本發(fā)明涉及一種提高水蛭體內(nèi)水蛭甲素含量的方法，屬于農(nóng)副產(chǎn)品養(yǎng)殖領(lǐng)域。通過(guò)模擬冬眠環(huán)境使水蛭活體處于冬眠狀態(tài)，從而提高了水蛭體內(nèi)水蛭甲素的含量，可為市場(chǎng)提供更優(yōu)質(zhì)的水蛭藥材。

背景技術(shù)：

水蛭為水蛭科動(dòng)物螞蟥Whitmania pigra Whitman、水蛭Hirudo nipponica Whitman或柳葉螞蟥Whitmania acranulata Whitman的干燥全體，夏、秋兩季捕捉，用沸水燙死，曬干或低溫干燥，其味咸、苦，性平，歸肝經(jīng)，有小毒。中醫(yī)認(rèn)為，水蛭具有破血通經(jīng)，逐瘀消瘕的作用，在治療中風(fēng)偏癱、跌打損傷、癥瘕痞塊、血瘀經(jīng)閉，以及高血壓、血瘀、閉經(jīng)等方面具有顯著的療效?，F(xiàn)代研究表明，水蛭不僅具有抗凝、溶栓、抗纖維化的作用，而且還可以改善局部血液循環(huán)、提高免疫力、改善腎功能、促進(jìn)血管新生等，對(duì)腫瘤細(xì)胞也有一定抑制及殺滅作用，在臨床上有著廣泛的應(yīng)用。

研究表明，水蛭中主要含有兩類成分，一類是以水蛭素為代表的多肽及蛋白類大分子成分，另一類是蝶啶類等小分子活性成分。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者對(duì)水蛭的藥理作用及活性成分進(jìn)行了深入研究，但這些研究多數(shù)集中在水蛭素類的多肽成分，對(duì)水蛭中小分子活性成分的研究鮮有報(bào)道。水蛭素在干燥狀態(tài)下穩(wěn)定存在，但在80℃下加熱15min后即被破壞，且水蛭素僅存在于水蛭的唾液腺中，含量甚微。

應(yīng)該注意到，臨床使用的水蛭大多為干品及其炮制品，炮制方法包括清炒、砂燙、石灰炒、滑石粉燙、蜜炙、米炒等。研究表明，水蛭在炮制或干燥過(guò)程中水蛭素已被破壞，水蛭素僅存在其鮮品中，因此中藥水蛭所具有的破血逐瘀作用，是否建立在水蛭素的基礎(chǔ)上，尚需深入研究?；诖耍l(fā)明人對(duì)水蛭中的小分子成分進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)了具有抗缺氧活性的蝶啶類雜環(huán)新化合物，水蛭甲素即是其中一個(gè)代表。

《中國(guó)藥典》2015年版一部規(guī)定水蛭的捕捉時(shí)間為夏、秋二季，用沸水燙死，曬干或低溫干燥。發(fā)明人意外發(fā)現(xiàn)，捕捉后的活體水蛭經(jīng)低溫冷藏后，其水蛭甲素含量會(huì)大幅升高，究其原因是水蛭在環(huán)境溫度低于10℃時(shí)會(huì)進(jìn)入冬眠狀態(tài)，冬眠狀態(tài)的活體水蛭在受到外界低溫刺激的情況下，機(jī)體在本能地適應(yīng)外部環(huán)境的過(guò)程中，其體內(nèi)水蛭甲素含量也會(huì)升高。為提高夏、秋二季捕捉的水蛭中水蛭甲素含量，發(fā)明人采用人工冬眠的方法，提高了水蛭中水蛭甲素的含量，可為市場(chǎng)提供更優(yōu)質(zhì)的水蛭藥材。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種提高水蛭中水蛭甲素含量的方法，具體是將水蛭置于低溫清水中，使水蛭人工冬眠，以提高水蛭體內(nèi)水蛭甲素含量。動(dòng)物的冬眠行為是一項(xiàng)對(duì)付不利環(huán)境的保護(hù)性行動(dòng)，引起動(dòng)物冬眠的主要因素是環(huán)境溫度的降低。當(dāng)周圍環(huán)境溫度在15℃以下時(shí)，即可引起變溫動(dòng)物的冬眠現(xiàn)象。

本發(fā)明一種提高水蛭體內(nèi)水蛭甲素含量的方法，包括以下步驟：

1)將活體水蛭置于低溫清水中人工冬眠；

2)每隔3-8天更換一次低溫清水。

優(yōu)選地，步驟1)所述水蛭為水蛭科動(dòng)物螞蟥(Whitmania pigra Whitman)、水蛭科動(dòng)物日本醫(yī)蛭(Hirudo nipponica Whitman)。

優(yōu)選地，步驟1)所述低溫清水的溫度為0℃～10℃，最優(yōu)為0℃～5℃時(shí)。

優(yōu)選地，步驟1)所述人工冬眠的時(shí)間為5～90天，最佳為15～45天。

步驟2)中，所述每隔3-8天更換一次低溫清水是指同溫度的低溫清水，目的是提供充足的氧氣，保證水蛭的存活。

優(yōu)選地，步驟2)每隔5天更換一次低溫清水。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明方法打破了自然條件的限制，首次采用人工冬眠的方式刺激活體水蛭產(chǎn)生更多的有效成分，尤其是產(chǎn)生更多的水蛭甲素。用本方法對(duì)活體水蛭進(jìn)行人工冬眠后，其水蛭干品中水蛭甲素的含量比沒有經(jīng)過(guò)人工冬眠的同一批次水蛭干品最多可提高0.178mg/g，從而大幅提高了水蛭藥材的品質(zhì)。本發(fā)明水蛭人工冬眠方法操作簡(jiǎn)單，成本低廉，條件可控，具很強(qiáng)的實(shí)用性。

附圖說(shuō)明

圖1為水蛭甲素對(duì)照品的高效液相色譜圖；

圖2為水蛭樣品的高效液相色譜圖。

具體實(shí)施方式

以下通過(guò)具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，但這并非是對(duì)本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的基本思想，可以做出各種修改或改進(jìn)，但只要不脫離本發(fā)明的基本思想，均在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。

實(shí)施例1 螞蝗人工冬眠及水蛭甲素含量的測(cè)定

1、螞蝗人工冬眠

1)將活體螞蝗置于5℃的清水中人工冬眠30天；

2)每隔3天更換一次溫度為5℃的清水。

將冬眠后的螞蝗加工成干品，備用。

2、水蛭甲素含量的測(cè)定

色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；乙腈-0.05％三氟乙酸溶液＝8：92為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為354nm。理論板數(shù)按水蛭甲素峰計(jì)算應(yīng)不低于3000。

對(duì)照品溶液的制備 精密稱取于60℃干燥至恒重的水蛭甲素對(duì)照品適量，精密稱定，用流動(dòng)相制成每1ml約含0.005mg的溶液，即得。

供試品溶液的制備 取本品適量，打粉過(guò)40目篩，稱取2.0g，置于50ml容量瓶中，加入50％甲醇定容至刻度，超聲(功率250W，頻率50kHz)提取30min，冷卻后用甲醇補(bǔ)足損失，離心(10000rpm)10min，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

測(cè)定法 分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各5μl，注入液相色譜儀，測(cè)定，用外標(biāo)法計(jì)算，即得。水蛭甲素對(duì)照品及樣品測(cè)定的HPLC圖譜分別見圖1、圖2。

經(jīng)測(cè)定，樣品中水蛭甲素的含量為0.297mg/g。

實(shí)施例2 日本醫(yī)蛭人工冬眠及水蛭甲素含量的測(cè)定

1、日本醫(yī)蛭人工冬眠

1)將活體日本醫(yī)蛭置于0℃的清水中人工冬眠5天；

2)每隔3天更換一次溫度為0℃的清水。

將冬眠后的日本醫(yī)蛭加工成干品，備用。

2、水蛭甲素含量的測(cè)定

按實(shí)施例1所述的HPLC條件進(jìn)行測(cè)定，樣品中水蛭甲素的含量為0.172mg/g。

實(shí)施例3 日本醫(yī)蛭人工冬眠及水蛭甲素含量的測(cè)定

1、日本醫(yī)蛭人工冬眠

1)將活體日本醫(yī)蛭置于2℃的清水中人工冬眠10天；

2)每隔4天更換一次溫度為2℃的清水。

將冬眠后的日本醫(yī)蛭加工成干品，備用。

2、水蛭甲素含量的測(cè)定

按實(shí)施例1所述的HPLC條件進(jìn)行測(cè)定，樣品中水蛭甲素的含量為0.213mg/g。

實(shí)施例4 螞蝗人工冬眠及水蛭甲素含量的測(cè)定

1、螞蝗人工冬眠

1)將活體螞蝗置于4℃的清水中人工冬眠30天；

2)每隔5天更換一次溫度為4℃的清水。

將冬眠后的螞蝗加工成干品，備用。

2、水蛭甲素含量的測(cè)定

按實(shí)施例1所述的HPLC條件進(jìn)行測(cè)定，樣品中水蛭甲素的含量為0.301mg/g。

實(shí)施例5 螞蝗人工冬眠及水蛭甲素含量的測(cè)定

1、螞蝗人工冬眠

1)將活體螞蝗置于3℃的清水中人工冬眠12天；

2)每隔4天更換一次溫度為3℃的清水。

將冬眠后的螞蝗加工成干品，備用。

2、水蛭甲素含量的測(cè)定

按實(shí)施例1所述的HPLC條件進(jìn)行測(cè)定，樣品中水蛭甲素的含量為0.238mg/g。

實(shí)施例6 日本醫(yī)蛭人工冬眠及水蛭甲素含量的測(cè)定

1、日本醫(yī)蛭人工冬眠

1)將活體日本醫(yī)蛭置于7℃的清水中人工冬眠30天；

2)每隔6天更換一次溫度為7℃的清水。

將冬眠后的日本醫(yī)蛭加工成干品，備用。

2、水蛭甲素含量的測(cè)定

按實(shí)施例1所述的HPLC條件進(jìn)行測(cè)定，樣品中水蛭甲素的含量為0.312mg/g。

實(shí)施例7 螞蝗人工冬眠及水蛭甲素含量的測(cè)定

1、螞蝗人工冬眠

1)將活體螞蝗置于10℃的清水中人工冬眠45天；

2)每隔7天更換一次溫度為10℃的清水。

將冬眠后的螞蝗加工成干品，備用。

2、水蛭甲素含量的測(cè)定

按實(shí)施例1所述的HPLC條件進(jìn)行測(cè)定，樣品中水蛭甲素的含量為0.338mg/g。

實(shí)施例8 日本醫(yī)蛭人工冬眠及水蛭甲素含量的測(cè)定

1、日本醫(yī)蛭人工冬眠

1)將活體日本醫(yī)蛭置于6℃的清水中人工冬眠40天；

2)每隔3天更換一次溫度為6℃的清水。

將冬眠后的日本醫(yī)蛭加工成干品，備用。

2、水蛭甲素含量的測(cè)定

按實(shí)施例1所述的HPLC條件進(jìn)行測(cè)定，樣品中水蛭甲素的含量為0.326mg/g。

實(shí)施例9 日本醫(yī)蛭人工冬眠及水蛭甲素含量的測(cè)定

1、日本醫(yī)蛭人工冬眠

1)將活體日本醫(yī)蛭置于9℃的清水中人工冬眠50天；

2)每隔8天更換一次溫度為9℃的清水。

將冬眠后的日本醫(yī)蛭加工成干品，備用。

2、水蛭甲素含量的測(cè)定

按實(shí)施例1所述的HPLC條件進(jìn)行測(cè)定，樣品中水蛭甲素的含量為0.342mg/g。

實(shí)施例10 螞蝗人工冬眠及水蛭甲素含量的測(cè)定

1、螞蝗人工冬眠

1)將活體螞蝗置于10℃的清水中人工冬眠75天；

2)每隔5天更換一次溫度為10℃的清水。

將冬眠后的螞蝗加工成干品，備用。

2、水蛭甲素含量的測(cè)定

按實(shí)施例1所述的HPLC條件進(jìn)行測(cè)定，樣品中水蛭甲素的含量為0.356mg/g。

實(shí)施例11 螞蝗人工冬眠及水蛭甲素含量的測(cè)定

1、螞蝗人工冬眠

1)將活體螞蝗置于5℃的清水中人工冬眠80天；

2)每隔4天更換一次溫度為5℃的清水。

將冬眠后的螞蝗加工成干品，備用。

2、水蛭甲素含量的測(cè)定

按實(shí)施例1所述的HPLC條件進(jìn)行測(cè)定，樣品中水蛭甲素的含量為0.362mg/g。

實(shí)施例12 螞蝗人工冬眠及水蛭甲素含量的測(cè)定

1、螞蝗人工冬眠

1)將活體螞蝗置于8℃的清水中人工冬眠90天；

2)每隔3天更換一次溫度為8℃的清水。

將冬眠后的螞蝗加工成干品，備用。

2、水蛭甲素含量的測(cè)定

按實(shí)施例1所述的HPLC條件進(jìn)行測(cè)定，樣品中水蛭甲素的含量為0.367mg/g。

實(shí)施例13 日本醫(yī)蛭人工冬眠及水蛭甲素含量的測(cè)定

1、日本醫(yī)蛭人工冬眠

1)將活體活體日本醫(yī)蛭置于10℃的清水中人工冬眠60天；

2)每隔5天更換一次溫度為10℃的清水。

將冬眠后的日本醫(yī)蛭加工成干品，備用。

2、水蛭甲素含量的測(cè)定

按實(shí)施例1所述的HPLC條件進(jìn)行測(cè)定，樣品中水蛭甲素的含量為0.350mg/g。

實(shí)施例14 不同人工冬眠時(shí)間螞蝗中水蛭甲素含量比較

1、試驗(yàn)材料

同一批活體螞蝗，平均分成7份，每份1.0kg。

2、試驗(yàn)方法

將上述活體螞蝗分別放于4℃清水中人工冬眠0天、10天、20天、30天、40天、50

天和60天，每隔6天更換一次溫度為4℃的清水，人工冬眠結(jié)束按相同的方法加工成

干品，備用。

3、水蛭甲素含量的測(cè)定

取上述7份螞蝗干品樣品，每份隨機(jī)抽取3份平行樣，按實(shí)施例1所述的HPLC條件測(cè)定其水蛭甲素的含量，結(jié)果見表1。

表1不同人工冬眠時(shí)間螞蝗中水蛭甲素含量比較

由表1可以看出，人冬眠時(shí)間越長(zhǎng)，指標(biāo)成分水蛭甲素的含量越高，但在40天以后提高的速度放緩，考慮生產(chǎn)效率及生產(chǎn)時(shí)間成本，一般人工冬眠時(shí)間控制在60天(2個(gè)月)以內(nèi)比較適宜。

實(shí)施例15 不同人工冬眠時(shí)間日本醫(yī)蛭中水蛭甲素含量比較

1、試驗(yàn)材料

同一批活體日本醫(yī)蛭，平均分成7份，每份1.0kg。

2、試驗(yàn)方法

將上述活體日本醫(yī)蛭分別放于7℃清水中人工冬眠0天、5天、10天、20天、30天、60天和80天，每隔4天更換一次溫度為7℃的清水，人工冬眠結(jié)束按相同的方法加工成干品，備用。

3、水蛭甲素含量的測(cè)定

取上述7份日本醫(yī)蛭干品樣品，每份隨機(jī)抽取3份平行樣，按實(shí)施例1所述的HPLC條件測(cè)定其水蛭甲素的含量，結(jié)果見表2。

表2不同人工冬眠時(shí)間日本醫(yī)蛭中水蛭甲素含量比較

由表2可以看出，人冬眠時(shí)間越長(zhǎng)，指標(biāo)成分水蛭甲素的含量越高，但在40天以后提高的速度放緩，考慮生產(chǎn)效率及生產(chǎn)時(shí)間成本，一般人工冬眠時(shí)間控制在60天(2個(gè)月)以內(nèi)比較適宜。