一種煙草青枯病人工發(fā)病的快捷方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種煙草青枯病人工發(fā)病的快捷方法，該方法的步驟如下：1）煙草幼苗培育準備；2）接種用細菌液的培養(yǎng)準備；3）煙草幼苗接種前處置；4）接種青枯病菌；5）接種后處置。本發(fā)明的優(yōu)點是：1）接種體系微型化，用微小的幼苗，在微小的空間內(nèi)接種，耗用很短的試驗周期。2）技術體系過程簡單，操作方便，技術難度小，工作效率高。3）全程在普通實驗室內(nèi)完成，無需配套溫室裝備，發(fā)病局部條件容易控制，受干擾小，容易實現(xiàn)技術方法標準化。
【專利說明】一種煙草青枯病人工發(fā)病的快捷方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)技術和生物技術。具體是一種煙草青枯病人工發(fā)病的快捷方法【背景技術】
[0002]煙草青枯病在全球普遍發(fā)生，是煙草生產(chǎn)的毀滅性病害，許多與防病控害有關的基礎研究和重大理論問題研究均離不開接種病菌人工發(fā)病這基本手段，特別是該病害的病原菌(Ralstonia solanacearum)是當前國際上研究植物病原細菌致病機制的模式系統(tǒng)之一，對該病原菌所開展的有關研究，要頻繁經(jīng)過致病性檢測的環(huán)節(jié)，即要實施人工接種發(fā)病的工作。高節(jié)奏的當代工作往往需要所用的手段方法能高效率、高通量、高準確度，因而高效快捷的人工發(fā)病方法是許多研究者的共同需求。煙草青枯病的人工發(fā)病至今已有不少的技術方法，歸結起來可包括土壤傷根接種、莖基部注射接種、葉腋注射接種、和葉面注射接種等。雖然這些方法技術非常成熟有效并廣為應用，但應用起來或多或少存在如下一些不足:1)試驗周期較長，這些方法技術的實際應用中，至今通常采用較大的煙苗，由于煙草前期生長緩慢，培育準備煙苗需要耗費較長的時期，一般需要2個月以上，因而導致試驗周期較長。2)培育長況良好的煙苗，往往需要有裝備良好的育苗溫室。3)技術要求較高，如采取注射接種,一般要求逐株逐點定量注射,往往需要操作者技術過關和細心操作,實施起來工作效率偏低。4) 一些與發(fā)病有關的局部條件控制有難度，如接種后要求創(chuàng)造利于發(fā)病的濕度，這在一些普通的實驗室裝備條件下仍有較大難度；采用土壤傷根接種容易受土壤中其它微生物的影響，雖然一些小試驗可以采用滅菌或消毒過的土壤來育苗，但在育苗期間，當前一般實驗室仍難以提供全程無菌化的條件，土壤中的微生物群體仍然無法控制。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是提供一種煙草青枯病人工發(fā)病的快捷方法。
[0004]本發(fā)明解決上述技`術問題的技術方案如下:
[0005]一種煙草青枯病人工發(fā)病的快捷方法，主要內(nèi)容是利用青枯病菌可侵染煙草引起細胞組織壞死的特性，在培養(yǎng)皿內(nèi)接種不帶土的幼小煙苗，導致煙苗快速表現(xiàn)清晰的發(fā)病癥狀。人工發(fā)病方法的步驟如下:
[0006]1.煙草幼苗培育準備:用普通的淺盤類器具盛裝肥力較好且疏松的土壤，用常規(guī)方法在室內(nèi)培育煙苗，長至3~4片小葉片后備用。
[0007]2.接種用細菌液的培養(yǎng)準備:將煙草青枯病菌移植到NA等一般細菌培養(yǎng)基平板上，NA培養(yǎng)基的成分:牛肉膏3克，蛋白胨10克，瓊脂18克，蔗糖10克，水1000ml，30°C培養(yǎng)48小時后，用無菌水將培養(yǎng)基平板上生長的細菌菌落洗滌懸浮，并將此細菌懸浮液轉入干凈的容器內(nèi)，用無菌水調(diào)配成2.5X108cfu/ml的細菌液，作接種用細菌液。
[0008]3.煙草幼苗接種前處置:取步驟I育好的適用幼苗，接種前先澆水濕潤軟化育苗土壤，以便于拔苗。取出干凈的培養(yǎng)皿和剪刀；選取有3~4片小葉片的幼苗，用手輕輕拔起并轉到清水中輕輕晃動，洗脫幼苗根系上的土壤，用干凈的剪刀剪除幼苗的部分根系；將剪根后的幼苗側放于培養(yǎng)皿內(nèi)，根系靠培養(yǎng)皿邊放置，然后將培養(yǎng)皿轉到普通桌面或培養(yǎng)架面上，傾斜放置，有根系的一邊處于傾斜面的最低處。
[0009]4.接種青枯病菌:取步驟2備好的接種用細菌液，輕輕注入步驟3操作完備的帶苗培養(yǎng)皿內(nèi)，以液面浸沒幼苗的根系和莖基部為宜，蓋上培養(yǎng)皿蓋。
[0010]5.接種后處置:步驟4操作完備后，接種后幼苗材料直接留在原地培育觀察，培育溫度維持在25~30°C。接種后至試驗完畢整個過程無需加濕或澆水等其它處置，注意避開直射陽光照曬，維持日常散射光即可。
[0011]接種結果導致幼苗出現(xiàn)壞死、蔫垂癥狀，最后整個幼苗都壞死腐爛。通常情況下，接種后4天可見明顯壞死表現(xiàn)，6~7天后全株腐爛。
[0012]本發(fā)明的優(yōu)點是:
[0013]I)接種體系微型化，主要表現(xiàn)在用微小的幼苗，在微小的空間內(nèi)接種，耗用很短的試驗周期。
[0014]2)技術體系過程簡單，操作方便，技術難度小，工作效率高。
[0015]3 )全程在普通實驗室內(nèi)完成，無需配套溫室裝備，發(fā)病局部條件容易控制，受干擾小，容易實現(xiàn)技術方法標準化。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1是本發(fā)明在普通實驗室內(nèi)培育的煙草幼苗示意圖。
[0017]圖中，A部是用普通搪 瓷方盤培育；B部是用培養(yǎng)皿培育，已適合使用。
[0018]圖2示意在培養(yǎng)架面上放置的接種后的幼苗及接種用培養(yǎng)皿的傾斜放置狀態(tài)。
[0019]圖3是本發(fā)明的同一組幼苗接種青枯病菌發(fā)病表現(xiàn)過程的樣例I。
[0020]圖中，A~D部是接種青枯病菌，其中A是接種后的當時，B是接種4天后，C是接種5天后，D是接種6天后。E和F是接種清水空白對照，其中E部與A部同期，F(xiàn)部與D部同期。
[0021]圖4是本發(fā)明的同一組幼苗接種青枯病菌發(fā)病表現(xiàn)過程的樣例2。
[0022]圖中，A~D部是接種青枯病菌，其中A是接種后的當時，B是接種4天后，C是接種5天后，D是接種6天后。E和F是接種清水空白對照，其中E部與A部同期，F(xiàn)部與D部同期。
【具體實施方式】
[0023]下面結合附圖與實施例對本發(fā)明作進一步描述。
[0024]本發(fā)明的煙苗培育和接種發(fā)病全程均在普通實驗室內(nèi)實施，實驗室只需要具備窗口向南，透光良好，并配備普通空調(diào)即行。按常規(guī)方法在室內(nèi)近窗口旁培育煙苗。接種所采用的是長出3~4片小葉片的微小煙苗，如圖1所示，通常需要培育3~4周。
[0025]為了消除土壤微生物的影響，設計為采用無土狀態(tài)的幼苗進行接種，這需要將幼苗拔起并洗去土壤；拔苗時造成的斷根傷口可成為青枯病菌的入侵途徑，為了保證統(tǒng)一形成傷口，對幼苗統(tǒng)一剪除部分根系。
[0026]接種操作在培養(yǎng)皿內(nèi)實施，無需注射方式將病菌導入煙草植株，只需要將青枯病菌簡單地加在有傷口的煙苗根系即行，細菌自行從傷口入侵并在植株體內(nèi)轉移和致病。[0027]接種后煙苗保留在培養(yǎng)皿內(nèi)，置于25~30°C溫度下培育，培養(yǎng)皿內(nèi)具備適合發(fā)病的穩(wěn)定的濕度狀態(tài)，無需在實驗室中額外創(chuàng)建提供適合發(fā)病的濕度條件。
[0028]發(fā)病通常先在根系和幼莖基部先出現(xiàn)，表現(xiàn)為水潰狀變褐壞死，如圖3和圖4的B部所示，并逐步向上和向葉片擴展；組織壞死后逐步腐爛軟化并變透明，小苗蔫垂，最后全株壞死腐爛，如圖3和圖4的C和D部所示。
[0029]通常情況下，接種后4天可見明顯壞死表現(xiàn)，6~7天后全株腐爛。青枯病菌菌株不同，接種造成發(fā)病的快慢或程度有差異。接種細菌液的細菌濃度和接種后環(huán)境的溫度對發(fā)病的輕重或快慢有影響。結果可以用株發(fā)病率或50%煙株發(fā)病所耗費的時間等指標來表示病情輕重或病情發(fā)展的快慢。
[0030]實施例1
[0031]一種煙草青枯病人工發(fā)病的快捷方法，在煙草品種云煙87微小幼苗上接種煙草青枯病菌菌株Rso-1,按如下步驟操作:
[0032]1.煙草幼苗培育準備:用普通的搪瓷方盤盛裝肥力較好且疏松的土壤，播撒煙草品種云煙87種子，在室內(nèi)窗口邊培育煙苗，常規(guī)管理，待幼苗長出如圖1B部所示的3~4片小葉片后備用。
[0033]2.接種用細菌液的培養(yǎng)準備:將本實施例用菌株移植到NA培養(yǎng)基平板上，(NA培養(yǎng)基的成分:牛肉膏3克，蛋白胨10克，瓊脂18克，蔗糖10克，水1000ml)，30°C培養(yǎng)48小時后，用無菌水將培養(yǎng)基平板上生長的細菌菌落洗滌懸浮，并將此細菌懸浮液轉入干凈的三角瓶內(nèi)，用無菌水調(diào)配成2.5X108cfu/ml (菌落形成單位/ml)的細菌液，作接種用細菌液。
[0034]3.煙草幼苗接種前處`置:本步驟主要是拔起煙苗、去泥并作傷根處置，操作均在育苗的普通室內(nèi)實施；具體操作如下:在拔苗前0.5~I小時將培育煙苗的土壤澆水充分濕潤，使土壤松軟便于拔起煙苗；取出日常使用的滅菌后的9cm培養(yǎng)皿和干凈的剪刀備用；取2個干凈塑料盆盛滿清水，置于拔苗操作的旁邊備洗苗用；選取有3~4片小葉片的幼苗，用手輕輕拔起，轉到旁邊的清水盆中輕輕晃動，洗脫幼苗根系所帶的土壤，接著用剪刀將幼苗根系前端的三分之一剪除；將剪根后的幼苗側放于培養(yǎng)皿內(nèi)，根系靠培養(yǎng)皿邊放置；并將培養(yǎng)皿轉到普通桌面或培養(yǎng)架面上，傾斜放置，有根系的一邊處于傾斜面的最低處，如圖3和圖4的A部所示。
[0035]4.接種青枯病菌:取步驟2備好的接種用細菌液10ml，輕輕注入步驟3操作完備的帶苗培養(yǎng)皿內(nèi)，液面浸沒幼苗的根系和莖基部，如圖3和圖4的A部所示，蓋上培養(yǎng)皿蓋。
[0036]5.接種后處置:步驟4操作完備后，接種的煙苗材料狀態(tài)如圖2所示，直接留在原地培育觀察，培育溫度維持在26~29°C。接種后至試驗完畢整個過程無需加濕或澆水等其它處置，注意避開直射陽光照曬，維持日常的散射光即可。
[0037]接種結果導致如同圖3和圖4 一樣清晰的幼苗壞死、蔫垂和腐爛癥狀；接種4天后60%幼苗表現(xiàn)出明顯的壞死癥狀。
[0038]實施例2
[0039]一種煙草青枯病人工發(fā)病的快捷方法，在煙草品種云煙87微小幼苗上接種煙草青枯病菌菌株Rso-2，按實施例1的步驟I至步驟5操作實施。
[0040]接種結果導致如同圖3和圖4 一樣清晰的幼苗壞死、蔫垂和腐爛癥狀；接種4天后80%幼苗表現(xiàn)出明顯的壞死癥狀。
[0041]實施例3
[0042]—種煙草青枯病人工發(fā)病的快捷方法，在煙草品種云煙87微小幼苗上接種煙草青枯病菌菌株Rso-3，按實施例1的步驟I至步驟5操作實施。
[0043]接種結果導致如同圖3和圖4 一樣清晰的幼苗壞死、蔫垂和腐爛癥狀；接種4天后100%幼苗表現(xiàn)出明顯的壞死癥狀。
[0044]實施例4
[0045]一種煙草青枯病人工發(fā)病的快捷方法，在煙草品種云煙87微小幼苗上接種煙草青枯病菌菌株Rso-4，按實施例1的步驟I至步驟5操作實施。
[0046]接種結果導致如同圖3和圖4 一樣清晰的幼苗壞死、蔫垂和腐爛癥狀；接種4天后80%幼苗表現(xiàn)出明顯的壞死癥`狀。
【權利要求】
1.一種煙草青枯病人工發(fā)病的快捷方法，其特征在于，利用青枯病菌可侵染煙草引起細胞組織壞死的特性，在培養(yǎng)皿內(nèi)接種不帶土的幼小煙苗，導致煙苗快速表現(xiàn)清晰的發(fā)病癥狀； 方法的步驟如下: 1)煙草幼苗培育準備: 用普通的淺盤類器具盛裝肥力較好且疏松的土壤，用常規(guī)方法在室內(nèi)培育煙苗，長至3~4片小葉片后備用； 2)接種用細菌液的培養(yǎng)準備: 將煙草青枯病菌移植到NA—般細菌培養(yǎng)基平板上，NA培養(yǎng)基的成分:牛肉膏3克，蛋白胨10克，瓊脂18克，蔗糖10克，水1000ml，30°C培養(yǎng)48小時后，用無菌水將培養(yǎng)基平板上生長的細菌菌落洗滌懸浮，并將此細菌懸浮液轉入干凈的容器內(nèi)，用無菌水調(diào)配成.2.5X108cfu/ml的細菌液，作接種用細菌液； 3)煙草幼苗接種前處置:取步驟I)育好的適用幼苗，接種前先澆水濕潤軟化育苗土壤，以便于拔苗，取出干凈的培養(yǎng)皿和剪刀；選取有3~4片小葉片的幼苗，用手輕輕拔起并轉到清水中輕輕晃動，洗脫幼苗根系上的土壤，用干凈的剪刀剪除幼苗的部分根系；將剪根后的幼苗側放于培養(yǎng)皿內(nèi)，根系靠培養(yǎng)皿邊放置，然后將培養(yǎng)皿轉到普通桌面或培養(yǎng)架面上，傾斜放置，有根系的一邊處于傾斜面的最低處； 4)接種青枯病菌:取步驟2)備好的接種用細菌液，輕輕注入步驟3)操作完備的帶苗培養(yǎng)皿內(nèi)，以液面浸沒 幼苗的根系和莖基部為宜，蓋上培養(yǎng)皿蓋； 5)接種后處置:步驟4)操作完備后，接種后幼苗材料直接留在原地培育觀察，培育溫度維持在25~30°C，接種后至試驗完畢整個過程無需加濕或澆水等其它處置，注意避開直射陽光照曬，維持日常散射光即可； 接種結果導致幼苗出現(xiàn)壞死、蔫垂癥狀，最后整個幼苗都壞死腐爛。通常情況下，接種后4天可見明顯壞死表現(xiàn)，6~7天后全株腐爛。
【文檔編號】A01G7/06GK103798064SQ201410006431
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2014年1月7日 優(yōu)先權日:2014年1月7日
【發(fā)明者】張君成, 王忠文, 黃柳, 譚金樂, 陳江凝 申請人:廣西大學