專利名稱：一種魚(yú)類精子抗凝集保存液及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于低溫生物學(xué)研究領(lǐng)域，具體涉及一種魚(yú)類精子抗凝集保存液及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
精子凝集是精子超低溫冷凍過(guò)程中比較常見(jiàn)的一種現(xiàn)象，輕微的凝集可使得部分精子發(fā)生交聯(lián)，限制精子的運(yùn)動(dòng)，嚴(yán)重的凝集則促使大量精子發(fā)生膜融合并呈片狀、條狀、團(tuán)塊狀，且單個(gè)精子結(jié)構(gòu)喪失。本專利申請(qǐng)的發(fā)明人董巧香等曾在對(duì)太平洋牡蠣精子超低溫凍存的研究中詳細(xì)的描述過(guò)這種現(xiàn)象(詳見(jiàn)Qiaoxiang Dong, Changjiang Huang, et al. Control of sperm concentration is necessary for standardization of spermcryopreservation in aquatic species: Evidence from sperm agglutination inoysters. Cryobiology, 2007，54:87-98)。
董巧香等在研究如何避免超低溫冷凍過(guò)程中魚(yú)類精子發(fā)生凝聚問(wèn)題時(shí)發(fā)現(xiàn)，在超低溫冷凍過(guò)程中斑馬魚(yú)精子可釋放出某種促精子凝聚的成分。因?yàn)橛檬占陌唏R魚(yú)凍精上清液來(lái)處理未經(jīng)冷凍的斑馬魚(yú)精子，同樣可使斑馬魚(yú)精子出現(xiàn)凝聚現(xiàn)象。在此基礎(chǔ)之上，他們發(fā)現(xiàn)用斑馬魚(yú)凍精上清液同樣可誘導(dǎo)其它魚(yú)類(虎皮魚(yú)、頭尾燈)精子的凝聚，但卻對(duì)人類精子不具促凝效果。為此，他們認(rèn)為人類精漿可能含有某種抗凝聚的成分。因此，他們用人類精漿來(lái)處理斑馬魚(yú)精子，從而發(fā)現(xiàn)了人類精漿的這種抗魚(yú)類精子凝聚的功效。他們根據(jù)多年從事魚(yú)類低溫冷凍保存的經(jīng)驗(yàn)和對(duì)精子冷凍中膜脂含量的變化，認(rèn)為魚(yú)類精子這種凍凝特性可能源自于精子胞膜中的鞘磷脂。他們們使用鞘磷脂脂質(zhì)體來(lái)處理斑馬魚(yú)精子時(shí)，發(fā)現(xiàn)了與低溫冷凍過(guò)程所產(chǎn)生的相同的凝聚現(xiàn)象，而用其它脂類制備的脂質(zhì)體則無(wú)類似的作用。因此，初步證實(shí)了是鞘磷脂誘導(dǎo)魚(yú)類精子在冷凍過(guò)程中發(fā)生凝聚現(xiàn)象，而人類精漿卻可以有效對(duì)抗這種由鞘磷脂誘導(dǎo)的魚(yú)類精子凝聚。通過(guò)使用人類精漿的處理來(lái)有效對(duì)抗魚(yú)類精子冷凍過(guò)程中凝聚的方法。目前國(guó)內(nèi)外還尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種魚(yú)類精子抗凝集保存液及其制備方法和應(yīng)用，以有效防止魚(yú)類精子在超低溫冷凍過(guò)程中發(fā)生凝聚，簡(jiǎn)單易行且適用于其他很多魚(yú)類。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案
一種魚(yú)類精子抗凝集保存液的制備方法，包括以下步驟
1)人類精漿的獲得；
2)人類精漿的純化；
3)魚(yú)類精子抗凝集保存液的制備。進(jìn)一步地，上述步驟I)包括從健康人體獲取新鮮精液，于35-40°C溫箱中保存待其液化；將液化的精液分裝至I. 5ml離心管(Iml/管)，然后高速離心(10000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘)，吸取上層精漿(吸取的精漿體積為離心用的精液體積的1/2至2/3，避免吸取到沉淀)至1.5ml離心管中，保存?zhèn)溆?。進(jìn)一步地，上述步驟2)包括將上述步驟I)中獲得的精漿于-16至-20°C冰箱中冷凍，待精漿全部?jī)鼋Y(jié)后取出，于室溫下自然解凍，高速離心(10000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘)去除析出的雜質(zhì)，并按上述條件再重復(fù)冷凍、解凍、離心一次，獲得含雜質(zhì)更少的精漿；最后，用O. 22-0. 45 μ m濾膜過(guò)濾，獲得純化的精漿于0_4°C保存?zhèn)溆?。進(jìn)一步地，上述步驟3)包括先將純化后的精漿與Hank’s平衡溶液以I :1至I :3的體積比混合；然后使用滲透壓儀對(duì)該混合溶液的滲透壓進(jìn)行檢測(cè)(制備完成后或使用時(shí)檢測(cè)均可)，以接近該種魚(yú)類精漿的滲透壓或利于抗凍的滲透壓為宜(需要添加某些非滲透性抗凍劑時(shí)，要考慮抗凍劑帶來(lái)的滲透壓變化以避免精子的激活或損傷)，并使用超純水(降低)，或葡萄糖(提升)來(lái)調(diào)節(jié)滲透壓至目標(biāo)滲透壓(淡水魚(yú)精子保存液的滲透壓應(yīng)介于260-310m0s/kg之間，海水魚(yú)精子保存液的滲透壓應(yīng)介于150_200m0s/kg之間)。具體使 用時(shí)只需用該保存液懸浮精子即可。本發(fā)明還提供上述方法制備的魚(yú)類精子抗凝集保存液，以人類精漿為原料，純化后以I :1至I :3的體積比與Hank’s平衡溶液混合制得。本發(fā)明進(jìn)一步提供上述魚(yú)類精子抗凝集保存液在防止魚(yú)類精子凝聚中的應(yīng)用。本發(fā)明產(chǎn)生的有益效果如下
本發(fā)明方法所制備的魚(yú)類精子抗凝集保存液，可以有效避免由精子凝聚所引起的精子損傷，最大限度地保存每一個(gè)精子所攜帶的信息，減少由于精子凝聚所引起的精子受精能力的影響，降低精子凝聚所帶來(lái)的精子參數(shù)分析的干擾，從而使得經(jīng)歷凍存的每一個(gè)精子在解凍后都可以被最大幅度地利用。


圖I示出了本發(fā)明提供用于抗魚(yú)類精子凝聚方法的技術(shù)路線 圖2示出了人類精漿抗斑馬魚(yú)冷凍凝聚的效果圖(A :對(duì)照組，B :人類精漿處理組)；
圖3示出了鞘磷脂脂質(zhì)體誘導(dǎo)的精子凝聚以及人類精漿抗鞘磷脂引起的精子凝聚效果(A:鞘磷脂測(cè)試液處理之前的斑馬魚(yú)精子圖；B: Hank’s平衡溶液懸浮的對(duì)照組經(jīng)過(guò)鞘磷脂測(cè)試液處理后的表現(xiàn)圖；C:人類精漿處理組經(jīng)鞘磷脂測(cè)試液處理后的結(jié)果圖；A’ :鞘磷脂測(cè)試液處理之前的斑馬魚(yú)精子放大效果圖；B’ : Hank’s平衡溶液懸浮的對(duì)照組經(jīng)過(guò)鞘磷脂測(cè)試液處理后的表現(xiàn)放大效果圖；C’ :人類精漿處理組經(jīng)鞘磷脂測(cè)試液處理后的結(jié)果放大圖)。
具體實(shí)施例方式應(yīng)該指出，以下具體說(shuō)明都是例示性的，旨在對(duì)本發(fā)明提供進(jìn)一步的發(fā)明。除非另有說(shuō)明，本文使用的所有科學(xué)和技術(shù)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域人員通常理解的相同含義。下面結(jié)合附圖作進(jìn)一步說(shuō)明
一種魚(yú)類精子抗凝集保存液的制備方法(見(jiàn)圖I)，具體實(shí)施步驟如下
一、人類精漿的獲得(I)精液獲取選 擇身體健康的志愿者(無(wú)性病、血液傳播疾病，相關(guān)病原檢測(cè)為陰性)。通過(guò)手淫法取得新鮮精液，于37°c溫箱中保存待其液化(30分鐘后仍未液化的精液則棄去不用)。(2)分離精漿將液化的精液分裝至I. 5ml離心管(lml/管)以4°C，10000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，吸取上層精漿備用(吸取的精漿體積為離心用的精液體積的1/2，避免吸取到沉淀)。二、人類精漿的純化
(I)精漿凍融處理將取得的精漿于-20°C冰箱中冷凍，待精漿全部?jī)鼋Y(jié)后取出，于室溫下自然解凍(注意冷凍時(shí)，需使用I. 5ml離心管分裝；冷凍和解凍過(guò)程中均需保持離心管正立，并在解凍后避免搖晃離心管以避免凍融過(guò)程中所析出的雜質(zhì)再溶)。(2)離心將解凍后的精漿(置于原離心管內(nèi))以4°C，10000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘去除析出的雜質(zhì)(注意重復(fù)執(zhí)行精漿凍融、離心兩步，可獲得含雜質(zhì)更少的精漿)。(3)過(guò)濾將離心后的精漿用O. 45 μ m聚碳酸酯濾膜過(guò)濾，獲得純化的精漿于-20°C保存?zhèn)溆谩Ｈ?、魚(yú)類精子抗凝集保存液的制備
(I)精漿稀釋將純化后的精漿以I :2的體積比與Hank’s平衡溶液混合。(2)調(diào)整滲透壓使用滲透壓儀(德國(guó)G0N0TEC公司0SM0MAT_30_M型)對(duì)該混合溶液的滲透壓進(jìn)行檢測(cè)，以接近該種魚(yú)類精漿的滲透壓或利于抗凍的滲透壓為宜(需要添加某些非滲透性抗凍劑時(shí)，要考慮抗凍劑帶來(lái)的滲透壓變化以避免精子的激活或損傷)，通過(guò)加入超純水(降低)，或葡萄糖(提升)來(lái)對(duì)抗凝集保護(hù)液的滲透壓進(jìn)行微調(diào)以調(diào)整至合適范圍。(用于保存淡水魚(yú)精子的溶液滲透壓應(yīng)為260-310m0s/kg，若是海水魚(yú)類則滲透壓應(yīng)為150-200m0s/kg，淡水卵生魚(yú)類一般可無(wú)需調(diào)整，在發(fā)現(xiàn)該保存液可激活魚(yú)類精子時(shí)再做調(diào)整)。用該液懸浮所需凍存的魚(yú)類精子即可達(dá)到抗凝聚的目的。以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的說(shuō)明。實(shí)例I、應(yīng)用于冷凍所引起的精子凝聚
通常，在精子冷凍過(guò)程中應(yīng)盡量避免出現(xiàn)精子凝聚，從而達(dá)到較好的凍存效果。因此，當(dāng)精子冷凍后出現(xiàn)了明顯的凝聚，則認(rèn)為所選擇的冷凍方案并不是十分適合該種精子的凍存。最為極端的情況就是不添加任何抗凍劑直接投入液氮，可引起嚴(yán)重的精子凝聚。而人類精漿可明顯地在這種極端的情況下發(fā)揮其抗凝作用，其具體的實(shí)施步驟如下
I)人類精漿的獲得
方法同上。2)人類精漿的純化
方法同上。3)斑馬魚(yú)精子抗凝保存液的配制
方法同上。4)斑馬魚(yú)精子冷凍
斑馬魚(yú)精巢取出后于抗凝保存液中吹打施放出精子(以Hank’s平衡溶液作為對(duì)照)，調(diào)整精子濃度至IO8個(gè)/ml，分裝入麥管(或凍存管)，然后直接投入液氮，待精子懸液完全凍結(jié)后取出解凍，于顯微鏡下觀察。結(jié)果見(jiàn)圖3，圖3顯示以Hank’s平衡溶液作為對(duì)照的斑馬魚(yú)精子解凍后，出現(xiàn)嚴(yán)重凝聚，保持獨(dú)立的精子密度極低，而使用抗凝保存液的處理組精子高度分散，分布均勻，無(wú)凝聚現(xiàn)象。說(shuō)明本方法可以很好地用于冷凍所引起的精子凝聚。實(shí)例2、應(yīng)用于鞘磷脂所誘導(dǎo)的精子凝聚
本發(fā)明人已初步證實(shí)鞘磷脂會(huì)誘導(dǎo)魚(yú)類精子在冷凍過(guò)程中發(fā)生凝聚，因而在非冷凍狀態(tài)下于魚(yú)類精液中加入鞘磷脂，同樣會(huì)引起魚(yú)類精子發(fā)生凝聚，但人類精漿卻可對(duì)抗鞘磷脂脂質(zhì)體的這種促凝作用我們采用不同魚(yú)種進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表I。表I :不同魚(yú)類精子添加人類精漿后的抗凝效果以及對(duì)于鞘磷脂敏感性測(cè)試。
權(quán)利要求
1.一種魚(yú)類精子抗凝集保存液的制備方法，其特征在于，包括以下步驟 1)人類精漿的獲得； 2)人類精漿的純化； 3)魚(yú)類精子抗凝集保存液的制備。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，步驟I)所述人類精漿獲得的方法包括如下步驟從健康人體獲取新鮮精液，于35-40°C的溫箱中保存待其液化；將液化的精液分裝至1.5ml離心管，10000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，吸取上層精漿至1.5ml離心管中，保存?zhèn)溆?；其中所述上層精漿的體積為離心用的精液體積的1/2至2/3。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，步驟2)所述人類精漿純化方法包括如下 步驟將步驟I)中獲得的人類精漿于_16°C至_20°C冰箱中冷凍，待精漿全部?jī)鼋Y(jié)后取出，于室溫下自然解凍，10000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘以去除析出的雜質(zhì)，并按上述條件再重復(fù)冷凍、解凍、離心一次，獲得含雜質(zhì)更少的精漿；最后，用O. 22-0. 45 μ m聚碳酸酯濾膜過(guò)濾，獲得純化的精漿于0-4°C保存?zhèn)溆谩?br> 4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，步驟3)所述魚(yú)類精子抗凝保存液的制備包括以下步驟先將純化后的精漿與Hank’s平衡溶液以I :1至I :3的體積比混合，然后使用滲透壓儀檢測(cè)該混合溶液的滲透壓是否達(dá)到目標(biāo)滲透壓，若滲透壓偏高或偏低，通過(guò)向混合溶液直接添加超純水來(lái)降低或添加葡萄糖來(lái)提升溶液滲透壓至目標(biāo)滲透壓。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述目標(biāo)滲透壓為接近所述魚(yú)類精漿的滲透壓或利于抗凍的滲透壓；其中，淡水魚(yú)精子保存液的滲透壓介于260-310m0s/kg之間，海水魚(yú)精子保存液的滲透壓介于150-200m0s/kg之間。
6.一種根據(jù)權(quán)利要求1-4任一所述方法制備的魚(yú)類精子抗凝集保存液，其特征在于，以人類精漿為原料，純化后以I :1至I :3的體積比與Hank’s平衡溶液混合制得。
7.—種權(quán)利要求6所述魚(yú)類精子抗凝集保存液在防止魚(yú)類精子凝聚中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種魚(yú)類精子抗凝集保存液及其制備方法和應(yīng)用，所述方法包括以下步驟1)人類精漿的獲得；2)人類精漿的純化；3)魚(yú)類精子抗凝保存液的制備。本發(fā)明方法所制備的魚(yú)類精子抗凝集保存液不僅能有效對(duì)抗魚(yú)類精子凝聚所引起的精子損傷以及對(duì)精子受精能力的影響，而且還能最大限度地保存每個(gè)精子所攜帶的信息以及解凍后精子最大幅度的被利用。本發(fā)明將對(duì)于珍稀魚(yú)類種質(zhì)資源的低溫冷凍保存具有重大的實(shí)際意義與應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)A01N1/02GK102630664SQ201210081749
公開(kāi)日2012年8月15日 申請(qǐng)日期2012年3月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月26日
發(fā)明者劉靜, 危林丹, 林函, 白承連, 董巧香, 陳元紅, 陳將飛, 黃長(zhǎng)江 申請(qǐng)人:溫州醫(yī)學(xué)院