玉米單倍體植株的培育方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及植株單倍體的培育方法，尤其涉及一種玉米單倍體幼胚培養(yǎng)成單倍體植株的方法，其以玉米單倍體幼胚為受體材料，將其誘導為愈傷組織，并將該愈傷組織接種于繼代培養(yǎng)基，采用光暗培養(yǎng)的方法進行光照鑒定，篩選出未變色的愈傷組織作為擬單倍體愈傷組織，進行分化和生根培養(yǎng)得到玉米單倍體植株。本發(fā)明利用玉米單倍體幼胚獲得玉米單倍體植株，通過光照培養(yǎng)進行單倍體愈傷組織的鑒定，該鑒定方法簡單易行，降低了鑒定成本；該培育方法建立了單倍體植株的穩(wěn)定高效的組織培養(yǎng)體系，可廣泛用于玉米的遺傳再生、組織培養(yǎng)、材料選育等方面。
【專利說明】玉米單倍體植株的培育方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及植株單倍體的培育方法，尤其涉及一種玉米單倍體幼胚培養(yǎng)成單倍體植株的方法。
【背景技術】
[0002]玉米是世界上主要的糧食、飼料和經濟作物，1998年以來，玉米的總產量超過水稻和小麥，居世界首位，但是全球玉米需求持續(xù)增長，尤其是亞洲地區(qū)；我國玉米長期以來存在需求量大、供求不足的問題，因此，當務之急應開發(fā)高產、優(yōu)質、多抗的玉米新品種。
[0003]玉米是雌雄同株異花、進行有性生殖的作物，是研究遺傳學、基因組學和分子生物學的理想的單子葉模式植物。通過常規(guī)的雜交育種獲得純合的株系需要漫長的育種周期。為了獲得純合的玉米株系，研究者以往采用選育玉米自交系的方法，但是玉米自交系的培育，必須經過多代的自交和選擇，選育一個品種的年限很長。因此，研究者一直致力于如何縮短選育玉米自交系的時間，提高育種效率。
[0004]隨著生物技術的迅速發(fā)展和不斷完善，越來越多的研究和新品種的產生采用基因工程手段來進行作物遺傳改良和新物種的創(chuàng)造。目前，植物基因轉化多以成熟胚、幼胚或其誘導的愈傷組織、叢生芽及原生質體等二倍體材料作為受體。這些材料來源相對較廣泛，轉化效率較高，生活力較強，但由于外源基因在轉化所得的陽性植株中易發(fā)生丟失和沉默或多以雜合狀態(tài)存在，導致遺傳穩(wěn)定性下降或形成嵌合體，由此要得到純合株系，至少需要培育5-7代，即4-6年的時間，導致需要消耗大量的人力和時間。而單倍體材料只有一套染色體，以單倍體為轉基因受體，避免了等位基因分離，單倍體植株或組織器官經加倍即可得到純合的二倍體植株，可使外源基因在后代中迅速純合并穩(wěn)定遺傳，即培育2個世代就可以獲得純合株系，明顯縮短育種年限。因此，以單倍體為受體的轉基因育種技術越來越受到關注，且以單倍體植株或組織器官作為轉基因受體已經成功的應用于煙草、水稻等多種植物中。
[0005]轉基因育種需要建立優(yōu)良的再生體系作為遺傳轉化的基礎，因此，對于研究以單倍體為受體的轉基因育種技術，首先需要建立一套成熟的遺傳再生體系。目前，國內外許多研究中雖已獲得了大量以單倍體為受體的玉米轉基因植株，但大部分都是經大量且多次重復實驗后僅得到幾個轉基因植株后代，尤其是以小孢子、花藥等組織為轉化受體的材料，其存在愈傷組織誘導率低、愈傷組織器官分化率低等問題，導致其轉化效率不到1%，遠不能達到生產應用的標準。由此可知，現(xiàn)階段迫切需要一種能提高材料轉化效率、縮短轉化時間的轉化受體，該轉化受體為玉米單倍體植株培養(yǎng)的關鍵。
[0006]玉米單倍體植株培養(yǎng)的另一關鍵是單倍體的鑒定效率。目前，玉米單倍體的鑒定方法主要有形態(tài)鑒別法及遺傳標記法等，但在實踐中，以上鑒定方法由于不同材料的表達差別以及不同的環(huán)境條件對表達的影響，對鑒定結果有較大差別。因此迫切需要開發(fā)出一種新的高效、準確的單倍體鑒定方法。
【發(fā)明內容】

[0007]針對上述現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明的目的在于提供了一種采用玉米單倍體幼胚為受體材料，培養(yǎng)成愈傷組織后進行單倍體鑒定，最后培養(yǎng)為玉米單倍體植株的方法。
[0008]為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術方案如下:
[0009]一種玉米單倍體植株的培育方法，包括以下步驟:
[0010](I)首先獲取玉米單倍體幼胚，取授粉后10-14d的玉米幼穗，從玉米幼穗的籽粒中挑取玉米幼胚；隨后將玉米幼胚接種于誘導培養(yǎng)基，(26±2) °C暗培養(yǎng)20d，后得到愈傷組織；
[0011](2)其次進行第一次繼代培養(yǎng)和第一次倍性鑒定，將得到的所述愈傷組織進行光暗周期培養(yǎng)，光照強度2000-25001X，光照時間14h+暗培養(yǎng)10h，篩選未變色的愈傷組織作為擬單倍體I愈傷組織；隨后將所述的擬單倍體I愈傷組織繼代培養(yǎng)數(shù)次，篩選出準單倍體愈傷組織，并對其繼續(xù)繼代培養(yǎng)數(shù)次；
[0012](3)再次進行分化培養(yǎng)和生根培養(yǎng)，將得到的所述準單倍體愈傷組織接種于分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到玉米單倍體幼苗，隨后將玉米單倍體幼苗轉移到生根培養(yǎng)基中，培養(yǎng)得到完整的植株。
[0013]較佳地，所述單倍體II型愈傷組織的分化及再生方法具體為:將II型愈傷組織轉到分化培養(yǎng)基中，28°C暗培養(yǎng)7d后，轉到相同溫度下每天12~16h的光照培養(yǎng)，待愈傷組織上長出綠色芽后， 將愈傷組織轉入分化培養(yǎng)瓶中光照強度為1500~20001x，日光燈照明，培養(yǎng)成苗。當幼苗長大到3~5cm時，從幼苗基部將小苗分成單株，不要損傷生長點，轉移到生根培養(yǎng)基上，在28 °C光照培養(yǎng)，2~3周后小植株長出大量的根，形成完整的植株。植株長到約1cm時，打開培養(yǎng)瓶瓶蓋，加入無菌水沒過培養(yǎng)基，光照培養(yǎng)2d后再取出，洗凈粘在根系上的培養(yǎng)基，煉苗(煉苗用的土:蛭石的比例為3: I)，煉苗時用蒸餾水保濕。待植株適應外界環(huán)境、健康生長后，將其轉移到育種基地，育成完整的植株個體。
[0014]較佳地，所述“將所述的擬單倍體I愈傷組織繼代培養(yǎng)數(shù)次，篩選出準單倍體愈傷組織”包括第二次繼代培養(yǎng)和第二次倍性鑒定，具體為將所述擬單倍體I愈傷組織接種于繼代培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)完成后進行第二次倍性鑒定，篩選出擬單倍體II愈傷組織后繼續(xù)進行繼代培養(yǎng)，得到準單倍體愈傷組織；其中所述第二次倍性鑒定為染色體壓片觀察鑒定。
[0015]具體地，所述染色體壓片觀察鑒定方法為:取Imm左右的擬單倍體I愈傷組織繼代培養(yǎng)后的愈傷組織材料浸泡在α -溴奈中進行預處理，以藥液浸沒該愈傷組織為度，處理3~4h。愈傷組織經預處理后，用流水沖洗，然后投入卡諾液(3份甲醇:1份冰乙酸，現(xiàn)配現(xiàn)用)中固定3d，用95%的乙醇洗兩次，轉入70%乙醇中保存?zhèn)溆?。?0%乙醇中取出固定好的愈傷組織，流水沖洗7min，吸水紙吸干；放入盛有適量lmol/L HC1，60°C的離心管中水浴保溫，解離lOmin。解離后材料水洗5min并吸干，取0.2mm左右的愈傷組織于載玻片上壓碎打散，滴加I~2滴卡寶品紅染液，染色10~15min，壓片。在經染色的材料上加一滴染液，蓋上蓋玻片，覆一層吸水紙，用帶橡皮頭的鉛筆垂直敲打，或以拇指垂直緊壓蓋片(注意勿使蓋片搓動)，使材料分散壓平。使用OLYMPUS相差顯微鏡進行觀察和記錄，篩選出擬單倍體II材料。
[0016]較佳地，所述“將所述的擬單倍體I愈傷組織繼代培養(yǎng)數(shù)次，篩選出準單倍體愈傷組織”還包括第三次繼代培養(yǎng)和第三次倍性鑒定，具體為將所述擬單倍體II愈傷組織接種于繼代培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)完成后進行第三次倍性鑒定，篩選出準單倍體愈傷組織；其中所述第三次倍性鑒定具體為流式細胞儀檢測鑒定。
[0017]具體地，所述流式細胞儀檢測鑒定方法為:取擬單倍體II愈傷組織材料繼代培養(yǎng)后的愈傷組織lg，分別在Im L中Otto I buffer (pH2.3的0.lmol/L梓檬酸+0.5% (v/v)Tween20)用鋒利的刀片切碎、過濾、收集濾液,經5000r/min離心5min后，棄上清至10mL,再加入 100m L Otto I buffer 于 4°C保存。加入 Otto II buffer (pH = 8.9 的 0.4mol/LNa2HPO4.12H20)和 RNase 后，用 PI (Propidium 1dide 碘化丙卩定，50mg/mL)染液對細胞核DNA進行熒光標記，置于暗處30min后，用流式細胞儀進行植株倍性鑒定。采用美國BD公司的FACSCalibur流式細胞儀(flow cytometry)進行倍性檢測，并用cellQuest (BD公司)軟件獲取數(shù)據(jù)，ModFit軟件(Yeritv Software House公司)分析結果,得到準單倍體愈傷組織。
[0018]較佳地,所述分化培養(yǎng)的培養(yǎng)基是在N6基本培養(yǎng)液中添加酸水解酪蛋白、L-脯氨酸、2，4 一二氯苯氧乙酸、激動素、6-芐氨基腺嘌呤、脫落酸、萘乙酸、碳源和凝膠劑得到的固體培養(yǎng)基；其中所述碳源為蔗糖、葡萄糖、麥芽糖中的一種或幾種，所述凝膠劑為瓊脂、卡拉膠中的一種；其他組分的濃度為:激動素為0.2~lmg/L, 6-節(jié)氨基腺嘌呤為0.5~2mg/L,脫落酸為0.2~lmg/L, 2，4 一二氯苯氧乙酸為0.2~lmg/L,萘乙酸為0.1~lmg/L。更優(yōu)地，所述激動素的濃度為0.5mg/L,所述6-芐氨基腺嘌呤的濃度為0.5mg/L,所述脫落酸的濃度為0.5mg/L,所述2，4 一二氯苯氧乙酸的濃度為lmg/L,所述萘乙酸的濃度為0.1mg/L0
[0019]較佳地，所述誘導培養(yǎng)基在N6基本培養(yǎng)液的基礎上添加2,4 —二氯苯氧乙酸、酸水解酪蛋白、L 一脯氨酸、碳源和凝膠劑得到的固體培養(yǎng)基，pH為6.0。更優(yōu)地，所述誘導培養(yǎng)基中2，4 一二氯苯氧乙酸的濃度為2.0mg/L，酸水解酪蛋白的濃度為500mg/L，L 一脯氨酸的濃度為1.38g/L。
[0020]較佳地，所述繼代培養(yǎng)基為在N6基本培養(yǎng)液的基礎上添加2，4 一二氯苯氧乙酸、酸水解酪蛋白、L 一脯氨酸、甘露醇、碳源和凝膠劑得到的固體培養(yǎng)基，pH為6.0 ;更優(yōu)地，所述繼代培養(yǎng)基中2，4 一 D的濃度為1.5mg/L，酸水解酪蛋白的濃度為500mg/L，L 一脯氨酸的濃度為690mg/L，甘露醇的濃度為20g/L。
[0021]較佳地，所述生根培養(yǎng)的培養(yǎng)基為在1/2MS培養(yǎng)液的基礎上添加生根粉、烯效矬、碳源和凝膠劑得到的固體培養(yǎng)基，PH為6.0 ;較優(yōu)地，所述生根培養(yǎng)基中生根粉的濃度為lmg/L,烯效娃的濃度為0.5mg/Lo
[0022]以上培養(yǎng)基中的所述碳源為蔗糖，其濃度為30g/L，所述凝膠劑為瓊脂粉，濃度為5g/L,以上培養(yǎng)液均在121 °C高壓滅菌15min。
[0023]較佳地，所述玉米單倍體幼胚的來源為以玉米孤雌生殖誘導系EDI為父本，優(yōu)良自交系18-599R為母本，雜交授粉10-14d后玉米幼穗中的籽粒。
[0024]玉米遺傳再生及再生的受體材料主要有幼胚和非幼胚類型，其中前者包括幼胚或幼胚誘導的胚性愈傷組織，后者包括莖尖組織直接分化再生和成熟胚、葉片、莖段、胚芽鞘等誘導的胚性愈傷組織。幼胚和幼胚誘導的胚性愈傷組織是玉米再生及轉化中最常用的受體材料，其遺傳轉化程序簡單、成熟，植株再生能力較強，培養(yǎng)過程比較容易。胚芽鞘和成熟胚的優(yōu)點在于不受季節(jié)限制，但其誘導和再生效率明顯較低，且轉化效率低。相較于胚芽鞘和成熟胚，玉米幼胚在授粉后10~15d即可進行取材培養(yǎng)，且再生能力最強，能夠形成較好的適合遺傳轉化的II型愈傷組織，可以在時間上縮短育種周期。而胚芽鞘和成熟胚的取材時間明顯晚于幼胚，再生能力也不如幼胚，因此幼胚優(yōu)于其他組織。
[0025]本發(fā)明具有以下積極的效果:
[0026](I)為實現(xiàn)發(fā)明目的，本發(fā)明使用單倍體玉米幼胚作為實驗材料，結合光照篩選、染色體壓片技術、流式細胞儀檢測技術，遺傳再生成單倍體植株，來達到建立玉米單倍體遺傳再生體系的目的，該方法從形態(tài)、組織和細胞水平上實現(xiàn)玉米單倍體的鑒定，為單倍體遺傳轉化打下基礎，實現(xiàn)縮短育種周期的效果。
[0027](2)本發(fā)明的方法操作簡單可行，與二倍體幼胚、單倍體花藥、小孢子培養(yǎng)和其他玉米組織培養(yǎng)的方法相比，玉米單倍體幼胚的組織培養(yǎng)具有明顯時間優(yōu)勢和突破性特點，可實現(xiàn)縮短育種周期，另外玉米幼胚的再生能力明顯高于其他部位，具有提高轉化效率的優(yōu)勢，對于玉米基因工程方面的理論研究以及遺傳育種實踐均具有重要意義。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0028]圖1為EDI與18-599R雜交果穗幼胚誘導培養(yǎng)及產生的胚性愈傷組織；
[0029]圖2為愈傷組織的光照觀察結果；
[0030]圖3為單倍體和二倍體愈傷組織染色體壓片觀察結果；
[0031]圖4為單倍體和二倍體愈傷組織流式細胞儀檢測結果；
[0032]圖5為三次倍性鑒定的篩選結果；
[0033]圖6為幼胚中的單倍體檢測結果；
[0034]圖7為準單 倍體II型愈傷組織的分化與成苗結果；
[0035]圖8為準單倍體II型愈傷組織的分化與成苗率；
[0036]圖9為煉苗并獲得的單倍體植株。
【具體實施方式】
[0037]下面結合附圖對本發(fā)明的【具體實施方式】作進一步的詳細說明。
[0038]一、材料
[0039]母本:玉米優(yōu)良自交系18-599R
[0040]父本:玉米孤雌生殖誘導系EDI
[0041]以上父本和母本均由四川農業(yè)大學玉米研究所提供，材料于2012年10月種植于
云南省西雙版納。
[0042]二、培養(yǎng)基組成及濃度
[0043]誘導培養(yǎng)基:N6基本培養(yǎng)液+2，4 — 二氯苯氧乙酸(2，4 — D) (2.0mg/L) +酸水解酪蛋白500mg/L+L —脯氨酸1.38g/L ；
[0044]繼代培養(yǎng)基:N6基本培養(yǎng)液+2，4 — 二氯苯氧乙酸(2，4 — D) (1.5mg/L) +酸水解酪蛋白500mg/L+L —脯氨酸690mg/L+甘露醇20g/L ；
[0045]分化培養(yǎng)基:N6基本培養(yǎng)液+激動素(KT) (0.5mg/L) +6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)(0.5mg/L) + 脫落酸(ABA) (0.5mg/L) +2, 4 一二氯苯氧乙酸(2，4_D) (lmg/L) + 萘乙酸(NAA)(0.lmg/L) ++ 酸水解酪蛋白 100mg/L+L —脯氨酸 690mg/L ；[0046]生根培養(yǎng)基:1/2MS基本培養(yǎng)液+生根粉(ABT) (lmg/L) +烯效唑(0.5mg/L)；
[0047]以上培養(yǎng)基均含30g/L蔗糖和5g/L瓊脂粉，以水為溶劑，pH6.0，且均在121 °C高
壓滅菌15min。
[0048]其中，N6基本培養(yǎng)液的組成如表1所示:
[0049]
【權利要求】
1.一種玉米單倍體植株的培育方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)首先獲取玉米單倍體幼胚，取授粉后10-14d的玉米幼穗，從玉米幼穗的籽粒中挑取玉米幼胚；隨后將玉米幼胚接種于誘導培養(yǎng)基，(26±2)°C暗培養(yǎng)20d，后得到愈傷組織； (2)其次進行第一次繼代培養(yǎng)和第一次倍性鑒定，具體為將所述愈傷組織接種于繼代培養(yǎng)基上進行光暗周期培養(yǎng)，光照強度2000-25001X，光照時間14h+暗培養(yǎng)10h，篩選未變色的愈傷組織作為擬單倍體I愈傷組織；隨后將所述的擬單倍體I愈傷組織繼代培養(yǎng)數(shù)次，篩選出準單倍體愈傷組織； (3)再次進行分化培養(yǎng)和生根培養(yǎng)，得到完整的玉米單倍體植株。
2.根據(jù)權利要求1所述的玉米單倍體植株的培育方法，其特征在于:所述“將所述的擬單倍體I愈傷組織繼代培養(yǎng)數(shù)次，篩選出準單倍體愈傷組織”包括第二次繼代培養(yǎng)和第二次倍性鑒定，具體為將所述擬單倍體I愈傷組織接種于繼代培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)完成后進行第二次倍性鑒定，篩選出擬單倍體II愈傷組織后繼續(xù)進行繼代培養(yǎng)，得到準單倍體愈傷組織；其中所述第二次倍性鑒定為染色體壓片觀察鑒定。
3.根據(jù)權利要求2所述的玉米單倍體植株的培育方法，其特征在于:所述“將所述的擬單倍體I愈傷組織繼代培養(yǎng)數(shù)次，篩選出準單倍體愈傷組織”還包括第三次繼代培養(yǎng)和第三次倍性鑒定，具體為將所述擬單倍體II愈傷組織接種于繼代培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)完成后進行第三次倍性鑒定，篩選出準單倍體愈傷組織；其中所述第三次倍性鑒定具體為流式細胞儀檢測鑒定。
4.根據(jù)權利要 求1所述的玉米單倍體植株的培育方法，其特征在于:所述分化培養(yǎng)的培養(yǎng)基是在N6基本培養(yǎng)液中添加酸水解酪蛋白、L-脯氨酸、2，4 一二氯苯氧乙酸、激動素、6-芐氨基腺嘌呤、脫落酸、萘乙酸、碳源和凝膠劑得到的固體培養(yǎng)基； 其中所述碳源為蔗糖、葡萄糖、麥芽糖中的一種或幾種，所述凝膠劑為瓊脂、卡拉膠中的一種；其他組分的濃度分別如下: 酸水解酪蛋白為400~lmg/L, L-脯氨酸為600~800mg/L,激動素為0.2~lmg/L,6-節(jié)氨基腺嘌呤為0.5~2mg/L,脫落酸為0.2~lmg/L, 2，4 一二氯苯氧乙酸為0.2~Img/L,萘乙酸為0.1~lmg/L。
5.根據(jù)權利要求3所述的玉米單倍體植株的培育方法，其特征在于:所述酸水解酪蛋白的濃度為500mg/L,所述L-脯氨酸的濃度為690mg/L,所述激動素的濃度為0.5mg/L,所述6-節(jié)氨基腺嘌呤的濃度為0.5mg/L,所述脫落酸的濃度為0.5mg/L,所述2，4 一二氯苯氧乙酸的濃度為lmg/L，所述萘乙酸的濃度為0.lmg/L ο
6.根據(jù)權利要求1所述的玉米單倍體植株的培育方法，其特征在于:所述誘導培養(yǎng)基在N6基本培養(yǎng)液的基礎上添加2，4 一二氯苯氧乙酸、酸水解酪蛋白、L 一脯氨酸、碳源和凝膠劑得到的固體培養(yǎng)基，pH為6.0。
7.根據(jù)權利要求1所述的玉米單倍體植株的培育方法，其特征在于:所述繼代培養(yǎng)基為在N6基本培養(yǎng)液的基礎上添加2，4 一二氯苯氧乙酸、酸水解酪蛋白、L 一脯氨酸、甘露醇、碳源和凝膠劑得到的固體培養(yǎng)基，PH為6.0。
8.根據(jù)權利要求1所述的玉米單倍體植株的培育方法，其特征在于:所述生根培養(yǎng)的培養(yǎng)基為在1/2MS培養(yǎng)液的基礎上添加生根粉、烯效唑、碳源和凝膠劑得到的固體培養(yǎng)基，pH 為 6.0。
9.根據(jù)權利要求1所述的玉米單倍體植株的培育方法，其特征在于:所述玉米單倍體幼胚的來源為以玉 米孤雌生殖誘導系EDI為父本，優(yōu)良自交系18-599R為母本，雜交授粉10-14d后玉米幼穗中的籽粒。
【文檔編號】A01H4/00GK104026017SQ201410277784
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2014年6月20日 優(yōu)先權日:2014年6月20日
【發(fā)明者】林海建, 陳琦, 殷麗琴, 張志明, 沈亞歐, 潘光堂, 鐘成, 蘭海, 周樹峰, 江舟, 劉麗 申請人:四川農業(yè)大學