專利名稱：海南粗榧種胚培養(yǎng)育苗方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種植物的快速繁育方法，尤其涉及海南粗榧種子胚培養(yǎng)進快繁育苗方法。
背景技術(shù)：
海南粗榧(C印/za/otoo^/^'"a"ew^yLi)為三尖杉科植物，別名紅殼松、薄葉蓖子杉， 為多年生高大常綠喬木。是我國特有的珍稀樹種，其分布范圍極為狹窄，僅見于海南及廣東、 云南等局部地區(qū)。研究表明，海南粗榧不僅有效生物堿含量為三尖杉科中最高，而且療效最 顯著，是目前公認的最好抗癌樹種之一。再加之該樹種因材質(zhì)優(yōu)良而屢遭砍伐，加之種群數(shù) 量少，是我國最重要的珍稀瀕危植物之一。但該樹種自然資源十分有限，很難滿足日益增長 的需求。由于該樹種為雌雄異株、種子產(chǎn)量和萌發(fā)率很低，受生態(tài)和人為破壞等因素而導(dǎo)致 瀕臨滅絕。鑒于此，海南粗榧的物種保護引起植物學(xué)研究機構(gòu)的高度重視。目前，海南粗榧 繁殖方式主要有兩種。其一是種子繁殖。但該樹種自然資源十分有限，而且為雌雄異株、種 子產(chǎn)量和萌發(fā)率很低(每年每雌株僅數(shù)十粒種子，種子萌發(fā)率野外約10% (—方面是因為海 南粗榧種子萌發(fā)需要低溫解除休眠，海南難以滿足；另一方面海南粗榧種子在野外很易被動 物啃食)、傳統(tǒng)人工萌發(fā)約20%)，而且海南粗榧種子野外和傳統(tǒng)的萌發(fā)方法需要約l年以上時 間才能成苗，再加之受其生態(tài)和人為破壞等因素而導(dǎo)致海南粗榧瀕臨滅絕(王獻溥,王有生.海 南粗榧瀕危的原因和保護措施.廣西植物1994， 14 (4): 369-372)。其二是扦插繁殖。但是在 種質(zhì)資源瀕臨滅絕的情況下，通過扦插提供大量苗木的難度很大，遠遠滿足不了制藥行業(yè)對 海南粗榧的需求，而且會對海南粗榧的有限資源造成更大的破壞；而且資料表明扦插幼嫩蓬 段來源直接影響到扦插幼苗的生長態(tài)勢，只有來源于主莖頂端的幼嫩枝條扦插產(chǎn)生的幼苗能 正常直立良好生長；而主莖頂端幼嫩莖段取材會直接毀滅該株植物的正常生長。所以，扦插 繁殖基本不能推廣(符文英,潘學(xué)峰,陳秀蕙,劉國民,李任珠.海南粗榧扦插與生根試驗研究.海 南大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，1997,15(3) :239-244;潘學(xué)峰,符文英，陳秀蕙,劉國民，李任珠.海南粗 榧扦插繁殖研究.熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)，1996， (3): 25-30;杜道林,符文英.珍稀瀕危植物海南粗榧 種群保護生物生態(tài)學(xué).湖南科技出版社，2003.11)。另外也有人研究采用傳統(tǒng)的組織培養(yǎng)方 法對海南粗榧進行幼苗繁殖，但是基本不能出苗，或者出苗率很低，不能進行應(yīng)用推廣(符 文英，杜道林，符木均.海南粗榧愈傷組織的誘導(dǎo)和培養(yǎng).植物生理學(xué)通訊，2004， 40(1): 34-36; 李志英，王祝年,徐立.海南粗榧的離體快速繁殖.植物生理學(xué)通訊，2005， 41(5): 786)。
本發(fā)明提供了一種直接以海南粗榧種子胚培養(yǎng)進行快繁育苗，在較短的時間內(nèi)，僅用很 少數(shù)量的種子便可以生產(chǎn)大量整齊一致的優(yōu)質(zhì)種苗，避免不能獲得大量種子的的限制問題和扦插與組培的技術(shù)問題，非常適宜大量推廣，以滿足海南粗榧這一珍稀瀕危植物種苗迫切需 求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的關(guān)鍵技術(shù)問題是直接以海南粗榧種子胚為外植體進行培養(yǎng)，產(chǎn)生有根的試 管苗，去根，誘導(dǎo)產(chǎn)生叢生芽，再誘導(dǎo)生根，形成幼苗。從而生產(chǎn)整齊一致的優(yōu)質(zhì)海南粗榧 幼苗，為解決珍稀瀕危植物海南粗榧快繁和恢復(fù)保護與資源開發(fā)利用提供技術(shù)保障。
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是用海南粗榧種胚為外植體，提供整套海南粗榧種苗快繁方法。 解決上述問題的技術(shù)方案包括如下步驟
(1) 外植體的采集與選擇采集并選擇發(fā)育成熟的種子；
(2) 種子的洗凈、滅菌與種胚獲取將成熟種子沖水1-3 h.，并用蒸餾水清洗干凈，濾 紙吸干后放入約0.5-2.0%次氯酸鈉溶液中真空抽濾滅菌3-8 miri ，然后無菌水反復(fù)沖洗3-6 次；在無菌操作臺上，利用已滅菌解剖顯微鏡用剪刀及小鑷子剝?nèi)シN殼并用刀尖挑取種胚； 或者將滅菌好的種子直接轉(zhuǎn)入以下第(3)步；
(3) 種胚接種與培養(yǎng)將獲得的海南粗榧種胚或者滅菌好的種子接種到如下培養(yǎng)基上培 養(yǎng)0.5-1 MS(Murashige and Skoog Stock培養(yǎng)基)+ 0.01-0.1 mg.L-1 6-BA (6-節(jié)基嘌呤)+ 0-100 mg'L"肌醇+0.2-0.6%瓊月旨+ 1-5%蔗糖+ 1-5%椰子乳，pH值5.0-6.0;暗培養(yǎng)2d后 再置于光照周期161rcT1、光照強度2000-3000 Lux的冷光燈下、環(huán)境溫度25 士 2 °C中繼 續(xù)培養(yǎng)15-25 d,便獲得新綠色的生有根的試管苗；
(4) 試管苗繼代與誘導(dǎo)生根將該生根的試管苗去根后在以下培養(yǎng)基上進行繼代培養(yǎng) 0.5-1 MS + 0.1-2.0 mg.L管1 6-BA + 0.01-0.2 mg-I/1 NAA (萘乙酸)+ 0-100 mg-L"肌醇+ 0.2-0.6%瓊脂+1-5°/。蔗糖+0.1-0.5%活性炭，pH值5.0-6.0;每3-5周繼代一次，經(jīng)2-4次 繼代，即可轉(zhuǎn)入以下培養(yǎng)基上誘導(dǎo)植株生根0.5-1 MS + 5.0-10.0 mg'L"IBA (3-吲哚丁酸)+ 0-100 mg'L"肌醇+0.2-0.6%瓊月旨+1-5%蔗糖,？11值5.0-6.0。
(5) 馴化移栽將生根良好的幼苗移至馴化室、光照強度2 0000 Lux 、馴化l-2周， 將苗從試管取出，用溫水沖洗苗根部培養(yǎng)基，再用冷水沖洗，移栽至體積比大約為椰糠:河沙 =1-3:1或蛙石:珍珠巖:泥炭=1-3:1-3:1混合而成的盆裝人工基質(zhì)中，每盆苗套上透明塑料袋， 隔3天將袋子剪一小口， 9-12 d去盆苗透明塑料袋移至溫室培養(yǎng)；1-2周后分別移入花盆 或裝袋制成袋苗(基質(zhì)為從野外海南粗榧群落收集的土壤及地表腐殖質(zhì)椰糠約按l-3: l比 例混合而成)，再培養(yǎng)l-2周，即可轉(zhuǎn)入室外大棚培養(yǎng)生長；成活率達90%以上。
本發(fā)明的有益效果是首創(chuàng)了用海南粗榧種胚作外植體組培快繁的整套方法，并提供了海南粗榧種胚育苗的優(yōu)良培養(yǎng)基，不僅可以生產(chǎn)整齊一致的優(yōu)質(zhì)海南粗榧幼苗，為解決珍稀 瀕危植物海南粗榧快繁和恢復(fù)保護與資源開發(fā)利用提供技術(shù)保障；也為進一步探索海南粗榧 的基因工程、拓寬外植體材料等莫定了基礎(chǔ)。
具體實施例方式
本發(fā)明具體實施方式
下面結(jié)合實例予以闡明培養(yǎng)基中所需各種藥品試劑均可市售獲得， 按商品說明書所示常規(guī)方法配用，為行業(yè)所通用。 實施例1:
(1) 外植體的采集與選擇采集并選擇發(fā)育成熟的種子；
(2) 種子的洗凈、滅菌與種胚獲得將成熟種子沖水lh.，并用蒸餾水清洗干凈，濾紙 吸干后放入0.5%次氯酸鈉溶液中真空抽濾滅菌8!!1111 ,然后無菌水反復(fù)沖洗3次；
(3) 種胚接種與培養(yǎng)在無菌操作臺上，利用已滅菌解剖顯微鏡用剪刀及小鑷子剝?nèi)シN
殼并用刀尖挑取種胚接種到如下培養(yǎng)基上培養(yǎng):0.5 MS(Murashige and Skoog Stock培養(yǎng)基)+ 0.01 mg.L" 6-BA (6-節(jié)基嘌呤)+ 0.2%瓊脂+ 1%蔗糖+ 1°/。椰子乳，pH值5.0;暗培養(yǎng)2 d 后再置于光照周期16 lv(T1、光照強度2000 Lux的冷光燈下、環(huán)境溫度25 士 2 'C中繼續(xù) 培養(yǎng)15 d,便獲得新綠色的生有根的試管苗；
(4) 試管苗繼代與誘導(dǎo)生根將該生根的試管苗去根后在以下培養(yǎng)基上進行繼代培養(yǎng) 0.5 MS + 0.1 mg-I/1 6-BA + 0.01 mg-I/1 NAA (萘乙酸)+ 0.2%瓊脂+ 1%庶糖+ 0.1%活性 炭,pH值5.0;每3周繼代一次，經(jīng)2次繼代，即可轉(zhuǎn)入以下培養(yǎng)基上誘導(dǎo)植株生根0.5MS + 5.0 mg-I/1 IBA (3』引哚丁酸)+ 0.2%瓊脂+ 1%蔗糖,pH值5.0。
(5) 馴化移栽將生根良好的幼苗移至馴化室、光照強度20000 Lux 、馴化1周，將苗 從試管取出，用溫水沖洗苗根部培養(yǎng)基，再用冷水沖洗，移栽至體積比為椰糠:河沙=1:1混合 而成的盆裝人工基質(zhì)中，每盆苗套上透明塑料袋，隔3天將袋子剪一小口， 9 d去盆苗透 明塑料袋移至溫室培養(yǎng)；10d后分別裝袋制成袋苗(基質(zhì)為從野外海南粗榧群落收集的土壤 及地表腐殖質(zhì)椰糠約按l: l比例混合而成)，再培養(yǎng)1周，即可轉(zhuǎn)入室外大棚培養(yǎng)生長,成 活率達卯％。
實施例2:
(1) 外植體的采集與選擇采集并選擇發(fā)育成熟的種子；
(2) 種子的洗凈、滅菌與種胚獲得將成熟種子沖水3h.，并用蒸餾水清洗干凈，濾紙
吸干后放入2.0X次氯酸鈉溶液中真空抽濾滅菌3min ，然后無菌水反復(fù)沖洗6次；
(3) 種胚接種與培養(yǎng)在無菌操作臺上，利用已滅菌解剖顯微鏡用剪刀及小鑷子剝?nèi)シN殼并用刀尖挑取種胚接種到如下培養(yǎng)基上培養(yǎng)1 MS(Murashige and Skoog Stock培養(yǎng)基)+ 0.1 mg七"6-BA(6-芐基嘌呤)+ 100mg丄"肌醇+0.6%瓊脂+5%庶糖十5。/。椰子乳,pH值 6.0;暗培養(yǎng)2d后再置于光照周期16ircT1、光照強度3000 Lux的冷光燈下、環(huán)境溫度25 士2'C中繼續(xù)培養(yǎng)25 d,便獲得新綠色的生有根的試管苗；
(4) 試管苗繼代與誘導(dǎo)生根將該生根的試管苗去根后在以下培養(yǎng)基上進行繼代培養(yǎng) 1 MS + 2.0 mg'I/1 6-BA + 0.2 mg.U1 NAA (萘乙酸)+100 mg.L'1肌醇+ 0.6%瓊脂+ 5%蔗糖 + 0.5%活性炭,pH值6.0;每5周繼代一次，經(jīng)4次繼代，即可轉(zhuǎn)入以下培養(yǎng)基上誘導(dǎo)植 株生根1 MS + 10.0 mg丄-1 IBA(3-吲哚丁酸H 100 mg'L—1肌醇+ 0.6%瓊脂+ 5%蔗糖，pH值 6.0。
(5) 馴化移栽將生根良好的幼苗移至馴化室、光照強度30000 Lux 、馴化2周，將 苗從試管取出，用溫水沖洗苗根部培養(yǎng)基，再用冷水沖洗，移栽至體積比大約為椰糠:河沙=3:1 混合而成的盆裝人工基質(zhì)中，每盆苗套上透明塑料袋，隔3天將袋子剪一小口， 12 d去盆 苗透明塑料袋移至溫室培養(yǎng)；2周后分別移入花盆或裝袋制成袋苗(基質(zhì)為從野外海南粗榧 群落收集的土壤及地表腐殖質(zhì)椰糠約按3: l比例混合而成)，再培養(yǎng)2周，即可轉(zhuǎn)入室外 大棚培養(yǎng)生長；成活率達95%以上。
按本發(fā)明的技術(shù)方法實施，培養(yǎng)基中成分相對比例差異會導(dǎo)致分化率、生根率、壯弱程 度上的差異，總的說，數(shù)值越接近最佳值，實施結(jié)果越理想。
權(quán)利要求
1、海南粗榧種胚培養(yǎng)育苗方法，其特征在于按照下述步驟進行(1)外植體的采集與選擇采集并選擇發(fā)育成熟的種子；(2)種子的洗凈、滅菌與種胚獲取將成熟種子沖水1-3h.，并用蒸餾水清洗干凈，濾紙吸干后放入0.5-2.0％次氯酸鈉溶液中真空抽濾滅菌3-8min，然后無菌水反復(fù)沖洗3-6次；在無菌操作臺上，利用已滅菌解剖顯微鏡用剪刀及小鑷子剝?nèi)シN殼并用刀尖挑取種胚；或者將滅菌好的種子直接轉(zhuǎn)入以下第(3)步；(3)種胚接種與培養(yǎng)將獲得的海南粗榧種胚或者滅菌好的種子接種到如下培養(yǎng)基上培養(yǎng)0.5-1Murashige and Skoog Stock培養(yǎng)基+0.01-0.1mg·L-1 6-芐基嘌呤+0-100mg·L-1肌醇+0.2-0.6％瓊脂+1-5％蔗糖+1-5％椰子乳，pH值5.0-6.0；暗培養(yǎng)2d后再置于光照周期16h·d-1、光照強度2000-3000Lux的冷光燈下、環(huán)境溫度25±2℃中繼續(xù)培養(yǎng)15-25d，即可獲得新綠色的生有根的試管苗；(4)試管苗繼代與誘導(dǎo)生根將該生根的試管苗去根后在以下培養(yǎng)基上進行繼代培養(yǎng)0.5-1Murashige and Skoog Stock培養(yǎng)基+0.1-2.0mg·L-1 6-芐基嘌呤+0.01-0.2mg·L-1萘乙酸+0-100mg-L-1肌醇+0.2-0.6％瓊脂+1-5％蔗糖+0.1-0.5％活性炭，pH值5.0-6.0；每3-5周繼代一次，經(jīng)2-4次繼代，即可轉(zhuǎn)入以下培養(yǎng)基上誘導(dǎo)植株生根0.5-1Murashige and SkoogStock培養(yǎng)基+5.0-10.0mg·L-1 3-吲哚丁酸+0-100mg·L-1肌醇+0.2-0.6％瓊脂+1-5％蔗糖，pH值5.0-6.0；(5)馴化移栽將生根良好的幼苗移至馴化室、光照強度20000Lux、馴化1-2周，將苗從試管取出，用溫水沖洗苗根部培養(yǎng)基，再用冷水沖洗，移栽至以體積比計為椰糠∶河沙＝1-3∶1或蛙石∶珍珠巖∶泥炭＝1-3∶1-3∶1混合而成的盆裝人工基質(zhì)中，每盆苗套上透明塑料袋，隔3天將袋子剪一小口，9-12天去盆苗透明塑料袋移至溫室培養(yǎng)；1-2周后分別移入花盆或裝袋制成袋苗，其基質(zhì)為從野外海南粗榧群落收集的土壤及地表腐殖質(zhì)∶椰糠按1-3∶1體積比例混合而成，再培養(yǎng)1-2周，即可轉(zhuǎn)入室外大棚培養(yǎng)生長。
全文摘要
本發(fā)明海南粗榧種胚培養(yǎng)育苗方法，涉及一種植物的快速繁育方法。按照下述步驟進行(1)外植體的采集與選擇；(2)種子的洗凈、滅菌與種胚獲?。?3)種胚接種與培養(yǎng)；(4)試管苗繼代與誘導(dǎo)生根；(5)馴化移栽。本發(fā)明首創(chuàng)了用海南粗榧種胚作外植體組培快繁的整套方法，并提供了海南粗榧種胚育苗的優(yōu)良培養(yǎng)基，不僅可以生產(chǎn)整齊一致的優(yōu)質(zhì)海南粗榧幼苗，為解決珍稀瀕危植物海南粗榧快繁和恢復(fù)保護與資源開發(fā)利用提供技術(shù)保障；也為進一步探索海南粗榧的基因工程、拓寬外植體材料等莫定了基礎(chǔ)。
文檔編號A01H4/00GK101637130SQ20091018421
公開日2010年2月3日 申請日期2009年8月14日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月14日
發(fā)明者司春燦, 宋經(jīng)元, 杜道林, 王有生, 甘炳春, 祁珊珊, 魏建和 申請人:江蘇大學(xué)