專利名稱：應(yīng)用乳腺上皮細(xì)胞制備乳腺特異性表達(dá)轉(zhuǎn)基因動物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及動物乳腺上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)基因技術(shù)；轉(zhuǎn)基因乳腺上皮細(xì)胞誘導(dǎo)表達(dá)技術(shù)及轉(zhuǎn)基因乳腺上皮細(xì)胞核移植技術(shù)。
背景技術(shù)：
體外轉(zhuǎn)染外源基因的細(xì)胞作為供核細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞核移植可以獲得絕大部分整合外源基因的動物，此方法與傳統(tǒng)的顯微注射相比效率得到了明顯提高。但是，由于外源基因整合位置效應(yīng)，在這些轉(zhuǎn)基因后代中僅有一部分具有表達(dá)外源基因的功能，因而其效率仍然較低。如果能在細(xì)胞核移植之前獲得具有表達(dá)潛能的細(xì)胞系，將進(jìn)一步提高轉(zhuǎn)基因動物的效率。乳腺上皮細(xì)胞具有合成和分泌乳汁的功能，是乳腺生物反應(yīng)器的靶細(xì)胞，可以用體外培養(yǎng)的乳腺上皮細(xì)胞作為轉(zhuǎn)基因載體，可以預(yù)測將要獲得的轉(zhuǎn)基因動物的表達(dá)特性，這可以減少實驗動物的數(shù)量，縮短研發(fā)時間，提高效率。本發(fā)明應(yīng)用乳腺上皮細(xì)胞誘導(dǎo)表達(dá)技術(shù)和體細(xì)胞克隆技術(shù)，制備高效乳腺特異性表達(dá)轉(zhuǎn)基因動物，從而獲得表達(dá)外源基因的轉(zhuǎn)基因動物，達(dá)到轉(zhuǎn)基因的最終目標(biāo)。動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)在農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)和基礎(chǔ)研究中有廣泛的應(yīng)用，乳腺上皮細(xì)胞能合成并分泌目的蛋白到培養(yǎng)液中，通過檢測誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白產(chǎn)物來篩選高效表達(dá)的細(xì)胞，該方法成本低、可靠性高。本專利可應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因乳腺生物反應(yīng)器制備、轉(zhuǎn)基因家畜育種及轉(zhuǎn)基因動物模型的制備及乳腺特異表達(dá)載體的效能評估。

發(fā)明內(nèi)容
外源基因在動物乳腺特異性表達(dá)可用于制備轉(zhuǎn)基因動物乳腺生物反應(yīng)器，也可用于奶牛、奶山羊等乳品改良及轉(zhuǎn)基因動物新品種培育。在乳腺特性表達(dá)轉(zhuǎn)基因動物制備中， 獲得高效表達(dá)動物是其最終目的，但通過現(xiàn)有技術(shù)制備乳腺特異性表達(dá)轉(zhuǎn)基因動物的效率較低，雖然通過體細(xì)胞克隆技術(shù)可以得到隨機整合動物，但這些整合個體中僅有少部分具有外源基因表達(dá)功能。如果在制備轉(zhuǎn)基因動物的前期(細(xì)胞培養(yǎng)階段)就能對選擇的細(xì)胞系是否具有潛在的個體表達(dá)功能，將大大提高轉(zhuǎn)基因動物制備效率。本發(fā)明提供了一種高效制備乳腺特異性表達(dá)轉(zhuǎn)基因動物的技術(shù)。本發(fā)明的技術(shù)方案為動物乳腺上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)基因一轉(zhuǎn)基因乳腺上皮細(xì)胞誘導(dǎo)表達(dá) —具有表達(dá)功能的乳腺上皮細(xì)胞核移植一獲得乳腺特性表達(dá)轉(zhuǎn)基因動物。一種應(yīng)用乳腺上皮細(xì)胞制備乳腺特異性表達(dá)轉(zhuǎn)基因動物的方法，包括以下步驟
(1)外源基因通過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的乳腺上皮細(xì)胞，并應(yīng)用催乳素3_8μΜ誘導(dǎo)表達(dá)；(2)篩選獲得高效表達(dá)乳腺上皮細(xì)胞系；(3)高效表達(dá)細(xì)胞系進(jìn)行一步或二步細(xì)胞核移植，獲得乳腺特異性表達(dá)個體。本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的技術(shù)方案推薦步驟(2)具體為取每株細(xì)胞中的1/2-1/3細(xì)胞傳代培養(yǎng)至50-80%豐度時在培養(yǎng)液中添加催乳素(3_8μΜ)誘導(dǎo)外源基因的表達(dá)，在 24-96小時取上清液進(jìn)行外源基因表達(dá)檢測(ELISA或其它生物檢測手段)。
本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案還有在步驟(3)具體為用篩選到高表達(dá)細(xì)胞系作為供核細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞核移植.其中部分20-50天的克隆胎兒進(jìn)行二次核移植，提高獲得表達(dá)個體頻率。本發(fā)明可提高轉(zhuǎn)基因動物制備效率，節(jié)省材料60%_80%，縮短轉(zhuǎn)基因動物研究開發(fā)時間。本發(fā)明可用于基因構(gòu)件表達(dá)性能評估、轉(zhuǎn)基因動物乳腺生物反應(yīng)器研制、生物制藥、 動物轉(zhuǎn)基因生物新品種培育等。


圖1是表達(dá)載體基本結(jié)構(gòu)。圖2是乳腺特異性表達(dá)轉(zhuǎn)基因動物的制備方法示意圖。圖3是用于轉(zhuǎn)染乳腺上皮細(xì)胞的pBnCL14線性DNA結(jié)構(gòu)圖。
具體實施例方式實驗材料
培養(yǎng)液DMEM/F12 ；胎牛血清FCS ；電轉(zhuǎn)染液(Hypoosmolar Buffer)從^pendorf公司購；FSH，LHRH和PG從寧波激素廠購；其他涉及的化學(xué)試劑均可從Sigma公司或國內(nèi)其它生物工程公司購得.實驗用山羊。.人溶菌酶轉(zhuǎn)基因乳腺上皮細(xì)胞制備 2.1乳腺上皮細(xì)胞分離和培養(yǎng)
無菌手術(shù)切取大約5 g左右的泌乳期山羊乳腺組織，組織剪成約1 mm3大小，用I型膠原/透明質(zhì)酸酶消化液(含I型膠原酶200 IU/mL，透明質(zhì)酸酶100 IU/mL)振蕩消化，收集細(xì)胞懸液，D-hank’ s洗滌3次，細(xì)胞計數(shù)并用培養(yǎng)液(含DMEM/F12，10% FCS,乙酸鈉5 mmol/L，轉(zhuǎn)鐵蛋白5 Pg/mL，乙醇胺0. 5 mmol/L，胰島素10 Pg/mL，氫化可的松5 Pg/mL)以 4X IO5個/mL接種于六孔細(xì)胞培養(yǎng)板，置CO2培養(yǎng)箱中37°C、5%C02、飽和濕度下靜置培養(yǎng)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染、篩選
用5 / I和Λ^ I雙酶切pBnCL14質(zhì)粒(圖3)(可參考成勇博士論文，2007年，乳蛋白與CMV復(fù)合啟動子驅(qū)動hLF cDNA乳腺特異性表達(dá))獲得線性化人溶菌酶乳腺特異性表達(dá)載體(圖2)，經(jīng)QIAEX試劑盒回收。收集對數(shù)期乳腺上皮細(xì)胞，用電轉(zhuǎn)染液洗滌離心后重懸細(xì)胞密度至 1 X IO6 個 /mL,加入 DNA 使終濃度為 8_2(^g/mL，以 1. 0-2. 0 KV/cm, 50-100 Ps 的條件電擊一次，轉(zhuǎn)染后400 Pg/mL G418篩選，挑取克隆細(xì)胞以200-30(^g/mL G418維持培養(yǎng)。細(xì)胞整合和表達(dá)產(chǎn)物的檢測.冷凍細(xì)胞同時每孔取一半擴(kuò)增至80%的豐度后，在培養(yǎng)液中加入催乳素(3_8μΜ)誘導(dǎo)人溶菌酶的表達(dá)，48 h后收集培養(yǎng)液進(jìn)行SDS-PAGE電泳和 Western-blot 檢測。.供體羊與受體羊的準(zhǔn)備
供體羊和受體羊均為波爾山羊與長江白山羊雜交羊.供體羊注射PG，于發(fā)情后第9 13天開始超排。連續(xù)3天注射FSH，每天2次，總劑量260 300單位。第4天下午注射 PG,第5天注射50單位LHRH。受體羊的同步除不注射FSH外均同供體羊。.供核細(xì)胞與卵母細(xì)胞的準(zhǔn)備冷凍乳腺上皮細(xì)胞解凍后培養(yǎng)至80%匯合后，在0. 5% FCS培養(yǎng)液中饑餓48小時，于核移植前2小時胰蛋白酶消化處理，用M2懸浮細(xì)胞備用。卵母細(xì)胞在注射⑶冊后沈 30 小時輸卵管手術(shù)沖取，用透明質(zhì)酸酶消化并吹打去除顆粒細(xì)胞。.核移植、融合和激活
卵母細(xì)胞預(yù)先置于含7. 5 Pg/mL CB的M2中處理20 min，重構(gòu)胚移入M16中培養(yǎng)30 60 min后開始融合(融合液0. 3 mmol/L甘露醇、0. 05 mmol/L氯化鈣、0. lmmol/L硫酸鎂、 3% BSA)，條件為2. 1 KV/cm、40 Ps、2個脈沖。在激活液(5 Mmol/L離子霉素+ 7.5 mg/mL CB)中5 min ；然后移入M16中短暫培養(yǎng)直到胚胎移植。.胚胎移植
激活后培養(yǎng)的胚胎手術(shù)法移入同步發(fā)情受體的輸卵管內(nèi)，每只受體移植4 15枚胚胎.在胚胎移植后30、60和90天進(jìn)行B超診斷妊娠情況。.轉(zhuǎn)基因羊鑒定
引物設(shè)計應(yīng)用I^imer Premier5. 0軟件，為了提高PCR檢測的可靠性，引物的上游引物以Pcmv或5 ’端調(diào)控序列下游部分為模板，下游引物以hLF為模板的跨接頭設(shè)計，擴(kuò)增產(chǎn)物為 550 IOOObp0PCR反應(yīng)混合物組成 組成成分
①IOXbuffer (含 Mg)
②dNTP(IOmM)
③permier I(20uM)
④permier II(20uM)
⑤Taq (5u/μ 1)
⑥模板DNA
⑦滅菌蒸餾水PCR循環(huán)參數(shù)(熱啟動法) 95 0C變性5min ；(加聚合酶)；94°C變性45s，56-61 °C復(fù)性45s，72 °C延伸30s，共
20-30個循環(huán)；然后72°C延伸lOmin，最后于4°C保溫。PCR產(chǎn)物于1. 4%凝膠中電泳。
加入量
5 μ 1 1 μ 1 1 μ 1 1 μ 1 0. 5μ 1
1 μ 1 up to 50 μ L0
終濃度
IX 200uM 0. 4uM 0. 4uM
200ng
權(quán)利要求
1.應(yīng)用乳腺上皮細(xì)胞制備乳腺特異性表達(dá)轉(zhuǎn)基因動物的方法，包括以下步驟(1)將外源基因通過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的乳腺上皮細(xì)胞，并應(yīng)用催乳素3-8μΜ誘導(dǎo)表達(dá)；(2)篩選獲得高效表達(dá)乳腺上皮細(xì)胞系；(3)高效表達(dá)細(xì)胞系進(jìn)行一步或二步細(xì)胞核移植，獲得乳腺特異性表達(dá)個體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用乳腺上皮細(xì)胞制備乳腺特異性表達(dá)轉(zhuǎn)基因動物的方法， 其特征在于步驟(2)中，取每株細(xì)胞中的1/2-1/4的細(xì)胞傳代培養(yǎng)至80%豐度，在培養(yǎng)液中添加催乳素3-8μΜ誘導(dǎo)外源基因的表達(dá)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述應(yīng)用乳腺上皮細(xì)胞制備乳腺特異性表達(dá)轉(zhuǎn)基因動物的方法，其特征在于分別在Μ-96小時取細(xì)胞上清液進(jìn)行表達(dá)產(chǎn)物檢測。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述應(yīng)用乳腺上皮細(xì)胞制備乳腺特異性表達(dá)轉(zhuǎn)基因動物的方法，其特征在于細(xì)胞核移植所用的供核細(xì)胞是經(jīng)步驟(2)和(3)篩選的特殊細(xì)胞系。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述應(yīng)用乳腺上皮細(xì)胞制備乳腺特異性表達(dá)轉(zhuǎn)基因動物的方法，其特征還在于乳腺上皮細(xì)胞體細(xì)胞核移植后20-50天的胎兒用作供核細(xì)胞，進(jìn)行二步克隆。
全文摘要
本發(fā)明涉及應(yīng)用乳腺上皮細(xì)胞制備乳腺特異性表達(dá)轉(zhuǎn)基因動物的方法，該方法包括以下步驟(1)將外源基因通過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的乳腺上皮細(xì)胞，并應(yīng)用催乳素3-8μM誘導(dǎo)表達(dá)；(2)篩選獲得高效表達(dá)乳腺上皮細(xì)胞系；(3)高效表達(dá)細(xì)胞系進(jìn)行一步或二步細(xì)胞核移植，獲得乳腺特異性表達(dá)個體。本發(fā)明方法可提高轉(zhuǎn)基因動物制備效率，應(yīng)用該技術(shù)可以在細(xì)胞篩選階段預(yù)測其轉(zhuǎn)基因動物的表達(dá)特性，提高乳腺特異表達(dá)轉(zhuǎn)基因動物制備效率3倍。由于整合的位置效應(yīng)，獲得的轉(zhuǎn)基因個體表達(dá)幾率在10-30%，并且可能出現(xiàn)低水平表達(dá)。應(yīng)用這一技術(shù)系統(tǒng)可在制備轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的同時鑒定將要獲得個體的表達(dá)潛能，從而獲得更多的表達(dá)動物。
文檔編號A61D19/04GK102358894SQ201110308200
公開日2012年2月22日 申請日期2011年10月12日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月12日
發(fā)明者成勇, 袁玉國 申請人:揚州大學(xué)