專利名稱：一種以莖段為外植體的川芎組織培養(yǎng)快繁方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種通過組織培養(yǎng)技術的植物再生方法，特別是涉及一種 以莖段為外植體的〗11芎組織培養(yǎng)快繁方法。
背景技術：
川芎為我國最常見的中藥材之一，同時也是近幾年國際市場的暢銷植 物藥，是許多保健品和藥品的重要原料。由于該藥材受地理條件的限制， 所以其栽種面積有限，主要分布在我國四川省都江堰。川芎為兩年生植物， 由于川芎植物結(jié)實困難，歷來川芎的育種方法都是采用傳統(tǒng)的莖節(jié)營養(yǎng)繁 殖栽培，這種方法由于育種期間需要進行山區(qū)育苓、壩區(qū)栽種等環(huán)節(jié)，因 此育種周期較長；另外，所采用的種芎種質(zhì)資源"苓種"自身存在易衰老 和易受病毒浸染等缺陷，因而造成川芎種性退化和品質(zhì)下降，并易使種芎 在生產(chǎn)和儲藏中大量產(chǎn)生各種嚴重的病蟲害。因此川芎的種質(zhì)資源質(zhì)量問 題及育種時間長一直是困擾川芎大規(guī)模生產(chǎn)和提高產(chǎn)品質(zhì)量的難題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術中存在的育種時間長、種質(zhì)資源不穩(wěn)定、 "零種"自身易衰老和帶菌等問題而提供一種以莖段為外植體的川芎組織 培養(yǎng)快繁方法，該方法可以大量快速地繁殖出生長速度快、品質(zhì)優(yōu)和染菌 率低的川芎組培苗。
為達到上述目的，本發(fā)明采用的以莖段為外植體的川芎組織培養(yǎng)快繁 方法包括如下步驟
(1)外植體的處理選取巳移栽到室內(nèi)培養(yǎng)14天以上的川芎莖段作為外植體并進行表面消毒處理；
(2) 分化培養(yǎng)將消毒后的外植體接種于分化培養(yǎng)基上，在24 26。C， 每天光照11 13小時、光照強度為1500 2000Lx進行培養(yǎng)，所述分化培 養(yǎng)基是采用在Bs或MS中加入6-BA 1 3mg/L、 NAA0.1 0.5mg/L、蔗糖 30g/L和瓊脂7.0g/L， PH值為5.8 6.5;
(3) 生根培養(yǎng)將所生長的芽切下轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基上，在24 26。C、 每天光照8 12小時、光照強度為1500 2000LX進行培養(yǎng)，所述生根培養(yǎng) 基是采用在1/2MS中加入IBA0.1 0.5mg/L、蔗糖15g/L和瓊脂7.0g/L， PH 值為5.8 6.5;
(4) 煉苗和移栽當每培苗長至2 3cm以上時，打開瓶蓋，在室內(nèi)煉 苗2 4天后，將組培苗從培養(yǎng)瓶中取出，洗掉根部的培養(yǎng)基，將其移栽至 松軟的蛭石介質(zhì)中。
上述方案中(l)步驟可采用的外植體消毒方法可以有很多，常用的消毒 劑有70 75%乙醇、次氯酸鈉溶液、二氯化汞溶液等，本發(fā)明優(yōu)選的方法 是先用洗衣粉浸泡外植體2 5分鐘，再用流水沖洗2 3小時，然后在無 菌條件下分別采用70 75%乙醇消毒20 30秒、0.1%升汞處理3 6分鐘， 最后用無菌水清洗3 4次。
上述方案中將芽轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基前，先將芽在MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 天以上，增加這樣一個過渡過程，更有利于根的生長。
上述方案中，在將組培苗移栽至松軟的蛭石介質(zhì)后，應適當遮光，并 保持溫度在1S 22。C，相對濕度在75 85%，這樣組培苗的生長更快、更 健壯。
本發(fā)明方案中外植體可以是地上莖綠色莖段、地上莖紫色莖段、地下 莖上部莖段或地下莖下部莖段，它們的分化率存在一k的差異，其中地上 莖的紫色莖段腋芽分化率最高，地下莖的上部莖段分化率次之，但地下莖作為外植體進行繁殖時，除菌稍困難，因此川芎地上莖紫色莖段為最佳外 植體。
本發(fā)明方法中最佳分化培養(yǎng)基為B5+6-BA2mg/L+NAA0.2mg/L+蔗糖 30g/L+瓊脂7.0g/L，采用這種分化培養(yǎng)基進行分化培養(yǎng)時，腋芽的分化率最 高，且苗生長速度快、健壯。
本發(fā)明方法中最佳生根培養(yǎng)基為1/2 MS+IBA0.5mg/L+蔗糖15g/L+瓊 脂7.0g/L，采用這種生根培養(yǎng)基進行生根培養(yǎng)時，生根率最高，且根分化速 度快、根系發(fā)達及根粗壯。
本發(fā)明采用組織培養(yǎng)方法培養(yǎng)組培苗所花的時間與傳統(tǒng)育種所花的時 間相比大大縮短，而且培養(yǎng)的組培苗由于自身生長健壯，根系發(fā)達，因此 不易感染病菌，克服了傳統(tǒng)育種中不能利用種子繁殖、種質(zhì)資源不穩(wěn)定、 育種時間長、"苓種"自身易衰老和帶菌等問題。另外實施該方法只需有簡 單的植物組織培養(yǎng)設備即可進行，實用性強，且不受季節(jié)限制，因此能滿 足川芎大規(guī)模生產(chǎn)的需求。
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明。
具體實施例方式
實施例1
(1) 外植體的處理采集已移栽到室內(nèi)培養(yǎng)H天以上的川芎地上莖的 紫色莖段作為外植體，并對其進行消毒處理，所采用的消毒方法是先用 洗衣粉浸泡2分鐘，再用流水沖洗3小時，然后在無菌條件下分別采用濃
度為70%的乙醇消毒20秒、濃度為0.1%的升汞處理3分鐘，最后用無菌
水清洗4次；
(2) 分化培養(yǎng)在超凈工作臺上將外植體切成l 2cm的長度，接種到 腋芽的分化培養(yǎng)基B5+6-BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7.0g/L 上，并在24 26。C，每天光照12小時、光照強度為1500 2000Lx的條件下進行培養(yǎng)，培養(yǎng)3天后，莖段腋芽陸續(xù)開始萌發(fā)，生長速度最快，7天后 腋芽分化率達到92.5%,且苗健壯，葉色濃綠；
(3) 生根培養(yǎng)當芽長到2cm左右時，將芽切下，在MS培養(yǎng)基中培養(yǎng) 7天后，轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基1/2MS+IBA0.5mg/L+蔗糖15g/L+瓊脂7.0g/L上， 并在26 26。C、每天光照10小時、光照強度為1500 2000Lx的條件下進 行生根培養(yǎng)，培養(yǎng)15天后無根苗(芽)莖節(jié)處開始生根，30天后統(tǒng)計生根 率為95%，觀察到無根苗生根速度快、根系發(fā)達且根粗壯，生根數(shù)在10條 以上；
(4) 煉苗和移栽當組培苗長至3cm以上時，選擇生長較健壯、具有綠 葉片數(shù)較多和根系較發(fā)達的壯苗逐漸打開瓶蓋，讓幼苗慢慢地適應周圍環(huán) 境，在室內(nèi)煉苗3天后，移栽至松軟的蛭石介質(zhì)中，適當遮光，溫度保持 在2(TC左右，相對濕度在75 85%，組培苗移栽的成活率可達100%。
實施例2
外植體采用已移栽到室內(nèi)培養(yǎng)14天以上的川芎地上莖的綠色莖段，其 它步驟與實施例1相同，7天后統(tǒng)計腋芽的分化率為62.5%。 實施例3
外植體采用已移栽到室內(nèi)培養(yǎng)14天以上的川芎地下莖的上部1/2莖段， 其消毒方法是先用洗衣粉浸泡5分鐘，再用流水沖洗2小時，然后在無 菌條件下分別采用75%乙醇消毒30秒、0.1%升汞處理6分鐘，最后用無菌 水清洗3次。
其它步驟同實施例1， 7天后統(tǒng)計腋芽的分化率87.5%。 實施例4
外植體采用已移栽到室內(nèi)培養(yǎng)14天以上的川芎地下莖的下部l/2莖段， 其它步驟同實施例3， 7天后，統(tǒng)計腋芽的分化率為81%。 實施例5分化培養(yǎng)基采用MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂 7.0g/L，其它步驟同實施例1。觀察到無根苗生長較快，但苗沒有實施例1 生長的壯。
實施例6
分化培養(yǎng)基采用B5+6-BA1.0mg/L+NAA0.2mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂 7.0g/L，其它步驟同實施例l。觀察到腋芽的生長較緩慢，分化率為62.5%。 實施例7
分化培養(yǎng)基采用B5+6-BA2mg/L+NAA0.5mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂 7.0g/L，其它步驟同實施例l。觀察到腋芽生長快、苗健壯，葉色正常，分 化率為85%。
實施例8
分化培養(yǎng)基采用B5+6-BA3mg/L+NAA0.2mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂 7.0g/L，其它步驟同實施例1。觀察到腋芽生長快，但苗沒有實施例1健壯。 實施例9
生根培養(yǎng)基采用1/2MS+IBA0.1mg/L+蔗糖15g/L+瓊脂7.0g/L，其它步 驟同實施例l。統(tǒng)計生根率為75%，觀察到根的生長速度快，根系發(fā)達，生 根數(shù)在IO條以上，但根沒有實施例1的粗。
實施例10
生根培養(yǎng)基采用1/2MS+IBA0.3mg/L+蔗糖15g/L+瓊脂7.0g/L，其它歩 驟同實施例l，統(tǒng)計生根率為85%，觀察到根的生長速度快，根系發(fā)達，生 根數(shù)在10條以上，但根沒有實施例1的粗。
權利要求
1.一種以莖段為外植體的川芎組織培養(yǎng)快繁方法，其特征在于它包括如下步驟(1)外植體的處理選取已移栽到室內(nèi)培養(yǎng)14天以上的川芎莖段作為外植體，并進行表面消毒處理；(2)分化培養(yǎng)將消毒后的外植體接種于分化培養(yǎng)基上，在24～26℃、每天光照11～13小時、光照強度為1500～2000Lx進行培養(yǎng)，所述分化培養(yǎng)培養(yǎng)基是采用在B5或MS中加入6-BA 1～3mg/L、NAA 0.1～0.5mg/L、蔗糖30g/L和瓊脂7.0g/L，PH值為5.8～6.5；(3)生根培養(yǎng)將所生長的芽切下轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基上，在24～26℃、每天光照8～12小時、光照強度為1500～2000LX進行培養(yǎng)，所述分化培養(yǎng)培養(yǎng)基是采用在1/2MS中加入IBA 0.1～0.5mg/L、蔗糖15g/L和瓊脂7.0g/L，PH值為5.8～6.5；(4)煉苗和移栽當組培苗長至2～3cm以上時，打開瓶蓋，在室內(nèi)煉苗2～4天后，將組培苗從培養(yǎng)瓶中取出，洗掉根部的培養(yǎng)基，將其移栽至松軟的蛭石介質(zhì)中。
2. 根據(jù)權利要求1所述的一種以莖段為外植體的川芎組織培養(yǎng)快繁方 法，其特征在于(1)步驟所采用的消毒方法是先用洗衣粉浸泡外植體2 5 分鐘，再用流水沖洗2 3小時，然后在無菌條件下分別采用濃度為70 75% 的乙醇消毒20 30秒、濃度為0.1%的升汞處理3 6分鐘，最后用無菌水 清洗3 4次。 .
3. 根據(jù)權利要求1或2所述的一種以莖段為外植體的川芎組織培養(yǎng)快 繁方法，其特征在于將芽轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基前，先將芽在MS培養(yǎng)基中 培養(yǎng)7天以上。
4. 根據(jù)權利要求1或2所述的一種以莖段為外植體的川芎組織培養(yǎng)快繁方法，其特征在于(4)步驟中將組培苗移栽至松軟的蛭石介質(zhì)后，適當遮光，并保持溫度在18 22°C，相對濕度為75 85%。
5. 根據(jù)權利要求3所述的一種以莖段為外植體的川芎組織培養(yǎng)快繁方 法，其特征在于(4)步驟中將組培苗移栽至松軟的蛭石介質(zhì)后，適當遮光， 并保證溫度在18 22°C，相對濕度為75 85%。
6. 根據(jù)權利要求1所述的一種以莖段為外植體的川芎組織培養(yǎng)快繁方 法，其特征在于(1)步驟中外植體為已移栽到室內(nèi)培養(yǎng)14天以上的川考地 上莖的紫色莖段。
7. 根據(jù)權利要求1所述的一種以莖段為外植體的種川芎組織培養(yǎng)快繁 方法，其特征在于(2)步驟中分化培養(yǎng)基為B5+6-BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L+ 蔗糖30g/L+瓊脂7.0g/L。
8. 根據(jù)權利要求1所述的一種以莖段為外植體的川芎組織培養(yǎng)快繁方 法，其特征在于(3)步驟中生根培養(yǎng)基為1/2MS+IBA0.5mg/L+蔗糖15g/L+ 瓊月旨7.0g/L。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種以莖段為外植體的川芎組織培養(yǎng)快繁方法，該方法包括外植體的處理、分化培養(yǎng)、生根培養(yǎng)、煉苗和移栽步驟，所采用的分化培養(yǎng)基為B₅(或MS)+6-BA 1～3mg/L+NAA0.1～0.5mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7.0g/L，所采用的生根培養(yǎng)基為1/2MS+IBA0.1+0.5mg/L。本發(fā)明方法可以大量快速繁殖出生長速度快、品質(zhì)優(yōu)、染菌率低的川芎組培苗，從而滿足大規(guī)模生產(chǎn)川芎的需求。
文檔編號A01H4/00GK101243775SQ20081004498
公開日2008年8月20日 申請日期2008年3月14日 優(yōu)先權日2008年3月14日
發(fā)明者潔 吳, 孫雁霞, 張海強, 徐作英, 徐文俊, 王躍華, 鄔曉勇 申請人:成都大學