一種含海藻糖的牛胚胎體外培養(yǎng)液及培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種含海藻糖的牛胚胎體外培養(yǎng)液及培養(yǎng)方法，所述牛胚胎體外培養(yǎng)液組成如下：海藻糖0.1～1.0mg/mL，大豆甙元0.1～10μg/mL，青霉素100IU/mL，鏈霉素100μg/mL，血清白蛋白5～10mg/mL，溶劑為SOF培養(yǎng)液。本發(fā)明將海藻糖和大豆甙元組合應(yīng)用于牛胚胎體外，相比于單獨使用海藻糖或者大豆甙元，可以顯著顯著提高體外胚胎的發(fā)育率，其經(jīng)濟成本較低，便于在生產(chǎn)中推廣應(yīng)用。
【專利說明】一種含海藻糖的牛胚胎體外培養(yǎng)液及培養(yǎng)方法
(-)【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種含海藻糖的牛胚胎體外培養(yǎng)液，以及利用所述牛胚胎體外培養(yǎng)液進行牛胚胎體外培養(yǎng)的方法。
(二)【背景技術(shù)】
[0002]隨著現(xiàn)代繁殖生物技術(shù)的發(fā)展及胚胎體外生產(chǎn)技術(shù)的逐步完善，利用體外受精技術(shù)生產(chǎn)體外胚胎呈現(xiàn)出潛在的廣闊應(yīng)用前景。家畜胚胎體外生產(chǎn)尤其是體細胞核移植是快速擴大優(yōu)秀種群數(shù)量的有效途徑。雖然通過體外受精技術(shù)已經(jīng)獲得了活的后代，但體外受精后的早期胚胎體外發(fā)育率較低，限制了胚胎體外生產(chǎn)在實踐中的推廣應(yīng)用。
[0003]體內(nèi)早期胚胎的發(fā)育在避光、低氧氣濃度(約7%)的雌性生殖道內(nèi)完成，并且有輸卵管和子宮分泌的粘液保護。但胚胎的體外培養(yǎng)在約含20%氧氣的培養(yǎng)箱中完成，這種高濃度氧氣將對體外培養(yǎng)的胚胎產(chǎn)生顯著的氧化應(yīng)激。并且體外胚胎脫離了母體的保護，不僅會受到氧化應(yīng)激的損傷，還面臨日光或燈光刺激、滲透壓變化等因素的影響。這些不利因素直接導(dǎo)致了目前體外胚胎的早期發(fā)育率顯著低于體內(nèi)胚胎，已成為體外受精等胚胎體外生產(chǎn)技術(shù)推廣應(yīng)用的一個瓶頸。
[0004]海藻糖是由兩個葡萄糖分子通過半縮醛羥基縮合而成的非還原性雙糖，化學性質(zhì)穩(wěn)定，對熱、酸都不敏感，并具有獨特的生物學特性、對生物抗脫水的保護作用、抗冷凍保護作用和抗高滲保護作用，在各種惡劣環(huán)境下，海藻糖表現(xiàn)出對物種的生物膜、蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子良好的保護作用。對于海藻糖的研究已有文獻報道。CN103450288A、CN103146779A、CN102965412A、CN102337313A、CN101831474A、CN1807465A 等多種專利申請公開了海藻糖的合成或純化方法。CNlOl 181279A、CN1302812C、CN100571707C、CN101443344A等多種專利公開了海藻糖在醫(yī)藥領(lǐng)域的用途。而CN101513221A、CN103250880A等多種專利公開了海藻糖用作動物飼料添加劑的用途。但到目前為止，尚未見有關(guān)海藻糖用于家畜繁殖【技術(shù)領(lǐng)域】，特別是用于胚胎體外培養(yǎng)的報道。
(三)
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種含海藻糖的牛胚胎體外培養(yǎng)液及培養(yǎng)方法，本申請發(fā)明人就海藻糖用于牛胚胎體外培養(yǎng)進行了長時間的研究，從而完成了本發(fā)明，該培養(yǎng)液具有緩解體外環(huán)境對早期胚胎的多種應(yīng)激損傷，提高卵母細胞體外受精后胚胎發(fā)育率的功能。
[0006]本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:
[0007]一種含海藻糖的牛胚胎體外培養(yǎng)液，所述牛胚胎體外培養(yǎng)液組成如下:海藻糖0.1~1.0mg/mL,大豆式元0.1~10 μ g/mL,青霉素100IU/mL,鏈霉素100 μ g/mL,血清白蛋白5~10mg/mL，溶劑為SOF培養(yǎng)液。
[0008]所述海藻糖已有多種制取方法，屬于已知工藝和成熟技術(shù)，并已有商品出售，較為成熟的生產(chǎn)和銷售廠家有河南華諾海藻生物工程有限公司、武漢富瑞斯凱材料供應(yīng)有限公司、廈門美拉德食品配料有限公司、Sigma公司等。本發(fā)明中所用海藻糖購自Sigma公司，純度大于98%。
[0009]所述大豆式兀已有多種制取方法,屬于已知工藝和成熟技術(shù)，并已有商品出售，較為成熟的生產(chǎn)和銷售廠家有西安融升生物科技有限公司、成都新基科技有限公司、Sigma公司等，本發(fā)明中所用大豆甙元購自Sigma公司。由于大豆甙元不溶于水，因此通常先用少量有機溶劑如DMSO溶解之后再進行培養(yǎng)基的配制。
[0010]優(yōu)選的，所述培養(yǎng)液組成如下:
[0011]
【權(quán)利要求】
1.一種含海藻糖的牛胚胎體外培養(yǎng)液，其特征在于所述牛胚胎體外培養(yǎng)液組成如下:海藻糖0.1~1.0mg/mL,大豆式元0.1~10 μ g/mL,青霉素100IU/mL,鏈霉素100 μ g/mL,血清白蛋白5~10mg/mL，溶劑為SOF培養(yǎng)液。
2.如權(quán)利要求1所述的牛胚胎體外培養(yǎng)液，其特征在于所述培養(yǎng)液組成如下:
3.利用權(quán)利要求1所述牛胚胎體外培養(yǎng)液進行牛胚胎體外培養(yǎng)的方法，所述方法包括:將受精后的早期牛胚胎用SOF培養(yǎng)液反復(fù)沖洗后，放入所述含海藻糖的牛胚胎體外培養(yǎng)液中，于38~39°C、5%C02的環(huán)境內(nèi)，進行胚胎體外培養(yǎng)。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述早期牛胚胎由牛卵母細胞經(jīng)體外成熟培養(yǎng)、體外受精獲得。
5.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述方法如下: (O配制牛卵母細胞體外成熟培養(yǎng)液，組成如下:海藻糖0.1~1.0mg/mL，大豆甙元0.1~10 μ g/mL,青霉素100IU/mL，鏈霉素100 μ g/mL,血清體積百分含量8%~20%，溶劑為M199培養(yǎng)液； (2)將牛卵母細胞體外成熟培養(yǎng)液在一次性塑料培養(yǎng)皿上形成體積為50~100μ L的培養(yǎng)小滴，置38~39°C環(huán)境中預(yù)熱1~3小時，牛卵母細胞經(jīng)沖洗后放入預(yù)熱后的培養(yǎng)小滴，在38~39°C、5%C02的環(huán)境內(nèi)培養(yǎng)20~24小時； (3)用受精培養(yǎng)液在一次性塑料培養(yǎng)皿上形成體積為50~100yL的受精小滴，置38~39°C環(huán)境中預(yù)熱1~3小時，將儲存在液氮罐中的凍精解凍，然后與步驟(2)培養(yǎng)后的牛卵母細胞一同放入受精小滴，在38~39°C、5%C02的環(huán)境內(nèi)培養(yǎng)15~18小時，進行受精，得到受精后的早期胚胎； (4)配制牛胚胎體外培養(yǎng)液，組成如下:海藻糖0.1~1.0mg/mL,大豆甙元0.1~10μ g/mL，青霉素100IU/mL，鏈霉素100 μ g/mL，血清白蛋白5~10mg/mL，溶劑為SOF培養(yǎng)液； (5)用步驟(4)牛胚胎體外培養(yǎng)液在一次性塑料培養(yǎng)皿上形成體積為50~100μ L的培養(yǎng)小滴，置38~39°C環(huán)境中預(yù)熱1~3小時，將受精后的早期胚胎沖洗后，放入培養(yǎng)小滴中，在38~39°C、5%C02的環(huán)境內(nèi)培養(yǎng)。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于步驟(3)所述受精培養(yǎng)液為含5~lOmg/mL肝素的BO液、或者Tyrode’ s改良液。
【文檔編號】C12N5/073GK103881965SQ201410130173
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2014年4月2日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月2日
【發(fā)明者】王爭光, 李正操, 俞頌東 申請人:浙江大學