口。翻動(dòng)小鼠使其背部向上，剪去背毛，左側(cè)背腹部開口約5mm，輕輕拉出腎臟，將腎臟暴露于體外，在腎臟被膜打開一個(gè)開口，輕柔揭起腎臟被膜，將卵巢組織塊植入被膜下，把腎臟送入腹腔，噴灑青鏈霉素粉末，縫合傷口。
1.2.3卵巢組織的收獲
卵巢組織移植后的第28天，頸椎脫白處死受體小鼠，背側(cè)剖開腹腔，取出腎臟，在含100 U/ml青霉素+ 100 mg/ml鏈霉素的PBS液中清洗后，于37°C預(yù)熱的組織(PBS液+10%FBS+ 100 U/ml青霉素+ 100 mg/ml鏈霉素)培養(yǎng)液中分離出卵巢組織移植物，機(jī)械法分離卵母細(xì)胞及各級(jí)卵泡，經(jīng)計(jì)數(shù)后于體外培養(yǎng)。1.2.4卵母細(xì)胞的成熟
對(duì)于收獲的卵母細(xì)胞，將其在a -MEM培養(yǎng)液中清洗后，置于成熟液中進(jìn)行成熟培養(yǎng)，卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)液的組成成分為a-MEM + 10IU/ml PMSG + 10IU/ml hCG+ IOng/ml EGF + 5% FBS，培養(yǎng)條件為37° C、5% C02、100%濕度，卵母細(xì)胞在成熟培養(yǎng)液中成熟培養(yǎng)16小時(shí)。2試驗(yàn)結(jié)果
卵巢組織移植的受體小鼠在移植后生長(zhǎng)發(fā)育良好，精神狀態(tài)正常。卵巢組織移植到受體小鼠腎包膜下之后經(jīng)過(guò)4周的生長(zhǎng)發(fā)育，卵巢組織移植物突出于腎臟表面，移植的卵巢組織生長(zhǎng)發(fā)育良好，主要表現(xiàn)為移植的卵巢組織表面可見清晰的血管和較多的血管分布，血液循環(huán)系統(tǒng)在卵巢組織移植物中已得到恢復(fù)和發(fā)生重建，移植物同腎臟組織結(jié)構(gòu)緊密結(jié)合形成組織結(jié)合體，兩種組織結(jié)合部位連接良好，無(wú)明顯的組織間連接間隙，卵巢組織移植物與腎包膜之間緊密連接。移植的卵巢組織比移植前有明顯的生長(zhǎng)，體積明顯增大。對(duì)于雌性和雄性受體小鼠，30個(gè)卵巢組織異體異位移植到受體公母小鼠腎包膜下以后，其中，在雌性小鼠受體中16個(gè)卵巢組織發(fā)育良好，卵巢組織發(fā)育成功率為53%(16/30)，在雄性小鼠受體中14個(gè)卵巢組織發(fā)育良好，卵巢組織發(fā)育成功率為47%(14/30);卵巢組織移植物直徑超過(guò)2mm在雌性和雄性受體小鼠均為10個(gè)。卵巢組織移植物在異體小鼠腎包膜下經(jīng)過(guò)4周生長(zhǎng)發(fā)育后，剝離卵巢組織，從卵巢組織移植物中能夠分離到較多由卵丘細(xì)胞和卵母細(xì)胞形成的復(fù)合物，這些復(fù)合物中卵丘細(xì)胞大小均勻，形態(tài)正常，在卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合物中，卵母細(xì)胞的重要組成成分透明帶已形成并發(fā)育良好，形成的透明帶包圍在卵母細(xì)胞周圍，透明帶形態(tài)正常，結(jié)構(gòu)均勻。分離的卵丘細(xì)胞和卵母細(xì)胞形成的復(fù)合物經(jīng)過(guò)體外成熟培養(yǎng)后，卵母細(xì)胞周圍的細(xì)胞形成卵丘細(xì)胞擴(kuò)展，成熟的卵母細(xì)胞大小體積正常，并能夠排出成熟卵母細(xì)胞所特有的第一極體(圖I、圖2)。以上所述的本發(fā)明實(shí)施方式，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限定。任何在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的權(quán)利要求保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.卵巢組織異體發(fā)育的方法，其特征在于包括以下步驟(1)移植卵巢組織的準(zhǔn)備頸椎脫白處死新生小鼠，分離出新生小鼠的卵巢組織，放入預(yù)熱的含青霉素與鏈霉素的PBS液中清洗后，臨時(shí)培養(yǎng)于37 °C預(yù)熱的組織培養(yǎng)液中；所述組織培養(yǎng)液的成分為PBS液 + 10% FBS+ 100 U/ml 青霉素 + 100 mg/ml 鏈霉素；(2)卵巢組織的移植受體母鼠移植程序?yàn)槭荏w小鼠麻醉后，對(duì)受體小鼠兩側(cè)背部剪毛，酒精背部消毒，置受體小鼠于熱臺(tái)上，使其背部向上；在小鼠左側(cè)背腹部開口，摘除卵巢，拉出腎臟，將腎臟暴露于體外，在腎臟被膜打開一個(gè)開口，揭起腎臟被膜，將卵巢組織塊移植入腎被膜下，把腎臟送入腹腔，噴灑青鏈霉素粉末，縫合傷口 ；右側(cè)腹部開口，摘除另一側(cè)卵巢，噴灑青鏈霉素粉末，縫合傷口 ；受體公鼠移植程序?yàn)樾∈蠼?jīng)麻醉后，酒精消毒，置于熱臺(tái)上，腹部向上，輕壓腹部使睪丸下降至陰囊；剪開陰囊，摘除雙側(cè)睪丸，噴灑青鏈霉素粉末后，縫合傷口 ；翻動(dòng)小鼠使其背部向上，剪去背毛，左側(cè)背腹部開口，拉出腎臟，將腎臟暴露于體外，在腎臟被膜打開一個(gè)開口，揭起腎臟被膜，將卵巢組織塊植入被膜下，把腎臟送入腹腔，噴灑青鏈霉素粉末，縫合傷口 ；(3)卵巢組織的收獲卵巢組織移植后的第28天，頸椎脫白處死受體小鼠，背側(cè)剖開腹腔，取出腎臟，在含青霉素與鏈霉素的磷酸鹽緩沖液中清洗后，于37 °C預(yù)熱的所述組織培養(yǎng)液中分離出卵巢組織移植物，機(jī)械法分離卵母細(xì)胞及各級(jí)卵泡，經(jīng)計(jì)數(shù)后于體外培養(yǎng)；(4)卵母細(xì)胞的成熟對(duì)于收獲的卵母細(xì)胞，將其在a -MEM培養(yǎng)液中清洗后，置于卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)液中進(jìn)行成熟培養(yǎng)16小時(shí)，培養(yǎng)條件為37° C、5% C02、100%濕度；所述卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)液的組成成分為 a -MEM + 10IU/ml PMSG + 10IU/ml hCG+ 10ng/ml EGF + 5% FBS。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的卵巢組織異體發(fā)育的方法，其特征在于步驟(I)中所述含青霉素與鏈霉素的PBS液含有100 U/ml青霉素+ 100 mg/ml鏈霉素。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的卵巢組織異體發(fā)育的方法，其特征在于所述受體小鼠為無(wú)特定病原體小鼠。
全文摘要
本發(fā)明公開了卵巢組織異體發(fā)育的方法，包括以下步驟(1)移植卵巢組織的準(zhǔn)備；(2)卵巢組織的移植；(3)卵巢組織的收獲；(4)卵母細(xì)胞的成熟。本發(fā)明采用受體小鼠的腎臟作為卵巢組織移植發(fā)育的載體，將異體卵巢組織移植在受體小鼠的腎包膜下，使卵巢組織借助腎包膜同腎臟表面緊密結(jié)合，該移植方法具有不破壞腎臟組織、對(duì)腎臟和受體小鼠損害最小及操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，因此，該方法可作為物種卵母細(xì)胞資源的儲(chǔ)備，對(duì)于挖掘遺傳資源開展現(xiàn)代畜牧業(yè)的遺傳育種、新品種培育和瀕臨滅絕野生動(dòng)物的保護(hù)等均具有著重要的意義。
文檔編號(hào)C12N5/071GK102703376SQ20121019466
公開日2012年10月3日 申請(qǐng)日期2012年6月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月14日
發(fā)明者劉亞, 張運(yùn)海, 方富貴, 曹鴻國(guó), 李運(yùn)生, 楊盼, 章孝榮, 蒲勇, 陶勇 申請(qǐng)人:安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)