專利名稱：三尖杉植株再生及快速繁殖方法
技術領域：
本發(fā)明屬于三尖杉的培養(yǎng)技術，更具體涉及一種三尖杉離體胚培養(yǎng)及植株再生方法。
技術背景三尖杉屬三尖杉科三尖杉屬常綠喬木，是古老的孑遺植物，為我國特有珍稀樹種，共有 9種，我國有8種，其中福建省內(nèi)有3種。其葉形似杉，但柔軟不刺手，枝端冬芽呈三角排列 ，春天小枝分三叉生長，故名三尖杉。該樹婆娑多姿，端莊秀麗，形態(tài)奇特，葉背有兩條銀 白色的氣孔帶，微風吹拂，銀光耀眼，具有獨特風姿。三尖杉木材堅實，紋理直，結(jié)構慎密 ，適合做高級家具和室內(nèi)裝飾。其種子出油率高，可應用于工業(yè)。此外，三尖杉的根、莖、 葉、皮、果中均含有多種生物堿，特別是其中的三尖杉酯堿和高三尖杉酯堿(簡稱雙酯堿) 對白血病、黑素病、肺癌、乳腺癌、腦腫瘤等均有療效，被列為全世界36種抗癌藥物之中。 但由于三尖杉植物對環(huán)境條件要求較特殊，自然資源稀少，加之其為雌雄異株，結(jié)實量少， 分布區(qū)域比較狹窄，因此難以滿足臨床上日益增長的需求和規(guī)?；a(chǎn)的需要。由于三尖杉 種子屬于生理休眠性種子，休眠時間長達一年以上，致使育苗時間長、出苗率低，因此很難 獲得理想的發(fā)芽率和更多的健壯苗。寧蒗縣林業(yè)局及林科所等單位開展了播種育苗方法研究 ，對種子進行層積催芽，提高了種子的發(fā)芽率，但仍無法滿足實際生產(chǎn)需要和規(guī)?；a(chǎn)要 求。在生產(chǎn)中，特別是對其進行藥用價值開發(fā)時，更不能提供大面積種植的優(yōu)良純化組培苗 ，因此急需完備的組織培養(yǎng)技術體系，但在專利公開以前沒有一個有關其組織培養(yǎng)比較成功 的實例。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種三尖杉植株再生及快速繁殖的組織培養(yǎng)方法，解決現(xiàn)有技術中 三尖杉種子休眠時間長、苗時間長、出苗率低，因此很難獲得理想的發(fā)芽率和更多的健壯苗 的問題，該方法培養(yǎng)的芽健康、茁壯、增殖時間短、成苗移植后的成活率高，苗木成活后生 長健壯，長勢良好，具有顯著的經(jīng)濟效益。本發(fā)明的技術內(nèi)容為三尖杉植株再生及快速繁殖方法的具體步驟包括1) 取材方法選取當年萌發(fā)飽滿新芽的莖段，在距離芽點1 2厘米處剪取，去除多余 的葉片，采摘后用濕布包好；2) 培養(yǎng)基的配制在基本培養(yǎng)基為MS中分別添加生長激素IBA、 NAA、 IAA、 ZE (玉米素)或KT中的幾種，分別配置成芽誘導培養(yǎng)基、芽增殖培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基，所述這些培養(yǎng) 基中還加入Su為30 g/L， Ag+為7. 5 g/L， PH值為5. 8，附加物為活性炭Ac;所述這些培養(yǎng)基 的厚度為1.4 1.6cm;3)材料消毒處理先對材料進行適當?shù)男藜簦孟礈靹┢锤蓛?，再將材料用自來?沖洗30分鐘，把水瀝干后置于超級工作臺內(nèi)，以重量濃度為75%的酒精消毒，搖蕩，3 5秒 鐘后倒去酒精，加入O. P/。升汞HgCl2處理8 13分鐘，將汞液倒入廢汞瓶，用無菌水沖3 4遍 后，用消毒濾紙吸干表面水分，然后進行接種；4)誘導培養(yǎng)取生長飽滿的新芽切成0.8 1.5cm的小段，分別接種于經(jīng)高溫、高 壓滅菌的所述芽誘導培養(yǎng)基中；100 150g的芽誘導培養(yǎng)基接種3個胚；所述誘導培養(yǎng)的培養(yǎng) 條件培養(yǎng)室溫度為25士2。C，光照時間12h/d，光照強度1000 1500Lx;誘導培養(yǎng)的時間 15 20天；5) 增殖培養(yǎng)將所述經(jīng)過步驟4)的誘導培養(yǎng)生長良好的叢生芽切開，分別接種在增殖 培養(yǎng)基中；100 150g的增殖培養(yǎng)基接種3個胚；所述增殖培養(yǎng)的培養(yǎng)條件培養(yǎng)室溫度為 25士2。C，光照時間12h/d，光照強度1000 1500Lx;增殖培養(yǎng)的時間25 30天；6) 誘導生根將步驟5)增殖培養(yǎng)出來的幼苗單株切下，帶有2 3片葉子，株高1 2cm，轉(zhuǎn)移到所述生根培養(yǎng)基中；100 150g的生根培養(yǎng)基接種3個胚；所述生根培養(yǎng)的培養(yǎng) 條件培養(yǎng)室溫度為25士2。C，光照時間12h/d，光照強度1000 1500Lx;生根培養(yǎng)的時間 2C) 25天；7) 試管苗完成當試管苗長至3cm， 3 5條根，5片葉子，長度2 3cm時，完成三尖杉 植株再生及快速繁殖試管苗培養(yǎng)。8) 試管苗移栽步驟7)的完成的三尖杉試管苗進行移栽，將試管苗放在自然光下煉苗 3 5天后再打開瓶蓋先進行煉苗3天，以增強試管苗對室外環(huán)境的適應能力；然后將苗從培 養(yǎng)瓶中取出，洗去根部培養(yǎng)基，移入蛭石和腐殖土 (質(zhì)量比)1 :2混合的基質(zhì)中，保濕遮陰 ，成活率可達95%以上。本發(fā)明的顯著優(yōu)點是采用本發(fā)明方法進行，莖段經(jīng)過誘導培養(yǎng)，15 20天即可萌發(fā)出 生長健壯的新芽；再經(jīng)過25 30天的增殖，20 25天誘導生根后即可成苗、移栽，成活率高 達95%以上；擴繁系數(shù)在18倍以上，苗木成活后生長健壯，長勢良好，基本上解決了中三尖 杉種子休眠時間長、苗時間長、出苗率低，因此很難獲得理想的發(fā)芽率和更多的健壯苗的問 題，具有顯著的經(jīng)濟效益。


圖l莖段誘導形成的芽圖2誘導芽增殖形成的叢芽具體實施方式
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步說明。 實施例取材方法選取當年萌發(fā)飽滿新芽的莖段，在距離芽點1 2厘米處剪取，去除多余的葉 片，采摘后用濕布包好。 培養(yǎng)基MS基本基本培養(yǎng)基采用1986，北京高等教育出版社出版，陳正華主編的《木本植物組織 培養(yǎng)及其應用》中的配方進行配制的。培養(yǎng)基的配制基本培養(yǎng)基為MS，加入生長激素為IBA、 NAA、 IAA、 ZE (玉米素)、 KT(植物激素)，培養(yǎng)基中加入Su (蔗糖)為30g/L， Ag+為7.5g/L， PH值為5. 8，附加物為活 性炭Ac;培養(yǎng)基厚度一般為1.4 1.6cm;芽誘導培養(yǎng)基一MS+ZE (3.0 mg/L)+KT (1.0 mg/L)+IAA (1.0 mg/L)+NAA (0.3 mg/L)+Ag屮(7.5 g/L) +Su (30 g/L)+Ac (2 2. 5 g/L)芽增殖培養(yǎng)基一MS+ZE (2. 0 mg/L) +KT (2. 0 mg/L) +NAA (0. 5 mg/L) + Ag+ (7. 5 g/L) +Su (30 g/L) +Ac (2 2.5 g/L)生根培養(yǎng)基一1/2 MS + NAA (0. 3 mg/L) + IBA (0. 5 mg/L) + Ag+ (7. 5 g/L) +Su (30 g/L) +Ac (2 2.5 g/L)這些培養(yǎng)基中Ag+的來源于AgN03。基本培養(yǎng)基1/2 MS是指MS中大量元素減半，其余不變。材料消毒處理先對材料進行適當?shù)男藜?，用洗滌劑漂洗干凈，再將材料用自來水沖洗 30分鐘，把水瀝干后置于超級工作臺內(nèi)，以重量濃度為75%的酒精消毒，搖蕩，3 5秒鐘后 倒去酒精，加入O. P/。升汞(HgCl2，該O. 1%升汞配制為1克升汞加1000毫升蒸餾水)處理8 13 分鐘，將汞液倒入廢汞瓶，用無菌水沖3 4遍后，用消毒濾紙吸干表面水分，然后進行接種誘導培養(yǎng)取生長飽滿的新芽切成0.8 1.5cm的小段，分別接種于經(jīng)高溫、高壓滅菌的 所述芽誘導培養(yǎng)基中；100 150g的芽誘導培養(yǎng)基接種3個胚；所述誘導培養(yǎng)的培養(yǎng)條件 培養(yǎng)室溫度為25士2。C，光照時間12h/d，光照強度1000 1500Lx;誘導培養(yǎng)的時間15 20天增殖培養(yǎng)將所述經(jīng)過步驟4)的誘導培養(yǎng)生長良好的叢生芽切開，分別接種在增殖培 養(yǎng)基中；100 150g的增殖培養(yǎng)基接種3個胚；所述增殖培養(yǎng)的培養(yǎng)條件培養(yǎng)室溫度為25士2。C，光照時間12h/d，光照強度1000 1500Lx;增殖培養(yǎng)的時間25 30天；誘導生根將步驟5)增殖培養(yǎng)出來的幼苗單株切下，帶有2 3片葉子，株高l 2cm， 轉(zhuǎn)移到所述生根培養(yǎng)基中；100 150g的生根培養(yǎng)基接種3個胚；所述生根培養(yǎng)的培養(yǎng)條件 培養(yǎng)室溫度為25士2。C，光照時間12h/d，光照強度1000 1500Lx;生根培養(yǎng)的時間20 25天試管苗完成當試管苗長至3cm， 3 5條根，5片葉子，長度2 3cm時，完成三尖杉植 株再生及快速繁殖試管苗培養(yǎng)。試管苗移栽步驟7)的完成的三尖杉試管苗進行移栽，將試管苗放在自然光下煉苗3 5天后再打開瓶蓋先進行煉苗3天，以增強試管苗對室外環(huán)境的適應能力；然后將苗從培養(yǎng)瓶 中取出，洗去根部培養(yǎng)基，移入蛭石和腐殖土 (質(zhì)量比)1 :2混合的基質(zhì)中，保濕遮陰，成 活率可達95%以上。采用以上方法進行，莖段經(jīng)過誘導培養(yǎng)，15 20天即可萌發(fā)出生長健壯的新芽；再經(jīng)過 25 30天的增殖，20 25天誘導生根后即可成苗、移栽，成活率高達95%以上；擴繁系數(shù)在 18倍以上，苗木成活后生長健壯，長勢良好。
權利要求
1.一種三尖杉植株再生及快速繁殖方法，其特征在于所述方法的具體步驟包括1)取材方法選取當年萌發(fā)飽滿新芽的莖段，在距離芽點1～2厘米處剪取，去除多余的葉片，采摘后用濕布包好。2)培養(yǎng)基的配制在基本培養(yǎng)基為MS中分別添加生長激素IBA、NAA、IAA、玉米素ZE或KT中的幾種，分別配置成芽誘導培養(yǎng)基、芽增殖培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基，所述這些培養(yǎng)基中還加入Su為30g/L，Ag+為7.5g/L，PH值為5.8，附加物為活性炭Ac；所述這些培養(yǎng)基的厚度為1.4～1.6cm。3)材料消毒處理先對材料進行適當?shù)男藜?，用洗滌劑漂洗干凈，再將材料用自來水沖洗30分鐘，把水瀝干后置于超級工作臺內(nèi)，以重量濃度為75％的酒精消毒，搖蕩，3～5秒鐘后倒去酒精，加入0.1％升汞HgCl2處理8～13分鐘，將汞液倒入廢汞瓶，用無菌水沖3～4遍后，用消毒濾紙吸干表面水分，然后進行接種；4)誘導培養(yǎng)取生長飽滿的新芽切成0.8～1.5cm的小段，分別接種于經(jīng)高溫、高壓滅菌的所述芽誘導培養(yǎng)基中；100～150g的芽誘導培養(yǎng)基接種3個胚；所述誘導培養(yǎng)的培養(yǎng)條件培養(yǎng)室溫度為25±2℃，光照時間12h/d，光照強度1000～1500Lx；誘導培養(yǎng)的時間15～20天；5)增殖培養(yǎng)將所述經(jīng)過步驟4)的誘導培養(yǎng)生長良好的叢生芽切開，分別接種在增殖培養(yǎng)基中；100～150g的增殖培養(yǎng)基接種3個胚；所述增殖培養(yǎng)的培養(yǎng)條件培養(yǎng)室溫度為25±2℃，光照時間12h/d，光照強度1000～1500Lx；增殖培養(yǎng)的時間25～30天；6)誘導生根將步驟5)增殖培養(yǎng)出來的幼苗單株切下，帶有2～3片葉子，株高1～2cm，轉(zhuǎn)移到所述生根培養(yǎng)基中；100～150g的生根培養(yǎng)基接種3個胚；所述生根培養(yǎng)的培養(yǎng)條件培養(yǎng)室溫度為25±2℃，光照時間12h/d，光照強度1000～1500Lx；生根培養(yǎng)的時間20～25天；7)試管苗完成當試管苗長至3cm，3～5條根， 5片葉子，長度2～3cm時，完成三尖杉植株再生及快速繁殖試管苗培養(yǎng)。
2.根據(jù)權利要求l所述的三尖杉植株再生及快速繁殖方法，其特征在 于所述步驟7)的完成的三尖杉試管苗進行移栽，將試管苗放在自然光下煉苗3 5天后再 打開瓶蓋先進行煉苗3天，以增強試管苗對室外環(huán)境的適應能力；然后將苗從培養(yǎng)瓶中取出 ，洗去根部培養(yǎng)基，移入蛭石和腐殖土的質(zhì)量比=1 : 2混合的基質(zhì)中，保濕遮陰，成活率可 達95%以上。
3.根據(jù)權利要求l所述的三尖杉植株再生及快速繁殖方法，其特征在于所述芽誘導培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基MS中再加入ZE 3.0 mg/L; KT 1.0 mg/L; IAA 1.0 mg/L; NAA 0.3 mg/L ; Ag+ 7.5 g/L;Su 30 g/L;Ac 2 2. 5 g/L;所述芽增殖培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基MS再加入ZE 2.0mg/L;KT 2. 0 mg/L; NAA 0. 5 mg/L;Ag+7. 5 g/L; Su 30 g/L; Ac 2 2. 5 g/L;所述生根培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基1/2 MS再加入NAAO. 3mg/L;IBA 0. 5 mg/L; Ag+ 7. 5 g/L; Su 30 g/L; Ac 2 2. 5 g/L。
4.根據(jù)權利要求3所述的三尖杉植株再生及快速繁殖方法，其特征在于所述培養(yǎng)基中3的來源為 3 。
5.根據(jù)權利要求3所述的三尖杉植株再生及快速繁殖方法，其特征在 于所述基本培養(yǎng)基1/2 MS是指MS中大量元素減半，其余不變。
6.根據(jù)權利要求l所述的三尖杉植株再生及快速繁殖方法，其特征在 于所述步驟3)用的O. 1%升汞配制為1克升汞加1000毫升蒸餾水。
全文摘要
本發(fā)明提供一種三尖杉離體胚培養(yǎng)及植株再生方法，屬于三尖杉的培養(yǎng)技術。解決現(xiàn)有技術中三尖杉種子休眠時間長、苗時間長、出苗率低，因此很難獲得理想的發(fā)芽率和更多的健壯苗的問題，本發(fā)明選取當年萌發(fā)飽滿新芽的莖段為材料，經(jīng)過誘導培養(yǎng)，15～20天即可萌發(fā)出生長健壯的新芽；再經(jīng)過25～30天的增殖，20～25天誘導生根后即可成苗、移栽，成活率高達95％以上；擴繁系數(shù)較高，苗木成活后生長健壯，長勢良好。
文檔編號A01H4/00GK101617632SQ20091030460
公開日2010年1月6日 申請日期2009年7月21日 優(yōu)先權日2009年7月21日
發(fā)明者何官榕, 何碧珠 申請人:福建農(nóng)林大學