一種蛹蟲草培養(yǎng)基及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種蛹蟲草培養(yǎng)基，由以下含量的各組分組成：干蠶蛹粉30g/L、大米粉170g/L、磷酸二氫鉀1.2g/L、磷酸二氫鈉0.8g/L、牛肉膏1g/L。配制該培養(yǎng)基，密封、滅菌、冷卻；然后接種蛹蟲草菌種，菌種密度為3～5個菌球/mL，培養(yǎng)基與菌種體積比為50:1；培養(yǎng)，包括暗培養(yǎng)、光培養(yǎng)；收獲子實體。使用該方法培育得到的蛹蟲草制成藥物，以接種有l(wèi)ewiss肺癌的C57小鼠為實驗對象，按藥物中蛹蟲草給藥劑量為5g/kg的標(biāo)準(zhǔn)進行給藥，每日給藥1次，連續(xù)10天后，檢測得lewis肺癌腫瘤的抑制率為19.6%。
【專利說明】一種蛹蟲草培養(yǎng)基及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】[0001]本發(fā)明涉及蛹蟲草培養(yǎng)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種蛹蟲草培養(yǎng)基，以及該蛹蟲草培養(yǎng)基在蛹蟲草培養(yǎng)中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]蛹蟲草(Cordyceps militaris),又名北蟲草,隸屬于真菌界的子囊菌亞門、麥角菌科、蟲草屬。它是一種藥用真菌。蛹蟲草中含有糖、脂肪和蛋白質(zhì)，此外，還含有多種氨基酸、微量元素和維生素。蛹蟲草中的多種生理活性成分具有抗腫瘤、抗菌、抗氧化、保護肝臟、增強免疫力等藥理作用。而其與腫瘤相關(guān)的活性物質(zhì)包括蟲草素、多糖、蟲草酸、甾醇類、硒、類胡蘿卜素、蛋白質(zhì)等。
[0003]然而，目前，人工培養(yǎng)的蛹蟲草產(chǎn)量有限，其營養(yǎng)成分含量低，質(zhì)量參差不齊，無法滿足人們的需要。尤其是在抗腫瘤效果方面，多采用提取其有效成分制成藥物進行抗腫瘤等方面的保健，直接用蛹蟲草制成藥物進行抗腫瘤的效果不是很理想。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種蛹蟲草培養(yǎng)基，使用該蛹蟲草培養(yǎng)基培養(yǎng)出的蛹蟲草子實體重量明顯增加、營養(yǎng)成分含量高、制成的藥物抗腫瘤效果明顯。
[0005]本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為:
[0006]一種蛹蟲草培養(yǎng)基，由以下含量的各組分組成:
[0007]
干蠶蛹粉30 g/L；
大米粉170 g/L;
磷酸二氫鉀1.2 g/L;
磷酸二氫鈉0.8g/L
牛肉膏 I g/L。
[0008]該培養(yǎng)基的制備如下:以純凈水將KH2P04、NaH2PO4溶解、并充分混勻后再加入干蠶蛹粉、大米粉、牛肉膏混合均勻，裝入培養(yǎng)瓶，密封，滅菌，冷卻。其中滅菌條件為:121°C，
1.1Mpa 滅菌 30 ~45min。
[0009]使用上述蛹蟲草培養(yǎng)基培養(yǎng)蛹蟲草的方法，包括以下步驟:
[0010](I)接種:在上述蛹蟲草培養(yǎng)基中接種蛹蟲草菌種,所述蛹蟲草菌種為Cordycepsmilitaris (L.) Link.、液體菌種，所述蛹蟲草菌種的密度為3~5個菌球/mL，所述蛹蟲草培養(yǎng)基與蛹蟲草菌種的體積比為50:1 ；
[0011](2)培養(yǎng):
[0012](a)暗培養(yǎng):在溫度22°C、濕度75~85%條件下避光培養(yǎng)3~5天，至蛹蟲草菌絲長滿所述蛹蟲草培養(yǎng)基表面；[0013](b)第5~20天采用的光照培養(yǎng):白天12小時日光燈光照，溫度20~22°C、濕度80~85%，光照強度控制在100~150Lx ;晚上12小時閉光，溫度18~20°C、濕度75~85% ;每天通風(fēng)2次，早晚各一次,每次20~30分鐘；
[0014](c)第21~35天采用的光照培養(yǎng):白天12小時自然光加日光燈光照，溫度20~22°C、濕度75%~85%，總光照強度控制在1000~1200Lx ;晚上12小時閉光，溫度18~200C、濕度75~85% ;每天通風(fēng)2次，早晚各一次，每次20~30分鐘；
[0015]本步驟(b)、(C)中培養(yǎng)所用的光源均為散射光，培養(yǎng)過程中對培養(yǎng)瓶進行轉(zhuǎn)瓶使光照均勻；
[0016](3)收獲及再培養(yǎng):將經(jīng)過步驟(3)培養(yǎng)后培養(yǎng)瓶中成熟的蛹蟲草子實體取出，剩余部分按照步驟(3) (c)的方法繼續(xù)培養(yǎng)至子實體成熟；
[0017](4)干燥:將收獲的蛹蟲草子實體置于墊有紗布的不銹鋼盤中，均勻鋪開，30~37°C熱風(fēng)循環(huán)烘干，其水分含量控制在10%以下。
[0018]本發(fā)明以蠶蛹粉為主要原料、大米為輔料、再加上牛肉膏作為營養(yǎng)成分配制蛹蟲草培養(yǎng)基，并且通過梯度實驗最終確定本發(fā)明所述的培養(yǎng)基最優(yōu)配方，然后采用特殊的培養(yǎng)方式:暗培養(yǎng)、然后不同時間段不同的光照培養(yǎng)方式，再加上光源米用散射光，培養(yǎng)過程中定時對培養(yǎng)瓶進行轉(zhuǎn)瓶使光照均勻，即通過確定最優(yōu)的蛹蟲草培養(yǎng)基配方、從整體上優(yōu)化培養(yǎng)方案，嚴(yán)格按照該方法培養(yǎng)得到的蛹蟲草子實體經(jīng)過檢測，發(fā)現(xiàn):產(chǎn)量比使用現(xiàn)有技術(shù)培養(yǎng)基及現(xiàn)有技術(shù)培養(yǎng)方法培養(yǎng)得到的蛹蟲草子實體產(chǎn)量增加20% ;每Ig蛹蟲草子實體中腺苷含量為15_20mg、蟲草素含量為7.5-8mg、多糖含量為25_33mg,明顯高于米用現(xiàn)有技術(shù)方法所培養(yǎng)得到的蛹蟲草。
[0019]本發(fā)明上述方法得到的蛹蟲草在制備治療肺癌的藥物中的應(yīng)用，即利用本發(fā)明方法培育所得的蛹蟲草進行制備治療肺癌的藥物，然后進行抗腫瘤試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)本發(fā)明方法培育所得的蛹蟲草制備成的藥物其抗肺癌效果顯著優(yōu)于目前市場上市售的蛹蟲草制成的藥物。以接種有Iewiss肺癌的C57小鼠為實驗對象，將蛹蟲草磨粉后制成藥物，按藥物中蛹蟲草給藥劑量為5g/kg的標(biāo)準(zhǔn)進行給藥，每日給藥I次，連續(xù)10天后，檢測得lewis肺癌腫瘤的抑制率為19.6%。
【具體實施方式】
[0020]以下結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步具體描述，但不局限于此。
[0021]實施例1:蛹蟲草培養(yǎng)基的配制
[0022]蛹蟲草培養(yǎng)基為水溶液，由干蠶蛹粉、大米粉、KH2PO4 (磷酸二氫鉀XNaH2PO4 (磷酸二氫鈉)以及牛肉膏構(gòu)成。
[0023]取如下重量的成分:干蠶蛹粉450g，大米粉2.55kg，磷酸二氫鉀18g，磷酸二氫鈉12g，牛肉膏15g ;加純凈水12L先把KH2P04、NaH2PCM先溶解、并充分混勻后再加入干蠶蛹粉、大米粉、牛肉膏混合均勻，得到體積為15L的培養(yǎng)基溶液，勻漿，分裝入培養(yǎng)瓶，每瓶裝50ml，蓋好蓋子，121°C，1.1Mpa滅菌30~40min，待其自然冷凝后備用。
[0024]實施例2:蛹蟲草的培養(yǎng)
[0025]使用實施例配制的蛹蟲草培養(yǎng)基培養(yǎng)蛹蟲草，包括以下步驟:
[0026](I)接種:在超凈臺中向?qū)嵤├?所配制的蛹蟲草培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中接種蛹蟲草菌種，所述蛹蟲草菌種為Cordycepsmilitaris (L.)Link.、液體菌種,所述蛹蟲草菌種的密度為3~5個菌球/mL，每培養(yǎng)瓶Iml ；
[0027](2)培養(yǎng):
[0028](a)暗培養(yǎng):在溫度22°C、濕度75~85%條件下避光培養(yǎng)3~5天，至蛹蟲草菌絲長滿所述蛹蟲草培養(yǎng)基表面；
[0029](b)第5~20天采用的光照培養(yǎng):白天12小時日光燈光照，溫度20~22°C、濕度80~85%，光照強度控制在100~150Lx ;晚上12小時閉光，溫度18~20°C、濕度75~85% ;每天通風(fēng)2次，早晚各一次,每次20~30分鐘；
[0030](c)第21~35天采用的光照培養(yǎng):白天12小時自然光加日光燈光照，溫度20~22°C、濕度75%~85%，總光照強度控制在1000~1200Lx ;晚上12小時閉光，溫度18~200C、濕度75~85% ;每天通風(fēng)2次，早晚各一次，每次20~30分鐘；
[0031]本步驟(b)、(C)中培養(yǎng)所用的光源均為散射光，培養(yǎng)過程中定時對培養(yǎng)瓶進行轉(zhuǎn)瓶使光照均勻；
[0032](3)收獲及再培養(yǎng):將經(jīng)過步驟(3)培養(yǎng)后培養(yǎng)瓶中成熟的蛹蟲草子實體取出，剩余部分按照步驟(3) (c)的方法繼續(xù)培養(yǎng)至子實體成熟；
[0033](4)干燥:將收獲的蛹蟲草子實體置于墊有紗布的不銹鋼盤中，均勻鋪開，30~37°C熱風(fēng)循環(huán)烘干，其水分含量控制在10%以下。
[0034]培養(yǎng)中的注意事項:
[0035]A、光照時要用散射光，而不能用直射光，蟲草的生長有向光性，對光照均勻的地方的瓶子要進行轉(zhuǎn)瓶，使其光照均勻，子實體向上生長。
[0036]B、在培養(yǎng)過程中要嚴(yán)格控制溫度和濕度，所以要嚴(yán)格控制好溫度。在目前車間沒控制溫度設(shè)備的情況下，要用地面灑水來控制培養(yǎng)室的溫度，一般一天灑水3次，但也要根據(jù)當(dāng)天的氣溫情況來變，溫度高要多灑，培養(yǎng)室溫度超過25°C，要開空調(diào)降溫。
[0037]C、每天培養(yǎng)室要通風(fēng)換氣一到兩次，時間選擇在早上和傍晚溫度相對低的時候，每次20~30分鐘。
[0038]D、接種后污染的瓶子要及時的拿出，把里面的培養(yǎng)基倒出重新滅菌后重新接種，不能讓污染的瓶子放在培養(yǎng)室里培養(yǎng)，而造成整個培養(yǎng)室受雜菌的污染。
[0039]本方法培養(yǎng)的蛹蟲草可收獲兩季，每瓶每次可獲1.2g干重的蛹蟲草，比現(xiàn)有技術(shù)的每瓶每次可獲Ig干重的蛹蟲草增加了 20%的產(chǎn)量。
[0040]實施例3:蛹蟲草制成的藥物對Iewiss肺癌的抑制試驗
[0041]實施實例中所提及的荷瘤鼠為接種有Iewiss肺癌的C57。小鼠C57小鼠為普通級實驗動物，雌雄兼用，購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心，實驗動物質(zhì)量合格證編號:SCXK-(軍)2007-004。腫瘤瘤源lewis肺癌由本實驗室傳代保存。環(huán)磷酰胺片，鋁塑包裝，每片含環(huán)磷酰胺50mg、人參莖葉總皂苷50mg，天津金世制藥有限公司生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字H12021006。氯化鈉注射液(生理鹽水)，瓶裝，500mL/瓶，山東齊都藥業(yè)有限公司，生產(chǎn)批號1D12052502,國藥準(zhǔn)字 H37020764。
[0042]1.蛹蟲草子實體的粉碎
[0043]分別稱取50g實施例2所得的烘干的蛹蟲草子實體，放入超微破碎機中，超微粉碎6min，破碎全過程用4~10°C的水作為冷卻液，確保有效成分的釋放和生物活性的穩(wěn)定。[0044]2.腫瘤接種
[0045]取接種腫瘤10-13天狀態(tài)良好的荷瘤鼠脫臼處死，體表酒精消毒，在無菌(超凈臺)環(huán)境下剝離小鼠腫瘤至盛有生理鹽水的無菌平皿，剪至小塊，將小塊腫瘤放入組織勻漿器，按體積比1:3左右加入生理鹽水勻漿，勻漿液即腫瘤細胞混懸液倒入50ml無菌離心管，備用?；罴毎嫈?shù)I X 107/ml濃度，2ml注射器針頭套在Iml注射器上，在C57小鼠腋下1.p.接種0.2ml腫瘤細胞混懸液，腫瘤細胞混懸液的制備均在無菌條件下(超凈工作臺中)完成。從取出腫瘤至腫瘤接種完畢在60分鐘內(nèi)完成 。
[0046]3.分組與給藥
[0047]腫瘤細胞接種后24小時所有實驗動物隨機分組，依實驗要求不同共分為6組，每組動物數(shù)量為10~12只不等。實驗分組為:①生理鹽水對照組(NS組)、②陽性藥物(環(huán)磷酰胺)對照組、③~⑥分別為市售蛹蟲草A制成的藥物、市售蛹蟲草B制成的藥物、市售蛹蟲草C制成的藥物、本發(fā)明方法培養(yǎng)所得蛹蟲草Z制成的藥物。
[0048]4.試劑配置:
[0049]取一粒環(huán)磷酰胺片，于硯缽中磨成粉末，加入40ml生理鹽水混勻，分裝，三天配置一次。分別稱取市售蟲草A、B、C以及本方法培育蟲草Z粉末1.5g,各加入4.5ml生理鹽水，配制成250mg/ml的溶液制成藥物,每天實驗前配制。
[0050]5.給藥方案:
[0051]NS組，灌胃相應(yīng)容積的生理鹽水；③~⑦市售蛹蟲草A制成的藥物、市售蛹蟲草B制成的藥物、市售蛹蟲草C制成的藥物、本發(fā)明方法培育所得蛹蟲草Z制成的藥物，分別灌胃給以相應(yīng)劑量的溶液，給藥容積均為0.4mL/20g (活性成分蛹蟲草給藥劑量為5g/kg);陽性藥物(環(huán)磷酰胺)對照組，口服環(huán)磷酰胺25mg/kg(0.4mL/20g);各給藥組每日均給藥I次，連續(xù)10天。自腫瘤接種后24小時開始給藥。
[0052]6.療效評價
[0053]末次給藥后24小時，處死動物，稱取體重，解剖并取出腫瘤組織，稱取腫瘤重量，以腫瘤生長抑制率來評價藥物的體內(nèi)抗癌效果，計算公式為:腫瘤生長抑制率=(I 一給藥組平均瘤重/對照組平均瘤重)X 100%。
[0054]7.數(shù)據(jù)處理
[0055]全部數(shù)據(jù)均以均值和標(biāo)準(zhǔn)差表示。統(tǒng)計分析，組間比較t檢驗。結(jié)果如表1所示。
[0056]初步抑瘤實驗結(jié)果顯示，市售蛹蟲草A制成的藥物、市售蛹蟲草B制成的藥物、市售蛹蟲草C制成的藥物、本發(fā)明方法培養(yǎng)所得蛹蟲草Z制成的藥物組小鼠lewis肺癌腫瘤的抑制率分別為:11.8%、-11.2%、-8.6%,20.6%。綜合評價，本發(fā)明方法培養(yǎng)所得蛹蟲草制成的藥物對小鼠肺癌(lewis)有抑制活性，其中本發(fā)明方法培養(yǎng)所得蛹蟲草制成的藥物組與生理鹽水組相比P值為0.009，差異顯著，抑瘤效果相對其他市售蛹蟲草制成的藥物效果顯著，作用肯定。
[0057]本發(fā)明的上述實施例是對本發(fā)明的說明而不能用于限制本發(fā)明，與本發(fā)明的權(quán)利要求書相當(dāng)?shù)暮x和范圍內(nèi)的任何改變，都應(yīng)認為是包括在權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。
[0058]表1各蛹蟲草制成的藥物對小鼠lewis腫瘤生長抑制作用
[0059]
【權(quán)利要求】
1.一種蛹蟲草培養(yǎng)基，其特征在于:由以下含量的各組分組成:干蠶蛹粉30g/L;大米粉170 g/L;磷酸二氫鉀1.2 g/L;磷酸二氫鈉0.8g/L；牛肉膏I g/L?
2.使用權(quán)利要求1所述的蛹蟲草培養(yǎng)基培養(yǎng)蛹蟲草的方法，其特征在于包括以下步驟: (1)接種:在蛹蟲草培養(yǎng)基中接種蛹蟲草菌種，所述蛹蟲草菌種為Cordycepsmilitaris (L.) Link.、液體菌種，所述蛹蟲草菌種的密度為3~5個菌球/mL，所述蛹蟲草培養(yǎng)基與蛹蟲草菌種的體積比為50:1 ； (2)培養(yǎng): (a)暗培養(yǎng):在溫度22°C、濕度75~85%條件下避光培養(yǎng)3~5天，至蛹蟲草菌絲長滿所述蛹蟲草培養(yǎng)基表面； (b)第5~20天采用的光照培養(yǎng):白天12小時日光燈光照，溫度20~22°C、濕度80~85%，光照強度控制在100~150Lx ;晚上12小時閉光，溫度18~20°C、濕度75~85% ;每天通風(fēng)2次，早晚各一次，每次20~30分鐘； (c )第21~35天采用的光照培養(yǎng):白天12小時自然光加日光燈光照，溫度20~22 °C、濕度75%~85%，總光照強度控制在1000~1200Lx ;晚上12小時閉光，溫度18~20°C、濕度75~85% ;每天通風(fēng)2次，早晚各一次，每次20~30分鐘； 本步驟(b)、(c)中培養(yǎng)所用的光源均為散射光，培養(yǎng)過程中對培養(yǎng)瓶進行轉(zhuǎn)瓶使光照均勻； (3)收獲及再培養(yǎng):將經(jīng)過步驟(3)培養(yǎng)后培養(yǎng)瓶中成熟的蛹蟲草子實體取出，剩余部分按照步驟(3) (c)的方法繼續(xù)培養(yǎng)至子實體成熟； (4)干燥:將收獲的蛹蟲草子實體置于墊有紗布的不銹鋼盤中，均勻鋪開，30~37°C熱風(fēng)循環(huán)烘干，其水分含量控制在10%以下。
3.權(quán)利要求2所述的使用權(quán)利要求1所述的蛹蟲草培養(yǎng)基培養(yǎng)蛹蟲草的方法培養(yǎng)所得的蛹蟲草在制備治療肺癌的藥物中的應(yīng)用，其特征在于:以接種有Iewiss肺癌的C57小鼠為實驗對象，將蛹蟲草磨粉、制成藥物，按藥物中蛹蟲草給藥劑量為5g/kg的標(biāo)準(zhǔn)進行給藥，每日給藥I次，連續(xù)10天后，檢測得lewis肺癌腫瘤的抑制率為19.6%。
【文檔編號】C05G1/00GK103539498SQ201310462899
【公開日】2014年1月29日 申請日期:2013年9月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月29日
【發(fā)明者】陳劍清, 陳昊, 葉曼 申請人:臺州康晶生物科技有限公司