專利名稱：金蕎麥組織培養(yǎng)快速育苗方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過組織培養(yǎng)技術(shù)的植物再生，具體屬于一種藥用植物金蕎麥的組織培養(yǎng)快速育苗方法。
背景技術(shù)：
目前，惡性腫瘤已成為日益常見且嚴(yán)重威脅人類生命和生活質(zhì)量的主要疾病之一。因此，抗癌藥物和癌預(yù)防藥物的機理以及研發(fā)成了近年來科學(xué)家研究的熱點。金蕎麥 (Fagopyrum dibotrys(D. Don) Hara)為蓼科(Polygonaccae)蕎麥屬的多年生草本,是一種營養(yǎng)豐富并具有重要藥用價值的資源植物。金蕎麥的塊根是我國民間傳統(tǒng)的一味中草藥。 據(jù)《本草綱目》記載，能“降氣寬腸，磨積滯，清熱腫痛，除白濁血滯，脾積泄瀉”。現(xiàn)代藥理學(xué)研究證明，金蕎麥塊根中含有一類包括左旋表兒茶素、表兒茶素-3-沒食子酸酯及原矢車菊素B-2、B-4和原矢車菊素B-2的3，3’ - 二沒食子酸酯在內(nèi)的原花色素的縮合性單寧混合物(張雯潔等，1994)。這類縮合物對來源于肺、肝、結(jié)腸、白細胞和骨骼的癌細胞生長具有抑制作用(Chan P K 2003)，是多種抗癌藥物和癌預(yù)防藥物(如復(fù)方金蕎麥顆粒、金蕎麥片、和威麥寧膠囊等)的主要成分之一。此外，金蕎麥還有解熱消炎、祛痰鎮(zhèn)咳、抗血小板聚集、抗突變、提高巨噬細胞吞噬功能等重要作用(何顯忠，2001)。由于野生金蕎麥資源大量減少，而需求日益增加。我國已于1999年將其列入《國家重點保護野生植物名錄(第一批)》。金蕎麥種子發(fā)芽率低，常規(guī)繁殖為根莖無性繁殖，而金蕎麥的藥用部位也是塊根， 這種矛盾限制了金蕎麥在中藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展中的廣泛應(yīng)用。近年來，金蕎麥?zhǔn)袌鲂枨笾鹉暝黾樱?傳統(tǒng)獲取金蕎麥的方法是以采集和消耗野生資源為代價，由于多年來無計劃的濫采濫挖以及自然環(huán)境的破壞導(dǎo)致金蕎麥野生資源再生能力大大下降等原因，使得天然野生藥用金蕎麥資源嚴(yán)重不足，需要通過人工栽培來補充。由于金蕎麥對成土母質(zhì)要求不嚴(yán)，為人工引種栽培提供了有利條件。劉鐵城等1981年就已在北京地區(qū)試種成功。由于人工栽培產(chǎn)量的限制，加之栽培品種在營養(yǎng)價值、藥用成分含量和效價等方面的研究還是空白，限制了金蕎麥在北京地區(qū)的推廣應(yīng)用。近年來，金蕎麥在新藥領(lǐng)域的應(yīng)用發(fā)展很快，原料藥材需求量逐年增加，而野生資源日趨匱乏，人工栽培產(chǎn)量較低，明顯不能滿足制藥工業(yè)發(fā)展的需要。在北京地區(qū)擴大金蕎麥引種栽培開發(fā)新藥源具有廣闊的發(fā)展空間和應(yīng)用前景。因此，迫切需要采用一種更加科學(xué)、系統(tǒng)、有效、實用的技術(shù)，進行金蕎麥優(yōu)良品種的篩選和培育，特別是對現(xiàn)有的、已被廣大藥農(nóng)所接受的人工栽培種進行種質(zhì)提純、復(fù)壯，培育出品質(zhì)優(yōu)良、變異小的高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)金蕎麥并批量生產(chǎn)和供應(yīng)市場，是目前亟待解決的問題。利用生物技術(shù)手段培育金蕎麥優(yōu)質(zhì)種苗是解決中草藥種質(zhì)資源短缺的重要途徑。 植物組織培養(yǎng)技術(shù)是快速育苗的有效方法，已在花卉、林木、蔬菜等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。應(yīng)用組織培養(yǎng)方法快速繁殖優(yōu)質(zhì)藥用植物金蕎麥，是解決金蕎麥供求矛盾、提高種植水平和金蕎麥生料藥質(zhì)量的快速而有效地途徑。皖西學(xué)院植物細胞工程安徽省工程技術(shù)研究中心的黃仁術(shù)等人，已經(jīng)對金蕎麥的離體快繁技術(shù)進行了研究。但該研究指出，細胞分裂素6-BA的水平不宜過高，過高會刺激外植體的多酚氧化酶的活性，從而使褐變現(xiàn)象加深；還容易出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象，其莖不宜誘導(dǎo)生根，繁殖系數(shù)大為降低。更重要的是該研究并沒有對金蕎麥組培苗的煉苗移栽技術(shù)進行研究，而組培苗的移栽成活率是該技術(shù)能否真正地應(yīng)用于商品化生產(chǎn)的關(guān)鍵。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是建立藥用植物金蕎麥的組織培養(yǎng)快速育苗方法，規(guī)?；a(chǎn)優(yōu)質(zhì)金蕎麥種苗。該方法簡單實用，高效迅速，適宜規(guī)?；a(chǎn)。本發(fā)明經(jīng)過反復(fù)實驗，多重篩選，優(yōu)化組織培養(yǎng)繁育條件，提出了適宜藥用植物金蕎麥組織培養(yǎng)快速繁育種苗的方法。本發(fā)明用田間金蕎麥(Fagopyrum dibotrys (D. Don) Hara)新萌枝條為外植體；篩選出了不定芽快速增殖的培養(yǎng)基成分；篩選出了適宜的生根培養(yǎng)基配方，篩選并建立了適宜的試管苗移栽條件及田間管理措施。本發(fā)明的金蕎麥組織培養(yǎng)快速育苗方法，具體步驟包括(1)外植體表面滅菌以金蕎麥帶腋芽的幼莖為外植體，切成2-3cm長的莖段，先用70%酒精處理30s，接著在0. 升汞溶液中浸泡10-15分鐘，期間不斷搖晃，最后用無菌水沖洗干凈；(2)不定芽誘導(dǎo)與增殖將經(jīng)上述處理的外植體切成單芽莖段，分別接種于含外源激素的MS培養(yǎng)基中，在25士2°C，1500-3000LuX，12_16h/d光照下培養(yǎng)25_30d，得到無根苗，每隔30d繼代培養(yǎng)1次；繼代培養(yǎng)基配方為MS培養(yǎng)基+1. Omg/L-3. Omg/L 6-BA+0mg/ L-l. Omg/L TDZ+0mg/L-0. 2mg/L NAA+25% -35%蔗糖，pH 5. 8-6. 0。上述培養(yǎng)基優(yōu)選為MS培養(yǎng)基+2. 0mg/L 6-BA+O. 5mg/L TDZ+0. 2mg/L NAA+30% 蔗糖，pH 6.0。在該培養(yǎng)基中接種IOd后，不定芽迅速增殖并形成叢生芽，增值系數(shù)可達12.0 以上。無菌苗生長健壯，苗高2-3cm。以上培養(yǎng)基中，外植體上的腋芽均能正常萌發(fā)。每隔 25-35d可繼代培養(yǎng)。(3)生根誘導(dǎo)選取健壯的2cm左右的無根苗，轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根，得到完整的試管植株；生根培養(yǎng)基配方為=IAMS培養(yǎng)基+0. lmg/L-1. 0mg/L NAA+15% -25%蔗糖，pH 5. 8-6. 0 ；在 25士2°C，1500-3000Lux，12_16h/d 光照下培養(yǎng) 15_20d。優(yōu)選生根培養(yǎng)基為l/2MS+0. 5mg/L NAA+20%蔗糖，pH 6.0。該培養(yǎng)基條件下，金蕎麥不定芽苗生根狀態(tài)良好，生根率為100%，平均生根數(shù)為5. 85，平均根長為2. 5cm，呈輻射狀分布，移栽易成活。(4)煉苗與移栽選取生根良好且健壯的試管苗，先在培養(yǎng)瓶中閉蓋煉苗5-8d，再開蓋煉苗2d，然后小心取出試管苗，洗凈培養(yǎng)基，移入含有草炭土和珍珠巖(1 1-3 1， 體積比)混合基質(zhì)的營養(yǎng)缽中并置于溫室中，初期注意噴水保濕，用塑料薄膜覆蓋，7d后逐漸揭去薄膜通風(fēng)，增加光照，及時補足營養(yǎng)缽水分，2-4周后新根形成，移栽成活，營養(yǎng)缽中過渡培養(yǎng)1個月后移栽至田間，田間移栽成活率可達90%以上。其中，6-BA 為 6-benzylaminopurine 6-芐氨基嘌呤TDZ 為 Thidiazuron (N-phenyl-N，-1，2，3-thidiazol-5_urea)苯基脲類衍生物 (N-苯基-N，-1,2,3-賽二唑-5-脲)NAA % Naphthaleneacetic acid與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點和效果
(1)繼代培養(yǎng)基中通過添加TDZ能夠誘導(dǎo)大量的叢生芽，提高了繁殖系數(shù)，縮短了金蕎麥種苗繁育周期。在金蕎麥莖段誘導(dǎo)不定芽的再生體系中，不同激素組合應(yīng)用對金蕎麥不定芽的增殖具有顯著影響。BA利于不定芽的誘導(dǎo)，TDZ促進叢生芽的產(chǎn)生，NAA促進不定芽的伸長。金蕎麥傳統(tǒng)種植育苗多采用根插繁殖方式，繁殖系數(shù)低，難以滿足大規(guī)模生產(chǎn)的需求。本發(fā)明可以在較短的時間內(nèi)規(guī)模化生產(chǎn)金蕎麥優(yōu)質(zhì)種苗，并且可以選擇優(yōu)質(zhì)品種、 變種或類型進行規(guī)?；墓S化育苗。(2)以莖段為外植體，通過不定芽直接再生的方式進行快速繁殖，保持了優(yōu)良性狀的遺傳穩(wěn)定性，并且取材容易，更新方便。(3)多次試驗證明，煉苗移栽過程中，通過先閉蓋煉苗5-8d，再開蓋煉苗2d的過渡煉苗法，能明顯提高試管苗的適應(yīng)能力，移栽成活率達90%以上。(4)可以根據(jù)市場供求關(guān)系，合理安排和調(diào)整生產(chǎn)規(guī)模，及時組織生產(chǎn)，并可實現(xiàn)周年生產(chǎn)。(5)具有普遍適用性。本發(fā)明基于對江蘇產(chǎn)金蕎麥及其具有優(yōu)良性狀的金蕎麥輻射誘變突變體進行的快速繁育研究，有助于今后篩選得到的金蕎麥優(yōu)質(zhì)品種或類型的快速繁殖與推廣。


圖1示金蕎麥不定芽的增殖外植體在激素配比為2. Omg/L 6-BA+O. 5mg/L TDZ+0. 2mg/L NAA+30%蔗糖的MS培養(yǎng)基中，不定芽迅速增殖，4周后得到大量叢生芽。圖2示金蕎麥不定芽苗生根將2-3cm高的不定芽苗接入含0. 5mg/L NAA+20%蔗糖的1/2MS培養(yǎng)基中，15天不定根開始形成，20d時形成完整根系。圖3示金蕎麥試管苗移栽至有基質(zhì)的營養(yǎng)缽中試管苗經(jīng)煉苗后，洗凈根部的培養(yǎng)基，移栽到含有草炭土和珍珠巖混合基質(zhì)的營養(yǎng)缽中。圖4示金蕎麥試管苗移栽大田營養(yǎng)缽中的試管苗適應(yīng)大田環(huán)境，根系發(fā)育完善后，移栽至大田，生長表現(xiàn)正常。圖5示移栽至大田的金蕎麥試管苗開花試管苗移栽至大田3個月后開花。圖6示移栽后的金蕎麥試管苗塊根移栽至大田的試管苗生長狀態(tài)良好，根莖發(fā)育正常。
具體實施例方式實施例1將引自江蘇，在藥用植物研究所試驗基地栽培多年的金蕎麥幼嫩莖段作為外植體，切成2-3cm切段，經(jīng)70 %酒精處理30s，無菌水沖洗2遍，再在0. 1 %升汞溶液中浸泡 12分鐘，期間不斷搖晃，最后用無菌水沖洗5次，每次1分鐘。將經(jīng)上述處理的外植體切成單芽莖段30個，接種于含2. Omg/L 6-BA+O. 5mg/L TDZ+0. 2mg/L NAA+30%蔗糖的MS培養(yǎng)基中，在25士2°C，1500-3000Lux，12-lMi/d光照下培養(yǎng)，進行不定芽的誘導(dǎo)與增殖，4周后得到叢生苗(如圖1)，每隔30d繼代培養(yǎng)1次，繼代3次以后得到大量不定芽苗。選取健壯的2-3cm左右的無根苗，轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根，生根培養(yǎng)基配方為l/2MS+0. 5mg/ LNAA+20%蔗糖，pH 6.0。在同樣培養(yǎng)條件下培養(yǎng)20d得到完整的試管植株(如圖2)。選取生根良好且健壯的植株先在培養(yǎng)瓶中閉蓋煉苗5-8d，再開蓋煉苗2d，然后小心取出試管苗，洗凈培養(yǎng)基，移入含有草炭土和珍珠巖(1 1，體積比)混合基質(zhì)的營養(yǎng)缽中(如圖3)， 在溫室中過渡培養(yǎng)。初期注意保濕，用塑料薄膜覆蓋，7d后逐漸揭去薄膜通風(fēng)，增加光照，及時補足營養(yǎng)缽水分，4周后新根形成，移栽成活，將營養(yǎng)缽置于田間，1周后移栽至田間，30d 后田間移栽成活率可達90%以上(如圖4)。3個月后，試管移栽苗正常開花(如圖5)，10 月底采收金蕎麥塊根，發(fā)育良好(如圖6)實施例2將引自貴州，在藥用植物研究所試驗基地栽培多年的金蕎麥幼嫩莖段作為外植體，切成2-3cm長的切段，經(jīng)70%酒精處理30s，無菌水沖洗2遍，再在0. 升汞溶液中浸泡10分鐘，期間不斷搖晃，最后用無菌水沖洗5次，每次1分鐘。將經(jīng)上述處理的外植體切成單芽莖段30個，接種于含1. Omg/L 6-BA+O. 5mg/L NAA+30%蔗糖的MS培養(yǎng)基中，在 25士2°C，1500-3000LuX，12-16h/d光照下培養(yǎng)，進行不定芽的誘導(dǎo)，2周后腋芽萌發(fā)，形成無菌苗。把所得的無菌苗繼續(xù)切割成單芽莖段，轉(zhuǎn)入篩選得到的芽增殖培養(yǎng)基。培養(yǎng)基組成為:MS+2. Omg/L 6-BA+O. 2mg/L TDZ+0. 5mg/L NAA+30%蔗糖，pH 6. 0，每隔 30d 繼代培養(yǎng) 1次，繼代3次以后得到大量不定芽苗。選取健壯的2-3cm左右的無根苗，轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根，煉苗及移栽(同實施例1)。其余的不定芽苗轉(zhuǎn)入不定芽增殖培養(yǎng)基中繼代增殖培養(yǎng)。
權(quán)利要求
1.一種金蕎麥組織培養(yǎng)快速育苗方法，其特征在于包括以下步驟(1)外植體表面滅菌以金蕎麥帶腋芽的幼莖為外植體，切成2-3cm切段，先用70%酒精處理30s，接著在0. 1 %升汞溶液中浸泡10-15分鐘，期間不斷搖晃，最后用無菌水沖洗干凈；(2)不定芽誘導(dǎo)與增殖將經(jīng)上述處理的外植體切成單芽莖段，分別接種于含外源激素的MS培養(yǎng)基中，在25士2°C，1500-3000LuX，12-16h/d光照下培養(yǎng)25-30d，得到無根苗，每隔30d繼代培養(yǎng)1次；繼代培養(yǎng)基配方為MS培養(yǎng)基+1. Omg/L-3. Omg/L 6-BA+0mg/ L-l. Omg/L TDZ+0mg/L-0. 2mg/L NAA+25% -35%蔗糖，pH 5. 8-6. 0 ；(3)生根誘導(dǎo)選取健壯的、2cm左右長的無根苗，轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根，得到完整的試管植株；生根培養(yǎng)基配方為1/2MS培養(yǎng)基+0. lmg/L-1. Omg/L NAA+15%-25%蔗糖， pH 5. 8-6. 0 ；在 25士2°C，1500-3000Lux，12_16h/d 光照下培養(yǎng) 15_20d ；(4)煉苗與移栽選取生根良好的試管苗，先在培養(yǎng)瓶中閉蓋煉苗5-8d，再開蓋煉苗 2d，然后小心取出試管苗，洗凈培養(yǎng)基，移入含有體積比為1 1-3 1的草炭土和珍珠巖混合基質(zhì)的營養(yǎng)缽中并置于溫室中，初期注意保濕，用塑料薄膜覆蓋，7d后逐漸揭去薄膜通風(fēng)，增加光照，及時補足營養(yǎng)缽水分，2-4周后，將營養(yǎng)缽置于田間，1-2周后移栽至田間。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的金蕎麥組織培養(yǎng)快速育苗方法，其特征在于所述的步驟(1) 中外植體表面滅菌為先用70%酒精處理30s，接著在0. 升汞溶液中浸泡12分鐘，期間不斷搖晃，最后用無菌水沖洗5次，每次1分鐘。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的金蕎麥組織培養(yǎng)快速育苗方法，其特征在于所述的步驟(2) 中不定芽誘導(dǎo)與增殖培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+2. Omg/L 6-BA+O. 5mg/L TDZ+0. 2mg/L NM+30% 蔗糖，pH 6.0。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的金蕎麥組織培養(yǎng)快速育苗方法，其特征在于所述的步驟(3) 中生根培養(yǎng)基為l/2MS+0. 5mg/L NAA+20%蔗糖，pH 6. 0。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的金蕎麥組織培養(yǎng)快速育苗方法，其特征在于所述的步驟(4) 中煉苗方式采用先閉蓋煉苗8d，再開蓋煉苗2d的兩步煉苗法，混合基質(zhì)中草炭土和珍珠巖的體積比為1 1。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種藥用植物金蕎麥的組織培養(yǎng)快速育苗方法。該方法選擇金蕎麥的帶芽莖段作為外植體，表面滅菌后接種于附加2.0mg/L 6-BA+0.5mg/L TDZ+0.2mg/L NAA+30％蔗糖的MS培養(yǎng)基中誘導(dǎo)不定芽的快速增值，繼代3次后得到大量不定芽苗；將2-3cm左右的不定芽苗轉(zhuǎn)入1/2MS+0.5mg/LNAA+20％蔗糖的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根；經(jīng)煉苗后移栽田間，試管苗的移栽成活率在90％以上。本發(fā)明方法快速、高效，成本低，移栽成活率高，便于推廣，遺傳穩(wěn)定好，適用于各種金蕎麥栽培品種或類型?？筛鶕?jù)市場情況，在短時間內(nèi)大量繁殖和生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的金蕎麥種苗和原料藥材。
文檔編號A01H4/00GK102228006SQ20111016021
公開日2011年11月2日 申請日期2011年6月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月15日
發(fā)明者李艾蓮, 陳彩霞 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所