專利名稱：具有美白功能的小球藻類金屬硫蛋白的提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及小球藻類金屬硫蛋白的制備及其美白功能的試驗(yàn)方法，特別是涉及ー種具有美白功能的小球藻類金屬硫蛋白的提取方法。
背景技術(shù)：
金屬硫蛋白(metallothioneins, MTs)是ー類低分子量、高巰基含量,且能大量結(jié)合金屬離子的蛋白質(zhì)。由于MTs具有特殊的分子結(jié)構(gòu)和氨基酸組成，該類蛋白質(zhì)具有抗氧化、抗輻射、排出體內(nèi)重金屬離子等生理功能。但目前MTs大多從哺乳動物中誘導(dǎo)提取，其產(chǎn)品制備成本高、技術(shù)難度大，造成MTs價(jià)格昂貴。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)在植物、原核藻類
和真核微生物中都有MTs的存在，雖然它們在正常生物體環(huán)境中通常含量很低，但可誘導(dǎo)提高其含量。故本發(fā)明采用生長周期短、對鋅脅迫敏感，且易于培養(yǎng)和分離的普通海洋小球藻{Chlorella vulgaris)為原材料,通過脅迫、提取和分離エ藝的優(yōu)化,可從小球藻中制取大量類金屬硫蛋白。目前國內(nèi)外主要是通過以下方法來制備金屬硫蛋白(1)以硫酸鋅誘導(dǎo)動物，以其肝組織為原料進(jìn)行MTs提取。如周攀登在《廣東化工》2011，12 (38) :187-188,報(bào)道的以硫酸鋅誘導(dǎo)家兔肝組織產(chǎn)生MTs，采取超濾、凝膠層析和離子交換方法對金屬硫蛋白進(jìn)行純化，制備其精品。這種方法的優(yōu)點(diǎn)在于利用人體所需的微量元素Zn，但其生產(chǎn)成本昂貴。(2)通過重金屬誘導(dǎo)微生物獲得MTs，如李明春在《南開大學(xué)學(xué)報(bào)》2003，36 (3) : 123-128，報(bào)道通過Cu2+誘導(dǎo)假絲酵母獲得類金屬硫蛋白。利用第二種方法獲得的類金屬硫蛋白成本比動物誘導(dǎo)(即第一種方法)的要低，但由于培養(yǎng)基物質(zhì)復(fù)雜，操作難度高。綜上所述，目前金屬硫蛋白的提取要么以動物為原料，其生產(chǎn)成本高且不符合國際上對動物保護(hù)的要求；要么以微生物為原材料，其微生物培養(yǎng)及蛋白分離提取較為困難。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種生產(chǎn)成本低、適用于エ業(yè)化生產(chǎn)的具有美白功能的小球藻類金屬硫蛋白的提取方法，并對該蛋白進(jìn)行美白功能試驗(yàn)。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)解決方案是
本發(fā)明是ー種具有美白功能的小球藻類金屬硫蛋白的提取方法，它包括以下步驟
(1)利用O.05 mol/L的ZnCl2誘導(dǎo)處于對數(shù)生長期的普通海洋小球藻ipdorellavulgaris),培養(yǎng)24-120 h后，考察不同鋅脅迫濃度及培養(yǎng)不同時(shí)間對藻細(xì)胞內(nèi)鋅結(jié)合類金屬硫蛋白誘導(dǎo)量的影響，確定ZnCl2的最佳誘導(dǎo)濃度和誘導(dǎo)時(shí)間；
(2)根據(jù)步驟(I)確定的最佳ZnCl2脅迫濃度和脅迫時(shí)間，大量培養(yǎng)小球藻，取離心收集的藻細(xì)胞，按藻泥重量和提取液體積以1:10 (w/v)的比例加入pH值為7. 8的Tris-HCl緩沖液，進(jìn)行超聲波細(xì)胞破碎，經(jīng)高速離心棄去沉淀，收集上清液；
(3)上清液過層析柱G-75，每10min收集一管洗脫液，測定254 nm的吸光度值，并測定各收集管的鋅含量，以第二個(gè)信號峰即254 nm吸收信號弱而鋅信號強(qiáng)的組分峰為目標(biāo)峰，確定類金屬硫蛋白在G-75洗脫分離的收集時(shí)間段，收集的組分經(jīng)真空冷凍干燥即為類金屬硫蛋白粗提物；
(4)獲得的類金屬硫蛋白粗提物用超純水復(fù)溶后，過層析柱G-25進(jìn)行脫鹽，再次真空冷凍干燥后即得到類金屬硫蛋白制品；
(5)通過酪氨酸酶進(jìn)行單酚酶和ニ酚酶的酶活性抑制率試驗(yàn)，確定類金屬硫蛋白的美白功能。步驟(I)中最佳ZnCl2脅迫濃度和最佳誘導(dǎo)時(shí)間的確定方法如下利用凝膠色譜與電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用的檢測手段，以鋅檢測信號及對應(yīng)的蛋白質(zhì)分子量大小確定小球藻鋅結(jié)合類金屬硫蛋白峰在色譜曲線上的位置，以鋅信號強(qiáng)度代表鋅結(jié)合類金屬硫蛋白的誘導(dǎo)量，確定最佳的鋅脅迫濃度和誘導(dǎo)時(shí)間。步驟(2)中藻細(xì)胞破碎時(shí)，以藻泥重量與緩沖液體積按1:10 (w/v)的比例加入，緩沖液由內(nèi)含1% ニ硫蘇糖醇、pH為7. 8的10 mmol/L Tris-HCl組成；進(jìn)行藻細(xì)胞破碎時(shí)， 破碎過程采用間歇式進(jìn)行，用顯微鏡觀察直至細(xì)胞破碎完全。步驟(3)中以固定間隔時(shí)間連續(xù)收集經(jīng)G-75分離的洗脫液，檢測每一收集管洗脫液在254 nm的吸光度值和鋅信號值，以收集管序號為橫坐標(biāo)、以254 nm和鋅信號值為縱坐標(biāo)作圖，可得到兩個(gè)組分峰，第一個(gè)峰的254 nm吸光度值高而鋅的信號值低，第二個(gè)峰的254 nm吸光度值低而鋅的信號值高，因此第二個(gè)峰對應(yīng)的組分即類金屬硫蛋白的目標(biāo)物。本發(fā)明采用氯化鋅脅迫培養(yǎng)普通海洋小球藻，通過不同鋅脅迫濃度和脅迫時(shí)間的考察，可獲得類金屬硫蛋白的最優(yōu)誘導(dǎo)條件，通過提取、分離和純化過程，得到類金屬硫蛋白制品。通過抑制酪氨酸酶活性試驗(yàn)證明，小球藻類金屬硫蛋白濃度為1.2 mg/mL時(shí),能使ニ酚酶的活性下降87%，使單酚酶在2300秒內(nèi)未呈現(xiàn)出活性，說明該蛋白質(zhì)具有良好的美白功能。下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)ー步的說明。


圖I為ZnCl2脅迫濃度和脅迫時(shí)間與鋅結(jié)合類金屬硫蛋白的關(guān)系 圖2為提取鋅結(jié)合類金屬硫蛋白經(jīng)凝膠層析柱G-75分離的鋅檢測信號與紫外檢測信號的洗脫曲線 圖3為單酚酶的美白功能試驗(yàn)結(jié)果 圖4為ニ酚酶的美白功能試驗(yàn)結(jié)果圖。具體實(shí)驗(yàn)方式
本發(fā)明是ー種具有美白功能的小球藻類金屬硫蛋白的提取方法，以下是本發(fā)明的幾個(gè)具體實(shí)例，它包括以下エ藝步驟
實(shí)施例I
I)在處于對數(shù)生長期的小球藻藻液中加入O. 05 mol/L氯化鋅，控制鋅在藻液中的最終濃度為5-100 MmoI/L范圍內(nèi)，繼續(xù)培養(yǎng)小球藻24-120 h，培養(yǎng)過程中每天定時(shí)手工搖瓶5次，姆次約3 min。取培養(yǎng)組小球藻藻液各100 mL,經(jīng)10000 r/min離心,收集藻細(xì)胞,分別用5 mmol/L EDTA_2Na和超純水清洗藻細(xì)胞2次，加入10 mmol/L Tris-HCl緩沖液5 mL,冰浴下超聲波破碎藻細(xì)胞5 min,經(jīng)12000 r/min離心10 min,收集上清液。
2)利用 TSK-gel 凝膠色譜柱(G3000PWxl, 7. 8 mm i. d. X 300 mm, 6 μ m)進(jìn)行色譜分離，以10 mmol/L Tris-HCl緩沖液為流動相，洗脫液經(jīng)電感耦合等離子體質(zhì)譜在線檢測鋅信號強(qiáng)度，以鋅信號為縱坐標(biāo)、保留時(shí)間為橫坐標(biāo)作色譜流出曲線圖，通過鋅信號峰與對應(yīng)蛋白質(zhì)分子量確定小球藻鋅結(jié)合類金屬硫蛋白峰在色譜曲線上的位置。如圖I所示，獲得不同鋅脅迫濃度和不同誘導(dǎo)時(shí)間小球藻鋅結(jié)合類金屬硫蛋白的誘導(dǎo)量，以確定鋅脅迫的濃度和脅迫時(shí)間。3)在確定的培養(yǎng)條件下大量培養(yǎng)小球藻，離心收集藻細(xì)胞后，分別用5 mmol/LEDTA-2Na和超純水清洗藻細(xì)胞2次，以除去細(xì)胞壁吸附的鋅。按藻泥重量和提取液體積1:10 (w/v)的比例加入內(nèi)含1% ニ硫蘇糖醇、pH為7. 8的10 mmol/L Tris-HCl,冰浴下采用間歇式超聲波破碎藻細(xì)胞，破碎過程用顯微鏡檢查直至細(xì)胞破碎完全。然后經(jīng)12000 r/min離心10 min,收集上清液。4)將上清液注入凝膠層析柱G-75 ( Φ3.0Χ80 cm),以pH為7. 8的10 mmol/LTris-HCl為洗脫液，以固定每10 min連續(xù)收集經(jīng)G-75分離的洗脫液，檢測每一收集管洗脫液在254 nm的吸光度值和鋅信號值，以收集管序號為橫坐標(biāo)、以254 nm和鋅信號值為縱坐標(biāo)作圖。如圖2所示，可得到兩個(gè)組分峰，第一個(gè)峰的254 nm吸光度值高而鋅的信號值低，·第二個(gè)峰的254 nm吸光度值低而鋅的信號值高，因此第二個(gè)峰對應(yīng)的組分即類金屬硫蛋白的目標(biāo)物，收集過程中通入惰性氣體，如氮?dú)饣驓鍤?，以防止樣品被氧化?)將G-75收集組分經(jīng)真空冷凍干燥后，復(fù)溶于超純水中，過G-25脫鹽柱(Φ I. 5X30 cm)，用純水脫鹽純化，收集鋅結(jié)合蛋白質(zhì)組分并經(jīng)真空冷凍干燥即得到具有美白功能的小球藻類金屬硫蛋白制品。6)通過抑制酪氨酸酶活性試驗(yàn)，證明該提取蛋白具有美白功能。實(shí)施例2
O向處于對數(shù)生長期的小球藻中加入ZnCl2，使藻液中鋅的最終濃度達(dá)到50 Mmol/L,并通氣培養(yǎng)72小吋。2)通過離心法收集藻細(xì)胞，經(jīng)反復(fù)凍融5次后，再經(jīng)超聲波細(xì)胞破碎，經(jīng)12000 r/min離心10 min收集上清液。3)同實(shí)施例I中步驟(4)和(5)
4)通過抑制酪氨酸酶活性試驗(yàn)，證明當(dāng)小球藻類金屬硫蛋白濃度為I. 2 mg/mL時(shí)，可使單酚酶在2300 s內(nèi)未表現(xiàn)出活性、使ニ酚酶的活性下降87%，說明該蛋白質(zhì)具有較強(qiáng)的美白功效。實(shí)施例3
I)向處于對數(shù)生長期的小球藻中加入ZnCl2，使藻液中鋅的最終濃度達(dá)到5 Mmol/L，并通氣培養(yǎng)120小時(shí)。2)通過離心法收集藻細(xì)胞，在冰浴下經(jīng)超聲波細(xì)胞破碎(540 W，每次開I. 2 S、關(guān)3 S)，用顯微鏡觀察直至細(xì)胞破碎完全。經(jīng)12000 r/min離心10 min收集上清液。3)同實(shí)施例I中步驟(4)和(5)
4)通過抑制酪氨酸酶活性試驗(yàn)，類金屬硫蛋白對單酚酶活性的半抑制率濃度為0. 5mg/mL、對ニ酚酶活性的半抑制率濃度為0. 7 mg/mL，說明該蛋白質(zhì)具有美白功能。實(shí)施例4I)向處于對數(shù)生長期的小球藻中加入ZnCl2，使藻液中鋅的最終濃度達(dá)到100 Mmol/L,并通氣培養(yǎng)24小時(shí)。2)通過離心法收集藻細(xì)胞，在冰浴下經(jīng)超聲波細(xì)胞破碎(540 W，每次開I. 2 S、關(guān)3 S)，用顯微鏡觀察直至細(xì)胞破碎完全。經(jīng)12000 r/min離心10 min收集上清液。3)同實(shí)施例I中步驟(4)和(5)；
4)通過抑制酪氨酸酶活性試驗(yàn)，類金屬硫蛋白對單酚酶活性的半抑制率濃度為O. 5mg/mL、對ニ酚酶活性的半抑制率濃度為O. 7 mg/mL，說明該蛋白質(zhì)具有美白功能。抑制酪氨酸酶活性試驗(yàn)即美白功能檢測方法
I、在試管中加入 I mL 0.5 mmol/L 酪氨酸、2 mL PBS 緩沖液(100 mmol/L pH,6. 8),30°C下水浴10 min,加入O. 2 mL不同濃度的類金屬硫蛋白制品和O. I mL酪氨酸酶,控制酶的終濃度為124 Pg/mL。通過測定OD475的動力學(xué)曲線，如圖3所示，計(jì)算單酚酶的抑制率。在試管中加入I mL 0.5 mmol/L左旋多巴(L-DOPA)溶液、3 mL PBS緩沖液(pH6. 8), 30°C下水浴10 min,加入 O. 2 mL不同濃度的類金屬硫蛋白和O. I mL酪氨酸酶,控制酶的終濃度為740 Pg/mL。通過測定OD475的動力學(xué)曲線，如圖4所示，計(jì)算ニ酚酶的抑制率。
權(quán)利要求
1.ー種具有美白功能的小球藻類金屬硫蛋白的提取方法，其特征在于它包括以下步驟 (1)利用O.05 mol/L的ZnCl2誘導(dǎo)處于對數(shù)生長期的普通海洋小球藻ipdorellavulgaris),培養(yǎng)24-120 h后，考察不同鋅脅迫濃度及培養(yǎng)不同時(shí)間對藻細(xì)胞內(nèi)鋅結(jié)合類金屬硫蛋白誘導(dǎo)量的影響，確定ZnCl2的最佳誘導(dǎo)濃度和誘導(dǎo)時(shí)間； (2)根據(jù)步驟(I)確定的最佳ZnCl2脅迫濃度和脅迫時(shí)間，大量培養(yǎng)小球藻，取離心收集的藻細(xì)胞，按藻泥重量和提取液體積以1:10 (w/v)的比例加入pH值為7. 8的Tris-HCl緩沖液，進(jìn)行超聲波細(xì)胞破碎，經(jīng)高速離心棄去沉淀，收集上清液； (3)上清液過層析柱G-75，每10min收集一管洗脫液，測定254 nm的吸光度值，并測定各收集管的鋅含量，以第二個(gè)信號峰即254 nm吸收信號弱而鋅信號強(qiáng)的組分峰為目標(biāo)峰，確定類金屬硫蛋白在G-75洗脫分離的收集時(shí)間段，收集的組分經(jīng)真空冷凍干燥即為類金屬硫蛋白粗提物； (4)獲得的類金屬硫蛋白粗提物用超純水復(fù)溶后，過層析柱G-25進(jìn)行脫鹽，再次真空冷凍干燥后即得到類金屬硫蛋白制品； (5)通過酪氨酸酶進(jìn)行單酚酶和ニ酚酶的酶活性抑制率試驗(yàn)，確定類金屬硫蛋白的美白功能。
2.如權(quán)利要求I所述的具有美白功能的小球藻類金屬硫蛋白的提取方法，其特征在于步驟(I)中最佳ZnCl2脅迫濃度和最佳誘導(dǎo)時(shí)間的確定方法如下利用凝膠色譜與電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用的檢測手段，以鋅檢測信號及對應(yīng)的蛋白質(zhì)分子量大小確定小球藻鋅結(jié)合類金屬硫蛋白峰在色譜曲線上的位置，以鋅信號強(qiáng)度代表鋅結(jié)合類金屬硫蛋白的誘導(dǎo)量，確定最佳的鋅脅迫濃度和誘導(dǎo)時(shí)間。
3.如權(quán)利要求I所述的具有美白功能的小球藻類金屬硫蛋白的提取方法，其特征在于步驟(2)中藻細(xì)胞破碎時(shí)，以藻泥重量與緩沖液體積按1:10 (w/v)的比例加入，緩沖液由內(nèi)含1%ニ硫蘇糖醇、PH為7. 8的10 mmol/L Tris-HCl組成；進(jìn)行藻細(xì)胞破碎時(shí)，破碎過程采用間歇式進(jìn)行，用顯微鏡觀察直至細(xì)胞破碎完全。
4.如權(quán)利要求I所述的具有美白功能的小球藻類金屬硫蛋白的提取方法，其特征在于步驟(3)中以固定間隔時(shí)間連續(xù)收集經(jīng)G-75分離的洗脫液，檢測每一收集管洗脫液在254 nm的吸光度值和鋅信號值，以收集管序號為橫坐標(biāo)、以254 nm和鋅信號值為縱坐標(biāo)作圖，可得到兩個(gè)組分峰，第一個(gè)峰的254 nm吸光度值高而鋅的信號值低,第二個(gè)峰的254 nm吸光度值低而鋅的信號值高，因此第二個(gè)峰對應(yīng)的組分即類金屬硫蛋白的目標(biāo)物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種具有美白功能的小球藻類金屬硫蛋白的提取方法，本發(fā)明采用氯化鋅脅迫培養(yǎng)普通海洋小球藻，通過不同鋅脅迫濃度和脅迫時(shí)間的考察，可獲得類金屬硫蛋白的最優(yōu)誘導(dǎo)條件，通過提取、分離和純化過程，得到類金屬硫蛋白制品。通過抑制酪氨酸酶活性試驗(yàn)證明，小球藻類金屬硫蛋白濃度為1.2mg/mL時(shí)，能使二酚酶的活性下降87%，使單酚酶在2300秒內(nèi)未呈現(xiàn)出活性，說明該蛋白質(zhì)具有良好的美白功能，在化妝品、保健品領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號C07K14/405GK102675436SQ20121018013
公開日2012年9月19日 申請日期2012年6月4日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月4日
發(fā)明者楊洪, 黃志勇 申請人:集美大學(xué)