專利名稱：：試管內(nèi)誘導(dǎo)草莓匍匐莖和高溫處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)脫毒方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種植物栽培方法，即一種試管內(nèi)誘導(dǎo)草莓匍匐莖和高溫處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)脫毒方法。
背景技術(shù)：
：在現(xiàn)有技術(shù)中，草莓、Fragariachiloensis.Duch.Bail.)是薔薇科多年生草本植物，近幾年，我國草莓生產(chǎn)發(fā)展迅速，草莓的面積和產(chǎn)量已躍居世界首位。但由于栽培草莓都是通過無性繁殖，病毒侵染之后，隨同無性繁殖材料傳播擴(kuò)散，因此無性繁殖數(shù)量越大，病毒傳播速度也越快，通過幾年的栽培后，受病毒的危害，引進(jìn)的品種果實變小、品質(zhì)變劣、產(chǎn)量降低等退化現(xiàn)象普遍發(fā)生，造成草莓產(chǎn)量的減少，一般減產(chǎn)30%左右，復(fù)合侵染時損失更大。草莓病毒病是由草莓感染病毒而發(fā)生的病害，在栽培上表現(xiàn)出黃化型和縮葉型兩種癥狀類型，草莓病毒病危害面廣，據(jù)不完全統(tǒng)計，草莓病毒的種類多達(dá)60多種，其中草莓斑駁病毒(Strawberrymottlevirus，SmoV)、草莓輕型黃邊病毒(StrawberrymiIdyellowedgevirus,SMTEV)、草莓壤脈病毒(Strawberryveinbandvirus,SVBV)和草莓皺縮病毒(Strawberrycrinklevirus，SCrV)是侵染我國草莓的4種主要病毒，總侵染率為80%以上，其中單病毒的侵染率達(dá)40%以上，兩種以上病毒的復(fù)合侵染率達(dá)38%以上。由于病毒病具有潛伏侵染的特性，植株不能很快表現(xiàn)癥狀，所以在生產(chǎn)上常被忽視。近年來病毒的危害已越來越受到育種學(xué)家的重視，成為草莓生產(chǎn)上急需解決的問題。我國的草莓脫毒技術(shù)起步較晚，目前還不能滿足生產(chǎn)要求。目前，國內(nèi)外利用生物技術(shù)等手段進(jìn)行定向選育抗逆性強的新品種，本課題組在前人研究的基礎(chǔ)上，開展了長白山野生深山草莓(別名綠葉東方草莓)[FragariaorientalisLozinsk.var.concolor(Kitag.)LiouetC.Y.Li]花瓣誘導(dǎo)再生植株和變異植株的研究，以期獲得具有優(yōu)良性狀和的抗逆性強的草莓新品種。通過近十余年試驗和栽培觀察，獲得了6個遺傳穩(wěn)定的優(yōu)良株系，又從這6個優(yōu)良株系種確定了1個優(yōu)質(zhì)、豐產(chǎn)及抗病力強，并可用于生產(chǎn)和推廣的新品種，暫定名為“長白1號”，栽培2年后發(fā)現(xiàn)該品種草莓植株嚴(yán)重矮化，葉片產(chǎn)生不規(guī)則黃色斑點，扭曲變形，匍匐莖數(shù)量逐年減少，繁殖率下降，果實變小，大幅度減產(chǎn)等現(xiàn)象。經(jīng)檢測該品種感染了草莓斑駁病毒和草莓皺縮病毒。草莓脫毒研究大多集中在莖尖脫毒、花藥培養(yǎng)脫毒、高溫處理和藥處理等方面，但均很難達(dá)到100%的脫毒率，莖尖脫毒采用0.30mm的莖尖，但0.3mm的莖尖脫毒效果雖好，但成活率低且達(dá)不到完全脫毒，而且剝離莖尖難度大，操作易被污染，所需時間較長，工作效率低。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是針對上述不足而提供一種脫毒效果更好的試管內(nèi)誘導(dǎo)草莓匍匐莖和高溫處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)脫毒方法。本發(fā)明的技術(shù)解決方案是試管內(nèi)誘導(dǎo)草莓匍匐莖和高溫處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)脫毒方法包括草莓的試管苗在試管內(nèi)培養(yǎng)基誘導(dǎo)匍匐莖，培養(yǎng)溫度(22士2)°C，培養(yǎng)3345d(天)；然后將帶有匍匐莖的試管苗在培養(yǎng)瓶中于溫度為5056°C的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行8085d高溫培養(yǎng)處理后，再切取0.51.Omm的莖尖在培養(yǎng)基中進(jìn)行莖尖愈傷組織誘導(dǎo)，溫度(24士2)°C，培養(yǎng)2835d；然后將莖尖愈傷組織轉(zhuǎn)接到培養(yǎng)基進(jìn)行愈傷組織芽苗再分化培養(yǎng)，溫度(24士2)°C，培養(yǎng)3040d得再生芽苗。將再生芽苗進(jìn)行病毒檢測，草莓斑駁病毒和皺縮病毒脫毒率達(dá)100%。生根、移栽成活率達(dá)97%以上。優(yōu)選方案是試管內(nèi)誘導(dǎo)草莓匍匐莖和高溫處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)脫毒方法包括草莓的試管苗在試管內(nèi)培養(yǎng)基誘導(dǎo)匍匐莖，培養(yǎng)溫度22°C，培養(yǎng)45天；然后將帶有匍匐莖的試管苗在培養(yǎng)瓶中于溫度為56°C的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行85天高溫培養(yǎng)處理后，再切取1.Omm的莖尖在培養(yǎng)基中進(jìn)行莖尖愈傷組織誘導(dǎo)，溫度24°C，培養(yǎng)30天；然后將莖尖愈傷組織轉(zhuǎn)接到培養(yǎng)基進(jìn)行愈傷組織芽苗再分化培養(yǎng)，溫度24°C，培養(yǎng)35天得再生芽苗。所述試管內(nèi)培養(yǎng)基為LS+6-BA1.OOmg·!^+GA3L90mg·I^+KTl.OOmg·Γ1。所述的莖尖愈傷組織誘導(dǎo)的培養(yǎng)基為MS+6-BA0.50mg·L^+NAAO.20mg·L—1。所述的愈傷組織芽苗再分化培養(yǎng)基為MS+6-BA1.OOmg·L^+NAAO.05mg·L—1。本發(fā)明的優(yōu)點是為了避免剝離極小莖尖的困難和可操作性難等問題，本發(fā)明在試管內(nèi)對試管苗進(jìn)行了匍匐莖的誘導(dǎo)，誘導(dǎo)率為99.5%以上，同時進(jìn)行了高溫處理結(jié)合較大莖尖(Imm)脫毒的方法對該新品種草莓進(jìn)行脫毒體系的建立。本發(fā)明試驗還采用均勻設(shè)計法對影響該新品種試管內(nèi)誘導(dǎo)匍匐莖發(fā)生的激素濃度配比和溫度及培養(yǎng)時間進(jìn)行優(yōu)化組合篩選，以期獲得試管內(nèi)誘導(dǎo)匍匐莖發(fā)生的最佳激素濃度配比和溫度及培養(yǎng)時間，并在試管內(nèi)利用適宜大小的莖尖進(jìn)行高溫處理獲得無病毒生產(chǎn)苗。為草莓等經(jīng)濟(jì)作物脫毒奠定基礎(chǔ)和提供新方法。該種方法是草莓脫毒苗工廠化快繁生產(chǎn)的一條簡便易行的脫毒實用方法，避免了以往莖尖培養(yǎng)與高溫處理相結(jié)合脫毒法存在的問題，脫毒率達(dá)100%，生根、移栽成活率達(dá)97%以上。下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的實施方式作進(jìn)一步詳細(xì)描述。具體實施例方式試管內(nèi)誘導(dǎo)草莓匍匐莖和高溫處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)脫毒方法1材料與方法1.1試材深山草莓花瓣愈傷組織誘導(dǎo)產(chǎn)生的優(yōu)質(zhì)、豐產(chǎn)性狀遺產(chǎn)穩(wěn)定的變異株系，其品種特性為植株大，生長健壯，多級花序，每支花序4-5朵花，花瓣易落，果形圓錐近心形。酸甜適中，香味濃郁。果皮紅色，富有光澤，韌性強，果皮硬度極大，含糖9.7-11.3%，可溶性固形物10.6-14.3%，維生素C129.4mg/100g,一級序平均單果重62.4g，最大果重90g?；ㄑ糠只托纬杀绕渌F(xiàn)有品種早，斷根處理能促進(jìn)花芽分化?；ㄆ鞔?，花粉量多，在低溫條件下畸形果比例少，大果、商品果比例極高(圖la，b)。1.2方法1.2.1匍匐莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基的篩選以LS為基本培養(yǎng)基，內(nèi)含蔗糖20g·Γ1,瓊脂粉7.Og·Ι^，再附加不同質(zhì)量濃度的細(xì)胞分裂素6-ΒΑ(由預(yù)試驗確定為1.001.50mg-L"1)、赤霉素GA3(由預(yù)試驗確定為1.201.80mg·L—1)和激動素KT(由預(yù)試驗確定為0.300.70mg·L-1)，調(diào)節(jié)pH為6.0，外植體在溫度(22士2)°C、光照強度25μmo1·m_2·s-1、光照周期ioh.d-1條件下培養(yǎng)，為了提高該新品種草莓試管苗匍匐莖的誘導(dǎo)速度和誘導(dǎo)率，采用均勻設(shè)計法，選用U10(103)均勻表，每個處理接種試管苗為30株，重復(fù)3次，誘導(dǎo)率取平均值?？疾?-BA、GA3*KT不同質(zhì)量濃度交叉配比對匍匐莖誘導(dǎo)率的影響，結(jié)果見表2。試管苗培養(yǎng)45d統(tǒng)計匍匐莖誘導(dǎo)率，篩選最適合新品種草莓試管苗匍匐莖誘導(dǎo)的培養(yǎng)基。1.2.2高溫結(jié)合莖尖脫毒以將帶有匍匐莖的試管苗接種于1/4LS培養(yǎng)基中，加入蔗糖IOg·ΙΛ瓊脂7.Og·L—1，調(diào)節(jié)PH為6.0，在溫度為3550°C條件下，培養(yǎng)3080d。為了提高試管苗匍匐莖尖的脫毒率，選用U11(II2)均勻表，每個處理接種莖尖數(shù)為30株，重復(fù)3次，脫毒率取平均值。同時考察培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間對脫毒率的影響，結(jié)果見表2。經(jīng)過處理的莖尖再切取1.Omm莖尖，在培養(yǎng)基MS+6-BA0.50mg·L^+NAAO.20mg·L—1中進(jìn)行莖尖愈傷組織培養(yǎng)，再將愈傷組織轉(zhuǎn)接到培養(yǎng)基MS+6-BA1.OOmg·L^+NAAO.05mg·L—1進(jìn)行愈傷組織芽苗再分化培養(yǎng)，將再生芽苗進(jìn)行病毒檢測，選擇無病毒苗用于栽培生產(chǎn)，同時確定最適合的脫毒條件。其中NAA為α-萘乙酸。1.3數(shù)據(jù)處理與分析采用均勻設(shè)計法進(jìn)行初步規(guī)律設(shè)計性試驗，數(shù)據(jù)分析處理應(yīng)用均勻設(shè)計軟件(UniformDesign3.0V)。2結(jié)果與分析2.1LS培養(yǎng)基中6-BA、GA3和KT濃度配比對草莓試管苗匍匐莖誘導(dǎo)的影響由表1試驗結(jié)果可得回歸方程7=-0.393-20.Li^+51.9J2+33.3不，樣本容量iV=10，顯著性水平a=0.05，經(jīng)計算，復(fù)相關(guān)系數(shù)=0.9939，剩余標(biāo)準(zhǔn)差·5=1.79，檢驗值Ft=163.6，臨界值尸(0.05,3,6)=4.t>F(Q.Q5，3，6)，表明回歸方程有意義。對各方程項進(jìn)行顯著性檢驗可知各方程項對7影響均顯著。根據(jù)回歸方程求出7的最優(yōu)組合為武=1.00，I2=L80，J3=O-70，在此組合基礎(chǔ)上求得最優(yōu)解:_f=96.3，此解為回歸方程的解析解，需按公式其中^為正態(tài)分布的雙側(cè)分位數(shù)，為剩余標(biāo)準(zhǔn)差)計算出優(yōu)化值區(qū)間估計為7=96.3士4.37，即91.93%100.67%。計算各方程項對回歸的貢獻(xiàn)值可知，《=97.0，U2=925，=193，即6-BA、GA3和KT對回歸的貢獻(xiàn)率為UjU=6.20%,UjU=59.1%，UjU=12.4%，說明GA3對草莓試管苗匍匐莖誘導(dǎo)的貢獻(xiàn)遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于6-BA和KT。又因6-BA與誘導(dǎo)率呈負(fù)相關(guān)，GA3和KT均與誘導(dǎo)率呈正相關(guān)，猜測GA3在1.SOmg·L—1以上有較高誘導(dǎo)率的峰值，又以TDZ為1.80、1.85、1.90、1.95和2.OOmg·L、6-BA為0.50,0.60,0.70,0.80、0.90和1.OOmg.Γ1以及KT為0.70,0.80,0.90和1.OOmg.L-1做了12個處理的試驗，發(fā)現(xiàn)GA3為1.90mg·Γ1和6-BA為1.OOmg·Γ1及KT為1.OOmg·Γ1時匍匐莖誘導(dǎo)率最高。因此，將新品種草莓試管苗接種到附加GA3L90mg·L-1和6-BA1.OOmg·L-1及KTl.OOmg·L-1的LS培養(yǎng)基上進(jìn)行試管苗匍匐莖誘導(dǎo)的驗證試驗，重復(fù)3次。培養(yǎng)10d，試管苗基部開始增粗；繼續(xù)培養(yǎng)至33d，從試管苗的苗心發(fā)出23條匍匐莖，33d后匍匐莖可長至2.Ocm以上，誘導(dǎo)率達(dá)99.5%以上，在估計區(qū)間內(nèi)，且比表1中10個處理的誘導(dǎo)率均高。因此，該新品種草莓試管苗匍匐莖誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為LS+6-BAl.OOmg-^+GA3L90mg-L^+KTl.OOmgL-1。表1草莓試管苗匍匐莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基的Ultl(102)均勻設(shè)計試驗安排與結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>2.2溫度和培養(yǎng)時間對草莓脫毒的影響根據(jù)表2試驗結(jié)果可得回歸方程7=-101+2.99^+0.608石，樣本容量iV=11，顯著性水平σ=0·05，經(jīng)計算，復(fù)相關(guān)系數(shù)=0.8579，剩余標(biāo)準(zhǔn)差5=10.3，檢驗值Fi=11.15，臨界值F(0.05；2；8)=4.459，F(xiàn)t>F(α(15，2，8)，回歸方程顯著。對各方程項進(jìn)行顯著性檢驗可知，各方程項對7影響均顯著。根據(jù)回歸方程求出7的最優(yōu)組合為不=50.0,J2=SO.0，在此組合基礎(chǔ)上求得最優(yōu)解:_F=97.2，此解為回歸方程的解析解，同理，按公式·5計算出優(yōu)化值區(qū)間估計為7=97.2士23.7，即73.5%120.9%。計算得各方程項對回歸的貢獻(xiàn)值和回歸貢獻(xiàn)率分別為-M1=2.06e+3，UJU=87.3%，U2=923，UjU=39.1%，即高溫溫度對脫毒率/的貢獻(xiàn)大于培養(yǎng)時間，通過回歸分析結(jié)果可知，溫度與培養(yǎng)時間均與脫毒率呈正相關(guān)。猜測處理溫度高于50°C和培養(yǎng)時間超過80d有較高的脫毒率，為此，又以溫度為50、53、56、57和60°C以及培養(yǎng)時間為80、85和90d做了10個處理的試驗，發(fā)現(xiàn)溫度為50V和培養(yǎng)時間為85d時脫毒率最高且苗在培養(yǎng)基中生長良好。因此，將帶有匍匐莖的試管苗在溫度為56°C的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)85d后切取1.Omm的莖尖在培養(yǎng)基MS+6-BA0.50mg-L"1+NAAO.20mg-Γ1中進(jìn)行莖尖愈傷組織培養(yǎng)，待莖尖完全脫分化形成愈傷組織后，再將愈傷組織切割成小塊轉(zhuǎn)接到培養(yǎng)基MS+6-BA1.OOmg·L^+NAAO.05mg·L—1進(jìn)行愈傷組織芽苗再分化培養(yǎng)，將再生芽苗進(jìn)行病毒檢測，草莓斑駁病毒和皺縮病毒脫毒率達(dá)100%。在估計區(qū)間內(nèi)，且比表2所列11個處理的脫毒率均高?？梢姡撔缕贩N草莓完全脫除斑駁病毒和皺縮病毒的最佳培養(yǎng)條件為將帶有匍匐莖的試管苗在培養(yǎng)瓶中于溫度為56°C的恒溫培養(yǎng)箱中處理85d。表2草莓高溫結(jié)合莖尖脫毒的U11(II2)因素及水平設(shè)計<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>待再生芽苗長至2.OOcm以上時，將芽苗從愈傷組織上切下，接種到1/2MS+IAA0.05mg-L"1培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，待根長至1.00cm，苗高達(dá)3.OOcm以上時，將生根苗從培養(yǎng)瓶中取出，在含有5mg-Γ1高錳酸鉀溶液中洗去根上殘留的瓊脂，然后植入經(jīng)100倍殺毒礬消毒過的田園土和河砂(3:1)混合的基質(zhì)中，用透光好的塑料薄膜覆蓋以保濕保溫，濕度保持在75%，溫度控制在(18士2)°C，每天自然光照9h，每天通風(fēng)換氣一次，7d后可揭去薄膜，每天傍晚噴灑清水1次，成活率達(dá)97%以上。待苗長至IOcm時(一般含有5片葉)，定植于畦上(嚴(yán)格防治蟲害)，每年取匍匐莖苗作為草莓生產(chǎn)苗，經(jīng)多年的栽培觀察，品種特性穩(wěn)定。栽培試驗同時證明了在試管內(nèi)進(jìn)行高溫處理結(jié)合莖尖脫毒方法是草莓脫毒和建立草莓無毒生產(chǎn)苗體系的一種可操作的實用方法。3結(jié)論與討論本試驗結(jié)果表明，培養(yǎng)基LS+6-BA1.OOmg·!^+GA3L90mg·I^+KTl.OOmg·I71對新品種草莓試管苗匍匐莖誘導(dǎo)的效果最好，誘導(dǎo)率達(dá)99.5%以上，這可能是適當(dāng)?shù)?-BA、GA3和KT可促進(jìn)并調(diào)節(jié)草莓試管苗向匍匐莖分化等原因。將帶有匍匐莖的試管苗在培養(yǎng)瓶中于溫度為56°C的恒溫培養(yǎng)箱中處理85d，可完全脫除草莓斑駁病毒和皺縮病毒，且草莓植株的器官形態(tài)較好，這可能是在封閉的培養(yǎng)瓶中有草莓生長和發(fā)育較適宜的濕度、營養(yǎng)物質(zhì)、生長調(diào)節(jié)物質(zhì)和自身內(nèi)源激素等物質(zhì)的調(diào)節(jié)作用所致。目前，草莓脫毒研究大多集中在莖尖脫毒、花藥培養(yǎng)脫毒、高溫處理和藥處理等方面。莖尖脫毒需采用0.30mm莖尖，且莖尖越小脫毒效果越好，但成活率低，況且剝離莖尖難度大，操作易被污染，所需時間較長，工作效率低；高溫脫毒法是利用病毒粒子不耐高溫的特點，使用高溫使病毒粒子鈍化失活的原理來滅活病毒。高溫脫毒后的脫毒率僅60%70%。由于溫度難以控制且各病毒對溫度的敏感范圍不同很難控制。況且高溫處理時間長、效果差，長時間在高溫下的草毒無濕度保障、營養(yǎng)失調(diào)和根部上熱等導(dǎo)致植株死亡，植株不易分化匍匐莖或匍匐莖生長不良，操作很麻煩；通過草莓花藥愈傷組織誘導(dǎo)再生植株的途徑被作為脫毒手段以來，國內(nèi)外不少單位進(jìn)行了草莓花藥培養(yǎng)的研究，并培育了春夏秋冬香、寶交、早生、達(dá)娜等品種的花藥脫毒苗。盡管多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，花藥培養(yǎng)的脫毒率為100%。但有些學(xué)者發(fā)現(xiàn)花藥培養(yǎng)的脫毒率雖然很高，但并不能達(dá)到100%，并發(fā)現(xiàn)花藥培養(yǎng)的植株帶輕型黃邊病毒，這可能是花藥培養(yǎng)達(dá)不到完全脫毒的原因；而抗病毒藥劑法是一種新的脫毒方法，其作用原理是將草莓莖尖在三氮唑核苷(病毒唑)、5-二氫尿嘧啶(DHT)和雙乙酰-二氫-5-氮尿嘧啶(DA-DHT)等抗病毒藥劑于三磷酸狀態(tài)下處理嫩莖，切取莖尖，再進(jìn)行組織培養(yǎng)誘導(dǎo)再生植株的方法，這樣可阻止病毒RNA帽子結(jié)構(gòu)形成。但此方法涉及到所用藥劑的選擇性、藥劑對草莓植株遺傳物質(zhì)的改變和藥劑在草莓植株體內(nèi)的殘留等問題有待于進(jìn)一步深入研究。相對于以上方法莖尖培養(yǎng)與熱處理結(jié)合脫毒，是草莓較好的脫毒方法，許多對其進(jìn)行了廣泛的研究。但得到的脫毒效果不盡相同，但均達(dá)到90%以上，這可能與熱處理方式、莖尖大小和品種有關(guān)?？梢姡o尖培養(yǎng)與高溫處理相結(jié)合比單純的高溫處理或莖尖培養(yǎng)脫毒率高得多。但此種莖尖培養(yǎng)與熱處理結(jié)合脫毒的方法存在高溫處理的溫度低病毒鈍化率低，處理后莖尖外植體消毒難且經(jīng)過消毒的莖尖成活率極低，不易操作。為此，本研究對莖尖培養(yǎng)與熱處理結(jié)合脫毒的方法進(jìn)行改良，即利用深山草莓花瓣誘導(dǎo)產(chǎn)生的已感染了斑駁病毒和皺縮病毒的新品種草莓的試管苗在試管內(nèi)誘導(dǎo)匍匐莖，然后將帶有匍匐莖的試管苗在試管內(nèi)直接進(jìn)行高溫處理，高溫處理后再切取Imm的莖尖進(jìn)行培養(yǎng)誘導(dǎo)無毒再生植株的方法，并通過多次試驗、病毒檢測和栽培觀察脫毒率達(dá)100%。證明了該種方法是草莓脫毒苗工廠化快繁生產(chǎn)的一條簡便易行的脫毒實用方法，避免了以往莖尖培養(yǎng)與高溫處理相結(jié)合脫毒法存在的問題。同時本試驗應(yīng)用均勻設(shè)計法處理和分析數(shù)據(jù)，縮短了試管內(nèi)誘導(dǎo)匍匐莖發(fā)生和溫度及培養(yǎng)時間的篩選周期。在加大科研力量培育出優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、多抗的草莓新品種的同時。還要積極開展草莓脫毒研究，本研究結(jié)果可能對其它種草莓的脫毒和工廠化育苗有一定的參考意義。權(quán)利要求一種試管內(nèi)誘導(dǎo)草莓匍匐莖和高溫處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)脫毒方法，其特征在于包括草莓的試管苗在試管內(nèi)培養(yǎng)基誘導(dǎo)匍匐莖，培養(yǎng)溫度20-24℃，培養(yǎng)33～45天；然后將帶有匍匐莖的試管苗在培養(yǎng)瓶中于溫度為50～56℃的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行80～85天高溫培養(yǎng)處理后，再切取0.5～1.0mm的莖尖在培養(yǎng)基中進(jìn)行莖尖愈傷組織誘導(dǎo)，溫度22-26℃，培養(yǎng)28～35天；然后將莖尖愈傷組織轉(zhuǎn)接到培養(yǎng)基進(jìn)行愈傷組織芽苗再分化培養(yǎng)，溫度22-26℃，培養(yǎng)30～40天得再生芽苗。2.按照權(quán)利要求1所述的試管內(nèi)誘導(dǎo)草莓匍匐莖和高溫處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)脫毒方法，其特征在于草莓的試管苗在試管內(nèi)培養(yǎng)基誘導(dǎo)匍匐莖，培養(yǎng)溫度22°C，培養(yǎng)45天；然后將帶有匍匐莖的試管苗在培養(yǎng)瓶中于溫度為56°C的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行85天高溫培養(yǎng)處理后，再切取1.Omm的莖尖在培養(yǎng)基中進(jìn)行莖尖愈傷組織誘導(dǎo)，溫度24°C，培養(yǎng)30天；然后將莖尖愈傷組織轉(zhuǎn)接到培養(yǎng)基進(jìn)行愈傷組織芽苗再分化培養(yǎng)，溫度24°C，培養(yǎng)35天得再生芽田ο3.按照權(quán)利要求1或2所述的試管內(nèi)誘導(dǎo)草莓匍匐莖和高溫處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)脫毒方法，其特征在于試管內(nèi)培養(yǎng)基為LS+6-BA1.OOmg·!^+GA3L90mg·L^+KTl.OOmg·Γ1。4.按照權(quán)利要求1或2所述的試管內(nèi)誘導(dǎo)草莓匍匐莖和高溫處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)脫毒方法，其特征在于莖尖愈傷組織誘導(dǎo)的培養(yǎng)基為MS+6-BA0.50mg·L^+NAAO.20mg·L—1。5.按照權(quán)利要求1或2所述的試管內(nèi)誘導(dǎo)草莓匍匐莖和高溫處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)脫毒方法，其特征在于愈傷組織芽苗再分化培養(yǎng)基為MS+6-BA1.OOmg·L^+NAAO.05mg·L—1。全文摘要試管內(nèi)誘導(dǎo)草莓匍匐莖和高溫處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)脫毒方法是在試管內(nèi)對深山草莓花瓣愈傷組織分化產(chǎn)生的優(yōu)良變異新品種的試管苗進(jìn)行匍匐莖誘導(dǎo)，并采取試管內(nèi)高溫結(jié)合莖尖對該品種進(jìn)行脫毒研究，獲得可用于生產(chǎn)的無病毒草莓種苗。該方法得到新品種在試管內(nèi)培養(yǎng)基誘導(dǎo)匍匐莖，誘導(dǎo)率為99.5%以上；將含有匍匐莖的試管苗在試管內(nèi)于56℃條件下培養(yǎng)85d后，切取1mm的莖尖在培養(yǎng)基中進(jìn)行莖尖愈傷組織誘導(dǎo)，然后將莖尖愈傷組織轉(zhuǎn)接到培養(yǎng)基進(jìn)行愈傷組織芽苗再分化培養(yǎng)，將再生芽苗進(jìn)行病毒檢測，脫毒率為100%。試驗結(jié)果證明，可利用在試管內(nèi)高溫處理結(jié)合莖尖脫毒的方法完全脫除病毒，從而建立草莓脫毒體系。文檔編號A01H4/00GK101803569SQ20101013342公開日2010年8月18日申請日期2010年3月26日優(yōu)先權(quán)日2010年3月26日發(fā)明者馮穎,姜云天,孫忠林,朱俊義,田亮,羅景華,陸爽,顧地周申請人:通化師范學(xué)院