一種以黃粉蟲幼蟲為載體培養(yǎng)蟲草產(chǎn)品的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種以黃粉蟲幼蟲為載體培養(yǎng)蟲草產(chǎn)品的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 冬蟲夏草[Cordyceps sinensis(Berk. )Sacc]是我國(guó)一種名貴的中草藥，因其具 有抗腫瘤、提高免疫力、降血脂、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌等多種功效，已被現(xiàn)代人們廣泛認(rèn)可和追捧。但 由于冬蟲夏草的生長(zhǎng)條件特殊，只能生長(zhǎng)在西藏、青海、四川等高海拔地區(qū)，且生長(zhǎng)周期較 長(zhǎng)，產(chǎn)量逐年下降，因此野生冬蟲夏草十分稀有珍貴，目前市場(chǎng)價(jià)格已達(dá)到4萬(wàn)元/千克左 右。
[0003] 蛹蟲草[Cordyceps militaris(L. )Link.]又稱北冬蟲夏草，子囊菌綱肉座菌目麥 角菌科蟲草屬，為蛹蟲草真菌寄生在鱗翅目昆蟲蛹體上形成的子座與蛹體的結(jié)合，是蟲草 屬的模式種。因其主要活性成分與冬蟲夏草相近或高于冬蟲夏草，并且已有較成熟的培養(yǎng) 條件，現(xiàn)已成為冬蟲夏草的有效替代品。
[0004]黃粉蟲[Tenebrio molitor(L.)]俗稱面包蟲，鞘翅目擬步行蟲科，富含豐富的蛋 白質(zhì)、脂肪、微量元素和維生素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，具有抗疲勞、調(diào)節(jié)血脂、抗組織缺氧等功效。并 且黃粉蟲能夠進(jìn)行大規(guī)模人工飼養(yǎng)，為相關(guān)研究提供穩(wěn)定的原料來(lái)源。
[0005]近年來(lái)，將蟲草菌接種于黃粉蟲以培養(yǎng)出冬蟲夏草替代品成為研究的熱點(diǎn)。北華 大學(xué)潘麗梅等人將黃粉蟲幼蟲通過(guò)注射接種蟲草菌，60天左右培育出黃粉蟲蟲草，感染率 為30%。安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)李春如教授等人將黃粉蟲幼蟲穿刺接種臺(tái)灣蟲草菌，獲得了30%的 感染率。以上兩種方法均為黃粉蟲幼蟲活體接種，感染率均不高，無(wú)法到達(dá)規(guī)模化生產(chǎn)的要 求。
[0006] CN1793317A中公開了一種以黃粉蟲蛹為寄主的蛹蟲草實(shí)體及其培育方法。所述方 法步驟為菌種制備、對(duì)黃粉蟲蛹接種感染和出草。CN103688760A中公開了一種將篩選后的 野生冬蟲夏草菌株制成菌懸液并接種到黃粉蟲上培育蟲草子實(shí)體的方法。上述兩項(xiàng)發(fā)明均 以黃粉蟲為寄主，培養(yǎng)最終得到蛹蟲草子實(shí)體，與大米培養(yǎng)基培養(yǎng)子實(shí)體或蠶蛹為寄主培 養(yǎng)子實(shí)體并無(wú)太大差別，且都為黃粉蟲蛹或黃粉蟲幼蟲活體接種，操作繁瑣，接種難度大； 培養(yǎng)周期均在50~60天，培養(yǎng)周期較長(zhǎng)，無(wú)法達(dá)到規(guī)?；a(chǎn)的要求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供一種以黃粉蟲幼蟲為載體培養(yǎng)蟲草產(chǎn)品的方法，以及由該方 法得到的蟲草活性成分含量較高的蟲草產(chǎn)品。
[0008] 本發(fā)明所述的一種以黃粉蟲幼蟲為載體培養(yǎng)蟲草產(chǎn)品的方法，其特征在于包括以 下步驟：
[0009] (1)蛹蟲草母種菌株的篩選
[0010] 將蛹蟲草[Cordyceps mil i tar is (L. )Link.]菌株接種于固體培養(yǎng)基上，待菌絲體 長(zhǎng)滿平板，反復(fù)篩選直至獲得長(zhǎng)勢(shì)較快、性狀穩(wěn)定的蛹蟲草母種菌株。
[0011] (2)菌懸液的制備
[0012] 將篩選得到的蛹蟲草母種菌株接種于滅菌處理后的液體培養(yǎng)基中，常溫培養(yǎng)7天 后，在超凈工作臺(tái)內(nèi)用雙層無(wú)菌紗布過(guò)濾，即得到菌懸液。
[0013] (3)黃粉蟲幼蟲的準(zhǔn)備
[0014] 將成熟的黃粉蟲幼蟲置于玻璃瓶中，68~105kPa，115~122°C條件下滅菌15~ 25min，放涼待用。
[0015] ⑷接種
[0016]在超凈工作臺(tái)內(nèi)，將滅菌后的成熟黃粉蟲幼蟲均勻放置在無(wú)菌的培養(yǎng)皿中，均勻 噴灑菌懸液至蟲體表面，培養(yǎng)皿用無(wú)菌封口膜封口。
[0017] (5)蟲草產(chǎn)品的培養(yǎng)
[0018] 將培養(yǎng)皿置于20~22°C黑暗條件下培養(yǎng)7~8天后可得到被蛹蟲草菌侵染的黃粉 蟲幼蟲，然后將其置于20~22°C，自然光照條件下培養(yǎng)，3~4天后蟲體轉(zhuǎn)為橙色，即得到本 發(fā)明所述蟲草產(chǎn)品。
[0019] 本發(fā)明所述的一種以黃粉蟲幼蟲為載體培養(yǎng)蟲草產(chǎn)品的方法，與現(xiàn)有技術(shù)中在黃 粉蟲活體上接種冬蟲夏草菌得到的蟲草子實(shí)體不同，本方法得到被蛹蟲草菌感染的顏色鮮 亮、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富的蟲體，可作為蛹蟲草、冬蟲夏草的替代品。
[0020] 進(jìn)一步地，本發(fā)明所述步驟（1)中采用的蛹蟲草菌株選取產(chǎn)于吉林長(zhǎng)白山國(guó)家自 然保護(hù)區(qū)的野生新鮮蛹蟲草[Cordyceps militaris(L. )Link.]菌株。
[0021] 進(jìn)一步地，本發(fā)明所述步驟(2)中，得到的菌懸液其孢子濃度為106~107個(gè)/mL(用 血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)）。
[0022] 進(jìn)一步地，本發(fā)明所述步驟（3)中，在100~105kPa，120~122°C條件下滅菌15~ 20min〇
[0023] 進(jìn)一步地，本發(fā)明所述步驟(5)中，培養(yǎng)的溫度為22 °C。
[0024] 更進(jìn)一步地，本發(fā)明所述步驟(3)中，在lOOkPa，121°C條件下滅菌15min。
[0025] 本發(fā)明還提供了一種以黃粉蟲幼蟲為載體培養(yǎng)得到的蟲草產(chǎn)品，其特征在于采用 本發(fā)明上述培養(yǎng)方法培養(yǎng)得到。
[0026] 本發(fā)明所述蟲草產(chǎn)品，其特征還在于其有效成分蟲草酸含量達(dá)10%以上，蟲草多 糖含量達(dá)15%以上，蟲草素含量達(dá)12%以上，蛋白質(zhì)含量達(dá)31%以上。
[0027] 現(xiàn)有技術(shù)中采用的黃粉蟲活體接種冬蟲夏草菌存在諸多問(wèn)題，例如因黃粉蟲為活 體，會(huì)將一部分注射(或穿刺）的菌懸液排出體外，活的黃粉蟲體對(duì)蛹蟲草菌也有一定的抗 性，在注射(或穿刺)量不夠或未成功注射(或穿刺)進(jìn)蟲體內(nèi)時(shí)無(wú)法成功感染黃粉蟲。另外， 活體接種難度較大，操作繁瑣且耗時(shí)，注射過(guò)程中若操作不當(dāng)將導(dǎo)致黃粉蟲死亡，并且由于 這些方法只對(duì)蟲體進(jìn)行表面滅菌，所以一旦在接種過(guò)程中導(dǎo)致黃粉蟲死亡，蟲體就會(huì)腐爛 發(fā)臭，不能繼續(xù)使用，因此不能達(dá)到較高的感染率。本發(fā)明所述方法是將黃粉蟲幼蟲在68~ 105kPa，115~122°C條件下滅菌15~25min，這樣處理后有以下優(yōu)點(diǎn)：1.在處死黃粉蟲幼蟲 的同時(shí)有效滅菌;2.最大程度的保持了黃粉蟲的可利用養(yǎng)分;3.在滅菌后僵死的蛹體上噴 施蛹蟲草菌懸液，避免了現(xiàn)有技術(shù)中活體接種存在的問(wèn)題，依本發(fā)明所述方法，并經(jīng)多次反 復(fù)驗(yàn)證，黃粉蟲接種蛹蟲草菌成功率均可達(dá)到100%，接種后10~12天即可達(dá)到收獲條件， 大大縮短了培養(yǎng)時(shí)間，且操作簡(jiǎn)單易行，提高了生產(chǎn)效率，能夠達(dá)到工廠規(guī)?；a(chǎn)的需 求。
[0028]本發(fā)明所述方法得到的橙黃色蟲草產(chǎn)品中有效成分蟲草多糖、蟲草素、蛋白質(zhì)、蟲 草酸含量豐富，可以作為蟲草子實(shí)體的替代品或作為大量提取蟲草活性成分的原料。
【附圖說(shuō)明】
[0029]圖1為蟲草酸測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0030]圖2為蟲草素測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0031]圖3為蟲草多糖測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0032]圖4為蟲草蛋白質(zhì)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0033]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明：
[0034] 本發(fā)明中的黃粉蟲幼蟲為本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)。
[0035] 實(shí)施例1
[0036] 1、菌種篩選
[0037] 選取高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、早熟、產(chǎn)于吉林長(zhǎng)白山國(guó)家自然保護(hù)區(qū)的野生新鮮蛹蟲草 [(3(^(15^6口8 111；[1；^31^8(1^.)1^111^.]菌株，去除表面雜物后置于超凈工作臺(tái)內(nèi)，分別用75% 乙醇表面消毒1分鐘、0.1 %升汞表面消毒30秒，無(wú)菌去離子水清洗5~6次，用無(wú)菌組織刀切 成1mm2組織塊放在斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)。待菌絲布滿斜面后再純化，經(jīng)反復(fù)純化后獲得蛹蟲 草母種數(shù)株。
[0038] 將母種擴(kuò)大培養(yǎng)后，無(wú)菌接種于以大米為主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的有機(jī)培養(yǎng)基上，于20°C ~22 °C下培養(yǎng)30天左右，觀察生長(zhǎng)情況，若有雜菌污染，則需對(duì)母種進(jìn)一步純化;若無(wú)雜菌 污染，則繼續(xù)培養(yǎng)30~40天后即長(zhǎng)出橙色子實(shí)體，證明母種可靠。經(jīng)培養(yǎng)，得到橙色蛹蟲草 子實(shí)體，證明已篩選得到優(yōu)質(zhì)的蛹蟲草菌株用于本發(fā)明的開展。
[0039] 2、菌懸液的制備
[0040]將液體培養(yǎng)基分裝于250ml三角瓶中，121°C滅菌20分鐘，放入超凈工作臺(tái)冷卻至 室溫備用。在無(wú)菌條件下，將母種用接種環(huán)接種到三角瓶中，置于搖床中，120r/min，22°C培 養(yǎng)7天，待形成均勻菌球后用雙層無(wú)菌紗布過(guò)濾，即得到菌懸液，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)菌懸液 孢子濃度為1〇 6個(gè)/mL。
[0041] 3、黃粉蟲幼蟲的準(zhǔn)備
[0042]將成熟的黃粉蟲幼蟲置于玻璃瓶中，100kPa，121°C滅菌15min，置于超凈工作臺(tái)內(nèi) 放涼待用。
[0043] 4、接種
[0044]在超凈工作臺(tái)內(nèi)，將滅菌后的成熟黃粉蟲幼蟲均勻放置在無(wú)菌的培養(yǎng)皿中，均勻 噴灑菌懸液至蟲體表面，培養(yǎng)皿用無(wú)菌封口膜封口。
[0045] 5、蟲草產(chǎn)品的培養(yǎng)
[0046] 將培養(yǎng)皿置于培養(yǎng)箱內(nèi)，22°C黑暗條件下培養(yǎng)7天，得到被蛹蟲草菌侵染的黃粉蟲 幼蟲，接種成功率達(dá)1〇〇 %，然后將其置于22°C自然光照條件下培養(yǎng)3天，使蟲體轉(zhuǎn)色為橙 色，即為以黃粉蟲幼蟲為載體培養(yǎng)得到的蟲草產(chǎn)品。
[0047] 實(shí)施例2