專利名稱：用于減少免疫應(yīng)激的酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了用于減少免疫應(yīng)激和改善動物生長表現(xiàn)的組合物和方法。特別地， 本發(fā)明提供了包含酶的組合物，所述酶有效減少免疫應(yīng)激、或有效治療或預(yù)防感染、或有效改善動物生長表現(xiàn)。本發(fā)明還提供了使用所述組合物的方法。
曲旦冃足動物可能因?yàn)樵S多原因經(jīng)歷免疫應(yīng)激，包括對動物的免疫系統(tǒng)所識別的抗原的暴露?？乖赡苡|發(fā)免疫應(yīng)答，所述免疫應(yīng)答是適應(yīng)性免疫應(yīng)答或者是先天免疫應(yīng)答。當(dāng)免疫應(yīng)答被觸發(fā)時，隨著動物的免疫系統(tǒng)響應(yīng)于所察覺到的威脅，動物經(jīng)歷了免疫應(yīng)激。通常， 免疫應(yīng)激阻礙動物的生長表現(xiàn)。急性期蛋白(APP)是一組血液蛋白，當(dāng)動物經(jīng)歷著應(yīng)激，例如感染、炎癥、手術(shù)創(chuàng)傷、或其他內(nèi)部或外部攻擊時，它們的血液濃度改變。參見，例如，Murata et al. , Vet. J. 168 :28 (2004)。APP被認(rèn)為在動物的先天免疫應(yīng)答中起到作用。例如，APP可能參與恢復(fù)穩(wěn)態(tài)和限制微生物生長直到發(fā)展出獲得性免疫。APP包括濃度在應(yīng)激時降低的“陰性”蛋白，和濃度在應(yīng)激時提高的“陽性”蛋白。 參見，例如，Murata et al.，同上。陰性APP包括白蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白。陽性APP包括在促炎細(xì)胞因子刺激時由肝細(xì)胞合成的、并釋放到血流中的蛋白，例如觸珠蛋白、C-反應(yīng)蛋白、血清淀粉樣蛋白A、血漿銅藍(lán)蛋白、纖維蛋白原和α-1-酸性糖蛋白(AGP)。對于大多數(shù)哺乳動物物種也已經(jīng)報(bào)道了肝臟外的APP產(chǎn)生。同上。促炎細(xì)胞因子例如白細(xì)胞介素-6 (IL-6) 和腫瘤壞死因子α (TNF-α)被認(rèn)為是肝臟中APP合成的主要介導(dǎo)物。炎癥、感染或組織損傷觸發(fā)防御定向細(xì)胞釋放細(xì)胞因子，從而誘導(dǎo)APP合成。陽性APP的誘導(dǎo)還與陰性APP的合成減少相關(guān)。同上。已經(jīng)確立了定量APP的方法，循環(huán)APP濃度(例如，APP的血清水平)已經(jīng)與動物狀況的嚴(yán)重度相關(guān)聯(lián)。同上。因而，APP濃度可以用作動物免疫應(yīng)激水平的指標(biāo)。動物的免疫系統(tǒng)可以識別對動物的健康不構(gòu)成實(shí)際威脅的抗原，例如在動物飼料組合物中的植物和動物來源的成分。這些抗原可能觸發(fā)免疫應(yīng)答，例如先天免疫應(yīng)答，從而引起動物經(jīng)歷免疫應(yīng)激。這種應(yīng)激反應(yīng)可以通過血清APP濃度來鑒定和監(jiān)視。即使當(dāng)免疫觸發(fā)抗原不對動物的健康構(gòu)成實(shí)際威脅時，應(yīng)激反應(yīng)可能具有有害的影響。例如，這可以作為飼料轉(zhuǎn)化的降低、體重增加速率的降低或體重的降低、對感染的敏感度的提高、體溫的提高來觀察到。已經(jīng)描述了利用抗體，例如抗磷脂酶Α2抗體來減少動物中的胃腸炎癥。參見，例如美國專利No. 6，383，485。已經(jīng)描述了飼料組合物，其包含能夠降解含β-甘露聚糖的半纖維素的半纖維素酶(例如，0-甘露聚糖酶型半纖維素酶)，例如，內(nèi)_1，4-0-甘露聚糖酶，或磷脂酶，例如磷脂酶Α2，用于改善飼料轉(zhuǎn)化。參見，例如，WO 97/41739、美國專利No. 6，162，473 和美國專利 No. 6，183，739。同樣描述了包含酶，例如PI-PLC的飼料組合物，其裂解鍵，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞表面蛋白質(zhì)或碳水化合物的釋放，用于治療或預(yù)防消化道感染。參見，例如，WO 01/41785。Walsh et al.，J. Anim. Sci. 73 1074 (1995)，討論了包含葡聚糖酶的飼料組合物，所述酶裂解混合的連接葡聚糖底物，例如，裂解混合的β_1，3、β_1，4底物的1，4-α-葡聚糖酶。然而，在我們的測試中，PI-PLC和1，4-β -葡聚糖酶都沒有顯示減少免疫應(yīng)激的活性。迄今還沒有描述包含除了 β-甘露聚糖酶型半纖維素酶或磷脂酶之外的、并以有效減少免疫應(yīng)激的量存在的酶的飼料組合物。因而，需要用于在動物中減少免疫應(yīng)激的組合物和方法。 發(fā)明概述一個實(shí)施方式提供了適合于向動物口服施用的組合物，其包含口服可接受的載體中的減少免疫應(yīng)激的酶。所述組合物選自下組(i)動物飼料，其包含有效降低動物中陽性急性期蛋白的水平、提高動物中陰性急性期蛋白的水平、和/或改善動物生長表現(xiàn)的量的酶；(ii)除了動物飼料之外的液體組合物，其包含至少40，000IU酶/L ；和(iii)除了動物飼料之外的固體組合物，其包含至少40，000IU酶/kg。所述酶不是β-甘露聚糖酶型半纖維素酶或磷脂酶，并且如果所述酶包含1，3- β -葡聚糖酶，所述組合物選自下組(i)包含至少20IU 1，3-β-葡聚糖酶/kg飼料的動物飼料；(ii)除了動物飼料之外的液體組合物， 其包含至少155，000IU 1，3-β-葡聚糖酶/L;和(iii)除了動物飼料之外的固體組合物， 其包含至少300，000IU 1，3-β-葡聚糖酶。在一個實(shí)施方式中，所述組合物是包含至少20IU酶/kg飼料的動物飼料。在另一個實(shí)施方式中，所述組合物是除了動物飼料之外的固體組合物，其包含至少80，000IU酶/ kg、或至少 160，000IU 酶 /kg。在一個實(shí)施方式中，所述組合物是動物飼料，其包含誘導(dǎo)動物中的免疫應(yīng)答的成分，所述酶包含降解所述成分的酶。在一個實(shí)施方式中，所述成分是病原微生物展示的抗原。在一個實(shí)施方式中，所述酶包含1，3-β-葡聚糖酶。在一個實(shí)施方式中，所述酶包含1，3-β-葡聚糖酶，所述組合物選自下組(i)包含至少30IU 1，3-β-葡聚糖酶/kg飼料的動物飼料；( )除了動物飼料之外的液體組合物，其包含至少230，000IU 1，3_β -葡聚糖酶/L ；和(iii)除了動物飼料之外的固體組合物，其包含至少450，000IU 1，3-β-葡
聚糖酶/kg。另一個實(shí)施方式提供了適合于向動物口服施用的組合物，其包含兩種或更多種減少免疫應(yīng)激的酶，其中所述組合物包含除了 1，4-β-甘露聚糖酶和1，3-β-葡聚糖酶之外的至少一種減少免疫應(yīng)激的酶。所述組合物選自下組(i)動物飼料，其包含有效降低所述動物中陽性急性期蛋白的水平、提高所述動物中陰性急性期蛋白的水平、和/或改善動物生長表現(xiàn)的量的所述減少免疫應(yīng)激的酶；(ii)除了動物飼料之外的液體組合物，其包含至少一種減少免疫應(yīng)激的酶，含量為至少40，000IU酶/L ；和(iii)除了動物飼料之外的固體組合物，其包含至少一種減少免疫應(yīng)激的酶，含量為至少40，000IU酶/L。在一個實(shí)施方式中，所述組合物是動物飼料，其包含至少一種減少免疫應(yīng)激的酶， 含量為至少20IU酶/kg飼料。在另一個實(shí)施方式中，所述組合物是除了動物飼料之外的固體組合物，其包含至少一種減少免疫應(yīng)激的酶，含量為至少80，000IU酶/kg、或至少 160，000IU 酶/kg。在特定的實(shí)施方式中，所述組合物選自下組(i)包含1，4-β_甘露聚糖酶和幾丁質(zhì)酶的組合物；( )包含1，4-β -甘露聚糖酶和木葡聚糖酶的組合物；(iii)包含1， 4-β-甘露聚糖酶和阿拉伯聚糖酶的組合物；(iv)包含1，3-β-葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶的組合物；(ν)包含1，3-β-葡聚糖酶和木葡聚糖酶的組合物；(vi)包含1，3-β-葡聚糖酶和阿拉伯聚糖酶的組合物，和(vii)包含1，4-β-甘露聚糖酶、1，3-β-葡聚糖酶和阿拉伯聚糖酶的組合物。另一個實(shí)施方式提供了適合于向動物口服施用的組合物，其包含1，4- β -甘露聚糖酶和1，3- β -葡聚糖酶。所述組合物選自下組(i)包含1，4- β -甘露聚糖酶和至少20IU 1，3-β-葡聚糖酶/kg飼料的動物飼料，(ii)除了動物飼料之外的液體組合物，其包含1， 4-β-甘露聚糖酶和至少155，000IU 1，3-β-葡聚糖酶/L，和(iii)除了動物飼料之外的固體組合物，其包含1，4- β -甘露聚糖酶和至少300，000IU 1，3- β -葡聚糖酶/kg。在一個實(shí)施方式中，所述組合物選自下組(i)包含1，4-β-甘露聚糖酶和至少30IU 1，3-β-葡聚糖酶/kg飼料的動物飼料；(ii)除了動物飼料之外的液體組合物，其包含1，4-β -甘露聚糖酶和至少230，000IU 1，3-0-葡聚糖酶/1，和(iii)除了動物飼料之外的固體組合物， 其包含1，4- β -甘露聚糖酶和至少450，000IU 1，3- β -葡聚糖酶/kg。在一個實(shí)施方式中， 所述組合物進(jìn)一步包含一種或多種其他的減少免疫應(yīng)激的酶。另一個實(shí)施方式提供了改善動物生長表現(xiàn)和/或減少動物中的免疫應(yīng)激的方法， 包括向所述動物口服施用任何如上所述的組合物。在一個實(shí)施方式中，所述動物施用了誘導(dǎo)動物中的免疫應(yīng)答的成分，并且所述組合物包含降解所述成分的至少一種減少免疫應(yīng)激的酶。在一個實(shí)施方式中，所述成分和酶在同一組合物中施用。在一個實(shí)施方式中，所述組合物是動物飼料。在一個實(shí)施方式中，所述成分是病原微生物展示的抗原。另一個實(shí)施方式提供了預(yù)防或治療與展示抗原的病原微生物相關(guān)的感染的方法， 包括向有需要的動物口服施用任何如上所述的組合物，其中所述組合物包含降解抗原的至少一種減少免疫應(yīng)激的酶。
附圖的簡要說明附


圖1顯示了用于使用實(shí)施例1中獲得的數(shù)據(jù)計(jì)算測試雞的血漿樣品中雞 α-1-酸性糖蛋白(AGP)的濃度的最佳曲線擬合(和基礎(chǔ)多項(xiàng)式方程)。附圖2是圖示來自測試雞的雞血清中AGP水平的Box和Wisker圖表，如實(shí)施例2 所描述。數(shù)據(jù)的范圍由垂直線條代表。方框代表平均值的一個標(biāo)準(zhǔn)差內(nèi)的數(shù)據(jù)的范圍。水平的線條代表數(shù)據(jù)平均值。附圖3顯示了來自接受幾種不同飼料之一的雞的血清的AGP水平，包括根據(jù)本發(fā)明的飼料和現(xiàn)有技術(shù)的飼料，如實(shí)施例3中描述的。附圖4顯示了用于使用實(shí)施例8中獲得的數(shù)據(jù)計(jì)算測試火雞的血漿樣品中AGP濃度的最佳曲線擬合(和基礎(chǔ)多項(xiàng)式方程)。
詳細(xì)說明如以下的討論中使用的，術(shù)語“一個”或“一種”應(yīng)當(dāng)理解為包括一個或多個，除非另作說明。如在此使用的，術(shù)語“動物”是指任何動物，包括人類和其他動物，例如非人動物， 包括寵物，例如狗和貓，家畜，例如牛和其他反芻動物、水牛、馬、豬、綿羊，家禽(例如，雞、 鴨、火雞和鵝)和水產(chǎn)業(yè)動物(例如，魚和蝦和鰻)。在本說明書中，用語“降解抗原的酶”和“降解成分的酶”是指所述酶將抗原或成分轉(zhuǎn)化成不被動物的免疫系統(tǒng)識別的形式。酶降解抗原或成分的能力可以通過測量動物的血清APP濃度來鑒定，從而陽性APP的血清濃度降低、或陰性APP的血清濃度提高表明所述酶降解了所述抗原或成分。如上所述，術(shù)語“APP”包括濃度在應(yīng)激時降低的“陰性”蛋白，和濃度在應(yīng)激時提高的“陽性”蛋白。本發(fā)明包括提高陰性急性期蛋白的濃度的組合物和方法，所述陰性急性期蛋白的濃度一般在應(yīng)激時降低，還包括降低陽性急性期蛋白的濃度的組合物和方法，所述陽性急性期蛋白的濃度一般在應(yīng)激時提高。為了方便起見，在以下的論述中，本發(fā)明參考針對陽性急性期蛋白的組合物和方法的效果來進(jìn)行例證。因而，術(shù)語“APP”在以下的論述中泛指與動物的應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)的任何一種或多種陽性急性期蛋白。要理解的是，在此描述為降低“APP”(是指陽性急性期蛋白)濃度的組合物和方法的對于提高陰性急性期蛋白的濃度也是有用的。本發(fā)明的一個方面涉及包含酶的組合物，所述酶有效減少動物經(jīng)歷的免疫應(yīng)激。 為了方便起見，這些酶在此稱為“減少免疫應(yīng)激的”酶。如在此使用的，術(shù)語“減少免疫應(yīng)激的酶”是指任何以下這樣的酶其降解動物的免疫系統(tǒng)所識別的抗原或分子模式，例如， 觸發(fā)免疫應(yīng)答從而引起動物經(jīng)歷免疫應(yīng)激的抗原或分子模式。如在此使用的術(shù)語“分子模式”包括一般的分子模式，其在先天免疫系統(tǒng)的環(huán)境中被受體結(jié)合，例如通常與病原體相關(guān)的分子的模式。根據(jù)一個實(shí)施方式，所述減少免疫應(yīng)激的酶不是β -甘露聚糖酶型半纖維素酶。 根據(jù)一個實(shí)施方式，減少免疫應(yīng)激的酶不是內(nèi)-1，4- β -D-甘露聚糖酶。根據(jù)另一個實(shí)施方式，所述酶不是磷脂酶。根據(jù)另一個實(shí)施方式，所述減少免疫應(yīng)激的酶不是1，4- β -D-葡聚糖酶。根據(jù)另一個實(shí)施方式，所述減少免疫應(yīng)激的酶不是PI-PLC。根據(jù)另一個實(shí)施方式，所述減少免疫應(yīng)激的酶不是甘露聚糖酶型半纖維素酶或磷脂酶。根據(jù)又一個實(shí)施方式， 所述減少免疫應(yīng)激的酶不是β -甘露聚糖酶型半纖維素酶、不是1，4- β -葡聚糖酶、并且不是磷脂酶。根據(jù)進(jìn)一步的實(shí)施方式，所述減少免疫應(yīng)激的酶不是甘露聚糖酶型半纖維素酶、不是1，4-β-葡聚糖酶、不是磷脂酶、并且不是PI-PLC。根據(jù)任何以上描述的實(shí)施方式的一個方面，所述酶不是1，3- β -葡聚糖酶。雖然不希望受到任何理論的限制，本發(fā)明人相信，減少免疫應(yīng)激的酶對抗原或分子模式的降解抑制或減少了所述抗原或分子模式觸發(fā)的免疫應(yīng)答，從而減少動物的免疫應(yīng)激。免疫應(yīng)激的減少可以通過使用用于定量APP的本領(lǐng)域已知的方法測量動物的血清APP 濃度來鑒定和監(jiān)視。這些方法的實(shí)例在Murata，et al.，同上中提及，并在Hulten et al.， Vet. Microbiol. 95 :75 0003)和Holt et al.，同上中描述和提及，以及在以下的實(shí)施例1 中提及。在相關(guān)的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了減少動物中免疫應(yīng)激的方法，其包括向所述動物施用組合物，所述組合物包含有效降低所述動物中APP水平的量的減少免疫應(yīng)激的酶。已經(jīng)鑒定了許多不同的陽性急性期蛋白，包括α -1-酸性糖蛋白(AGP)、血漿銅藍(lán)蛋白(Cp)、膠原凝素家族的蛋白(例如，肺表面活性蛋白、共凝集素和結(jié)合甘露聚糖的凝集素)、纖維蛋白原(冊)、C-反應(yīng)蛋白(CRP)、觸珠蛋白、蛋白酶抑制物(例如，α-Ι-抗胰蛋白酶、α-l-抗胰凝乳蛋白酶和α-2-巨球蛋白)和血清淀粉樣蛋白-A(SAA)。其他潛在的APP包括脂多糖結(jié)合蛋白(LPB)、磷脂結(jié)合蛋白例如膜聯(lián)蛋白，和主要急性期蛋白(MAP)。 Murata, et al.，同上。這些或其他APP的任何一種的血清濃度可以用于根據(jù)本發(fā)明鑒定、 評定和監(jiān)視酶活性。不同的APP可能在不同的動物的應(yīng)激反應(yīng)中起到更顯著的作用。例如，已知AGP 在牛中是臨床重要的，并且在豬、狗、貓和雞(包括母雞)中與感染相關(guān)。已經(jīng)報(bào)道了 Cp是牛、馬和雞中感染的指標(biāo)。已經(jīng)在反芻動物、馬、豬、狗和貓中鑒定了 CRP，然而沒有顯示CRP 是牛中的APP。已經(jīng)顯示了 CRP與馬和豬中的感染相關(guān)聯(lián)。冊是牛和羊中炎癥、細(xì)菌感染或手術(shù)創(chuàng)傷的可靠指標(biāo)，并且與馬中的感染相關(guān)聯(lián)。Hp是許多生產(chǎn)動物和寵物中的APP，包括反芻動物，例如牛、綿、豬、馬和狗。SAA與牛中的炎癥和感染相關(guān)聯(lián)，并且與馬、豬、寵物例如狗和雞中的感染相關(guān)聯(lián)。已經(jīng)在患有乳腺炎的母牛和母羊中發(fā)現(xiàn)了 SAA乳水平的提高。 血清LBP已經(jīng)與牛中的感染相關(guān)聯(lián)，膜聯(lián)蛋白的局部水平也是(在感染的牛的肺中分泌上皮的表面上)。報(bào)道了 MAP是豬中感染的指標(biāo)。另外，雖然轉(zhuǎn)鐵蛋白通常被認(rèn)為是陰性急性期蛋白，它看起來在雞中作為陽性急性期蛋白起作用。Murata，et al，同上；Holt et al., Poultry Sci. 81 1295-130(^2002)。其他還報(bào)道了 SAA 和 Hp、以及 CRP 和 MAP 與豬中的感染相關(guān)聯(lián)。Hulten et al.，同上。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的組合物包含有效降低動物中APP的血清濃度的量的減少免疫應(yīng)激的酶。所述量可以取決于所述動物和所述減少免疫應(yīng)激的酶而變化，可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員使用本領(lǐng)域已知的方法容易地確定。例如，可以在施用所述酶之前或之后測量動物的血清APP水平，或者可以比較等同處理的動物和對照動物的血清APP水平。(就此來說，可能有益的是比較相同年齡的處理的和對照動物，因?yàn)锳PP水平可能隨年齡而改變。例如，我們發(fā)現(xiàn)血清AGP水平隨著雞的年齡提高。)與所述酶的施用相關(guān)的血清APP濃度的降低表明施用了有效量的酶。在其他實(shí)施方式中，本發(fā)明的組合物包含有效改善動物生長表現(xiàn)(也稱為“存活表現(xiàn)”，特別是在家禽領(lǐng)域)的量的減少免疫應(yīng)激的酶。如在此使用的，用語“動物生長表現(xiàn)”包括反映動物生長的任何參數(shù)，包括飼料轉(zhuǎn)化、水?dāng)z取、糞便水含量、動物的群或組之內(nèi)的體重均勻性、存活率和死亡率。雖然不希望受到任何理論的限制，相信的是，在某些條件下，減少免疫應(yīng)激的酶對APP濃度的影響被因子例如免疫應(yīng)激誘導(dǎo)因子所屏蔽，例如，在動物群體中低水平感染的存在或緊張的生活條件。在這些條件之下，盡管如此，減少免疫應(yīng)激的酶可有效改善動物生長表現(xiàn)。因而，動物生長表現(xiàn)是本發(fā)明的組合物和方法的有效性的備選度量。所述組合物可以是適合于向動物施用的任何組合物。在一個實(shí)施方式中，所述組合物適合于口服施用。在一個特定的實(shí)施方式中，適合于口服施用的所述組合物一般被認(rèn)為對于向動物口服施用是安全的。在另一個特定的實(shí)施方式中，適合于口服施用的所述組合物僅含有一般被認(rèn)為對于向動物口服施用是安全的成分，以及所述成分的量。在另一個特定的實(shí)施方式中，適合于口服施用的所述組合物不含有一般認(rèn)為對于向動物口服施用不安全的任何成分，或所述成分的量。在另一個特定的實(shí)施方式中，適合于口服施用的所述組合物僅含有容許、或不禁止向動物口服施用的成分和所述成分的量。在另一個特定的實(shí)施方式中，適合于口服施用的所述組合物不含有不允許、或禁止向動物口服施用的任何成分、 或所述成分的量。在某些實(shí)施方式中，所述組合物包含所述酶的口服可接受的載體。如在此使用的， “口服可接受的載體”包括適合于口服施用的任何生理學(xué)可接受的載體?？诜山邮艿妮d體包括但不限于動物飼料組合物、水性組合物、以及適用于動物飼料產(chǎn)物中和/或用于向動物口服施用的液體和固體組合物。適合的載體是本領(lǐng)域已知的，包括在美國專利6，780, 628 中描述的那些。在某些實(shí)施方式中，所述組合物是動物飼料。如在此使用的，術(shù)語“動物飼料”具有畜牧業(yè)領(lǐng)域中其常規(guī)的含義。例如，動物飼料包括為了它們的營養(yǎng)價值被家畜消耗的可食用材料。動物飼料包括飼料配給，例如，滿足動物的營養(yǎng)需求的組合物，并且還包括不滿足動物的營養(yǎng)需求的組合物。在這種實(shí)施方式的特定實(shí)例中，酶的量是至少約50，000國際單位(IU)/美噸 (U. S. ton)飼料、至少約60，OOOIU/噸飼料、至少約70，000IU/噸飼料、至少約80，000IU/噸飼料、至少約90，OOOIU/噸飼料、至少約100，OOOIU/噸飼料、至少約200，000IU/噸飼料、或至少約500，OOOIU/噸飼料，或更高。在其他特定的實(shí)例中，本發(fā)明提供了動物飼料，其包含至少約20IU/kg飼料，例如至少20IU/kg飼料、至少25IU/kg飼料、至少30IU/kg飼料、至少35IU/kg飼料、至少40IU/ kg飼料、至少45IU/kg飼料、至少50IU/kg飼料、或更多量的減少免疫應(yīng)激的酶。雖然不希望受到任何理論的限制，相信的是，包含至少約20IU/kg飼料的量的減少免疫應(yīng)激的酶的動物飼料將有效降低所述動物中陽性急性期蛋白的水平、提高所述動物中陰性急性期蛋白的水平、和/或改善動物生長表現(xiàn)。因而，在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了動物飼料，其包含有效降低動物中陽性急性期蛋白的水平、提高動物中陰性急性期蛋白的水平、和/或改善動物生長表現(xiàn)的量的減少免疫應(yīng)激的酶。所述飼料組合物可以通過本領(lǐng)域已知的方法來制備。例如，減少免疫應(yīng)激的酶可以在制造過程期間的任何階段添加到其他飼料成分中，如本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)為合適的。在一個實(shí)施方式中，作為溶液來提供所述酶，例如在制造過程期間被添加到其他飼料成分中的液體酶濃縮物。做為選擇，含有酶的溶液被噴霧到動物飼料的基本最終的形式上。在另一個實(shí)施方式中，作為固體組合物(例如，粉未)來提供所述酶，例如在制造過程期間被添加到其他飼料成分中的固體組合物。制造含有酶的飼料的示范性的方法在WO 97/41739中描述。在某些實(shí)施方式中，所述組合物不是動物飼料。例如，所述組合物可以是除動物飼料之外的液體組合物，或除動物飼料之外的固體組合物。這樣的組合物可能適合于直接施用給動物，或可以用作飼料添加劑(例如，在喂飼之前添加到飼料中)或飼料補(bǔ)充劑(包括在喂飼之前用其他飼料成分稀釋的補(bǔ)充劑，和在自由選擇、獨(dú)立的基礎(chǔ)上向動物提供的補(bǔ)充劑)。除動物飼料之外的液體組合物的實(shí)例包括液體酶濃縮物，包括在向動物口服施用之前一般用其他成分稀釋或與其他成分組合的液體酶濃縮物。在所述組合物是除動物飼料之外的液體組合物，例如酶溶液的實(shí)施方式中，所述液體組合物或溶液可以包含至少約40，000國際單位(IU)/升溶液，例如至少40，000IU/L、 至少 50，000IU/L、至少 60，000IU/L、至少 70，000IU/L、至少 80，000IU/L、至少 90，000IU/L、 至少 100，000IU/L、至少約 500，000IU/L、至少約 600，000IU/L、至少約 700，000IU/L、至少約 800，000IU/L、至少約 900，000IU/L、至少約 1，000，000IU/L、至少約 2，000，000IU/L 或至少約 5，000，000IU/L。在某些實(shí)施方式中，一定量的除了動物飼料之外的液體組合物，例如約500mL溶液，被應(yīng)用于或組合于一定量的飼料，例如一噸飼料，來得到具有如上所述的酶水平的飼料制劑。在其他實(shí)施方式中，一定量的除動物飼料之外的液體組合物被應(yīng)用于或組合于一定量的飼料，來制備動物飼料，該飼料具有有效降低動物中陽性急性期蛋白的水平、提高動物中陰性急性期蛋白的水平、和/或改善動物生長表現(xiàn)的量的酶。相信的是，目前可得到的適合于口服施用的液體酶濃縮物組合物(除了以下討論的1，3-β -葡聚糖酶組合物之外)包含比至少約40，000IU/L少得多的減少免疫應(yīng)激的酶 (如果有)，并且當(dāng)根據(jù)它們的說明書使用時，對于降低陽性急性期蛋白的水平、提高陰性急性期蛋白的水平、和/或改善動物生長表現(xiàn)是無效的。在組合物是除動物飼料之外的固體組合物的實(shí)施方式中，所述組合物可以包含至少約 40，000IU/kg，例如至少 40，000IU/kg、至少 50，000IU/kg、至少 60，000IU/kg、至少 70，000IU/kg、至少 80，000IU/kg、至少 90，000IU/kg、至少 100，000IU/kg、至少 120，000IU/ kg、至少 140，000IU/kg、至少 160，000IU/kg、至少 180，000IU/kg、至少 200，000IU/kg,或更
^^ ο 在某些實(shí)施方式中，一定量的除了動物飼料之外的固體組合物被應(yīng)用于或組合于一定量的飼料，來得到具有如上所述的酶水平的飼料制劑。在其他實(shí)施方式中，一定量的除動物飼料之外的固體組合物與一定量的飼料組合，來制備動物飼料，所述飼料具有有效降低動物中陽性急性期蛋白的水平、提高動物中陰性急性期蛋白的水平、和/或改善動物生長表現(xiàn)的量的酶。相信的是，目前可得到的適合于口服施用的固體酶粉未組合物包含比至少約 40，OOOIU/kg少得多的減少免疫應(yīng)激的酶(如果有)，并且當(dāng)根據(jù)它們的說明書使用時，對于降低陽性急性期蛋白的水平、提高陰性急性期蛋白的水平、和/或改善動物生長表現(xiàn)是無效的。如本領(lǐng)域中常規(guī)的，術(shù)語“IU”或“國際單位”是指在酶的最佳條件下每分鐘催化 1微摩爾底物的轉(zhuǎn)化的酶的量。相當(dāng)于減少免疫應(yīng)激的酶的國際單位的重量是本領(lǐng)域已知的，可以使用標(biāo)準(zhǔn)的分析來測定。下文列出了用于代表性的減少免疫應(yīng)激的酶的示范性的標(biāo)準(zhǔn)分析。在一個實(shí)施方式中，所述酶被動物飼料中使用的植物表達(dá)。例如，玉米可以被遺傳工程化來表達(dá)減少免疫應(yīng)激的酶，產(chǎn)生的遺傳修飾的玉米產(chǎn)物可以用于飼料中。生產(chǎn)還可以使用其他遺傳修飾的或經(jīng)典修飾的系統(tǒng)，例如細(xì)菌，例如大腸桿菌、芽孢桿菌、乳桿菌；酵母，例如畢赤氏酵母、耶氏酵母、糖酵母、裂殖酵母(例如粟酒裂殖酵母、漢遜氏酵母、克魯維氏酵母、假絲酵母)和其他真菌，例如曲霉、根霉、木霉、腐質(zhì)霉、青霉和腐質(zhì)霉。
根據(jù)另一個實(shí)施方式，所述減少免疫應(yīng)激的酶在用于口服攝入的膠囊或片劑中提供。本發(fā)明還包括這樣的實(shí)施方式，其中酶通過其他途徑施用，例如，靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)或皮下，作為根據(jù)已知的藥理學(xué)實(shí)踐為這種施用配制的組合物的成分。動物的免疫系統(tǒng)可以將飼料組合物的某些成分識別為不對動物的健康構(gòu)成實(shí)際威脅的抗原或分子模式。盡管如此，成分觸發(fā)了免疫應(yīng)答，其引起動物經(jīng)歷免疫應(yīng)激，并且可以通過一種或多種APP的血清濃度的提高來鑒定和監(jiān)視。雖然不希望受到任何理論的限制，本發(fā)明人相信，這種“不必要的和對抗產(chǎn)生的(counterproductive) ”免疫應(yīng)答可能涉及模式識別受體(PRR)，例如在先天免疫系統(tǒng)中涉及的那些。先天免疫系統(tǒng)提供了不依賴于特異性抗原識別的免疫應(yīng)答。參見，例如，Tosi, J. Allergy Clin. Immunol. 116 241 (2005) 0先天免疫系統(tǒng)的一個方面涉及PRR，其識別并結(jié)合病原體相關(guān)的分子模式，傳導(dǎo)免疫應(yīng)答信號。參見，例如，F(xiàn)abrick et al. , J.Biol. Chem. 279 =26605(2004)。PRR的實(shí)例包括Toll樣受體(TLR)，其識別一系列分子模式并產(chǎn)生用于活化一系列宿主反應(yīng)的細(xì)胞內(nèi)信號。參見，例如，Tosi，同上；Blach-Olszewska， Arch. Immunol. Ther. Exp. 53 :245 (2005)。已經(jīng)鑒定了識別甘露糖的 PRR/TLR(例如， Blach-Olszewska,同上)、1, 3_ β -葡聚糖(例如 Rice et al. , J. Leukoc. Biol. 72 14(K2002))、脂多糖和磷酸膽堿(例如，Baumgarth et al.，Semin. Immunopathol. 26 347(2005))、脂胞壁酸、苯酚可溶的調(diào)節(jié)蛋白、胞壁酰二肽和肽聚糖(例如，F(xiàn)ournier et al,Clin. Microbiol. Rev. 18 521 (2005)) 甘露聚糖(例如，Klabunde et al. ,Parasitol. Res. 88 =113(2002)(結(jié)合甘露聚糖的凝集素))，和N-乙酰-D-葡糖胺和N-乙酰-D-甘露糖胺(例如，Hansen et al, J. Immunol. 169 :5726(2002))的免疫調(diào)節(jié)受體。還已經(jīng)鑒定了雙鏈 RNA 的 TLR(例如，Bell et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102 :10976 (2005)), VX 及具有不同于內(nèi)源DNA的甲基化模式的DNA(Huang et al, J. Immunol 175 =3964(2005)； Nonnemacher et al, Infect. Immun. 71 :850(2003))。雖然這些分子模式與病原微生物(例如，細(xì)菌、病毒、真菌和原生動物)相關(guān)聯(lián)，它們也由某些非致病分子例如動物飼料成分展示。對展示這些分子模式的非致病分子的先天免疫應(yīng)答使得動物不必要地經(jīng)歷免疫應(yīng)激，并且可能不利地影響動物的飼料效率，減緩動物的體重增加速率或引起重量損失，使得動物對感染更加敏感，提高動物的體溫，或者對動物的健康或食物能量(卡路里)利用效率有消極影響。例如由MBL(結(jié)合甘露糖的凝集素)功能引起的先天免疫應(yīng)答誘導(dǎo)了強(qiáng)反應(yīng)。顯示的是，在小鼠中甘露糖結(jié)合蛋白的基因之一的突變反而容許通常致命的急性膿毒性腹膜炎攻擊下的存活(Takahashi，K. et al.， Microbes Infect. 4(8) :773_784，200 。在這種情況下，來自攻擊性先天免疫應(yīng)答的免疫應(yīng)激是比感染更加致命的。β -甘露聚糖是大豆制品和基于大豆的動物飼料的成分。在動物飼料中存在的高分子量形式的β -甘露聚糖可以觸發(fā)“不必要的和對抗產(chǎn)生的”先天免疫應(yīng)答，從而使動物經(jīng)歷免疫應(yīng)激。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，這種免疫應(yīng)激可以使用甘露聚糖酶型半纖維素酶，即內(nèi)-1，4-β-D-甘露聚糖酶來減少或防止，所述所述酶降解β-甘露聚糖(例如，β-半乳甘露聚糖、β-葡甘露聚糖)，從而減少或防止對β-甘露聚糖的免疫應(yīng)答。如在下文實(shí)施例中顯示的，免疫應(yīng)激的減少反映于血清APP濃度的降低。根據(jù)本發(fā)明，降解α -甘露聚糖的α _甘露聚糖酶作為減少免疫應(yīng)激的酶是有用的。α -甘露聚糖不被認(rèn)為是半纖維素，因?yàn)樗幌碛邪肜w維素的特征性質(zhì)。在工業(yè)酶的領(lǐng)域，術(shù)語“半纖維素酶”已經(jīng)被用作β-甘露聚糖酶的商品名。同樣地，發(fā)明人合著的專利和公開物使用了術(shù)語“半纖維素酶”來指代甘露聚糖酶，包括內(nèi)-1，4-B-D-甘露聚糖酶。參見，例如，美國專利No. 6，162,473。在其他環(huán)境中，術(shù)語“半纖維素酶”可以更廣義，除了甘露聚糖酶之外包括葡聚糖酶和木聚糖酶，如以下所解釋的。術(shù)語“半纖維素”被用于描述通過用稀堿性溶液提取獲得的、比纖維素更容易水解的碳水化物植物材料。參見，例如，khulze，E.，Berichte der Deutschen Botanischen Gesellschaf，24 :2277 (1891) ；Schulze, R, Z. Physiol Chem. 16:387(1892)。 從那時起，“半纖維素”開始表示除了植物汁液中的果膠和淀粉和多糖之外的、與纖維素相關(guān)的不溶于水的植物多糖，它們是在稀堿溶液中可溶的。參見，例如，Whisler et al. ， “ Hemicelluloses, “ in IV POLYSACCHARIDE CHEMISTRY 112(Academic Press, 1953)。木聚糖、甘露聚糖和半乳聚糖一般被認(rèn)為是半纖維素，雖然某些甘露聚糖， 如刺槐豆膠和瓜耳膠半乳甘露聚糖是容易溶解的。軟木具有與它們的纖維素相關(guān)的大量 β -甘露聚糖，而硬木具有大量木聚糖。與半纖維素相比，α-甘露聚糖與真菌細(xì)胞壁，例如糖酵母相關(guān)，而不是木材的結(jié)構(gòu)成分，并且在一般可溶于水的真核糖蛋白中均勻地存在。因而，α-甘露聚糖不被認(rèn)為是半纖維素，并且α-甘露聚糖酶不是半纖維素酶。根據(jù)本發(fā)明，α-甘露聚糖酶作為減少免疫應(yīng)激的酶是有用的，因?yàn)樗到鈩游锏拿庖呦到y(tǒng)識別的、但不是病原體相關(guān)的α-甘露聚糖。先天免疫系統(tǒng)對于甘露聚糖是敏感的，因?yàn)楹懈事短堑木酆衔镌谠S多病原體的表面存在?？梢员粍游锏拿庖呦到y(tǒng)識別的其他飼料成分包括β -1，3_葡聚糖(植物材料的常見結(jié)構(gòu)成分)、Ν-連接的糖蛋白復(fù)合物(例如，在大豆制品中存在)、來自植物、動物或微生物的雙鏈RNA，和來自微生物、植物或動物的具有外源(非內(nèi)源)甲基化模式的DNA。因而， 根據(jù)一個實(shí)施方式，本發(fā)明提供了包含降解一種或多種這些或其他飼料成分的一種或多種減少免疫應(yīng)激的酶的組合物。在相關(guān)的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了減少動物中的免疫應(yīng)激的方法，其包括向所述動物施用包含有效量的這樣的酶的組合物。在以下的表格中闡述了減少免疫應(yīng)激的酶和它們降解的抗原的具體實(shí)例。本發(fā)明包括組合物，其包含降解相同或不同抗原的其他減少免疫應(yīng)激的酶，以及這些其他的酶來減少免疫應(yīng)激的用途。
權(quán)利要求
1.一種適合于向動物口服施用的組合物，其包含口服可接受的載體中的減少免疫應(yīng)激的酶，其中所述組合物選自(i)動物飼料，其包含至少20IU所述減少免疫應(yīng)激的酶/kg飼料；( )除了動物飼料之外的液體組合物，其包含至少40，000IU所述減少免疫應(yīng)激的酶/LjP(iii)除了動物飼料之外的固體組合物，其包含至少40，000IU所述減少免疫應(yīng)激的酶/kg,其中所述減少免疫應(yīng)激的酶選自堿性磷酸酶、磷酸膽堿水解酶、酸性磷酸酶、磷酸膽堿酯酶和磷酸膽堿磷酸酶。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中所述組合物是包含至少20IU所述減少免疫應(yīng)激的酶/kg 飼料的動物飼料。
3.權(quán)利要求1的組合物，其中所述組合物是除了動物飼料之外的液體組合物，其包含至少40，000IU所述減少免疫應(yīng)激的酶/L。
4.權(quán)利要求1的組合物，其中所述組合物是除了動物飼料之外的固體組合物，其包含至少40，000IU所述減少免疫應(yīng)激的酶/kg。
5.權(quán)利要求1的組合物，其中所述組合物是除了動物飼料之外的固體組合物，其包含至少80，000IU所述減少免疫應(yīng)激的酶/kg。
6.權(quán)利要求1的組合物，其中所述組合物是除了動物飼料之外的固體組合物，其包含至少160，000IU所述減少免疫應(yīng)激的酶/kg。
7.權(quán)利要求1的組合物，其中所述組合物是動物飼料，其包含誘導(dǎo)動物中的免疫應(yīng)答的成分，并且其中所述減少免疫應(yīng)激的酶降解所述成分。
8.權(quán)利要求7的組合物，其中所述成分是非致病分子，其展示被動物的先天免疫系統(tǒng)識別的分子模式，并且被所述減少免疫應(yīng)激的酶降解。
9.權(quán)利要求7的組合物，其中所述成分是病原微生物展示的抗原。
10.權(quán)利要求1的組合物，其中所述減少免疫應(yīng)激的酶是堿性磷酸酶。
11.權(quán)利要求1的組合物，其中所述減少免疫應(yīng)激的酶是得自細(xì)菌的酶。
12.權(quán)利要求3或4的組合物，其中所述組合物是動物飼料添加劑。
13.權(quán)利要求3或4的組合物，其中所述組合物是動物飼料補(bǔ)充劑。
14.權(quán)利要求4的組合物，其中所述組合物是粉末。
15.權(quán)利要求1的組合物在制備口服藥物中的應(yīng)用，以用于通過口服施用所述藥物來改善動物生長表現(xiàn)和/或減少動物中的免疫應(yīng)激。
16.權(quán)利要求15的應(yīng)用，其中所述組合物包含至少一種減少免疫應(yīng)激的酶，其降解施用給所述動物并且誘導(dǎo)動物中的免疫應(yīng)答的成分。
17.權(quán)利要求16的應(yīng)用，其中所述組合物包含所述減少免疫應(yīng)激的酶和所述成分。
18.權(quán)利要求17的應(yīng)用，其中所述組合物為動物飼料。
19.權(quán)利要求16的應(yīng)用，其中所述成分是非致病分子，其展示被動物的先天免疫系統(tǒng)識別的分子模式，并且被所述減少免疫應(yīng)激的酶降解。
20.權(quán)利要求16的應(yīng)用，其中所述成分是病原微生物展示的抗原。
21.權(quán)利要求15的應(yīng)用，其中所述組合物包含堿性磷酸酶。
22.權(quán)利要求1的組合物在制備用于預(yù)防或治療與展示抗原的病原微生物相關(guān)的感染的口服藥物中的應(yīng)用，其中所述組合物包含至少一種降解所述抗原的減少免疫應(yīng)激的酶。
23.權(quán)利要求22的應(yīng)用，其中所述組合物包含堿性磷酸酶。
全文摘要
提供了適合于向動物口服施用的組合物，該組合物包含有效降低所述動物中陽性急性期蛋白的水平、提高所述動物中陰性急性期蛋白的水平、和/或改善動物生長表現(xiàn)的量的至少一種減少免疫應(yīng)激的酶，還提供了使用這種組合物的方法。所述組合物包括動物飼料組合物、除了動物飼料之外的液體組合物和除了動物飼料之外的固體組合物。
文檔編號A23K1/165GK102293323SQ20111019687
公開日2011年12月28日 申請日期2006年12月14日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月15日
發(fā)明者D·M·安德森, H·-Y·肖, L·劉 申請人:坎姆根公司