一種猴耳環(huán)種子苗莖段組織培養(yǎng)快速繁殖方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種猴耳環(huán)種子苗莖段組織培養(yǎng)快速繁殖方法，依次經(jīng)過外植體的采集與表面消毒、叢生芽的誘導(dǎo)、叢生芽的增殖、叢生芽的繼代培養(yǎng)以及生根培養(yǎng)后，得到完整植株，即可出瓶煉苗，并移栽。本發(fā)明的方法操作容易，生產(chǎn)成本低，不污染環(huán)境，可以實(shí)現(xiàn)規(guī)模化生產(chǎn)。通過本發(fā)明培養(yǎng)的猴耳環(huán)種苗，其遺傳性狀穩(wěn)定，保持了親本特性，具備包括穩(wěn)定、投入少、產(chǎn)出高、周期短等諸多優(yōu)勢。
【專利說明】一種猴耳環(huán)種子苗莖段組織培養(yǎng)快速繁殖方法【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于組織培養(yǎng)快速繁殖【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種猴耳環(huán)種子苗莖段組織培養(yǎng)快速繁殖方法。
【背景技術(shù)】
[0002]猴耳環(huán)iArchidendron clypearia)為含羞草科猴耳環(huán)屬，別名圍涎樹、蚊龍木、落地金錢、雞三樹、尿桶公等，常綠喬木，高達(dá)十米。猴耳環(huán)分布于浙江、福建、廣東、海南、四川、廣西及云南，生于荒山坡樹林中、路旁及河旁。猴耳環(huán)既是一種分布在亞熱帶沿海地區(qū)的優(yōu)秀鄉(xiāng)土植物，也是一種重要的園林觀花觀果植物。此外，猴耳環(huán)的莖干、葉片甚至整個(gè)植株體內(nèi)含有多種化學(xué)成分，其生理活性廣泛，具有細(xì)胞毒、抑菌、鎮(zhèn)痛、抗病毒等作用。目前猴耳環(huán)的需求量、市場交易量逐年增加，猴耳環(huán)的利潤額一直處于持續(xù)上漲趨勢，受利益驅(qū)動，很多原生地的猴耳環(huán)都遭遇掠奪性的砍伐，使大量資源迅速減少和消失。國內(nèi)外研究工作者大都對猴耳環(huán)的藥性成分進(jìn)行研究，對猴耳環(huán)的快速繁殖技術(shù)研究甚少。因此，建立猴耳環(huán)的組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)體系，培育性狀一致的植株，對保護(hù)猴耳環(huán)野生資源和滿足藥材市場的原材料需求，實(shí)現(xiàn)猴耳環(huán)的人工規(guī)?；绾蜕a(chǎn)顯得十分迫切。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]有鑒于此，本發(fā)明所解決的技術(shù)問題在于提供了一種猴耳環(huán)實(shí)生苗莖段組織培養(yǎng)快速繁殖方法，通過叢生芽途徑進(jìn)行猴耳環(huán)組織培養(yǎng)能夠獲得大量遺傳性狀穩(wěn)定的試管苗，保持良好的親本特性，并且具備包括不變性、投入少、產(chǎn)出高、周期短在內(nèi)的諸多優(yōu)勢。
[0004]本發(fā)明通過以下技術(shù)方案來解決上述技術(shù)問題:
一種猴耳環(huán)實(shí)生苗莖段組織培養(yǎng)快速繁殖方法，依次包括以下步驟:
1)外植體的采集與表面消毒:選取猴耳環(huán)實(shí)生種子苗一二年生幼嫩枝條，采集后將洗凈的枝條分段，并對枝條進(jìn)行預(yù)處理獲取1.5-2cm長、帶1-2個(gè)側(cè)芽的徑段，而后在超凈工作臺上先用無菌蒸餾水潤洗兩次，再依次通過酒精和升汞溶液進(jìn)行表面消毒處理，在用升汞溶液進(jìn)行處理期間不斷的搖晃培養(yǎng)瓶，使莖段與液體充分接觸，之后立即用無菌蒸餾水沖洗5-8次，沖洗好后將莖段置于滅菌待用的碟子中，切除葉柄、莖段兩端受傷部位，將莖段接種到芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中；
2)叢生芽的誘導(dǎo):采用誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)一周之后，新芽長出，30天后新芽長到l-2cm；培養(yǎng)過程中，溫度為25±2°C，光照強(qiáng)度為1500-2000 lx，光照時(shí)間為12小時(shí)/天；
3)叢生芽的增殖:將叢生芽切割成2段，每段1-2節(jié)，轉(zhuǎn)接到叢生芽增殖培養(yǎng)基，培養(yǎng)45-60天，獲得大量叢生芽；培養(yǎng)條件為:溫度為25±2°C，光照強(qiáng)度為1500-2000 lx，光照時(shí)間為12小時(shí)/天；
4)繼代培養(yǎng):采用繼代培養(yǎng)基進(jìn)行繼代培養(yǎng)，每45天繼代一次；培養(yǎng)條件為:溫度為25±2°C，光照強(qiáng)度為1500-2000 lx，光照時(shí)間為12小時(shí)/天；
5)生根培養(yǎng):繼代苗達(dá)到合適數(shù)量后，采用生根培養(yǎng)基進(jìn)行生根培養(yǎng)，培養(yǎng)30?50天得到生根苗；培養(yǎng)條件為:溫度為25±2°C，光照強(qiáng)度為1500-2000 lx，光照時(shí)間為12小時(shí)
/天;
6)試管苗移栽:選擇每年3-5月、7-11月為出瓶移栽的季節(jié)，或者提供類似3?5、7-11月份自然條件的生長環(huán)境進(jìn)行出瓶移栽；移栽前，試管苗放置于具自然光散射的溫室中煉苗7-10天，然后從瓶中取出小苗，清洗根部的培養(yǎng)基，取出后種植于新配制的培養(yǎng)土中，溫室須保持通風(fēng)，濕度在70?80%，溫度保持在15°C以上至室溫范圍內(nèi)，高于30°C必須用風(fēng)機(jī)、水簾降溫。
[0005]優(yōu)選地,所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基成為MS基本培養(yǎng)基,未添加任何激素,培養(yǎng)基pH值為
5.8-6.00
[0006]優(yōu)選地，所述叢生芽增殖培養(yǎng)基成分中含有MS + 6-BAC6-芐氨基腺嘌呤)0.50?
1.50 mg/L +IBA (吲哚丁酸)0.00 ?0.20 mg/L +NAA (萘乙酸)0.00 ?0.10mg/L +GA3 (赤霉素)0.10 ?1.00 mg/L ο
[0007]優(yōu)選地，所述繼代培養(yǎng)基成分中含有MS +6-BA (6_芐氨基腺嘌呤)0.20?1.50mg/L + NAA (萘乙酸)0.00 ?0.10 mg/L + IBA (吲哚丁酸)0.00 ?0.20 mg/L + GA3 (赤霉素)0.10 ?1.50 mg/L ο
[0008]優(yōu)選地，所述生根培養(yǎng)基成分中含有1/2MS + IBA (吲哚丁酸)0.00?1.00 mg/L+ NAA (萘乙酸)0.00 ?2.00 mg/L。
[0009]優(yōu)選地，所述外植體的采集與表面消毒，所述外植體的采集與表面消毒步驟中，對枝條進(jìn)行預(yù)處理是指用自來水沖洗外植體表面0.5-1 h，剪去葉片，并剪成1.5-2cm長、帶
1-2個(gè)側(cè)芽的徑段，接著用洗潔劑溶液浸泡6min后，再用棉球蘸洗潔劑溶液仔細(xì)輕輕清洗腋芽及莖段，再用清水沖洗0.5-1 h，放入干凈容器中待用。
[0010]優(yōu)選地，所述外植體的采集與表面消毒步驟中，依次通過酒精和升汞溶液進(jìn)行處理是指接著轉(zhuǎn)入75%的酒精中30 S，用無菌蒸餾水沖洗2到3次，然后用0.1%升汞6- 10min對猴耳環(huán)莖段滅菌，期間不斷的搖晃培養(yǎng)瓶。
[0011]優(yōu)選地，所述培養(yǎng)土中草炭土、珍珠巖、蛭石的配比3:1:1。
[0012]相比于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的猴耳環(huán)實(shí)生苗莖段組織培養(yǎng)快速繁殖方法的有益效果在于:該方法操作容易，生產(chǎn)成本低，不污染環(huán)境，能夠?qū)崿F(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)。通過本發(fā)明培育出的猴耳環(huán)種苗，其遺傳性狀穩(wěn)定，保持了親本的特性，具備包括不變性、投入少、產(chǎn)出高、周期短在內(nèi)的諸多優(yōu)勢。
【具體實(shí)施方式】
[0013]本發(fā)明【具體實(shí)施方式】中提供的一種猴耳環(huán)組織培養(yǎng)快速繁殖方法，具體包括以下依次進(jìn)行的步驟:
I)外植體的采集與表面消毒:選取猴耳環(huán)實(shí)生種子苗一二年生幼嫩枝條，采集后將洗凈的枝條分段，并對枝條進(jìn)行預(yù)處理獲取1.5-2cm長、帶1-2個(gè)側(cè)芽的徑段，而后在超凈工作臺上先用無菌蒸餾水潤洗兩次，再依次通過酒精和升汞溶液進(jìn)行表面消毒處理，在用升汞溶液進(jìn)行處理期間不斷的搖晃培養(yǎng)瓶，使莖段與液體充分接觸，之后立即用無菌蒸餾水沖洗5-8次，沖洗好后將莖段置于滅菌待用的碟子中，切除葉柄、莖段兩端受傷部位，將莖段接種到芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中；2)叢生芽的誘導(dǎo):采用誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)一周之后，新芽長出，30天后新芽長到l-2cm；培養(yǎng)過程中，溫度為25±2°C，光照強(qiáng)度為1500-2000 lx，光照時(shí)間為12小時(shí)/天；
3)叢生芽的增殖:將叢生芽切割成2段，每段1-2節(jié)，轉(zhuǎn)接到叢生芽增殖培養(yǎng)基，培養(yǎng)45-60天，獲得大量叢生芽；培養(yǎng)條件為:溫度為25±2°C，光照強(qiáng)度為1500-2000 lx，光照時(shí)間為12小時(shí)/天；
4)繼代培養(yǎng):采用繼代培養(yǎng)基進(jìn)行繼代培養(yǎng)，每45天繼代一次；培養(yǎng)條件為:溫度為25±2°C，光照強(qiáng)度為1500-2000 lx，光照時(shí)間為12小時(shí)/天；
5)生根培養(yǎng):繼代苗達(dá)到合適數(shù)量后，采用生根培養(yǎng)基進(jìn)行生根培養(yǎng)，培養(yǎng)30?50天得到生根苗；培養(yǎng)條件為:溫度為25±2°C，光照強(qiáng)度為1500-2000 lx，光照時(shí)間為12小時(shí)/天;
6 )試管苗移栽:選擇每年3-5月、7-11月為出瓶移栽的季節(jié)，或者提供類似3?5、7-11月份自然條件的生長環(huán)境進(jìn)行出瓶移栽；移栽前，試管苗放置于具自然光散射的溫室中煉苗7-10天，然后從瓶中取出小苗，清洗根部的培養(yǎng)基，取出后種植于新配制的培養(yǎng)土中，溫室須保持通風(fēng)，濕度在70?80%，溫度保持在15°C以上至室溫范圍內(nèi)，高于30°C必須用風(fēng)機(jī)、水簾降溫。
[0014]上述各個(gè)步驟中涉及到的處理方式、培養(yǎng)條件、培養(yǎng)時(shí)間和培養(yǎng)基的成分都會根據(jù)具體需要進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。
[0015]其中，各培·養(yǎng)在成分確定的情況下，其中用到的各組分的含量可根據(jù)實(shí)際的培養(yǎng)情況進(jìn)行調(diào)整，上述方法中用到的培養(yǎng)基及培養(yǎng)土成分和各成分的含量范圍如下:
誘導(dǎo)培養(yǎng)基成分為MS基本培養(yǎng)基，不添加任何激素，培養(yǎng)基pH值為5.8-6.0。
[0016]叢生芽增殖培養(yǎng)基為MS + 6-BA (6_芐氨基腺嘌呤)0.50?1.50 mg/L +IBA (噴哚丁酸)0.00 ?0.20 mg/L +NAA (萘乙酸)0.00 ?0.10mg/L +GA3 (赤霉素)0.10 ?1.00mg/L ο
[0017]繼代培養(yǎng)基為MS +6-BA (6_芐氨基腺嘌呤)0.20?1.50 mg/L + NAA (萘乙酸)
0.00 ?0.10 mg/L + IBA (吲哚丁酸)0.00 ?0.20 mg/L + GA3 (赤霉素)0.10 ?1.50 mg/
L0
[0018]所述生根培養(yǎng)基成分中含有1/2MS + ΙΒΑ(Π引哚丁酸)0.00?1.00 mg/L+ NAA (萘乙酸)0.00 ?2.00 mg/L O
[0019]所述培養(yǎng)土中草炭土、珍珠巖、蛭石的配比3:1:1。
[0020]另外，由于培養(yǎng)過程受諸如溫度、光照、濕度等多種因素的影響，因而，在本發(fā)明的各步驟中，處理方式、培養(yǎng)條件、培養(yǎng)時(shí)間都會根據(jù)具體需要進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。其中，外植體的采集與表面消毒步驟中，所述外植體的采集與表面消毒步驟中，對枝條進(jìn)行預(yù)處理是指用自來水沖洗外植體表面0.5-1 h，剪去葉片，并剪成1.5-2cm長、帶1_2個(gè)側(cè)芽的徑段，接著用洗潔劑溶液浸泡6min后，再用棉球蘸洗潔劑溶液仔細(xì)輕輕清洗腋芽及莖段，再用清水沖洗0.5-1 h，放入干凈容器中待用。另外，依次通過酒精和升汞溶液進(jìn)行處理是指接著轉(zhuǎn)入75%的酒精中30 S，用無菌蒸餾水沖洗2到3次，然后用0.1%升汞6- 10 min對猴耳環(huán)莖段滅菌，期間不斷的搖晃培養(yǎng)瓶。
[0021]為使本發(fā)明更加容易理解，下面將進(jìn)一步闡述本發(fā)明的具體實(shí)施例。
[0022]實(shí)施例1于4月份晴天上午10時(shí)以后采集猴耳環(huán)實(shí)生種子苗一二年生幼嫩枝條，并把枝條下部立即浸入水中，防止幼嫩枝條水分蒸發(fā)。對所采的枝條先進(jìn)行預(yù)處理:用自來水沖洗外植體表面0.5-1 h，剪去葉片，并剪成1.5-2 cm長的莖段(帶側(cè)芽1-2個(gè))，接著用少量洗潔劑溶液浸泡6min后用棉球蘸洗潔劑溶液仔細(xì)輕輕清洗腋芽及莖段，再用清水沖洗0.5-1 h，放入干凈容器中待用。在超凈工作臺上用75%酒精浸泡30 S，之后倒出酒精，立即用無菌水沖洗2-3次，接著用0.1%的升汞溶液消毒8 min，期間不斷搖晃培養(yǎng)瓶，使莖段與液體充分接觸，之后倒出升汞，用無菌水沖洗5-8次。沖洗完畢后將莖段置于滅菌待用的碟子中，切除葉柄、莖段兩端受傷部位，將莖段接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS0 (未添加激素的MS培養(yǎng)基)，光照強(qiáng)度為1500-2000 lx，光照時(shí)間為12 h/d，溫度為25±2°C。培養(yǎng)一星期左右側(cè)芽萌發(fā)并生長，誘導(dǎo)率為50.9%，污染率為22.8%，褐化率為26.3%。待其芽培養(yǎng)30 d時(shí)長至2_3 cm時(shí)，將其剪下把芽切成I cm長的小段接到增殖培養(yǎng)基為MS + 6-BA (6-芐氨基腺嘌呤)0.50 mg/L + IBA (吲哚丁酸)0.20 mg/L + NAA(萘乙酸)0.05 mg/L + GA3(赤霉素)1.00 mg/L 上，在光照強(qiáng)度為1500-2000 lx，光照時(shí)間為12 h/d，溫度為25±2°C條件下，培養(yǎng)45-60 d有大量叢生芽長出，增殖系數(shù)可達(dá)到3.64，不定芽高度能達(dá)到1.46 cm，有效芽率為55.0%。每40?60天繼代增殖I次，繼代培養(yǎng)基為MS + 6-BA (6-芐氨基腺嘌呤)0.20 mg/L + IBA(口引哚丁酸)0.20 mg/L + NAA (萘乙酸)0.05 mg/L + GA3(赤霉素)1.00 mg/L,在光照強(qiáng)度1500?20001x，光照10小時(shí)/天，溫度25?28°C條件下培養(yǎng)。當(dāng)繼代苗達(dá)到一定數(shù)量后將其接入生根培養(yǎng)基1/2MS + IBA (吲哚丁酸)1.00 mg/L中，光照強(qiáng)度為1500-2000 Ix,光照時(shí)間為12 h/d，溫度為25±2°C，培養(yǎng)兩星期左右組培苗開始生根，培養(yǎng)30 d時(shí)，生根率達(dá)到96.3%，平均根數(shù)為4.7，平均根長為1.54 cm，此時(shí)的根長、根數(shù)生長較一致，上部葉片綠色。將生根苗置于溫室煉苗，先扭松蓋子放置2-3d，再完全打開蓋子3-4天，讓組培苗慢慢適應(yīng)溫室環(huán)境，并在煉苗的過程中宜在苗的表面噴施適量水分，保持濕度。溫室溫度為25°左右，濕度為80%-90%，溫室頂部用75%遮陽網(wǎng)減少光照。移栽前將苗從瓶中取出，在清水中輕輕漂洗猴耳環(huán)根上附著的培養(yǎng)基，洗凈基部，隨即把根浸泡在0.1%的多菌靈溶液中2min，接著把苗移栽至泥炭:黃土(1:1)基質(zhì)中。并保持溫室通風(fēng)，高于30°C必須用風(fēng)機(jī)、水簾降溫，移栽成活率達(dá)95%以上。
[0023]實(shí)施例2
于7月份晴天上午10時(shí)以后采集猴耳環(huán)實(shí)生種子苗一二年生幼嫩枝條，并把枝條下部立即浸入水中，防止幼嫩枝條水分蒸發(fā)。對所采的枝條先進(jìn)行預(yù)處理:用自來水沖洗外植體表面0.5-1 h，剪去葉片，并剪成1.5-2 cm長的莖段(帶側(cè)芽1-2個(gè))，接著用少量洗潔劑溶液浸泡5min后用棉球蘸洗潔劑溶液仔細(xì)輕輕清洗腋芽及莖段，再用清水沖洗0.5-1 h，放入干凈容器中待用。在超凈工作臺上用75%酒精浸泡30 S，之后倒出酒精，立即用無菌水沖洗2-3次，接著用0.1%的升汞溶液消毒8 min，期間不斷搖晃培養(yǎng)瓶，使莖段與液體充分接觸，之后倒出升汞，用無菌水沖洗5-8次。沖洗完畢后將莖段置于滅菌待用的碟子中，切除葉柄、莖段兩端受傷部位，將莖段接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS0 (未添加激素的MS培養(yǎng)基)，光照強(qiáng)度為1500-2000 lx，光照時(shí)間為12 h/d，溫度為25±2°C。培養(yǎng)一星期左右側(cè)芽萌發(fā)并生長，誘導(dǎo)率為13..3%，污染率為71.1%，褐化率為15.6%。待其芽培養(yǎng)30 d時(shí)長至2_3 cm時(shí)，將其剪下把芽切成I cm長的小段接到增殖培養(yǎng)基為MS + 6-BA(6-芐氨基腺嘌呤)1.00 mg/L + IBA (吲哚丁酸)0.10 mg/L + GA3 (赤霉素)1.00 mg/L 上，在光照強(qiáng)度為 1500-2000lx，光照時(shí)間為12 h/d，溫度為25±2°C條件下，培養(yǎng)45-60 d有大量叢生芽長出，增殖系數(shù)可達(dá)到4.00，不定芽高度能達(dá)到1.37cm，有效芽率為52.7%。每40?60天繼代增殖I次，繼代培養(yǎng)基為MS + 6-BA (6-芐氨基腺嘌呤)0.50 mg/L + IBA (吲哚丁酸)0.10 mg/L +NAA (萘乙酸)0.05 mg/L + GA3(赤霉素)1.00 mg/L，在光照強(qiáng)度1500?20001x，光照10小時(shí)/天，溫度25?28°C條件下培養(yǎng)。當(dāng)繼代苗達(dá)到一定數(shù)量后將其接入生根培養(yǎng)基1/2MS + IBA (吲哚丁酸)0.50 mg/L中，光照強(qiáng)度為1500-2000 lx，光照時(shí)間為12 h/d，溫度為25±2°C，培養(yǎng)兩星期左右組培苗開始生根，培養(yǎng)30 d時(shí)，生根率達(dá)到80.5%，平均根數(shù)為3.3，平均根長為1.99cm，此時(shí)地上部苗的生長與根協(xié)調(diào)生長。將生根苗置于溫室煉苗，先扭松蓋子放置2-3 d，再完全打開蓋子3-4 d，讓組培苗慢慢適應(yīng)溫室環(huán)境，并在煉苗的過程中宜在苗的表面噴施適量水分，保持濕度。溫室溫度為25°左右，濕度為80%-90%，溫室頂部用75%遮陽網(wǎng)減少光照。移栽前將苗從瓶中取出，在清水中輕輕漂洗猴耳環(huán)根上附著的培養(yǎng)基，洗凈基部，隨即把根浸泡在0.1%的多菌靈溶液中2min，接著把苗移栽至泥炭基質(zhì)中。并保持溫室通風(fēng)，高于30°C必須用風(fēng)機(jī)、水簾降溫，移栽成活率可達(dá)90%以上。
[0024]實(shí)施例3
于10月份晴天上午10時(shí)以后采集猴耳環(huán)實(shí)生種子苗一二年生幼嫩枝條，并把枝條下部立即浸入水中，防止幼嫩枝條水分蒸發(fā)。對所采的枝條先進(jìn)行預(yù)處理:用自來水沖洗外植體表面0.5-1 h，剪去葉片，并剪成1.5-2 Cm長的莖段(帶側(cè)芽1_2個(gè))，接著用少量洗潔劑溶液浸泡5min后用棉球蘸洗潔劑溶液仔細(xì)輕輕清洗腋芽及莖段，再用清水沖洗0.5-1h，放入干凈容器中待用。在超凈工作臺上用75%酒精浸泡30 S，之后倒出酒精，立即用無菌水沖洗2-3次，接著用0.1%的升汞溶液對猴耳環(huán)嫩莖段消毒8 min,老莖段用0.1%升汞lOmin，期間不斷搖晃培養(yǎng)瓶，使莖段與液體充分接觸，之后倒出升汞，用無菌水沖洗5-8次。沖洗完畢后將莖段置于滅菌待用的碟子中，切除葉柄、莖段兩端受傷部位，將莖段接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基MStl (未添加激素的MS培養(yǎng)基)，光照強(qiáng)度為1500-2000 lx，光照時(shí)間為12h/d，溫度為25±2°C。 培養(yǎng)一星期左右側(cè)芽萌發(fā)并生長，嫩莖段誘導(dǎo)率為55.8%，老莖段誘導(dǎo)率為56.0%。待其芽培養(yǎng)30 d時(shí)長至2-3 cm時(shí)，將其剪下把芽切成I cm長的小段接到增殖培養(yǎng)基為MS + 6-BA (6-芐氨基腺嘌呤)0.50 mg/L + IBA (吲哚丁酸)0.10 mg/L +NAA (萘乙酸)0.10 mg/L + GA3(赤霉素)0.50 mg/L上，在光照強(qiáng)度為1500-2000 lx，光照時(shí)間為12 h/d，溫度為25±2°C條件下，培養(yǎng)45-60 d有大量叢生芽長出，增殖系數(shù)可達(dá)到3.43，不定芽高度能達(dá)到1.14cm,有效芽率為50.0%。每40?50天繼代增殖I次，繼代培養(yǎng)基為MS + 6-BA (6-芐氨基腺嘌呤)0.20 mg/L + IBA (吲哚丁酸)0.10 mg/L + NAA(萘乙酸)0.10 mg/L + GA3 (赤霉素)0.50 mg/L，在光照強(qiáng)度1500?20001x，光照10小時(shí)/天，溫度25?28°C條件下培養(yǎng)。當(dāng)繼代苗當(dāng)增殖苗達(dá)到一定數(shù)量后將其接入生根培養(yǎng)基1/2MS + NAA (萘乙酸)2.00 mg/L中，光照強(qiáng)度為1500-2000 lx，光照時(shí)間為12 h/d,溫度為25±2°C，培養(yǎng)兩星期左右組培苗開始生根，培養(yǎng)30 d時(shí)，生根率達(dá)到80.5%，平均根數(shù)為5.3，平均根長為1.34 cm，此時(shí)苗長勢較好。將生根苗置于溫室煉苗，先扭松蓋子放置
2-3 d，再完全打開蓋子3-4 d，讓組培苗慢慢適應(yīng)溫室環(huán)境，并在煉苗的過程中宜在苗的表面噴施適量水分，保持濕度。溫室溫度為25°左右，濕度為80%-90%，溫室頂部用75%遮陽網(wǎng)減少光照。移栽前將苗從瓶中取出，在清水中輕輕漂洗猴耳環(huán)根上附著的培養(yǎng)基，洗凈基部，隨即把根浸泡在0.1%的多菌靈溶液中2min，接著把苗移栽至黃土基質(zhì)中。并保持溫室通風(fēng)，高于30°C必須用風(fēng)機(jī)、水簾降溫，移栽成活率達(dá)90%以上。
[0025]相比于現(xiàn)有技術(shù)，上述方式中揭示的猴耳環(huán)種子苗莖段組織培養(yǎng)快速繁殖方法，操作容易，生產(chǎn)成本低，不污染環(huán)境，能夠?qū)崿F(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)。通過本發(fā)明培育出的鼓槌石斛種苗，其遺傳性狀穩(wěn)定，保持了親本的特性，具備包括不變性、投入少、產(chǎn)出高、周期短在內(nèi)的諸多優(yōu)勢。
[0026]最后所應(yīng)當(dāng)說明的是，以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非對本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，盡管參照較佳實(shí)施例對本發(fā)明作了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和范圍 。
【權(quán)利要求】
1.一種猴耳環(huán)種子苗莖段組織培養(yǎng)快速繁殖方法，其特征在于該方法依次包括以下步驟:1)外植體的采集與表面消毒:選取猴耳環(huán)實(shí)生種子苗一二年生幼嫩枝條，采集后將洗凈的枝條分段，并對枝條進(jìn)行預(yù)處理獲取1.5-2cm長、帶1-2個(gè)側(cè)芽的徑段，而后在超凈工作臺上先用無菌蒸餾水潤洗兩次，再依次通過酒精和升汞溶液進(jìn)行表面消毒處理，在用升汞溶液進(jìn)行處理期間不斷的搖晃培養(yǎng)瓶，使莖段與液體充分接觸，之后立即用無菌蒸餾水沖洗5-8次，沖洗好后將莖段置于滅菌待用的碟子中，切除葉柄、莖段兩端受傷部位，將莖段接種到芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中；2)叢生芽的誘導(dǎo):采用誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)一周之后，新芽長出，30天后新芽長到l-2cm；培養(yǎng)過程中，溫度為25±2°C，光照強(qiáng)度為1500-2000 lx，光照時(shí)間為12小時(shí)/天；3)叢生芽的增殖:將叢生芽切割成2段，每段1-2節(jié)，轉(zhuǎn)接到叢生芽增殖培養(yǎng)基，培養(yǎng)45-60天，獲得大量叢生芽；培養(yǎng)條件為:溫度為25±2°C，光照強(qiáng)度為1500-2000 lx，光照時(shí)間為12小時(shí)/天；4)繼代培養(yǎng):采用繼代培養(yǎng)基進(jìn)行繼代培養(yǎng)，每45天繼代一次；培養(yǎng)條件為:溫度為25±2°C，光照強(qiáng)度為1500-2000 lx，光照時(shí)間為12小時(shí)/天； 5)生根培養(yǎng):繼代苗達(dá)到合適數(shù)量后，采用生根培養(yǎng)基進(jìn)行生根培養(yǎng)，培養(yǎng)30?50天得到生根苗；培養(yǎng)條件為:溫度為25±2°C，光照強(qiáng)度為1500-2000 lx，光照時(shí)間為12小時(shí)/天;6)試管苗移栽:選擇每年3-5月、7-11月為出瓶移栽的季節(jié)，或者提供類似3?5、7-11月份自然條件的生長環(huán)境進(jìn)行出瓶移栽；移栽前，試管苗放置于具自然光散射的溫室中煉苗7-10天，然后從瓶中取出小苗，清洗根部的培養(yǎng)基，取出后種植于新配制的培養(yǎng)土中，溫室須保持通風(fēng)，濕度在70?80%，溫度保持在15°C以上至室溫范圍內(nèi)，高于30°C必須用風(fēng)機(jī)、水簾降溫。
2.如權(quán)利要求1所述的猴耳環(huán)種子苗莖段組織培養(yǎng)快速繁殖方法，其特征在于:所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基，未添加任何激素，培養(yǎng)基pH值為5.8-6.0。
3.如權(quán)利要求1所述的猴耳環(huán)種子苗莖段組織培養(yǎng)快速繁殖方法，其特征在于:所述叢生芽增殖培養(yǎng)基成分中含有MS +6-芐氨基腺嘌呤0.50?1.50 mg/L +吲哚丁酸0.00?0.20 mg/L + 蔡乙酸 0.00 ?0.10mg/L + 赤霉素 0.10 ?1.00 mg/L。
4.如權(quán)利要求1所述的猴耳環(huán)種子苗莖段組織培養(yǎng)快速繁殖方法，其特征在于:MS+6-芐氨基腺嘌呤0.20?1.50 mg/L +萘乙酸0.00?0.10 mg/L +吲哚丁酸0.00?0.20mg/L + 赤霉素 0.10 ?1.50 mg/L。
5.如權(quán)利要求1所述的猴耳環(huán)種子苗莖段組織培養(yǎng)快速繁殖方法，其特征在于:所述生根培養(yǎng)基成分中含有1/2MS +吲哚丁酸0.00?1.00 mg/L+萘乙酸0.00?2.00 mg/L。
6.如權(quán)利要求1所述的猴耳環(huán)種子苗莖段組織培養(yǎng)快速繁殖方法，其特征在于:所述外植體的采集與表面消毒步驟中，對枝條進(jìn)行預(yù)處理是指用自來水沖洗外植體表面0.5-1h，剪去葉片，并剪成1.5-2cm長、帶1-2個(gè)側(cè)芽的徑段，接著用洗潔劑溶液浸泡6min后，再用棉球蘸洗潔劑溶液仔細(xì)輕輕清洗腋芽及莖段，再用清水沖洗0.5-1 h，放入干凈容器中待用。
7.如權(quán)利要求1所述的猴耳環(huán)種子苗莖段組織培養(yǎng)快速繁殖方法，其特征在于:所述外植體的采集與表面消毒步驟中，依次通過酒精和升汞溶液進(jìn)行處理是指接著轉(zhuǎn)入75%的酒精中30 S，用無菌蒸餾水沖洗2到3次，然后用0.1%升汞6- 10 min對猴耳環(huán)莖段滅菌，期間不斷的搖晃培養(yǎng)瓶。
8.如權(quán)利要求1所述的猴耳環(huán)種子苗莖段組織培養(yǎng)快速繁殖方法，其特征在于:所述培養(yǎng)土中草炭土、珍珠巖 、蛭石的配比3:1:1。
【文檔編號】A01H4/00GK103430843SQ201310345570
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2013年8月9日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月9日
【發(fā)明者】趙小蘭, 黃烈健, 王渝余 申請人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)