專利名稱：擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶基因ugt87a2在提高植物耐旱性中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一個糖基轉(zhuǎn)移酶基因及其應(yīng)用，尤其涉及一種擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶基因 UGT87A2在提高植物耐旱性中的應(yīng)用，屬于基因工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
糖基轉(zhuǎn)移酶是專門負責催化糖基化修飾反應(yīng)的酶類，它將活性糖基從供體(通常是UDP-glucose)轉(zhuǎn)移到受體分子上。糖基化修飾往往會改變植物分子的生物活性、水溶性、在細胞內(nèi)和整體植株的轉(zhuǎn)運特性、亞細胞定位以及與受體的相互識別與結(jié)合特性，另外還能降低或消除內(nèi)源和外源物質(zhì)的毒性(Lim and Bowles, 2004; Bowles et al. , 2006; Wang and Hou, 2009)。因此，糖基轉(zhuǎn)移酶基因在調(diào)節(jié)植物細胞代謝平衡、維持植物正常生長發(fā)育等方面有重要意義。例如，已有報道糖基轉(zhuǎn)移酶基因參與植物激素平衡調(diào)節(jié)、植物防御反應(yīng)、植物次生代謝物合成以及植物信號轉(zhuǎn)導等(Wang and Hou, 2009)。生物界存在的糖基轉(zhuǎn)移酶按照所催化的底物性質(zhì)和序列相關(guān)性分屬94個不同的家族。其中家族I包含的成員數(shù)量最多，與植物的關(guān)系最密切。在家族I中大多數(shù)基因C端具有一個由44個氨基酸組成的保守序列，即PSPG盒(plant secondary product glycosy I transferase box)。隨著擬南芥(Arabidopsis thaliana)全基因組測序的完成， 通過對PSPG盒的序列分析發(fā)現(xiàn)擬南芥中共有119個可能的糖基轉(zhuǎn)移酶，這些糖基轉(zhuǎn)移酶中大部分的功能還不清楚。見7 7尤 是擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶家族I中的一個成員，目前它的基因序列已公開于核酸序列數(shù)據(jù)庫中。但是經(jīng)過檢索，擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶基因見7 7尤 在增強植物耐旱性中的應(yīng)用目前未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
(I)本發(fā)明的目的
針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的是提供了一種擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶基因UGT87A2在提高植物耐旱性中的應(yīng)用。(2)實現(xiàn)本發(fā)明的具體技術(shù)方案
本發(fā)明所述擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶基因UGT87A2在提高植物耐旱性中的應(yīng)用。其中所述糖基轉(zhuǎn)移酶基因UGT87A2的核苷酸序列如SEQ ID No. I所示。所述植物優(yōu)選是十字花科植物，所述十字花科植物優(yōu)選是擬南芥、芥菜、油菜、白菜或甘藍。本發(fā)明利用SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示的引物序列，通過RT-PCR技術(shù)從擬南芥中克隆糖基轉(zhuǎn)移酶基因UGT87A2，然后利用該基因構(gòu)建植物過表達載體，進行植物轉(zhuǎn)基因操作，獲得轉(zhuǎn)基因植物。檢測表明轉(zhuǎn)基因植物的耐鹽性得到顯著提高。(3)本發(fā)明實施后帶來的有益效果
實驗證實，應(yīng)用本發(fā)明所述擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶基因見貨7尤 進行植物轉(zhuǎn)基因操作，可以顯著提高轉(zhuǎn)基因植物的耐旱性(見附圖I、附圖2和附圖3)。預示本發(fā)明實施后將會創(chuàng)造新型耐旱植物，可用于后續(xù)的作物品種改良，對我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有重大意義。


圖I.干旱處理實驗。其中Col-O為擬南芥對照植物，嘆訪7a之為突變體，87A20E-1 和87A20E-2為兩個過表達株系。擬南芥對照植物、突變體和過表達株系正常培養(yǎng)2周，然后停止?jié)菜?2天，突變體會全部出現(xiàn)萎蔫，野生型對照只部分出現(xiàn)萎蔫，而兩個過表達株系均無萎蔫現(xiàn)象。這說明見7 7尤 基因過表達之后明顯增強了植株的抗旱性。圖2.干旱處理后的存活率統(tǒng)計。其中Col-O為擬南芥對照植物，ugt87a2為突變體，87A20E-1和87A20E-2為兩個過表達株系。擬南芥對照植物、突變體和過表達株系正常培養(yǎng)2周，然后停止?jié)菜?2天，再恢復澆水3天，統(tǒng)計植株的存活率。結(jié)果兩個過表達株系的存活率明顯高于野生型對照及突變體。突變體 訪的存活率最低。這說明過表達株系的耐旱性最強，見7 7尤 基因過表達之后明顯增強了植株的抗旱性。圖3.離體失水率實驗。其中Col-O為擬南芥對照植物，為突變體， 87A20E-1和87A20E-2為兩個過表達株系。實驗材料是正常生長2周的擬南芥對照植物、 突變體和兩個過表達株系。選取生長狀態(tài)一致的植株，剪取地上部分，放于室溫下的臺面上，每隔20min測定植株的鮮重，計算每個時間段的離體失水率。結(jié)果2個過表達株系的離體失水率最低，說明過表達株系水分散失較慢，保水性優(yōu)于野生型對照及突變體。說明了 UGT87A2基因在增強抗旱性方面的作用。
具體實施例方式實施例I克隆擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶基因
I.擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶基因UGT87A2的克隆
通過公開網(wǎng)站http://www. cazy. org獲得泌基因的cDNA序列。根據(jù)cDNA序列設(shè)計引物，正向引物為87A2-F: 5’ -GCGTCTAGAATGGATCCAAATGAATCTCC-3’，反向引物為 87A2-R: 5’ -GCGGAGCTCTTAAITTGTAITGGTAATAT-3’。利用 TRIzol 試劑盒提取擬南芥 RNA， RT-PCR方法擴增見7 7尤 基因的全長cDNA序列。將cDNA克隆的過程是先經(jīng)過油a I和 Sac I酶切，之后連入相應(yīng)酶切的pBluescript II SK(+)載體中，構(gòu)建成測序中間載體，稱為pK87A2,然后用載體進行基因全長PCR擴增和ZAa I和fee I酶切驗證,最后進行序列測定，驗證克隆序列的正確性。2.擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶基因的序列信息與特性分析
UGT87A2基因的編碼區(qū)cDNA為1368bp，編碼455個氨基酸的51. 7kDa蛋白，C端具有 44個氨基酸的PSPG盒，為植物次生代謝物糖基轉(zhuǎn)移酶所共同具有的保守序列。3.擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶基因見7 7尤？的表達分析
組織特異性表達對成熟的野生型擬南芥Col-O的各個組織器官包括根、莖、蓮座葉、 莖生葉、花、角果等進行RT-PCR分析，發(fā)現(xiàn)UGT87A2在各個組織器官中都有表達。見貨沒之啟動子驅(qū)動⑶S表達為了定位見TST7A 基因表達的精細部位，將 UGT87A2啟動子區(qū)域2000bp的片段構(gòu)建到pBI121 (⑶S表達載體)，取代該載體上的35S啟動子。通過農(nóng)桿菌GV3101轉(zhuǎn)化擬南芥，最后篩選獲得/7見7 7尤 右動f: .-GUS純系植株。，萌發(fā)階段UGT87A2在根、子葉都有表達；營養(yǎng)生長階段在根、老葉葉邊緣有表達；生殖階段在花托，雄蕊，幼嫩角果與果柄的連接處，成熟角果的隔膜中都有表達。
實施例2擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶基因UGT87A2的轉(zhuǎn)基因應(yīng)用
I.含有UGT87A2編碼區(qū)cDNA表達載體的構(gòu)建
PK87A2中間測序載體經(jīng)過油a I和fee I雙酶切后，獲得帶有酶切粘性末端的全長 cDNA序列。將此基因片段與用相應(yīng)酶酶切后的PBI121載體部分相連，得到以CaMV 35S 啟動子驅(qū)動糖基轉(zhuǎn)移酶基因過表達的植物表達載體，稱為PB87A2。2.農(nóng)桿菌介導植物轉(zhuǎn)化
農(nóng)桿菌GV3101具有侵染植物和轉(zhuǎn)移基因的能力，故將構(gòu)建的UGT87A2植物表達載體 (PB87A2)轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，然后進行PCR驗證和酶切驗證。利用浸花法(一種公開的通用方法)， 使含有植物表達載體的農(nóng)桿菌GV3101浸染擬南芥花蕾。待其長出的角果成熟之后，收集 Tl代種子并在篩選培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基附加30mg/L卡那霉素)上進行篩選，將能夠正常生長的綠色轉(zhuǎn)化苗移栽至營養(yǎng)土中培養(yǎng)，分別收獲其T2代種子再進行下一輪的卡那霉素篩選， 挑選出綠苗白苗為3:1的培養(yǎng)皿。將此培養(yǎng)皿上的綠苗移栽，單株收獲種子(T3代)。對每一單株的種子部分用于卡那霉素平皿篩選，直到選出在篩選培養(yǎng)基上為全綠的株系，即為純合轉(zhuǎn)基因株系。3.轉(zhuǎn)基因植株分子鑒定
對上述轉(zhuǎn)基因植株進行基因表達水平的檢測。分別提取轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株的RNA，反轉(zhuǎn)錄后進行RT-PCR擴增，分析過表達植株和野生型植株的基因表達差異。 UGT87A2在過表達植株中的表達量都明顯高于野生型植株。利用兩個UGT87A2表達量高的株系，即87Α20Ε-1、87Α20Ε-2，來進行后續(xù)的工作。4. UGT87A2基因的抗旱性功能驗證
(I)幼苗的干旱處理實驗。將在土壤中正常生長2周的擬南芥對照植物(Col-Ο)、突變體(嘆訪7aJ )、兩個過表達株系(87Α20Ε-1、87Α20Ε-2)停止?jié)菜?2天，結(jié)果發(fā)現(xiàn)突變體全部出現(xiàn)萎蔫，野生型對照有部分出現(xiàn)萎蔫，而兩個過表達株系均無萎蔫現(xiàn)象(見附圖I)。然后再恢復澆水3天，統(tǒng)計植株的存活率。結(jié)果兩個過表達株系的存活率明顯高于野生型對照及突變體。突變體收·訪的存活率最低(見圖2)。這些結(jié)果表明見7 7尤 基因過表達之后能明顯增強植株的抗旱性。(2)各株系在添加甘露醇的培養(yǎng)基中種子萌發(fā)情況。甘露醇添加在培養(yǎng)基中可以模擬干旱環(huán)境，是一種常用的檢測植物抗旱性的方法。選取生長狀態(tài)一致的種子，滅菌后均勻鋪在含150mM、200mM、300mM甘露醇的MS培養(yǎng)基中生長3天，第三天統(tǒng)計萌發(fā)率。在低濃度甘露醇培養(yǎng)基中突變體收的萌發(fā)率明顯低于野生型Col-O和過表達株系0E-1、 0E-2，在300mM的甘露醇培養(yǎng)基中，過表達株系的萌發(fā)率明顯高于野生型和突變體，表明 UGT87A2基因具有增強抗旱性的作用。(3)甘露醇培養(yǎng)基中的水平培養(yǎng)實驗。選取生長狀態(tài)一致的種子，滅菌后均勻鋪在含0、150禮、2001111、3001111甘露醇的]^培養(yǎng)基中生長7天，統(tǒng)計子葉的綠化率。在150mM甘露醇培養(yǎng)基中突變體ugt87a2形成正常小苗的數(shù)量即子葉綠化率9. 8%，明顯低于野生型和 2個過表達株系，過表達株系的子葉綠化率最高。因此，UGT87A2基因過表達之后明顯增強
5植株的對甘露醇(干旱環(huán)境)的耐受性。(4)離體失水率實驗。實驗材料是正常生長2周的擬南芥對照植物、突變體和兩個過表達株系。選取生長狀態(tài)一致的植株，剪取地上部分，放于室溫下的臺面上，每隔20min 測定植株的鮮重，計算每個時間段的離體失水率。結(jié)果2個過表達株系的離體失水率最低， 說明過表達株系水分散失較慢，保水性優(yōu)于野生型對照及突變體。再次說明了 UGT87A2基因在增強抗旱性方面的作用(見附圖3)。
權(quán)利要求
1.擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶基因UGT87A2在提高植物耐旱性中的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其特征在于所述糖基轉(zhuǎn)移酶基因UGT87A2的核苷酸序列如SEQ ID No. I所示。
3.如權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其特征在于所述植物是十字花科植物。
4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述十字花科植物是擬南芥、芥菜、油菜、 白菜或甘藍。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶基因UGT87A2在提高植物耐旱性中的應(yīng)用，其中所述糖基轉(zhuǎn)移酶基因UGT87A2的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，其是通過RT-PCR技術(shù)從擬南芥中克隆的。本發(fā)明利用基因UGT87A2構(gòu)建植物過表達載體，進行植物轉(zhuǎn)基因操作，獲得轉(zhuǎn)基因植物。檢測表明轉(zhuǎn)基因植物的耐旱性得到顯著提高，預示本發(fā)明實施后將會創(chuàng)造新型耐旱植物，可用于后續(xù)的作物品種改良，對我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有重大意義。
文檔編號A01H5/00GK102604976SQ20121008134
公開日2012年7月25日 申請日期2012年3月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月26日
發(fā)明者侯丙凱, 王波 申請人:山東大學