專利名稱：：利用鋅指核酸酶敲除牛整合素β6亞基基因的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其是涉及ー種利用鋅指核酸酶(ZincFingerNuclease,ZFN)敲除牛整合素(Integrin)P6亞基基因的方法。
背景技術(shù)：
：ロ蹄疫病毒(FMDV)可引起牛、羊、豬等偶蹄動(dòng)物發(fā)生ロ蹄疫(FMD)，該病不僅造成巨大的直接經(jīng)濟(jì)損失，而且嚴(yán)重危害畜牧業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展以及相關(guān)產(chǎn)品的對(duì)外貿(mào)易。我國(guó)通過(guò)免疫控制并結(jié)合局部強(qiáng)制捕殺的綜合防控政策，雖然取得了顯著成效，但始終存在FMD散發(fā)、地方性流行等。由于FMDV流行株血清型多、變異快、持續(xù)性及亞臨床感染等原因，、通過(guò)疫苗免疫的単一手段很難控制和根除FMD。因此，需要采取多種手段控制FMD的發(fā)生及流行。病毒受體是能夠被病毒識(shí)別并與之結(jié)合，進(jìn)而導(dǎo)致病毒感染的宿主細(xì)胞表面分子，是病毒宿主特異性和組織嗜性的關(guān)鍵因素。若能發(fā)現(xiàn)并敲除或封閉FMDV的關(guān)鍵受體，則可阻斷病毒感染，進(jìn)而達(dá)到控制和根除FMD的目的。據(jù)報(bào)道，整合素aび6是啟動(dòng)FMDV感染牛、羊等易感動(dòng)物的關(guān)鍵受體。在FMDV感染的上皮細(xì)胞可同時(shí)檢測(cè)出病毒抗原和整合素受體av06(O'Donnell等，2009;Dash等，2010);體外重組的a6可與所有血清型的FMDV結(jié)合(Ferris等，2011)，是FMDV利用率最高的整合素受體(Duque等，2003)，提升了FMDV的感染效率(Dicara等，2008；Duque等，2004);抗￠6抗體可阻斷受體與病毒間的結(jié)合并抑制病毒感染(Jackson等，2000);敲除￠6亞基基因的轉(zhuǎn)基因小鼠生長(zhǎng)發(fā)育正常，3日齡轉(zhuǎn)基因乳鼠可完全抵抗低劑量病毒的攻擊。因此，整合素￠6亞基基因可作為抗ロ蹄疫病毒育種研究的靶點(diǎn)?；虼虬惺歉淖兩矬w遺傳信息的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，包括通過(guò)同源重組將外源基因/修飾的自身基因定點(diǎn)整合到受體細(xì)胞基因組(knockin)及將宿主細(xì)胞特定基因區(qū)段敲除(knockout)。依賴于同源重組及體細(xì)胞克隆的傳統(tǒng)的基因打靶方法，其打靶效率低、成本高、周期長(zhǎng)。因此，人們嘗試發(fā)現(xiàn)新的基因打靶技術(shù)并應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因研究中，ZFN技術(shù)的應(yīng)用大大提高了基因打靶效率。ZFN由ー個(gè)DNA識(shí)別結(jié)構(gòu)域和ー個(gè)非特異性核酸內(nèi)切酶的剪切結(jié)構(gòu)域融合而成。此酶N末端為鋅指蛋白DNA結(jié)合域，由一系列Cys2-His2鋅指蛋白串聯(lián)組成，每個(gè)鋅指蛋白識(shí)別并結(jié)合一個(gè)特異的三聯(lián)體堿基。C末端為非特異性核酸酶FokI剪切結(jié)構(gòu)域，F(xiàn)okI是海床黃桿菌表達(dá)的一種限制性內(nèi)切酶(Flavobacteriumokeanokoites),當(dāng)兩個(gè)單體形成ニ聚體時(shí)才具有活性。ZFNs利用了鋅指結(jié)構(gòu)域?qū)NA序列的特異性識(shí)別來(lái)達(dá)到準(zhǔn)確定位靶點(diǎn)的目的，同時(shí)利用核酸酶的DNA水解活性，使靶DNA雙鏈斷裂，然后利用細(xì)胞的修復(fù)機(jī)制，引入基因突變。該項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)被成功用于動(dòng)物基因改造實(shí)驗(yàn)中，具有非常高的基因整合效率。例如，利用ZFNs技術(shù)，獲得GGTAl基因敲除的豬，其打靶效率為5.7%(Hauschild等，2011)。針對(duì)腎素設(shè)計(jì)的ー對(duì)ZFNs使其第5外顯子上10個(gè)堿基缺失，從而產(chǎn)生移碼突變，產(chǎn)生的Ren+轉(zhuǎn)基因小鼠的腎素?zé)o血漿活性(Moreno等，2011)。參考文獻(xiàn)I.DashP，BarnettPV,DenyerMS，etal.Foot-and-mouthdiseasevirusreplicatesonlytransientlyinwell-differentiatedporcinenasalepithelialcells.JVirol.,2010,84(18):9149-9160.2.DicaraD，BurmanA，ClarkS，etal.Foot-and-mouthdiseasevirusformsahighlystable，EDTA—resistantcomplexwithitsprincipalreceptor，integrinalphavbeta6-implicationsforinfectiousness，JVirol.，2008，82(3):1537-1546.3.DuqueH，LaRoccoM，GoldeWT,etal.Interactionsoffoot-and-mouthdiseaseviruswithsolublebovinealphaVbeta3andalphaVbeta6integrins，JVirol.，2004，78(18):9773-9781.4.DuqueHandBaxtB.Foot-and-mouthdiseasevirusreceptors-comparisonofbovinealpha(V)integrinutilizationbytypeAand0viruses,JVirol.,2003,77(4):2500-2511.5.FerrisNP，GrazioliS，HutchingsGH,etal.Validationofarecombinantintegrinav旦6/monoclonalantibodybasedantigenELISAforthediagnosisoffoot-and-mouthdisease.JVirolMethods.，2011，175(2):253-260.6.HauschildJ,PetersenB,SantiagoY,QueisserAL,CarnwathJW,Lucas-HahnA,ZhangL，MengX,GregoryPD,SchwinzerR，CostGJ,NiemannH.233gender-unspecificknockoutoftheggtalgeneinpigsusingzincfingernucleases.ReprodFertilDev.2011Dec；24(1):229.7.JacksonT，SheppardD，DenyerM，etal.Theepithelialintegrinalphavbeta6isareceptorforfoot-and-mouthdiseasevirus,JVirol.，2000，74(11)4949-4956.8.MorenoC，HoffmanM，StodolaTJ,DidierDN,LazarJ，GeurtsAM，NorthPE,JacobHJ,GreeneAS.Creationandcharacterizationofareninknockoutrat.Hypertension.2011Mar；57(3):614-9.9.0'DonnellV，PachecoJM,GreggD，etal.Analysisoffoot-and-mouthdiseasevirusintegrinreceptorexpressionintissuesfromnaiveandinfectedcattle，JCompPathol.，2009，141(2-3):98-112.
發(fā)明內(nèi)容針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的目的是提供ー種利用鋅指核酸酶敲除牛整合素￠6亞基基因的方法。本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的ー種利用鋅指核酸酶(ZFNs)敲除牛整合素￠6亞基基因的方法，其是根據(jù)牛整合素36基因序列，設(shè)計(jì)可特異性識(shí)別該基因的鋅指核酸酶ZFNs，構(gòu)建表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染牛的細(xì)胞，如成纖維細(xì)胞，獲得整合素P6亞基基因敲除的細(xì)胞，其中，所設(shè)計(jì)的可特異性識(shí)別并剪切整合素￠6亞基基因的ZFNs可特異性識(shí)別并剪切整合素￠6亞基基因，其識(shí)別(大寫字母)及剪切(小寫字母)的￠6亞基基因序列如下TGTTCTTTCTATGTCtaggaaGGAATGATCACGTAC。所述的可特異識(shí)別并切割整合素P6亞基基因的ZFN重組表達(dá)載體為pBeta6_ko_ZFNPI和pBeta6_ko_ZFNP2，其ZFN編碼序列分別如序列表中的序列I和序列2所示，由可特異結(jié)合染色體的鋅指蛋白結(jié)合域和非限制性內(nèi)切核酸酶FokI切割域兩部分組成，結(jié)合域和切割域以整合蛋白形式表達(dá)。pBeta6-ko_ZFNPl及pBeta6-ko_ZFNP2分別識(shí)別整合素￠6亞基基因的TGTTCTTTCTATGTC和GGAATGATCACGTAC序列，當(dāng)二者同時(shí)表達(dá)且有鋅離子存在吋，ZFNs形成ニ聚體，其FokI切割域發(fā)揮作用，在taggaa處使整合素P6亞基DNA雙鏈斷裂，然后細(xì)胞利用其自身的修復(fù)機(jī)制，通過(guò)移碼突變的方式敲除整合素￠6亞基基因。所述轉(zhuǎn)染牛的細(xì)胞，獲得整合素￠6亞基基因敲除的細(xì)胞具體是將pBeta6-ko-ZFNPl及pBeta6-ko_ZFNP2共轉(zhuǎn)染牛的細(xì)胞后，如成纖維細(xì)胞，通過(guò)PCR產(chǎn)物測(cè)序方法鑒定并篩選整合素￠6亞基基因被敲除的細(xì)胞克隆。其中，PCR檢測(cè)使用的引物為Pl:5’-CCTGTCCAGGTAGCTTCTG_3’，P2:5’-GTTTCTGAGCTGCATGACA-3’。本發(fā)明還提供通過(guò)上述方法獲得的整合素P6亞基基因敲除的細(xì)胞。本發(fā)明還提供通過(guò)ー種制備整合素P6亞基基因敲除的轉(zhuǎn)基因?？寺∨咛サ姆椒?，其以上述的基因敲除細(xì)胞為核供體細(xì)胞，以去核的成熟卵母細(xì)胞為核移植受體細(xì)胞，利用核移植技術(shù)獲得的?？寺∨咛ァ１景l(fā)明還提供ー種利用ZFN制備轉(zhuǎn)基因牛的方法，其是將上述的克隆胚胎通過(guò)胚胎移植技術(shù)獲得轉(zhuǎn)基因牛。本發(fā)明首次利用ZFNs成功敲除牛成纖維細(xì)胞中的整合素P6亞基基因，進(jìn)而獲得該基因敲除的轉(zhuǎn)基因克隆牛。ZFNs介導(dǎo)的基因敲除在單細(xì)胞克隆中的效率為12.518.3%，與傳統(tǒng)的基因打靶技術(shù)比較，效率提高了IO4105，大大地提高了基因敲除核供體細(xì)胞系的制備效率。本發(fā)明利用ZFNs介導(dǎo)的基因敲除技術(shù)，設(shè)計(jì)合成了可特異性識(shí)別并切割整合素36亞基基因的ー對(duì)ZFNs，并成功獲得整合素P6亞基雙等位基因敲除的轉(zhuǎn)基因克隆牛。利用一次轉(zhuǎn)染，得到雙等位基因敲除的細(xì)胞克隆，省去了藥物篩選過(guò)程，促進(jìn)了細(xì)胞單克隆的形成，提高了后續(xù)轉(zhuǎn)基因胚胎的發(fā)育率。在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物體內(nèi)不含有外源基因，減少了對(duì)外源基因生物安全評(píng)價(jià)的環(huán)節(jié)。圖IA為pBeta6-ko_ZFNPl表達(dá)載體結(jié)構(gòu)示意圖。圖IB為pBeta6-ko_ZFNP2表達(dá)載體結(jié)構(gòu)示意圖。圖2為鋅指核酸酶在293T細(xì)胞中的瞬時(shí)表達(dá)的WB檢測(cè)結(jié)果，其中，I:pAVX對(duì)照；2:pBeta6-ko_ZFNPI；3:pBeta6-ko_ZFNP2。圖3為轉(zhuǎn)染重組ZFN總細(xì)胞的PCR產(chǎn)物測(cè)序峰圖，測(cè)序峰圖在ZFN切割位點(diǎn)附近出現(xiàn)雙峰。圖4為整合素P6亞基雙等位基因敲除的細(xì)胞克隆的PCR產(chǎn)物測(cè)序峰圖，雙等位基因在ZFN切割位點(diǎn)附近同時(shí)發(fā)生堿基缺失。圖5為發(fā)生移碼突變的整合素￠6亞基基因雙敲除的不同細(xì)胞克隆的基因缺失及插入的分析比較結(jié)果示意圖。圖6為7d時(shí)顯微鏡下觀察到的高質(zhì)量的囊胚。圖7為轉(zhuǎn)基因牛整合素￠6亞基基因ZFN作用位點(diǎn)附近的基因測(cè)序比對(duì)結(jié)果，WT野生型序列，Tl、T2及T33頭轉(zhuǎn)基因克隆牛。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)ー步的說(shuō)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。下述實(shí)施例中無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法，所用試劑及藥品如無(wú)特別說(shuō)明均購(gòu)自Sigma公ロJ。實(shí)施例I:ZFN表達(dá)載體的構(gòu)建及其基因敲除功能的檢驗(yàn)IZFN表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)整合素P6亞基基因(NM174698)序列信息，ZFNs的設(shè)計(jì)由Sigma公司完成。設(shè)計(jì)的ー對(duì)ZFNs所識(shí)別(大寫字母)及剪切(小寫字母)的P6亞基基因序列如下TGTTCTTTCTATGTCtaggaaGGAATGATCACGTACAAG，如序列表中的序列3所示。可識(shí)別并剪切整合素P6亞基基因的ZFN重組表達(dá)載體pBeta6-ko_ZFNPI及pBeta6-ko-ZFNP2的結(jié)構(gòu)如圖1A、圖IB所示，載體骨架為pAVX，含有pUCori、CMV啟動(dòng)子、BGHpA及kanR基因。根據(jù)推測(cè)的可與整合素特異結(jié)合鋅指蛋白的編碼序列，體外化學(xué)合成了EcoRI-Flag-NLS-ZFNPl-BamHI及EcoRI-Flag-NLS-ZFNP2_BamHI基因，其序列分別如序列表中的序列l(wèi)(l_576bp)和序列2(l-657bp)所不，同時(shí)化學(xué)合成了其各自的BamHI-FokI-XhoI基因，序列分別如序列表中的的序列I(571-1182bp)和序列2(652-1257bp)所示。利用EcoRI、BamHI及XhoI酶切位點(diǎn)，將鋅指蛋白及FokI克隆到pAVX載體上，構(gòu)建成可識(shí)別并剪切整合素￠6亞基基因的ZFN重組表達(dá)載體。其中，NLS為核定位信號(hào)，可引導(dǎo)重組ZFN進(jìn)入核區(qū)；Flag-tag用于重組蛋白表達(dá)的WB檢測(cè)中。2鋅指核酸酶在293T細(xì)胞中的瞬時(shí)表達(dá)293T細(xì)胞在37°C、5%CO2的條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)液為含10%FBS的DMEM。在脂質(zhì)體Lipfectamine2000的介導(dǎo)下，將8ygpBeta6-ko_ZFNPl及pBeta6-ko_ZFNP2分別轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，pAVX質(zhì)粒做對(duì)照。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，收取細(xì)胞并用RIPA裂解液裂解，取含20yg總蛋白的細(xì)胞裂解液進(jìn)行SDS-PAGE電泳，然后經(jīng)電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用含10%BSA封閉液封閉后，用I:1000的酶標(biāo)小鼠抗FLAG的一抗和酶偶聯(lián)的羊抗鼠IgG(PIERCE)稀釋的ニ抗進(jìn)行免疫標(biāo)記，用化學(xué)發(fā)光底物顯色，檢測(cè)重組蛋白表達(dá)產(chǎn)物。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2，2個(gè)重組質(zhì)粒均表達(dá)了目的蛋白。3ZFN基因敲除功能的檢驗(yàn)3.I牛胎兒成纖維細(xì)胞系的建立選用2月齡的荷斯坦奶牛胎兒(購(gòu)自山東奧克斯生物技術(shù)有限公司)，用70%酒精清洗包被奶牛胎兒的羊膜數(shù)次后，刺穿羊膜，取出奶牛胚胎，于PBS液中洗數(shù)遍，取胎兒組織,剪碎成小塊(體積小于Imm3)，再用PBS洗2遍后，加入IOmL的膠原酶和胰蛋白酶混合液37°C消化20-40min后，加入20mL含10%胎牛血清的DMEM:F12營(yíng)養(yǎng)液分散，IOOOrpmIOmin,再加入10%胎牛血清的DMEM:F12營(yíng)養(yǎng)液重新懸浮，細(xì)胞計(jì)數(shù)，按3.OXIO5的細(xì)胞量接種于IOOmm的培養(yǎng)皿中，37°C、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2_3d，待細(xì)胞生長(zhǎng)至單層后，用0.25%胰蛋白酶消化傳代I次，液氮保存(凍存液成分為80%DMEM:F12,10%FBS和10%DMSO)，獲得牛胎兒皮膚成纖維細(xì)胞系。3.2ZFN基因敲除作用的檢驗(yàn)將pBeta6-ko_ZFNPl及pBeta6-ko_ZFNP2重組質(zhì)粒線性化后，濃縮濃度不低于IUg/UL,經(jīng)脂質(zhì)體LTX轉(zhuǎn)染處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的牛胎兒成纖維細(xì)胞(DNA脂質(zhì)體LTX=I3；pBeta6-ko-ZFNPlpBeta6-ko_ZFNP2=II)，24h后提取總細(xì)胞DNA并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR檢測(cè)使用的引物為Pl:5，-CCTGTCCAGGTAGCTTCTG_3，，P2:5，_GTTTCTGAGCTGCATGACA_3’，如序列表中的序列4、5所示。引物Pl和P2分別位于ZFN作用位點(diǎn)的上游和下游，當(dāng)轉(zhuǎn)染的pBeta6-ko-ZFNPl/pBeta6-ko-ZFNP2在部分細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮ZFN功能時(shí)，純化的PCR產(chǎn)物測(cè)序后，其峰圖將是雜合峰圖。對(duì)上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，均獲得了雜合峰圖，見(jiàn)圖3，表明pBeta6-ko-ZFNPl/pBeta6-ko-ZFNP2對(duì)牛整合素P6亞基基因具有特異的敲除作用。3.3ZFN敲除效率的檢測(cè)線性化的pBeta6-ko_ZFNPl及pBeta6-ko_ZFNP2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染牛胎兒成纖維細(xì)胞，24h后提取總細(xì)胞DNA并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物為P1/P2。純化回收PCR產(chǎn)物并與T3載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，挑取不同克隆測(cè)序，經(jīng)序列比對(duì)分析，計(jì)算突變型與總有效測(cè)序數(shù)(突變型與野生型克隆的總和)的比值，該值為敲除效率。對(duì)上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，pBeta6-ko-ZFNPl/pBeta6-ko-ZFNP2的敲除效率為12.518.3%。實(shí)施例2:整合素@6亞基基因敲除單克隆細(xì)胞的獲得I轉(zhuǎn)染pBeta6-ko-ZFNPl/pBeta6-ko-ZFNP2細(xì)胞的單克隆培養(yǎng)線性化的pBeta6-ko_ZFNPl及pBeta6-ko_ZFNP2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染牛胎兒成纖維細(xì)胞，24h后細(xì)胞計(jì)數(shù)，按照每皿500個(gè)細(xì)胞的量將細(xì)胞接種于IOcm培養(yǎng)皿中，使用含15%FBS的DMEM培養(yǎng)基，于37°C、5%CO2條件下培養(yǎng)I周后，在顯微鏡下觀察并用記號(hào)筆標(biāo)記細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)好的單克隆細(xì)胞，利用克隆環(huán)及胰蛋白酶消化的方法，將單克隆細(xì)胞擴(kuò)繁到48孔板培養(yǎng)。待細(xì)胞鋪滿單層后，用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，取出10%的細(xì)胞進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物為P1/P2，鑒定其是否發(fā)生基因敲除。另外，90%的細(xì)胞接種于6孔板，長(zhǎng)滿單層后凍存，陽(yáng)性克隆細(xì)胞用于后續(xù)轉(zhuǎn)基因胚胎及克隆牛的生產(chǎn)。2基因敲除單克隆細(xì)胞的鑒定將實(shí)施例2方法I中所取出的10%細(xì)胞進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物為P1/P2，PCR產(chǎn)物回收純化后，分成兩份，ー份直接進(jìn)行測(cè)序，若測(cè)序峰圖在ZFN切割位點(diǎn)附近出現(xiàn)雙峰，表明該克隆發(fā)生了基因敲除且其為雜合子；另外，也會(huì)出現(xiàn)野生型及雙等位基因敲除的突變型克隆，見(jiàn)圖4。將基因敲除為雜合子的克隆的另ー份PCR產(chǎn)物與T3載體連接，通過(guò)TA克隆測(cè)序方法獲得突變細(xì)胞克隆的整合素￠6亞基的基因序列。篩選發(fā)生移碼突變的整合素36亞基基因敲除的細(xì)胞，用于后續(xù)轉(zhuǎn)基因胚胎及牛的生產(chǎn)。實(shí)施例3:整合素06亞基基因敲除轉(zhuǎn)基因胚胎及牛的制備I基因敲除單克隆細(xì)胞的獲得利用實(shí)施例2方法2，獲得發(fā)生移碼突變的整合素P6亞基基因雙敲除的細(xì)胞克隆，其基因缺失及插入的分析結(jié)果如圖5，將其作為核供體細(xì)胞，用于轉(zhuǎn)基因胚胎及牛的生產(chǎn)。2卵母細(xì)胞的成熟培養(yǎng)將取自周邊地區(qū)屠宰場(chǎng)的成年奶牛和黃牛的卵巣，用PBS液清洗3遍后，用直徑為0.7mm的針頭抽取卵泡，回收形態(tài)均勻、結(jié)構(gòu)致密的卵丘-卵母細(xì)胞-復(fù)合體，將其用成熟液(M199培養(yǎng)液中添加10%FBS,0.01U/mLbFSH，0.01U/mLbLH和Iug/mL雌ニ醇)洗滌兩適，然后將卵丘-卵母細(xì)胞-復(fù)合體按50-60枚/孔放入含成熟液的四孔板，置于38.5°C、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約20h，將成熟的卵母細(xì)胞放入含0.1%透明質(zhì)酸酶的管內(nèi)振蕩2-3min后，用玻璃管輕輕吹打，使卵丘細(xì)胞和卵母細(xì)胞完全脫離，選擇形態(tài)完整，細(xì)胞質(zhì)均勻，并排出第一極體的卵母細(xì)胞為胞質(zhì)受體。3核移植和克隆胚胎的體外培養(yǎng)將步驟2獲得的第一極體的卵母細(xì)胞移入操作液(M199培養(yǎng)液中添加10%FBS,7.5ug/mL細(xì)胞松弛素B)中，在顯微鏡下用玻璃針于極體上方的透明帶切ー小口，再用玻璃管將第一極體及其下方的卵母細(xì)胞的染色體一井吸除，再用含20%的FBS的M199液體培養(yǎng)基洗3遍，置于38.5°C>5%CO2的培養(yǎng)箱中備用。將步驟I獲得的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞活化至長(zhǎng)滿單層，用胰蛋白酶消化，懸浮細(xì)胞離心，再加微量的營(yíng)養(yǎng)液懸浮，用玻璃針選擇直徑為10-12um的轉(zhuǎn)基因成纖維細(xì)胞的細(xì)胞核，用玻璃管將其移入去核的卵母細(xì)胞的透明帶內(nèi)，然后將其放入0.3M甘露醇、0.15mmol/LCa2+和0.15mmol/LMg2+的溶液中，3_5min后放入融合槽內(nèi)，轉(zhuǎn)動(dòng)卵母細(xì)胞使供體細(xì)胞核與卵母細(xì)胞接觸面與電場(chǎng)垂直，同時(shí)在直流脈沖的場(chǎng)強(qiáng)為2.5KV/cm、脈沖時(shí)間為10US、脈沖次數(shù)為2次、脈沖間隔Is的條件下融合(融合儀為BTX公司的ECM-2001)后，迅速將重構(gòu)胚移入添加10%FBS的M199培養(yǎng)液中，放置0.5h后觀察融合率，挑選融合胚進(jìn)行下一步的激活處理，將重構(gòu)胚放入5ymol/L離子霉素液中，4min后移至I.9mmol/L的6-DMAP液中，4h后再移入含5%FBS的CRIaa液中，在38.5°C、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，于7d時(shí)觀察胚胎的發(fā)育狀況，挑選出高質(zhì)量的囊胚(見(jiàn)圖6)，共獲得好的轉(zhuǎn)基因囊胚148枚，玻璃化凍存于液氮中，每管2枚，需要移植時(shí)直接解凍即可用。4胚胎移植與妊娠檢測(cè)將形態(tài)優(yōu)良的第7d的克隆囊胚移入已同期的受體牛的子宮角內(nèi)。在移植后的第30d對(duì)受體母牛進(jìn)行B超檢測(cè)以確定受胎情況，并在移植后的第60d進(jìn)行直腸檢測(cè)以確定妊娠率。已累計(jì)使用受體牛74頭，懷孕2個(gè)月以上的受體牛25頭，懷孕率33.8%。目前，已出生轉(zhuǎn)基因牛3頭。5轉(zhuǎn)基因克隆牛的分子生物學(xué)鑒定取3頭轉(zhuǎn)基因牛耳部組織少許，消化并提取基因組DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測(cè)序，基因敲除鑒定的具體方法同實(shí)施例2中基因敲除單細(xì)胞克隆的鑒定?；驕y(cè)序結(jié)果見(jiàn)圖7，與野生型(WT)比較，轉(zhuǎn)基因牛Tl和T2的整合素P6亞基基因分別缺失4bp和10bp，轉(zhuǎn)基因牛T3則插入4bp，3頭牛均為移碼突變導(dǎo)致的整合素P6亞基雙等位基因敲除的轉(zhuǎn)基因克隆牛。盡管上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以較容易地進(jìn)行ー些修改或改進(jìn)。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。權(quán)利要求1.ー種利用鋅指核酸酶敲除牛整合素β6亞基基因的方法，其是根據(jù)牛整合素β6基因序列，設(shè)計(jì)可特異性識(shí)別該基因的鋅指核酸酶，構(gòu)建ZFN重組表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染牛的細(xì)胞，獲得整合素β6亞基基因敲除的細(xì)胞，其特征在于所設(shè)計(jì)的ー對(duì)ZFNs可特異性識(shí)別并剪切整合素β6亞基基因，其識(shí)別及剪切的β6亞基基因序列如下TGTTCTTTCTATGTCtaggaaGGAATGATCACGTACAAG；其中，大與字母表不的序列為識(shí)別的序列，小與字母表不的序列為到切的序列。2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的利用鋅指核酸酶敲除牛整合素β6亞基基因的方法，其特征在干所述可特異識(shí)別并剪切整合素β6亞基基因的ZFN重組表達(dá)載體為pBeta6_ko_ZFNPI和pBeta6_ko_ZFNP2，其ZFN編碼序列分別如序列表中的序列I和序列2所示。3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的利用鋅指核酸酶敲除牛整合素β6亞基基因的方法，其特征在于將pBeta6-ko-ZFNPl及pBeta6-ko-ZFNP2共轉(zhuǎn)染牛的細(xì)胞，通過(guò)PCR產(chǎn)物測(cè)序方法檢測(cè)整合素β6亞基基因是否被敲除，篩選并獲得整合素β6亞基基因敲除的細(xì)胞。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的利用鋅指核酸酶敲除牛整合素β6亞基基因的方法，其特征在于所述PCR檢測(cè)使用的引物為Pl:5’-CCTGTCCAGGTAGCTTCTG-3’，Ρ2:5’-GTTTCTGAGCTGCATGACΑ-3’。5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的利用鋅指核酸酶敲除牛整合素β6亞基基因的方法，其特征在于所述牛的細(xì)胞為成纖維細(xì)胞。6.權(quán)利要求I所述的利用鋅指核酸酶敲除牛整合素β6亞基基因的方法獲得的基因敲除細(xì)胞。7.權(quán)利要求I5中任一項(xiàng)所述的利用鋅指核酸酶敲除牛整合素β6亞基基因的方法在生產(chǎn)整合素β6亞基基因敲除的轉(zhuǎn)基因牛中的應(yīng)用。8.一種制備整合素β6亞基基因敲除的轉(zhuǎn)基因?？寺∨咛サ姆椒?，其特征在干以權(quán)利要求6所述的基因敲除細(xì)胞為核供體細(xì)胞，以去核的成熟卵母細(xì)胞為核移植受體細(xì)胞，利用核移植技術(shù)獲得牛克隆胚胎。9.ー種制備轉(zhuǎn)基因牛的方法，其特征在于是將權(quán)利要求8所述的方法制備的克隆胚胎通過(guò)胚胎移植技術(shù)獲得轉(zhuǎn)基因牛。全文摘要本發(fā)明公開了一種利用鋅指核酸酶(ZFNs)敲除牛整合素β6亞基基因的方法，其是根據(jù)牛整合素β6基因序列，設(shè)計(jì)可特異性識(shí)別該基因的鋅指核酸酶ZFNs，構(gòu)建表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染牛的細(xì)胞，如成纖維細(xì)胞，獲得整合素β6亞基基因敲除的細(xì)胞。本發(fā)明利用ZFNs介導(dǎo)的基因敲除技術(shù)，設(shè)計(jì)合成了可特異性識(shí)別并切割整合素β6亞基基因的一對(duì)ZFNs，并成功獲得整合素β6亞基雙等位基因敲除的轉(zhuǎn)基因克隆牛。利用一次轉(zhuǎn)染，得到雙等位基因敲除的細(xì)胞克隆，省去了藥物篩選過(guò)程，促進(jìn)了細(xì)胞單克隆的形成，提高了后續(xù)轉(zhuǎn)基因胚胎的發(fā)育率。在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物體內(nèi)不含有外源基因，減少了對(duì)外源基因生物安全評(píng)價(jià)的環(huán)節(jié)。文檔編號(hào)A01K67/027GK102660577SQ20121011454公開日2012年9月12日申請(qǐng)日期2012年4月18日優(yōu)先權(quán)日2012年4月18日發(fā)明者仲躋峰,何洪彬,劉文浩,劉曉,方永志,武建明,王洪梅申請(qǐng)人:山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院奶牛研究中心