專利名稱：日本結(jié)縷草植株再生方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物組織培養(yǎng)技術(shù)，具體涉及日本結(jié)縷草的高頻再生方法。
背景技術(shù)：
日本結(jié)縷草(Poa pratensis L.)是禾本科優(yōu)質(zhì)暖季型草坪草，采用基因工程對日本結(jié)縷草進行品種改良、新品種選育已經(jīng)成為當前日本結(jié)縷草生物技術(shù)領(lǐng)域研究的重點。日本結(jié)縷草基因轉(zhuǎn)化的受體系統(tǒng)主要來源于組織培養(yǎng)途徑，作為基因轉(zhuǎn)化的受體系統(tǒng)，要求具有很強的再生能力、較高的遺傳穩(wěn)定性、穩(wěn)定的外植體來源、對選擇性抗生素敏感、對農(nóng)桿菌侵染要有敏感性等。因此，建立高效的再生體系一直是日本結(jié)縷草育種學家追尋的目標。然而日本結(jié)縷草的離體培養(yǎng)相對于冷季型草坪草難度更大，雖然已有日本結(jié)縷草組培再生體系建立的報道，但是還存在再生頻率較低、維持愈傷胚性困難等不足，沒有較系統(tǒng)的研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供日本結(jié)縷草植株再生的方法。
本發(fā)明首先通過外植體誘導形成愈傷組織，再進一步挑選胚性愈傷組織進行繼代培養(yǎng)或直接分化成植株。本發(fā)明通過實驗獲得了具體的技術(shù)參數(shù)，從而建立了日本結(jié)縷草植株高頻再生體系。
本發(fā)明將外植體經(jīng)預處理后，接種愈傷組織誘導培養(yǎng)基，從而得到愈傷組織，挑選胚性愈傷組織接種繼代培養(yǎng)基進行繼代培養(yǎng)，或者接種再生培養(yǎng)基分化成再生植株。
其中，愈傷組織誘導培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基加入2，4-D 3-6mg/L、6-BA或KT 0.05-0.2mg/L及CuSO42-3.5mg/L。
其中，繼代培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基加入2，4-D 2mg/L其中，再生培養(yǎng)基為1/2的MS培養(yǎng)基加入KT 0.2mg/L上述外植體可以為成熟種子、芽尖、胚軸或根，優(yōu)選為成熟種子和芽尖。對于成熟種子而言，其通過次氯酸鈉處理，特別是去皮之后用次氯酸鈉處理，可以顯著提高誘導率。
胚性愈傷組織生長22～35天期間為旺盛生長期，是繼代的最佳時期；繼代時仔細挑選奶白至淡黃色、顆粒狀的胚性愈傷組織，然后轉(zhuǎn)接至新鮮培養(yǎng)基上。及時繼代與仔細挑選，是保持愈傷組織胚性的關(guān)鍵。
本發(fā)明以愈傷組織和胚性愈傷組織誘導率來評價本發(fā)明中的各個影響因素(如選用的外植體、使用的培養(yǎng)基、添加的誘導物等等)。
其中，愈傷組織的誘導率＝形成愈傷的外植體數(shù)/接種的外植體數(shù)×100％；胚性愈傷率＝胚性愈傷數(shù)/愈傷數(shù)×100％。
按照本發(fā)明的方法，外植體的愈傷誘導率可達90％，胚性愈傷率可達30％，愈傷組織再生率可達45％。再生植株在有很強的分蘗、生根能力。植株經(jīng)壯苗、煉苗后移栽入土壤中，成活率達87.5％以上。移栽的植株在田間能夠正常擴繁生長。


圖1是由日本結(jié)縷草成熟種子誘導愈傷組織；圖2是繼代培養(yǎng)的胚性愈傷組織；圖3是日本結(jié)縷草胚性愈傷組織，其中，E為胚性愈傷；NE為非胚性愈傷；圖4是體細胞胚胎發(fā)生(箭頭所示)；圖5是綠色芽點出現(xiàn)；圖6是日本結(jié)縷草植株再生；圖7是再生苗移栽入土壤；圖8是日本結(jié)縷草愈傷組織生長曲線，1-5表示5個重復的‘Qingdao’愈傷組織。
具體實施例方式
下面實施例用于對本發(fā)明的進一步說明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
1.材料與方法1.1試驗材料日本結(jié)縷草品種‘Zenith’(Zoysia japonica cv.Zenith)、‘Liaoning’(Zoysia japonica cv.Liaoning)、‘Qingdao’(Zoysia japonica cv.Qingdao)、‘Lanyin 3’(Zoysia japonica cv.Lanyin3)；‘Zenith’種子購自美國TMI公司(Turf Merchants，Inc)，‘Liaoning’、‘Qingdao’品種種子購自北京市種子公司，‘Lanyin 3’品種種子購自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)牧研究所。
1.2外植體的獲得成熟種子浸在約50mL次氯酸鈉溶液(北京化工廠生產(chǎn)，活性氯＞5％，加入1～2滴吐溫20)中，在磁力攪拌器上消毒1h，以無菌水沖洗3～5次，4℃下浸泡若干天。對于由種子誘導愈傷組織，消毒處理后的種子以無菌濾紙吸干多余水分后接種于不同固體培養(yǎng)基上，對于由無菌苗各部位誘導愈傷組織，將消毒處理后的種子接種于無菌種子萌發(fā)培養(yǎng)基中，28℃黑暗或16h/d光照下培養(yǎng)，萌發(fā)出小苗后，取不同部位接種于不同的愈傷組織誘導培養(yǎng)基上。
將處理過的成熟種子消毒并置于無激素的1/2MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)，待種子接種13天后，選取結(jié)縷草無菌苗(生長5-10天，長出莖、根后)的葉尖(5mm長)、葉段(5mm長)、莖基(5mm長)和根部作為外植體。
1.3培養(yǎng)基各培養(yǎng)基以MS基本培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，變動其它因素，pH5.8，附加植物凝膠3g/L，1/2MS培養(yǎng)基附加20g/L蔗糖，其余培養(yǎng)基蔗糖濃度為30g/L。
1.4培養(yǎng)方法外植體接種入誘導愈傷培養(yǎng)基中，，黑暗狀態(tài)下28℃誘導愈傷組織。愈傷每月繼代一次到愈傷組織繼代培養(yǎng)基上，一個月后統(tǒng)計愈傷誘導率，2個月后統(tǒng)計胚性愈傷率。挑選淡黃或白色，結(jié)構(gòu)致密，顆粒狀的胚性愈傷組織(0.5mm大小)轉(zhuǎn)入不同再生培養(yǎng)基，光下培養(yǎng)，光照強度約2000～3000Lux，光照周期16h/d，溫度25～28℃，一個月后統(tǒng)計植株再生率。待小植株形成后，轉(zhuǎn)入1/2MS培養(yǎng)基上壯苗。根系強壯后，打開瓶蓋煉苗3天，然后以自來水小心洗去植株根部瓊脂，移栽入由砂(0.25～0.5mm)與草炭土混合基質(zhì)中，混合比例砂草炭土＝9∶1。
2.結(jié)果與分析2.1種子的預處理對愈傷誘導的影響日本結(jié)縷草種子經(jīng)次氯酸鈉消毒后，于4℃浸泡不同天數(shù)后接種于MS+2，4-D 5mg/L的培養(yǎng)基中，以未經(jīng)過浸泡的處理作對照，一個月后統(tǒng)計愈傷誘導率。結(jié)果可見，隨著浸泡天數(shù)的增加，愈傷誘導率也呈增長趨勢，除品種‘Qingdao’未去皮種子在浸泡14d愈傷誘導率仍呈上升趨勢外，其余處理在浸泡3d后愈傷誘導率開始下降。因此，除品種‘Qingdao’未去皮種子需浸泡2周以上外，其余處理種子消毒后4℃下浸泡2～3d將大大提高愈傷誘導率。
表1 4℃浸泡處理對成熟種子愈傷誘導率的影響


2.2日本結(jié)縷草種子誘導愈傷的多因素正交實驗以‘Qingdao’、‘Zenith’、‘Liaoning’及‘Lanyin 3’4個品種的成熟種子為材料，確定基因型、2，4-D、KT、6-BA及CuSO45個主要影響因子，設(shè)計5因素4水平L16(45)的正交試驗。正交試驗表頭及各因素、水平見表2，數(shù)據(jù)經(jīng)反正弦變換后做方差分析，結(jié)果見表3(表中數(shù)據(jù)為各水平均值)。
表2 以日本結(jié)縷草種子為外植體誘導愈傷的正交試驗設(shè)計

表3 日本結(jié)縷草種子誘導愈傷的多因素正交實驗結(jié)果


注a)英文小寫字母不同表示0.05水平顯著；b)英文大寫字母不同表示0.01水平顯著。
可見，對于愈傷誘導率，2，4-D、KT、6-BA各水平差異不顯著(P＞0.05)，而基因型、CuSO4對愈傷誘導率影響顯著。CuSO4在2.5mg/L時愈傷誘導率極顯著(α＜0.01)高于其它3個水平；品種‘Zenith’的愈傷誘導率極顯著(α＜0.01)高于其它3個品種，并且‘Lanyin 3’的愈傷誘導率也極顯著(α＜0.01)高于‘Liaoning’和‘Qingdao’2個品種。即，在日本結(jié)縷草組織培養(yǎng)中，選用品種‘Zenith’，在愈傷組織誘導培養(yǎng)基中添加2，4-D 5mg/L、6-BA或KT 0.1mg/L及CuSO42.5mg/L，將提高效率。
2.3以無菌實生苗各部分為外植體誘導愈傷組織的正交實驗2.3.1以胚軸、根段及幼芽誘導愈傷組織的正交實驗日本結(jié)縷草品種‘Zenith’種子28℃光下無菌萌發(fā)4d后，取小苗的胚軸、根段及幼芽分別接種至不同培養(yǎng)基中，黑暗狀態(tài)下28℃培養(yǎng)。1個月后統(tǒng)計愈傷誘導率，2個月后統(tǒng)計胚性愈傷率，數(shù)據(jù)經(jīng)反正弦變換后做方差分析。由于以幼芽為外植體的實驗中，僅得到少數(shù)幾個愈傷組織，而且愈傷呈水漬狀，無胚性結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)，因此未做分析。以胚軸和根段為外植體結(jié)果分別見表4和表5，表中數(shù)據(jù)為各水平均值。
4 日本結(jié)縷草胚軸誘導愈傷的多因素正交實驗結(jié)果

注a)英文小寫字母不同表示0.05水平顯著；b)英文大寫字母不同表示0.01水平顯著。
對于以胚軸為外植體誘導愈傷組織，2，4-D在2～5mg/L水平內(nèi)對愈傷誘導率和胚性愈傷率都沒有顯著影響(P＞0.05)；KT濃度為0時的愈傷誘導率極顯著(α＜0.01)高于其它2個水平，而各水平間對胚性愈傷誘導無顯著影響；6-BA濃度在0～0.05mg/L范圍內(nèi)的愈傷誘導率顯著(α＜0.05)高于0.1mg/L的濃度處理，在濃度為0.05mg/L時胚性愈傷率顯著(α＜0.05)高于不含的6-BA處理，因此添加6-BA有利于胚性愈傷組織的誘導；含0.025mg/L CuSO4處理的愈傷誘導率顯著高于其它2個水平，而且各水平間對胚性愈傷率無顯著影響(P＞0.05)，說明MS培養(yǎng)基中的CuSO4濃度(0.025mg/L)已經(jīng)適于由胚軸誘導愈傷組織，無需再額外添加CuSO4?？梢?，在以日本結(jié)縷草胚軸為外植體誘導愈傷組織的實驗中，可以選用2～5mg/L的2，4-D，添加0.05mg/L 6-BA。
表5 日本結(jié)縷草根段誘導愈傷的多因素正交實驗結(jié)果

注a)英文小寫字母不同表示0.05水平顯著；b)英文大寫字母不同表示0.01水平顯著。
以日本結(jié)縷草根段為外植體誘導愈傷的實驗中，2，4-D在2～5mg/L范圍內(nèi)對愈傷誘導率無顯著影響(P＞0.05)；KT和6-BA反應相似，0mg/L的處理相比于其它兩水平可以極顯著(α＜0.01)提高愈傷誘導率；0.025mg/L的CuSO4與1.25mg/L的處理對愈傷誘導率無顯著差異，但顯著好于2.5mg/L。而2，4-D、KT、6-BA及CuSO4各水平間對胚性愈傷率均無顯著影響。實驗中也觀察到，由根段誘導得到的愈傷組織很容易在繼代后失去胚性，這可能是由根中的激素水平導致的結(jié)果。因此，根段不適于日本結(jié)縷草的組織培養(yǎng)。
2.3.2以芽尖誘導愈傷組織的正交實驗日本結(jié)縷草消毒處理后的種子接種在種子萌發(fā)培養(yǎng)基上，28℃黑暗條件下培養(yǎng)，使種子萌發(fā)出黃化苗。因為光會抑制胚軸的生長，因此綠色小苗的芽尖位于種子附近，不利于操作，而黑暗狀況有利于胚軸的伸長，黃化苗的芽尖部分距離種子較遠，有利于芽尖的撥取。種子萌發(fā)后，在體視顯微鏡下以解剖針撥取黃化苗的芽尖部位，接種至含有不同濃度2，4-D、KT及CuSO4的MS培養(yǎng)基上誘導愈傷組織，1個月后統(tǒng)計愈傷誘導率，2個月后統(tǒng)計胚性愈傷率，數(shù)據(jù)經(jīng)反正弦變換后做方差分析，實驗結(jié)果見表6，表中數(shù)據(jù)為各水平均值。
表6 日本結(jié)縷草芽尖誘導愈傷的多因素正交實驗結(jié)果

經(jīng)方差分析得出，2，4-D、KT及CuSO4在本實驗取值范圍內(nèi)，對日本結(jié)縷草芽尖誘導愈傷組織的愈傷誘導率和胚性愈傷率都沒有顯著(P＞0.05)影響。原因可能是因為芽尖部分是草坪草葉原基所在之處，由細胞分裂旺盛的分生組織組成，而草坪草組織培養(yǎng)中分裂越旺盛的細胞越有利于愈傷組織的誘導與胚性愈傷的形成，因此受各因素影響較小，與種子、胚軸、根段等其它外植體相比，愈傷誘導率和胚性愈傷率都很高，最有利于日本結(jié)縷草胚性愈傷組織的誘導，但由于萌發(fā)苗太小，芽尖的撥取要在體視顯微鏡下操作，費時費力且容易對芽尖造成損傷從而影響愈傷組織的誘導，需要有經(jīng)驗的人才能熟練操作，因此應用受到限制。
2.4愈傷組織生長曲線的測定愈傷組織繼代后經(jīng)過恢復期、旺盛生長期而達到增殖頂峰而后生長緩慢。愈傷組織的繼代培養(yǎng)最合適時間是愈傷組織即將達到頂峰之前，這時愈傷組織中的細胞處于旺盛分裂中，繼代后容易進入生長階段。若長時間不繼代，培養(yǎng)基中各種養(yǎng)分被吸收殆盡，無法滿足繼續(xù)生長所需，從而影響愈傷組織的質(zhì)量。為了找出日本結(jié)縷草愈傷組織的最佳繼代時期，對5個重復的‘Qingdao’愈傷組織進行12次稱重，三天一次。其中重復5在第8次稱重后污染。如附圖8所示，愈傷組織在轉(zhuǎn)接到新的培養(yǎng)基上后重量開始增加，在第8次(繼代第24天)稱重后，愈傷增重率較大，說明愈傷組織進入旺盛生長狀態(tài)，在第11次稱重后(繼代33天后)，愈傷增重持平，表明培養(yǎng)基中的養(yǎng)分已消耗殆盡，不足以維持愈傷組織的旺盛生長，此時如果再不繼代，會影響到愈傷組織的生長。因此，愈傷組織在第8次至第11次間(24～33天)為旺盛生長期，是繼代的最佳時期。該結(jié)論也與平時的肉眼觀察相符合，從胚性愈傷的生長來看，經(jīng)過恢復期的生長，在繼代后約25天左右，可在原來的愈傷旁邊看到顆粒狀的胚性愈傷長出，并在以后的一星期內(nèi)迅速增殖。而愈傷生長30多天后若再不繼代，原培養(yǎng)基中的2，4-D濃度已下降至不足以控制胚性愈傷的生長，而胚性愈傷開始繼續(xù)體細胞胚的發(fā)育階段，此時胚性愈傷已有分化的趨勢，甚至見到芽叢長出。因此，對于愈傷胚性的維持，及時繼代非常重要。
2.5不同培養(yǎng)基對日本結(jié)縷草植株再生的影響挑選狀態(tài)相同的日本結(jié)縷草‘Zenith’和‘Qingdao’兩品種的胚性愈傷組織，轉(zhuǎn)接入不同再生培養(yǎng)基中，觀察不同培養(yǎng)基對植株再生的影響。一星期后愈傷出現(xiàn)綠色芽點，并逐漸分化為小植株，全部為正常的綠色植株。日本結(jié)縷草植株的再生可能是由愈傷的狀態(tài)決定的，各培養(yǎng)基對成苗率影響不大。這可能是因為實驗中嚴格挑選胚性的愈傷組織轉(zhuǎn)接入各種培養(yǎng)基，胚性愈傷經(jīng)過體細胞胚發(fā)生途徑再生植株，而不是依賴于激素的作用。在實踐中也發(fā)現(xiàn)，胚性愈傷組織具有很強的分化趨勢，在愈傷組織繼代培養(yǎng)基上需要以較高濃度的2，4-D控制體胚的發(fā)生，一旦2，4-D濃度降低或消除，胚性愈傷便會迅速發(fā)育，這就是如果愈傷繼代間隔較長，即原培養(yǎng)基中2，4-D濃度已急劇下降時，經(jīng)常會見到芽叢產(chǎn)生的原因。
雖然各培養(yǎng)基中成苗率相差不多，但在1/2MS+KT 0.2mg/L培養(yǎng)基中，根與芽更趨向于同時分化，符合體細胞胚發(fā)育途徑，而不需經(jīng)芽分化與根分化兩個獨立的階段，從而縮短了培養(yǎng)時間。植株經(jīng)壯苗、煉苗后移栽入土壤中，成活率達87.5％以上。
表7 不同培養(yǎng)基對植株再生的影響

3.該再生體系應用實例采用基因槍轉(zhuǎn)化法，轟擊由此再生體系培養(yǎng)出的胚性愈傷組織，經(jīng)過繼代與分化培養(yǎng)，成功將提高植物抗旱、耐寒、耐鹽性的DREB1A基因轉(zhuǎn)入日本結(jié)縷草，獲得了轉(zhuǎn)基因植株。
權(quán)利要求
1.日本結(jié)縷草愈傷組織誘導方法，其包括步驟1)將外植體預處理；2)接種愈傷組織誘導培養(yǎng)基，其中所述的愈傷組織誘導培養(yǎng)基含有2，4-D 3-6mg/L、6-BA或KT 0.05-0.2mg/L及CuSO42-3.5mg/L。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的愈傷組織誘導培養(yǎng)基含有2，4-D 5mg/L、6-BA或KT 0.1mg/L及CuSO42.5mg/L。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的外植體為成熟種子。
4.日本結(jié)縷草植株再生方法，其特征在于，通過權(quán)利要求1～3所述的方法誘導得到愈傷組織，挑選胚性愈傷組織接種再生培養(yǎng)基，其中所述的再生培養(yǎng)基為1/2的MS培養(yǎng)基加入KT 0.2mg/L。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，挑選胚性愈傷組織經(jīng)繼代培養(yǎng)后接種再生培養(yǎng)基。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述的繼代培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基加入2，4-D 2mg/L。
全文摘要
本發(fā)明提供了日本結(jié)縷草植株再生方法。該方法將外植體經(jīng)預處理后，接種愈傷組織誘導培養(yǎng)基，從而得到愈傷組織，挑選胚性愈傷組織接種繼代培養(yǎng)基進行繼代培養(yǎng)，或者接種再生培養(yǎng)基分化成再生植株，其中愈傷組織誘導培養(yǎng)基含有2，4－D 3－6mg/l、6－BA或KT 0.05－0.2mg/l及CuSO
文檔編號C12N5/04GK101015281SQ20071006424
公開日2007年8月15日 申請日期2007年3月7日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月7日
發(fā)明者韓烈保, 齊春輝, 梁小紅, 方文娟, 曾會明 申請人:北京林業(yè)大學, 韓烈保, 齊春輝