專利名稱：定向誘導(dǎo)合成金屬硫蛋白的工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，尤其是涉及一種定向誘導(dǎo)合成金屬硫蛋白及分離純化工藝。
背景技術(shù)：
金屬硫蛋白是一種含有大量CM和Zn的蛋 白質(zhì),廣泛存在于生物體內(nèi)。金屬硫蛋白相對分子質(zhì)量600(Γ10000，富含氨基酸和半胱氨酸，并能大量結(jié)合金屬離子，具有很強(qiáng)的生物活性。大量研究結(jié)果表明，金屬硫蛋白有下列功能I、清除自由基，措抗電尚福射；2、參與微量元素的貯存、運(yùn)輸和代謝；3、重金屬的解毒作用；4、參與激素和發(fā)育過程的調(diào)節(jié)，增強(qiáng)機(jī)體對各種應(yīng)激反應(yīng)；5、參與細(xì)胞DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄,蛋白質(zhì)的合成與分解，以及能量代謝的調(diào)節(jié)過程。201110076199. 2公開了一種蟲草金屬硫蛋白的生產(chǎn)方法。生產(chǎn)步驟為蟲草菌一液體培養(yǎng)一過濾一含金屬硫蛋白菌體一研磨一有機(jī)物變性一去雜蛋白一加熱變性一除變性蛋白一超濾濃縮一層析一冷凍干燥成品。201110063616. X公開了嗜冷紅酵母中金屬硫蛋白的制備工藝,工藝過程為菌株篩選一培養(yǎng)一細(xì)胞破壁一凝膠過濾一離子層析一冷凍干燥成品。200910308720. 3公開了從家蠅幼蟲中誘導(dǎo)并提取金屬硫蛋白的方法。該方法利用富含金屬離子生物誘導(dǎo)劑的培養(yǎng)基加入家蠅幼蟲培育出成蟲，再經(jīng)漂洗、滅菌、均漿、膜過濾、分離、濃縮、冷凍干燥成品。01128543. 5公開了液體涂層發(fā)酵轉(zhuǎn)基因工程菌生產(chǎn)人或動物金屬硫蛋白制品的方法。該方法是將轉(zhuǎn)基因工程菌通過深層發(fā)酵、培養(yǎng)工程菌、過濾、洗滌、冷凍干燥成品。200910309136. X公開了一種富鋅黃粉蟲的飼養(yǎng)方法，該方法包括幼蟲養(yǎng)殖、富鋅養(yǎng)殖，大齡黃粉蟲用硫酸鋅水溶液飼喂得富鋅黃粉蟲。200910309135. 5公開了一種富硒黃粉蟲的飼養(yǎng)方法，該方法包括幼蟲養(yǎng)殖、富硒養(yǎng)殖，大齡黃粉蟲用亞硒酸鈉水飼喂，得富硒黃粉蟲。01131966. 6公開了金屬硫蛋白的制備方法，該方法選擇金屬硫蛋白工程菌，接種于培養(yǎng)液，收集菌體，超聲破碎，層析分離，梯度洗脫，收集目標(biāo)蛋白。金屬硫蛋白是一種用途廣泛的金屬蛋白物，但是由于來源的局限性，科技人員一直在研究開發(fā)產(chǎn)生金屬硫蛋白的原料，產(chǎn)率和效率是一個長期關(guān)注的問題。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有金屬硫蛋白來源的局限性，本發(fā)明提供一種定向誘導(dǎo)合成金屬硫蛋白的工藝。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的1、選擇合適的原材料配制培養(yǎng)基；2、培養(yǎng)基二次發(fā)酵復(fù)制；3、九龍蟲蟲卵培殖；4、九龍蟲蟲卵植入復(fù)制培養(yǎng)基中；5、超聲波振蕩培育；6、九龍蟲成蟲處理；7、微濾與超濾；8、超聲駐波液相制備色譜分離純化；9、冷凍干燥至成品；具體步驟如下
(O選擇合適的原材料配制培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基由IOOOg麥麩或米糠、5(T200g大豆豆粉、0 20g 賴氨酸、0 20g 甘氨酸、l(T80g 胱氨酸、l(T20gCuS04、5 20gNaCl、(T20gCdS04、0 10gCaS04、OlOgZnSO4 混合而成；
(2)上述培養(yǎng)基噴淋去離子水，保持溫度25 45°C，時間48 120h，使培養(yǎng)基充分發(fā)酵；
(3)將九龍蟲雄蟲與雌蟲按23比例混合，保持溫度25 30°C，濕度60 85%，雄蟲與雌蟲交配5 7天產(chǎn)卵，蟲卵在8 12天孵化出幼蟲，收集幼蟲；
(4)將5 8g幼蟲置于前述的發(fā)酵培養(yǎng)基中，保持溫度2(T30°C、濕度6(Γ85%培養(yǎng)，待幼蟲第一次脫皮后超聲波振蕩培育；
(5)待幼蟲脫皮6次后的第4飛天，收集九龍蟲幼蟲，用去離子水清洗，甩干九龍蟲幼蟲表面水分；
(6)甩干的九龍蟲幼蟲搗碎，加熱8(Γ100 ，時間5 10min，離心分離，收集分離液；
(7)分離液進(jìn)行微濾與超濾處理，收集濃縮液；
(8)100mL濃縮液溶于100(T2000mL溶劑體系中，泵入超聲駐波液相制備色譜里連續(xù)分尚純化金屬硫蛋白；
(9)將分離純化的金屬硫蛋白冷凍干燥至成品。本發(fā)明根據(jù)金屬硫蛋白化學(xué)成份與結(jié)構(gòu)特征，選擇并配制合適的培養(yǎng)基；以九龍蟲蟲卵作為生物合成的載體，隨著九龍蟲生長過程，采用化學(xué)成分，超聲波定向催化使得九龍蟲機(jī)體大量合成金屬硫蛋白，該金屬硫蛋白為白色或微黃色凍干品，相對分子量6800Da,分子直徑50A，等電點(diǎn)為4，含量為90-99%。本發(fā)明不僅為金屬硫蛋白生產(chǎn)提供了一種新的工藝，而且由于分離過程的特殊性，確保了金屬硫蛋白的生物活性，具有工業(yè)化生產(chǎn)的價值。
具體實(shí)施例方式下面通過實(shí)施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步描述。實(shí)施例I :
(1)取IOOOg麥麩，100 200g大豆豆粉，10 20g賴氨酸，50 80g胱氨酸，10 15gCuS04，5 IOgNaCl,及l(fā)(T20gCdS04，5 IOg CaSO4混合均勻成為培養(yǎng)基；
(2)上述培養(yǎng)基噴淋50(Tl000mL去離子水，保持溫度25 45°C，時間48 120h，培養(yǎng)基充分發(fā)酵；
(3)選羽化后1(Γ20天的九龍蟲，將雄蟲與雌蟲按2:3比例混合，保持溫度25 30°C，濕度6(Γ85%，雄蟲與雌蟲交配5 7天產(chǎn)卵，蟲卵在8 12天孵化出幼蟲，收集幼蟲；
(4)將5 8g幼蟲置前述的發(fā)酵培養(yǎng)基中，保持溫度2(T30°C、濕度6(Γ85%培養(yǎng)，待幼蟲第一次脫皮后，用超聲波發(fā)生器在頻率25(T500kHz、功率O. Γ0. 5kw超聲處理2 lOmin，每間隔8 IOh重復(fù)超聲處理一次，幼蟲培育周期5(T80d ；
(5)待幼蟲脫皮6次后的第4飛天，收集九龍蟲幼蟲，IOOOg九龍蟲幼蟲用2L 10L去離子水清洗3次，甩干九龍蟲幼蟲表面水分；
(6)甩干的九龍蟲幼蟲放入組織搗碎勻漿機(jī)中以1000(Tl5000r/min搗碎，加熱8(Tl00°C，時間5 lOmin，離心機(jī)75(Tl250r/min分離，收集分離液；
(7)分離液用膜孔徑O.5^1. O μ m微孔膜過濾機(jī)過濾，再用膜孔徑l(Tl20nm超濾機(jī)濃縮，收集濃縮液；
(8)IOOmL濃縮液溶于由質(zhì)量比4. 5%PEG6000-質(zhì)量比8. 0%葡萄糖T600組成的100(T2000mL溶劑體系中，泵入超聲駐波液相制備色譜里，以超聲頻率50(Tl000kHz、功率O. I"!. 5kw、流速2(Tl00ml/min、紫外檢測器波長220nm連續(xù)分離純化金屬硫蛋白；
(9)將分離純化的金屬硫蛋白用真空冷凍干燥機(jī)在真空度l(T50kpa、溫度-3(T50°C、時間15 24h干燥含水份5 6%為成品，金屬硫蛋白含量為96. 5%。實(shí)施例2(1)取IOOOg 米糠，5(Tl00g 大豆蛋白粉，l(T20g 甘氨酸，l(T20g 胱氨酸，l(T20gCuS04，l(T20gNaCl，l(T20gZnS04充分混合成為培養(yǎng)基；
(2)上述培養(yǎng)基噴淋50(Tl000mL去離子水，保持溫度25 45°C，時間48 120h，培養(yǎng)基充分發(fā)酵；
(3)選羽化后1(Γ20天的九龍蟲，將雄蟲與雌蟲按2:3比例混合，保持溫度25 30°C，濕度6(Γ85%，雄蟲與雌蟲交配5 7天產(chǎn)卵，蟲卵在8 12天孵化出幼蟲，收集幼蟲；
(4)將5 8g幼蟲置前述的發(fā)酵培養(yǎng)基中，保持溫度2(T30°C、濕度6(Γ85%培養(yǎng)，待幼蟲第一次脫皮后，用超聲波發(fā)生器在頻率25(T500kHz、功率O. Γ0. 5kw超聲處理2 lOmin，每間隔8 IOh重復(fù)超聲處理一次，幼蟲培育周期5(T80d ；
(5)待幼蟲脫皮6次后的第4飛天，收集九龍蟲幼蟲，IOOOg九龍蟲幼蟲用2L 10L去離子水清洗3次，甩干九龍蟲幼蟲表面水分；
(6)甩干的九龍蟲幼蟲放入組織搗碎勻漿機(jī)中以1000(Tl5000r/min搗碎，加熱8(Tl00°C，時間5 lOmin，離心機(jī)75(Tl250r/min分離，收集分離液；
(7)分離液用膜孔徑O.5^1. O μ m微孔膜過濾機(jī)過濾，再用膜孔徑l(Tl20nm超濾機(jī)濃縮，收集濃縮液；
(8)IOOmL濃縮液溶于100(T2000mL由亞丁醇-乙醚-水按照10 5 12體積比組成的溶劑體系中，注入超聲駐波液相制備色譜中，超聲頻率50(Tl000kHz，功率O. Γ1. 5kw，流速2(Tl00ml/min,紫外檢測器波長220nm,連續(xù)分離純化金屬硫蛋白；
(9)將分離純化的金屬硫蛋白用真空冷凍干燥機(jī)在真空度l(T50kPa、溫度-3(T50°C、時間15 24h干燥含水份5 6%為成品，金屬硫蛋白含量為97. 1%。
權(quán)利要求
1.定向誘導(dǎo)合成金屬硫蛋白的工藝，其特征在于所述工藝如下 (O選擇合適的原材料配制培養(yǎng)基； (2)上述培養(yǎng)基噴淋去離子水，保持溫度25 45°C，時間48 120h，使培養(yǎng)基充分發(fā)酵； (3)將九龍蟲雄蟲與雌蟲按23比例混合，保持溫度25 30°C，濕度60 85%，雄蟲與雌蟲交配5 7天產(chǎn)卵，蟲卵在8 12天孵化出幼蟲，收集幼蟲； (4)將5 8g幼蟲置于前述的發(fā)酵培養(yǎng)基中，保持溫度2(T30°C、濕度6(Γ85%培養(yǎng)，待幼蟲第一次脫皮后超聲波振蕩培育； (5)待幼蟲脫皮6次后的第4飛天，收集九龍蟲幼蟲，用去離子水清洗，甩干九龍蟲幼蟲表面水分； (6)甩干的九龍蟲幼蟲搗碎，加熱8(Γ100 ，時間5 10min，離心分離，收集分離液； (7)分離液進(jìn)行微濾與超濾處理，收集濃縮液； (8)100mL濃縮液溶于100(T2000mL溶劑體系中，泵入超聲駐波液相制備色譜里連續(xù)分尚純化金屬硫蛋白； (9)將分離純化的金屬硫蛋白冷凍干燥至成品。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的定向誘導(dǎo)合成金屬硫蛋白的工藝，其特征在于所述步驟(I)中，培養(yǎng)基由IOOOg麥麩或米糠、5(T200g大豆豆粉、0 20g賴氨酸、0 20g甘氨酸、l(T80g胱氨酸、10 20gCuS04、5 20gNaCl、(T20gCdS04、(Tl0gCaS04、(r20gZnS04 混合而成。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的定向誘導(dǎo)合成金屬硫蛋白的工藝，其特征在于所述培養(yǎng)基由IOOOg 麥麩、10(T200g 大豆豆粉、l(T20g 賴氨酸、50 80g 胱氨酸、l(Tl5gCuS04、5 lOgNaCl、10 20gCdS04、5 IOg CaSO4 混合而成。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的定向誘導(dǎo)合成金屬硫蛋白的工藝，其特征在于所述培養(yǎng)基由IOOOg米糠、50 100g大豆蛋白粉、10 20g甘氨酸、10 20g胱氨酸、10 20gCuS04、l(T20gNaCl、l(T20gZnS04 混合而成。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的定向誘導(dǎo)合成金屬硫蛋白的工藝，其特征在于所述步驟(4)中，每間隔8 10h重復(fù)超聲處理一次，幼蟲培育周期5(T80d，超聲波振蕩頻率為250 500kHz，功率為 O. Γθ. 5kw，時間為 2 lOmin。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的定向誘導(dǎo)合成金屬硫蛋白的工藝，其特征在于所述步驟(7)中，分離液用膜孔徑O. 5^1. O μ m微孔膜過濾機(jī)過濾，再用膜孔徑l(Tl20nm超濾機(jī)濃縮。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的定向誘導(dǎo)合成金屬硫蛋白的工藝，其特征在于所述步驟(8)中，溶劑體系由質(zhì)量比4. 5%PEG6000-質(zhì)量比8. 0%葡萄糖T600組成。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的定向誘導(dǎo)合成金屬硫蛋白的工藝，其特征在于所述步驟(8)中，溶劑體系由亞丁醇-乙醚-水按照10 5 12體積比組成。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的定向誘導(dǎo)合成金屬硫蛋白的工藝，其特征在于所述步驟(8)中，超聲頻率50(Tl000kHz，功率O. Γ1. 5kw，流速2(Tl00ml/min，紫外檢測器波長220nm。
10.根據(jù)權(quán)利要求I所述的定向誘導(dǎo)合成金屬硫蛋白的工藝，其特征在于所述步驟(9)中，分離純化的金屬硫蛋白用真空冷凍干燥機(jī)在真空度l(T50kPa、溫度-3(T50°C、時間15 24h干燥含水份5 6%為成品。
全文摘要
定向誘導(dǎo)合成金屬硫蛋白的工藝，屬于生物工程領(lǐng)域。針對現(xiàn)有金屬硫蛋白來源的局限性，本發(fā)明的定向誘導(dǎo)合成金屬硫蛋白的工藝是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的1、選擇合適的原材料配制培養(yǎng)基；2、培養(yǎng)基二次發(fā)酵復(fù)制；3、九龍蟲蟲卵培殖；4、九龍蟲蟲卵植入復(fù)制培養(yǎng)基中；5、超聲波振蕩培育；6、九龍蟲成蟲處理；7、微濾與超濾；8、超聲駐波液相制備色譜分離純化；9、冷凍干燥至成品。本發(fā)明不僅為金屬硫蛋白生產(chǎn)提供了一種新的工藝，而且由于分離過程的特殊性，確保了金屬硫蛋白的生物活性，具有工業(yè)化生產(chǎn)的價值。
文檔編號A01K67/033GK102786591SQ201210315550
公開日2012年11月21日 申請日期2012年8月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月31日
發(fā)明者徐華民, 徐萌, 趙艷琨, 趙榮華 申請人:哈爾濱工業(yè)大學(xué)