專(zhuān)利名稱(chēng)：制備凍干血小板的方法、包括凍干血小板的組合物和使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及血液和血液制品領(lǐng)域。更具體而言，本發(fā)明涉及血小板和血小板組合物，特別是可用于治療、診斷和研究目的的含有凍干血小板或者再水化凍干血小板的那些。
背景技術(shù)：
血液是多種組分的復(fù)雜混合物。通常，可以將血液描述為包括四種主要成分紅血球、白血球、血小板和血漿。前三種是細(xì)胞或者細(xì)胞樣組分，而第四種(血漿)是含有鹽、蛋白質(zhì)和其它許多身體功能必需要素的寬泛和可變混合物的液體組分。通過(guò)離心，可以將血液的組分彼此分離。一般，離心將導(dǎo)致大體積/質(zhì)量的濃稠紅血球遷移到離心管的底部。在紅血球之上，可以發(fā)現(xiàn)相對(duì)較稀薄的白血球和血小板層，由于其帶有白灰色，因此該層通稱(chēng)為“血沉棕黃層(buffy coat)”。在血沉棕黃層之上為液體血漿部分。
紅血球，通常還稱(chēng)為紅細(xì)胞，負(fù)責(zé)將氧氣從肺運(yùn)載到細(xì)胞以供細(xì)胞代謝過(guò)程中使用，和將廢物二氧化碳從細(xì)胞運(yùn)載到肺中而得以排出。紅血球不具有細(xì)胞核，因此它是在健康個(gè)體中不斷得到更換的短壽血液細(xì)胞組分。由紅血球構(gòu)成的血液體積的百分比稱(chēng)為血細(xì)胞比容，該數(shù)字通常用于表明存在一種或者多種血液系統(tǒng)的或影響血液系統(tǒng)的疾病或者病癥。對(duì)于女性，正常的血細(xì)胞比容值為37％～47％，對(duì)于男性，該值為40％～54％。通常將紅血球輸血給需要它們的患者，比如患有慢性貧血的那些或者遭受損傷或外傷或者進(jìn)行手術(shù)，從而導(dǎo)致血液損失的患者。此外，通常將紅血球用于治療由多種疾病或者病癥所引起的貧血。
白血球，通常還稱(chēng)為白細(xì)胞，是負(fù)責(zé)防止身體受到異物傷害的有核細(xì)胞。通常白血球起抗衡病源生物比如細(xì)菌、真菌和病毒或者可能對(duì)身體有害的物質(zhì)比如蛋白毒素的功能。然而，在某些個(gè)體中，白血球?qū)︼@然無(wú)害的物質(zhì)比如花粉設(shè)置保護(hù)反應(yīng)，從而導(dǎo)致過(guò)敏性反應(yīng)。實(shí)際上，在一些情形中，白血球?qū)ι眢w自身的細(xì)胞或者蛋白質(zhì)會(huì)不適當(dāng)?shù)胤磻?yīng)，從而導(dǎo)致自身免疫疾病和破壞身體組織，這在某些環(huán)境中可以是致命的。其中，經(jīng)純化的白血球在治療對(duì)抗生素療法無(wú)響應(yīng)的患者中已得到使用。
血小板，通常還稱(chēng)為凝血細(xì)胞，是小的、不規(guī)則成形的源于巨核細(xì)胞的血液組分，它們?cè)诠撬柚行纬刹⑶疑婕澳踢^(guò)程，由此有助于防止身體由于不僅受到外傷或者傷害而且同樣由于正常生理活動(dòng)而產(chǎn)生過(guò)度出血。實(shí)際上，血小板在正常止血中是至關(guān)重要的，它提供了防止血液流出受損傷的血管的第一道防線。血小板通常通過(guò)粘附在血管內(nèi)壁和與存在于血漿中或者由血液的其它細(xì)胞組分釋放的凝固系統(tǒng)的組分相互作用而發(fā)揮其功能。經(jīng)純化的血小板在治療患有異常血小板功能(血小板功能不全)和低血小板數(shù)(血小板減少)的患者中已得到使用。濃縮血小板通常用于在受傷之后或者獲得性血小板功能缺失(例如，在繞道手術(shù)(bypass surgery)期間產(chǎn)生的那些)期間控制出血。正常流通的血小板數(shù)為，每微升(μl)血液150,000～450,000個(gè)血小板。
當(dāng)突然發(fā)生傷口流血時(shí)，血小板就聚集在傷口處并且通過(guò)形成凝塊力圖阻斷血液流動(dòng)。存在兩種一般的凝塊形成機(jī)制。在一種機(jī)制中，當(dāng)血液暴露于空氣中時(shí)凝塊開(kāi)始形成。血小板感受空氣的存在并且與血纖蛋白原反應(yīng)，從而開(kāi)始形成纖維蛋白。所得纖維蛋白形成將血細(xì)胞俘獲在其中的網(wǎng)狀網(wǎng)絡(luò)。在另一種一般的機(jī)制中，受傷害的血管釋放出提高受傷區(qū)域中血小板粘性的化學(xué)信號(hào)。該粘性血小板粘附在受傷害區(qū)域并且逐漸形成血小板堵塞。同時(shí)，血小板釋放出一系列促使血液中其它因子增強(qiáng)血小板堵塞的化學(xué)信號(hào)。在血小板和其加強(qiáng)之間，形成堅(jiān)固的凝塊，當(dāng)受傷害區(qū)域愈合時(shí)其起貼片的作用。
為血小板凝膠形式的血小板已經(jīng)被廣泛用于促進(jìn)傷口愈合中，并且結(jié)合自體纖維蛋白膠原，已經(jīng)表明自體血小板凝膠可以改善手術(shù)期間的止血和降低替換上行主動(dòng)脈手術(shù)中的輸血需求(Christenson和Kalangos，2004)。Costasis Surgical Hemostat(Costatis)。已經(jīng)表明，牛凝血酶、牛膠原和作為血纖蛋白原和血小板源的血漿的組合物在兔腎和脾臟的體內(nèi)出血模型中作用良好(Prior等人，1999)。然而，其它研究表明，當(dāng)單獨(dú)使用時(shí)，血小板凝膠不是一種有效的止血?jiǎng)?Wajon等人，2001)。盡管存在關(guān)于血小板和它們作為止血?jiǎng)┳饔玫南嗷ッ艿陌l(fā)現(xiàn)，但是，幾乎無(wú)疑的是血小板微粒的前凝血性質(zhì)(pro-coagulantnature)；它們的主要組分，通常被忽視，逐漸被認(rèn)為是體外和體內(nèi)凝固過(guò)程中的活性參與者(Nieuwland等人，1997)。當(dāng)血小板受到生理激動(dòng)劑比如凝血酶和膠原的組合物刺激時(shí)，它們釋放出大量的微粒(Sims等人，1988；Tans等人，1991)。經(jīng)活化的血小板和微粒表達(dá)氨基磷脂，這就提供了促凝血表面(procoagulant surface)以支持活化凝固酶以內(nèi)源性、外源性或者通常途徑形成(Rosing等人，1985)。
與經(jīng)活化的血小板相比，微粒含有對(duì)于活化因子IX(IXa)(Hoffman等人，1992)和因子Va(Sims等人，1988)高密度的高親合性結(jié)合位點(diǎn)。它們具有對(duì)于因子VIII的高親合性結(jié)合位點(diǎn)的連續(xù)表達(dá)(Gilbert等人，1991)并且支持因子X(jué)a活性(Gilbert等人，1991；Holme等人，1995)和凝血酶原酶活性(Sims等人，1989)。
除了血小板微粒是止血響應(yīng)中重要組分的事實(shí)之外，以血小板凝膠形式的血小板同樣已被用于外科傷口愈合應(yīng)用中以及治療難以愈合的傷口(Mazzucco等人，2004)。此外，以富含血漿的血小板形式的血小板的應(yīng)用已經(jīng)擴(kuò)展到了新的應(yīng)用中，比如生物組織工程或者自體和同種異體組織移植以及骨質(zhì)骨骼整合(osseous bone integration)和軟組織再生(Oikarinen等人，2003)。這是因?yàn)檠“逶谒鼈冇兄谥寡蛡谟线^(guò)程的α粒子中含有許多重要的生長(zhǎng)因子。研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在其它因子中生長(zhǎng)因子比如血小板源傷口愈合因子(PDWHF)、血小板源性生長(zhǎng)因子(PDGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因于(TGF)和胰島素生長(zhǎng)因子(IGF)在傷口愈合級(jí)聯(lián)的不同階段是尤其重要的，并且會(huì)極大地影響促有絲分裂和細(xì)胞分化活性(Pierce等人，1989；Steed，1997)。
這些發(fā)現(xiàn)引起了生長(zhǎng)因子替換策略的發(fā)展。例如，將Regranex，在載體凝膠中的重組人類(lèi)PDGF，用于治療糖尿病性創(chuàng)傷，然而比如TGF的其它因子，當(dāng)前正為獲得FDA批準(zhǔn)進(jìn)行試驗(yàn)。盡管如此，用于傷口的單一生長(zhǎng)因子還是不如多重生長(zhǎng)因子有效。這并不奇怪，因?yàn)閭谟鲜且环N復(fù)雜的級(jí)聯(lián)整合，在該過(guò)程中的不同階段，對(duì)于不同的刺激和抑制功能需要多種生長(zhǎng)因子。
血液的液體部分，通常稱(chēng)為血漿，是含有多種蛋白質(zhì)和鹽的復(fù)雜溶液。一般而言，血漿是將紅血球、白血球和血小板從血液中除去時(shí)的剩余物質(zhì)。由于多種蛋白質(zhì)以高濃度存在，因此血漿是一種在室溫下不穩(wěn)定的淡黃色液體(即，必須將血漿在低于室溫下良好地貯存，從而防止其中存在的蛋白質(zhì)喪失活性)。血漿的主要蛋白成分為白蛋白、血纖蛋白原、抗體以及多種凝固和止血必需的蛋白質(zhì)。從此血漿蛋白的簡(jiǎn)明列舉中可以看出，從保持滿意血壓和提供容積到提供對(duì)于血液凝固和免疫至關(guān)重要的蛋白質(zhì)，血漿提供多種功能。例如，從血漿中分離的γ球蛋白可以用于治療需要抗毒素的患者，并且可以分析某些抗體的存在，從而表明患者是否感染了某些病毒或者細(xì)菌。此外，可以從血漿中分離的凝血因子VIII，通常用于治療典型的先天性血友病。
血液的主要功能是運(yùn)送氧氣和二氧化碳以及使得免疫系統(tǒng)組分能夠迅速和有效地到達(dá)身體所有部分，從而排斥入侵的微生物。然而，因?yàn)檠菏橇黧w并且需要不僅保持在體內(nèi)，而且需要限于身體的特定區(qū)域(比如血管或者循環(huán)系統(tǒng)的其它部分)，因此血液的重要功能是監(jiān)控其自身在體內(nèi)的分布，和修補(bǔ)使得血液漏出身體或者應(yīng)當(dāng)保持它的體內(nèi)特定區(qū)域的損傷。所述監(jiān)控和保持血液分布在其正常界限內(nèi)的過(guò)程是一種生理學(xué)過(guò)程的平衡，該生理學(xué)過(guò)程一方面防止血管損傷之后大量出血(通過(guò)形成凝塊)，同時(shí)另一方面，通過(guò)使血液保持在非凝聚(即，未凝固)的流體狀態(tài)來(lái)保持正常的血液循環(huán)。這些表面上的競(jìng)爭(zhēng)過(guò)程是具有許多控制點(diǎn)和反饋回路的復(fù)雜系統(tǒng)的一部分。
保持適當(dāng)血液流動(dòng)和封閉的主要過(guò)程稱(chēng)為止血，這是形成和最終降解血塊以及修復(fù)受傷害組織的過(guò)程。止血由四個(gè)主要事件組成血管收縮；在創(chuàng)傷位置聚集血小板、通過(guò)血纖蛋白原進(jìn)行介導(dǎo)和通過(guò)凝血酶活化血小板；通過(guò)血小板和許多凝固因子的復(fù)雜相互作用形成凝塊(也稱(chēng)為血栓或者纖維蛋白網(wǎng)絡(luò))；和最后降解凝塊和修復(fù)受傷害組織。
血液凝固是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程如果凝塊的形成未得到抑制，那么血管將被阻斷；如果凝塊不堅(jiān)固，那么將產(chǎn)生過(guò)度出血。因此，為了進(jìn)行正常止血，必須保持精確的平衡。在正常止血失衡的情形中，凝塊形成可能受到損害。這樣的反常可以由于攝取阿斯匹林產(chǎn)生或者由免疫功能障礙引起。該反常還可以是先天性的，比如通過(guò)遺傳性疾病和凝血因子缺陷引起。例如，已經(jīng)對(duì)導(dǎo)致出血病癥的止血過(guò)程缺陷進(jìn)行了鑒定，大多數(shù)這樣的缺陷都在凝固所需要的活化級(jí)聯(lián)中所涉及的酶中、在血小板活化和功能中或者在接觸激活作用中。這樣的病癥包括vWD和血友病。其它血液凝固系統(tǒng)疾病或者病癥是其它疾病或者病癥的治療結(jié)果(即，副作用)。此類(lèi)疾病和病癥的治療一般涉及降低引起副作用的藥物的劑量或者中止使用該藥物的治療。
血液凝固依賴于通過(guò)多種反饋環(huán)和控制點(diǎn)進(jìn)行密切控制的酶活化的復(fù)雜級(jí)聯(lián)。當(dāng)血小板粘結(jié)在受傷害血管的傷口壁上或者其它受傷位置上時(shí)，凝固開(kāi)始。在這種情況下，血小板粘附于在創(chuàng)傷位置處的細(xì)胞上存在的膠原上，從而進(jìn)行通過(guò)熟知為von Willebrand因子(vWF)的凝血因子介導(dǎo)的過(guò)程。vWF是在巨核細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中產(chǎn)生并且貯存在血小板或者某些結(jié)締組織中的復(fù)雜蛋白質(zhì)。通常發(fā)現(xiàn)它與因子VIII配合，并且已知它是穩(wěn)定血漿中因子VIII所必需的。vWF數(shù)量和功能上的缺陷在本質(zhì)上一般是遺傳性的，并且導(dǎo)致熟知為血管性血友病(vWD)的疾病。
血小板對(duì)傷害位置的粘附通過(guò)vWf結(jié)合內(nèi)皮下膜中膠原介導(dǎo)。作為可溶性蛋白質(zhì)存在于血漿中的血纖蛋白原可以在稱(chēng)為集結(jié)或者粘合的過(guò)程中將活化血小板橋接在一起。通過(guò)凝血酶(其通過(guò)活化因子X(jué)得到活化(因子X(jué)a))，血纖蛋白原被轉(zhuǎn)化成不溶性的纖維蛋白束，所述凝血酶還是一種有效的血小板活化劑。自發(fā)聚合成絲的纖維蛋白與血小板上的表面蛋白或者磷脂結(jié)合，從而將血小板誘捕在網(wǎng)格中。然后，通過(guò)因子X(jué)IIIa的活性，纖維蛋白絲狀體進(jìn)行交聯(lián)，所述因子X(jué)IIIa由因子X(jué)III通過(guò)凝血酶形成。形成的纖維蛋白-血小板網(wǎng)格被稱(chēng)為纖維蛋白網(wǎng)格、血栓或者凝塊。
因子X(jué)可以通過(guò)稱(chēng)為外源性和內(nèi)源性途徑的兩種途徑中的任何一種途徑得到活化。所述內(nèi)源性途徑涉及一系列活化多種蛋白酶的酶促反應(yīng)。該過(guò)程始于將因子X(jué)II結(jié)合至據(jù)推測(cè)由內(nèi)皮下膜的組分提供的帶負(fù)電荷的表面，以及在通過(guò)高分子量激肽原(HMWK)介導(dǎo)的反應(yīng)中通過(guò)激肽釋放酶將因子X(jué)II活化成因子X(jué)IIa。然后，因子X(jué)IIa將因子X(jué)I轉(zhuǎn)化為因子X(jué)Ia(血漿凝血激酶前質(zhì))。在鈣離子存在下，因子X(jué)Ia將因子IX轉(zhuǎn)化成其活化形式，因子IXa。因子IXa與非酶蛋白因子VIII(抗血友病球蛋白或者AHG)結(jié)合，并且在鈣離子和細(xì)胞來(lái)源的磷脂存在下，活化循環(huán)因子X(jué)，從而形成因子X(jué)a。
在廣泛認(rèn)為是開(kāi)始凝血的主要生理學(xué)途徑的外源性途徑中，因子VII的活化形式因子VIIa與通常稱(chēng)為組織因子(TF)的因子III(組織促凝血酶原激酶)結(jié)合在一起。在鈣離子存在下，因子VIIa/TF配合物活化循環(huán)因子X(jué)，從而形成因子X(jué)a。因子X(jué)a還可以從通過(guò)因子IX和XI的因子VII的作用而形成。在此方案中，因子IX和X可以通過(guò)聯(lián)合TF和因子VIIa的活性得到活化。因子VIIa/TF配合物被認(rèn)為是凝塊級(jí)聯(lián)的最有效引發(fā)劑。如上所述，在鈣、血小板表面上的磷脂和因子VIIIa存在下，因子IXa將因子X(jué)活化為因子X(jué)a，隨后該因子將凝血酶原轉(zhuǎn)化為凝血酶。凝血酶將可溶性血纖蛋白原轉(zhuǎn)化為不溶性血纖維蛋白纖維，從而形成網(wǎng)格。
由此，因子X(jué)通過(guò)內(nèi)源性或者外源性活化途徑得到了活化。因子X(jué)a，與活化因子V并且在鈣離子以及存在于血小板表面上的磷脂存在下，將凝血酶原活化成凝血酶，其由血纖蛋白原形成纖維蛋白，導(dǎo)致凝塊形成。血液的凝結(jié)是涉及許多組分相互作用的復(fù)雜過(guò)程，包括血纖蛋白原、凝血酶、因子VII、因子VIII、因子IX、因子X(jué)、因子X(jué)I和因子X(jué)II。這些組分中的一種組分缺失將必定導(dǎo)致血液病的臨床表現(xiàn)，這對(duì)于一些患者可能會(huì)是致命的。
已經(jīng)對(duì)導(dǎo)致出血病癥的止血過(guò)程缺陷進(jìn)行了鑒定，大多數(shù)上述缺陷都在于凝固所需要的活化級(jí)聯(lián)中所涉及的酶、在于血小板活化和功能或者在于接觸激活作用。這些病癥包括vWD和血友病。對(duì)于這兩種疾病進(jìn)行的多種治療都是已知的，其中大多數(shù)依賴于提供一種或者多種上述凝血因子。
先天性血友病被分類(lèi)為三種不同的組典型性血友病或者血友病A(FVIII缺失)；克里斯馬斯病或者血友病B(FIX缺失)；和血友病C(FXI缺失)。血友病被認(rèn)為是其中流血沒(méi)有在正常時(shí)間內(nèi)得到終止的病癥。即，血友病患者不會(huì)出血更多或者更快，而是他們出血更長(zhǎng)的一段時(shí)間。大約有20,000美國(guó)人患有血友病。其中大多數(shù)情形為血友病A或者血友病B，其中血友病A占全部血友病案例的約80％。血友病C是稀少的，大約100,000個(gè)美國(guó)人中發(fā)生一例。
血友病A是源于因子VIII缺失的X-相聯(lián)系病癥，定義為不存在凝血因子VIII或者凝血因子VIII低于正常水平。血友病A產(chǎn)生于關(guān)于因子VIII基因的多種突變。當(dāng)前，血友病A的治療涉及輸注因子VIII濃縮物或者由人血漿或者通過(guò)重組DNA技術(shù)制備的因子VIII和vWF配合物的濃縮物。與血友病A相比，血友病B源于因子IX的缺失。當(dāng)前，血友病B的治療涉及輸注源于血漿的或者重組因子IX濃縮物。最后，血友病C源于因子X(jué)I的缺失。
由于持續(xù)關(guān)心公眾血液供給的安全性和出現(xiàn)可以通過(guò)血液和血液制品傳播的疾病，因此因子VIII的選擇源已經(jīng)成為重組形成形式。重組因子IX已經(jīng)批準(zhǔn)用于人類(lèi)應(yīng)用(Benefix，Genetics Institute)，并且其將可能成為選擇源。此外，已經(jīng)建議將基因療法作為血友病的治療或者治愈方法。然而，迄今為止，用于治療血友病患者的轉(zhuǎn)基因方法并沒(méi)有導(dǎo)致長(zhǎng)期穩(wěn)定的凝血因子表達(dá)，已經(jīng)遭遇到了非預(yù)期的致死率問(wèn)題，并且仍然會(huì)導(dǎo)致受體中產(chǎn)生抑制劑(如下所述)。
使用因子VIII濃縮物進(jìn)行的血友病的治療分別引起大約15％～約30％的血友病A患者和大約3％的血友病B患者產(chǎn)生了抗引入因子VIII或者IX的抗體。雖然重組因子VIII看起來(lái)僅僅在約5％的患有血友病A的患者中引起了上述響應(yīng)，但是，這仍然是在該病癥治療中的一個(gè)顯著問(wèn)題。該過(guò)程和產(chǎn)生的病癥被稱(chēng)為“具有抑制劑的血友病”，通常將其描述為對(duì)通常用于治療缺乏凝血因子的輸注蛋白質(zhì)的抗體感應(yīng)。與此相反，獲得性血友病是含有正常水平凝血蛋白的人中抑制劑的升高。由此，獲得性血友病是一種擬-自身免疫病(pseudo-autoimmune disease)，并且可以發(fā)生在用含有涉及凝固的因子的產(chǎn)品治療的其它正常的非血友病個(gè)體中。通常，產(chǎn)生的抗體與給予的因子VIII反應(yīng)，并且導(dǎo)致因子VIII的活性受到抑制，由此使得在缺少內(nèi)源性因子VIII的患者中進(jìn)行的治療無(wú)效，并且會(huì)不利地使得對(duì)原來(lái)具有低、但是不充分水平或者活性的內(nèi)源性因子VIII的患者的治療有害。
許多防止獲得性血友病和具有抑制劑的血友病的方法已經(jīng)提出和實(shí)現(xiàn)。例如，并不利用外源性因子VIII進(jìn)行治療，另一種治療血友病A的策略是給藥外源性因子VIIa，由此除去為止血對(duì)因子VIII的需求。同樣，用過(guò)量因子VIII和用抗-獨(dú)特型抗-因子VIII抗體進(jìn)行的治療已經(jīng)得到了試驗(yàn)。其它方法包括使用FEIBA分流試劑(bypassing agents)、凝血酶原復(fù)合物濃縮物、重組因子VIIa、豬因子VIII、輸注高劑量靜脈內(nèi)免疫球蛋白、免疫耐受性療法(ITT)和利用或者不利用A蛋白吸附血漿除去法從而除去抑制抗體。
此外，用經(jīng)純化的重組因子VIIa進(jìn)行的治療已經(jīng)變得普遍。例如，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，因子VIIa10～15μg/kg，并且甚至高達(dá)150μg/kg的劑量，該劑量范圍可以提供因子VIIa的循環(huán)水平為約0.2～2.0μg/ml血液，在一些具有抑制劑的血友病A患者中是安全和有效的。同因子VIIa的正常測(cè)定濃度約0.005μg/ml血液相比，這些劑量是非常高的。雖然這些方法看來(lái)是成功的，但是當(dāng)前這些方法沒(méi)有一個(gè)是完全有效的，并且所有方法都相當(dāng)昂貴。此外，至少5-10％的接受重組FVIIa療法的患者不能達(dá)到止血。
此外，III型或者嚴(yán)重的血管性血友病通常臨床上表現(xiàn)為血友病A。因子VIII通常通過(guò)vWf運(yùn)送和保護(hù)其免受血漿蛋白酶。在缺少循環(huán)vWf時(shí)，內(nèi)源性因子VIII被迅速降解和從循環(huán)中清除，從而產(chǎn)生血友病A的癥狀。對(duì)于vWD的治療根據(jù)疾病的本質(zhì)和嚴(yán)重程度而變化。所述治療包括或者通過(guò)注射或者通過(guò)鼻部通道進(jìn)行的DDAVP療法。DDAVP療法通過(guò)將內(nèi)皮細(xì)胞vWf釋放入流通中而起作用。治療還包括血漿冷沉淀物，該冷沉淀物提供vWf和其它凝固因子的濃縮物形式。
血友病的常規(guī)治療一般僅僅在出血癥狀得到確認(rèn)之后才進(jìn)行。最近，治療方案已經(jīng)得到了發(fā)展，其中不論當(dāng)時(shí)的出血狀況如何，都進(jìn)行定期預(yù)防性地輸注失去的凝固因子。該方法將因子水平保持在足夠高的水平使得出血、連接破壞和危及生命的出血最小化，并且差不多完全避免。雖然卓有成效，但是該治療方案相當(dāng)昂貴。
血小板功能是血塊中另一至關(guān)重要的組分。異常的血小板會(huì)引起異常出血，比如出血或者血栓形成。由此，血小板功能測(cè)定是血液相關(guān)疾病的診斷和監(jiān)控中不可分割的部分。例如，僅舉幾個(gè)例子，獲得性血小板缺陷，比如阿斯匹林注射、心臟病、腎病或者先天性血小板缺陷如伯-蘇氏(Bernard-Soulier)綜合征、格蘭茨曼氏(Glanzmann′s)血小板機(jī)能不全和血小板顆粒缺乏癥(storage pool disease)都會(huì)影響血小板的正常止血功能。為了評(píng)價(jià)血小板功能，在非常少時(shí)，利用周?chē)和科M(jìn)行的全血細(xì)胞計(jì)數(shù)將提供一些基本信息。其它測(cè)試，如出血時(shí)間，對(duì)全血或者富含血小板血漿進(jìn)行的使用血小板凝集計(jì)評(píng)價(jià)血小板對(duì)血小板激動(dòng)劑板的聚集的血小板功能試驗(yàn)將區(qū)分出缺陷。然而，上述分析雖然準(zhǔn)確，但是其靈敏度不高，并且不能檢測(cè)在病癥早期正常凝固功能的微小波動(dòng)。同樣地，血液凝固級(jí)聯(lián)失敗的精確點(diǎn)的測(cè)定會(huì)需要使用新近抽血進(jìn)行多種測(cè)定。
雖然已知血小板涉及凝固過(guò)程并且它們是至少一種凝血因子的來(lái)源，但是，迄今為止，對(duì)于獲得性或者先天性血友病的治療或者患有出血病癥的具有正常血小板數(shù)和血小板功能的患者的治療，并沒(méi)有公開(kāi)使用保持、活化、固定、凍結(jié)或者凍干血小板或者這些的任意組合。Kirby&Gregoriadis(1984)制備的含有因子VIII的脂質(zhì)體試圖口服治療血友病。后來(lái)，Giles等人(1988)公開(kāi)了因子X(jué)a和不含因子VIII的卵磷脂-磷脂酰絲氨酸泡的體內(nèi)聯(lián)用，Hong&Giles(1992)證明，輸注因子X(jué)a和卵磷脂-磷脂酰絲氨酸泡的組合之后，患有血友病A(因子VIII缺失)的狗的止血阻塞正常化。最近，Yarovoi等人(2003)，使用轉(zhuǎn)基因方法，證明在血小板中異常表達(dá)的因子VIII在鼠模型中進(jìn)行的血友病A治療中顯示出了效果。此外，Hrachovinova等人(2003)表明，P-選擇蛋白和PSGL1的相互作用產(chǎn)生了在血友病A鼠模型中矯正止血的源于白細(xì)胞的微粒。然而，這些研究人員都沒(méi)有使用或者提出使用正常的血小板或者血小板衍生物治療血友病。
血液凝固疾病或者病癥的檢測(cè)一般都涉及分析患者血液，從而得到血小板數(shù)、多種涉及血液凝固的標(biāo)示物和凝固形成能力。將測(cè)定活化凝結(jié)時(shí)間(ACT)、凝血酶原時(shí)間(PT)、血漿凝血酶時(shí)間(PTT)和活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)的凝血測(cè)定用于評(píng)價(jià)內(nèi)源性和外源性途徑。這些測(cè)定通常在實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，并且所述分析通常需要從患者抽取多個(gè)血液樣本。此外，這些測(cè)定可能是不可靠的，因?yàn)樗鼈兪瞧渲薪Y(jié)果基于體外凝固形成時(shí)間的終點(diǎn)試驗(yàn)。另一種局限性涉及必須加入外源性試劑如高嶺土、凝血酶、鈣等等的事實(shí)，因此所得結(jié)果基于人為系統(tǒng)，并不必然反映患者的血栓形成可能性。
如上所述，血液凝固系統(tǒng)的關(guān)鍵功能是停止受傷害組織如通過(guò)傷口、手術(shù)或者其它外傷受到損傷的組織的血液損失。然而，有時(shí)傷口或者外傷非常大，使得受傷者的血液系統(tǒng)不能迅速和有效地停止全部出血。此外，雖然凝固功能在大部分人中令人滿意地提供，但是在一些人中，凝固系統(tǒng)受到了削弱，從而使得充分凝固不能提供和不廣泛，由于創(chuàng)傷或者外傷，有時(shí)會(huì)發(fā)生致死性的出血。因此，通常會(huì)存在個(gè)體需要另外的血小板以提供凝固功能的情形，所述個(gè)體失去凝固功能或者凝固功能不充分。
除了它們的如上應(yīng)用以向需要的個(gè)體提供血液凝固功能之外，在實(shí)驗(yàn)室中還對(duì)血小板進(jìn)行廣泛的研究，以表征它們的性能和理解它們?cè)谘耗碳?jí)聯(lián)中的準(zhǔn)確作用。對(duì)血小板的研究提供了關(guān)于由血小板提供的凝血因子、與血小板相互作用從而促進(jìn)凝固和傷口愈合的因子和活化血小板或者否則將血小板引誘并且將它們保持在受傷害位置的必需因子的信息。
血小板的治療學(xué)和研究應(yīng)用都需要血小板以生物學(xué)活性的形式獲得。當(dāng)前，用于治療學(xué)應(yīng)用(例如，用于傷口愈合的輸注)的血小板一般作為新近分離的產(chǎn)品而提供，時(shí)間一般短于五天。正如馬上所意識(shí)到的，為了由需要的患者進(jìn)行應(yīng)用，保持新鮮血小板的充分供應(yīng)源是昂貴的并且由于在使用之前過(guò)期，會(huì)導(dǎo)致供應(yīng)源受到大量損失。此外，因?yàn)樾迈r血小板在治療學(xué)應(yīng)用中非常重要，因此獲得用于研究目的的那些血小板非常困難和昂貴。因此，在本領(lǐng)域中需要用于治療和研究的新鮮血小板替代物。
Livesey等人的美國(guó)專(zhuān)利No.5,622,867公開(kāi)了用于存儲(chǔ)的低溫保護(hù)血小板系統(tǒng)。該系統(tǒng)用含有第二信使效應(yīng)物的抑制劑系統(tǒng)處理新鮮血小板。將一種或者多種以下途徑的抑制劑加入cAMP、鈉通道、cGMP、環(huán)氧化酶、脂氧合酶、磷脂酶、鈣、蛋白酶和蛋白酶以及膜修飾(membrane modification)。還將冷凍保護(hù)劑如DMSO、麥芽糖糊精、葡聚糖、羥乙基淀粉和葡萄糖加入，其中將血小板保持在低溫下。在使用之前，對(duì)血小板進(jìn)行洗滌，從而除去抑制劑和冷凍保護(hù)劑。
Iijima等人的美國(guó)專(zhuān)利No.5,656,498公開(kāi)了凍干血小板和它們的制備方法。該方法包括用含有糖、生物聚合物、酸或者酸式鹽的溶液預(yù)處理血漿中的血小板，對(duì)經(jīng)處理的血漿進(jìn)行?；?，迅速冷卻顆粒和凍干顆粒。
Spargo等人的美國(guó)專(zhuān)利No.5,736,313公開(kāi)了凍干血小板和制備它們的方法。制備凍干血小板的方法包括，在磷酸鹽-檸檬酸鹽緩沖液或者磷酸鹽-磷酸鹽-檸檬酸鹽緩沖液中預(yù)培養(yǎng)血小板，所述兩種緩沖液中都含有碳水化合物(例如，葡萄糖)。在預(yù)培養(yǎng)之后，用碳水化合物負(fù)載血小板，然后將其懸浮在含有基質(zhì)-形成聚合物和碳水化合物的冷凍干燥緩沖液中。然后，將血小板緩慢冷卻至約-50℃，同時(shí)將壓力降低至真空狀態(tài)。
Goodrish等人的美國(guó)專(zhuān)利No.5,958,670和美國(guó)專(zhuān)利No.5,800,978也都公開(kāi)了凍干血小板和制備它們的方法。這些專(zhuān)利中公開(kāi)的發(fā)明依賴于使用玻璃化轉(zhuǎn)變溫度為約-60℃以上的組合物。所述組合物通常包括可滲透血小板的組分(例如，碳水化合物，如蔗糖)和不能滲透血小板的組分(例如，明膠，PEG)。為了產(chǎn)生凍干血小板，將組合物的溫度降低至低于組合物玻璃態(tài)轉(zhuǎn)化溫度的點(diǎn)，和從組合物中真空蒸發(fā)或者升華液體。同樣是Goodrish等人的在先專(zhuān)利，美國(guó)專(zhuān)利No.5,213,814公開(kāi)了穩(wěn)定化的血小板和制備它們的方法。所述方法和血小板適用于在約4℃下長(zhǎng)期貯存血小板。所述方法通常包括將血小板浸入含有碳水化合物和生物學(xué)上相容的聚合物或者聚合物混合物的緩沖水溶液中，然后冷凍所述溶液和干燥所得凍結(jié)溶液，從而生產(chǎn)含有低于10重量％濕氣的凍干血小板。
Braun的美國(guó)專(zhuān)利No.6,127,111和美國(guó)專(zhuān)利No.6,372,423公開(kāi)了凍干血小板和制備它們的方法。所述制備凍干血小板的方法包括，在室溫下，將血小板暴露于凝血抑制劑(例如，EDTA或者檸檬酸鹽)和“餅成型劑”(例如，蛋白質(zhì)如血清白蛋白的或者多糖如甘露醇)約5～60分鐘，然后將其凍干，從而將其濕度降低至低于10％。
加州大學(xué)的研究者Davis已開(kāi)發(fā)出制備凍干血小板的方法。該方法包括在凍干之前用海藻糖負(fù)載血小板。在美國(guó)專(zhuān)利No.6,723,497中公開(kāi)了制備凍干血小板的方法，其中通過(guò)用高達(dá)50mM的海藻糖在約25～低于約40℃的溫度下培養(yǎng)血小板，用海藻糖負(fù)載血小板，將負(fù)載的血小板冷卻至低于-32℃，和冷凍干燥冷卻的血小板。公開(kāi)的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)2005/0048460公開(kāi)了一種制備凍干血小板的方法，其包括將血小板暴露于碳水化合物(例如，海藻糖)和兩親試劑(例如，熊果苷)，和凍干血小板。參見(jiàn)，例如美國(guó)專(zhuān)利No.6,770,478、美國(guó)專(zhuān)利No.6,723,497、5,827,741和美國(guó)公開(kāi)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?005/0048460、2004/0152964、2004/0147024和2004/0136974。
Stienstra的美國(guó)專(zhuān)利No.6,833,236公開(kāi)了生產(chǎn)穩(wěn)定的血小板的方法和通過(guò)該方法制備的血小板。該方法包括將血小板例如通過(guò)將它們暴露于壓力下而預(yù)活化，從而誘發(fā)微泡形成，將預(yù)活化的血小板與碳水化合物接觸，從而將碳水化合物引入血小板中，和干燥負(fù)載的血小板。
雖然血液制品和傷口愈合在前幾年已取得許多進(jìn)展，但是仍然需要用于處理傷口如，通過(guò)止血或者傷口凝固的改良組合物。因此，需要制備用于處理傷口的組合物的改良方法。同樣地，需要快速、有效并且適用于多種應(yīng)用的處理傷口以抑制出血的方法。此外，仍然需要改良的用于出血疾病和病癥的診斷測(cè)定法。

發(fā)明內(nèi)容
通過(guò)提供血小板、血小板微粒和含有血小板和/或血小板微粒的組合物，本發(fā)明滿足了本領(lǐng)域需求。所述血小板、微粒和/或組合物可以用于多種目的，包括但不限于用作止血?jiǎng)?、用于在涉及出血的傷口位置形成凝塊以及用于促進(jìn)組織再生和愈合。它們還可以用于治療血友病，包括血友病A、血友病B、血友病C和具有抑制劑的獲得性血友病。還提供了用于預(yù)防性預(yù)防或者治療與抗凝血療法或者導(dǎo)致抑制凝固級(jí)聯(lián)的其它療法或環(huán)境影響相關(guān)的活性大量出血的組合物和方法。本發(fā)明還通過(guò)提供可以用作檢測(cè)血液凝固病癥的診斷學(xué)的組合物和方法，滿足了本領(lǐng)域需求。因此，本發(fā)明提供了制備診斷用組合物和將它們用于診斷出血病癥的方法中的方法。本發(fā)明進(jìn)一步通過(guò)提供制備凍干血小板、凍干微粒的方法，重構(gòu)或者再水化凍干血小板的方法和重構(gòu)血小板，滿足了本領(lǐng)域需求。本發(fā)明的這些方法提供了在室溫或者更低溫度下長(zhǎng)期穩(wěn)定的凍干血小板。它們也提供凍干血小板，通過(guò)重構(gòu)，所述血小板在血液凝固過(guò)程中作用良好，并且由此可以將它們成功用于治療學(xué)應(yīng)用中，如用于傷口愈合和治療出血疾病和病癥。提供含有所述血小板、微粒和/或組合物的試劑盒。
在實(shí)施方案中，本發(fā)明將血小板和多種血小板和/或微粒制劑用作活性劑，從而如對(duì)血友病患者提供常規(guī)或者假常規(guī)止血性能，和對(duì)血友病患者以及其它受到導(dǎo)致出血的外傷的患者提供止血?jiǎng)┬阅?。本發(fā)明進(jìn)一步提供用于治療藥物誘發(fā)凝血病和在凍干血小板衍生物存在下用于促進(jìn)促凝血藥物效果的凍干(冷凍干燥)海藻糖穩(wěn)定的血小板衍生物。所述血小板、微粒和/或組合物的應(yīng)用的其它非限制性實(shí)例包括在診斷分析中的應(yīng)用和在對(duì)血小板功能和血液凝固研究中的應(yīng)用。所述血小板、微粒和/或組合物可以按照本文提供的方法生產(chǎn)。因此，本發(fā)明提供了制備止血?jiǎng)┑姆椒ê褪褂盟鲋寡獎(jiǎng)?，例如用于治療?chuàng)傷和出血的方法。
出乎意料地發(fā)現(xiàn)，所述血小板或者血小板制劑，如凍干血小板，可以提供常規(guī)或者幾乎常規(guī)的凝固性能，并且由此可以提供止血性能。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，它們適用于向外傷性損傷位置和向血友病患者的血液提供這些功能。因此，它們可以預(yù)防性地用于治療血友病，不論該血友病是血友病A、血友病B、血友病C或者獲得性血友病。它們同樣可以對(duì)進(jìn)行抗凝血療法的血液提供增強(qiáng)的凝固性能。當(dāng)涉及出血疾病和病癥時(shí)，上述發(fā)現(xiàn)至少部分是意想不到的，因?yàn)榭梢杂帽景l(fā)明的血小板組合物治療的疾病和病癥一般不存在低血小板的臨床癥狀。也就是說(shuō)，例如，血友病患者中的血小板數(shù)一般是正常的，并且由此通常期望提供血小板一般提供的所有必需組分。據(jù)信，本發(fā)明的血小板提供因子VIII或者因子IX、或者一種或者多種在涉及因子VIII或者因子IX的步驟之前發(fā)生的凝固級(jí)聯(lián)步驟中涉及的主要組分，并且由此克服血友病中的這些物質(zhì)的缺失。同樣地，通過(guò)提供凝血級(jí)聯(lián)中的至少一種這些患者缺少組分的下游組分，本發(fā)明組合物克服了在抗凝血療法患者和其它表現(xiàn)出延遲或者缺乏凝固的對(duì)象中觀察到的缺失。因?yàn)閷⒈景l(fā)明的血小板可以保持在體內(nèi)相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)期(例如，同小分子藥物相比)，因此治療可以在療程中獲得，并且不必在受傷時(shí)進(jìn)行治療，不過(guò)根據(jù)本發(fā)明的治療并不排斥這種“按需”治療。
在第一方面，本發(fā)明提供血小板和含有血小板的組合物。所述血小板和組合物一般含有凍干血小板或者再水化凍干血小板。通常，所述組合物還包括血小板微粒。所述血小板、微粒和組合物可以利用本發(fā)明方法進(jìn)行制備。本發(fā)明的凍干血小板是非常穩(wěn)定的，其貯存期限至少為六個(gè)月。所述凍干血小板和由它們得到的再水化血小板保持大多數(shù)，既便不是全部，當(dāng)被引入到需要血小板功能的個(gè)體、患者或者目標(biāo)(在此全部可互換使用)時(shí)所需的血小板血液凝固功能的特性。由此，本發(fā)明凍干血小板可以用于體內(nèi)治療學(xué)目的和體外診斷或者研究。不論是凍干還是重構(gòu)的血小板都可以用于多種目的，包括但不限于，用作治療患者出血的可注射或者可注入物質(zhì)，用作可以從體外進(jìn)行的直接出血的治療。它們同樣可以用于診斷目的如用于診斷血液凝固系統(tǒng)病癥或者用于體外試驗(yàn)如用于血液凝固過(guò)程的研究。它們同樣可以用于監(jiān)控患者血液凝固系統(tǒng)在一段時(shí)期內(nèi)的血液凝固能力，如，例如在對(duì)血液凝固系統(tǒng)或者患者體內(nèi)其它系統(tǒng)或者組織的疾病或者病癥進(jìn)行治療的療程期間。所述凍干血小板或者由它們制備的再水化血小板可以具有足以提供凝固功能的新鮮獲得或者有效期內(nèi)的血小板的性能，和促進(jìn)傷口愈合。所述血小板可以存在于任何適宜的組合物內(nèi)，并且可以以任何濃度存在。在多種實(shí)施方案中，它們作為從血液濃縮的血小板或者作為已凍干和任選重構(gòu)的從血液濃縮的血小板而提供。所述組合物可以含有其它血液組分，并且特別是可以含有其它處于正?；蛘呋罨瘧B(tài)的凝血因子，如因子VII、因子VIII或者因子IX。
在另一方面，本發(fā)明提供制成或者制備(在此可互換使用)凍干血小板、凍干微粒和/或包括凍干血小板和/或微粒的組合物的方法。所述方法通常包括，獲得血小板；在足以將糖接合入血小板的條件下使血小板暴露于至少一種糖；加入冷凍保護(hù)劑；和冷凍干燥。例如，所述方法可以包括，提供血小板，將血小板懸浮在含有至少一種糖的鹽緩沖液中從而制成組合物，在凍結(jié)以上溫度下將組合物培養(yǎng)至少足以使至少一種糖與血小板進(jìn)行接觸的一段時(shí)間，加入冷凍保護(hù)劑從而形成第二組合物，和冷凍干燥第二組合物。該方法可以進(jìn)一步包括將凍干血小板加入到其它血小板或者血漿中，從而形成混合物。根據(jù)本發(fā)明的凍干血小板，單獨(dú)或者與其它血小板和血漿聯(lián)用，尤其可以用于診斷多種血液凝固系統(tǒng)疾病和病癥。通過(guò)暴露于含水液體如水或者含水緩沖液，可以對(duì)所述凍干血小板進(jìn)行重構(gòu)或者再水化(在此可以互換使用)。另外，所述凍干血小板制劑可以直接用于治療對(duì)象或者患者(在此可以互換使用)，如遭受流血傷口或者出血病癥的對(duì)象或者患者。用于制備凍干血小板或者組合物的血小板可以在有效期內(nèi)(新近分離)或者可以過(guò)期(時(shí)間長(zhǎng)于由USFDA法規(guī)允許的血液治療學(xué)應(yīng)用期限)。
在另一方面，本發(fā)明提供由本發(fā)明凍干血小板制備再水化或者重構(gòu)血小板的方法。通常，所述重構(gòu)方法包括，以足量和足夠長(zhǎng)的時(shí)間將凍干血小板暴露于含水液體，從而再水化所述血小板，使得它們恢復(fù)到正常形狀和流體含量。在實(shí)施方案中，含水液體的量為干燥的血小板體積的兩倍。在實(shí)施方案中，含水液體的量等于干燥的血小板體積。在實(shí)施方案中，含水液體的量等于干燥的血小板體積的一半。在其它實(shí)施方案中，含水液體的體積為冷凍干燥之前的組合物的體積的兩倍。在其它實(shí)施方案中，含水液體的體積等于冷凍干燥之前的組合物的體積。在又一實(shí)施方案中，含水液體的體積為冷凍干燥之前的組合物的體積的一半。
在另一方面，本發(fā)明提供了再水化的血小板。當(dāng)被引入到需要血液凝固功能的對(duì)象時(shí)，本發(fā)明的再水化血小板具有正常血液凝固所需要的全部血小板特性。例如，所述再水化血小板含有參與血小板被引入對(duì)象(即，給予血小板的對(duì)象)中血塊形成的必要的所有表面分子。
本發(fā)明的另一方面提供了試劑盒。通常，本發(fā)明試劑盒含有本發(fā)明的凍干血小板。本發(fā)明試劑盒一般包括至少一個(gè)含有本發(fā)明血小板的容器，并且可以進(jìn)一步包括任選組分如用于再水化血小板的無(wú)菌含水液體、用于給予血小板的設(shè)備等等。由此，在其基本水平上，本發(fā)明的試劑盒為含有根據(jù)本發(fā)明的血小板、微?；蛘呓M合物的容器。所述容器可以為任何適用于包含這些物質(zhì)的材料，如管形瓶或者安瓿。在實(shí)施方案中，所述容器含有足量的血小板以進(jìn)行根據(jù)本發(fā)明至少一種方法的至少一個(gè)實(shí)施方案。由此，所述試劑盒尤其可以是診斷試劑盒、用于凝結(jié)蛋白質(zhì)或者血小板的血液凝固監(jiān)控試劑盒或者藥物治療監(jiān)控試劑盒。在實(shí)施方案中，所述容器作為更大試劑盒的部件提供，所述更大試劑盒包括適宜的包裝和任選包括與組合物應(yīng)用相關(guān)的說(shuō)明書(shū)和其它信息。在實(shí)施方案中，所述容器或者試劑盒包括其它組分，如純化的凝固級(jí)聯(lián)組分?？梢詫?duì)所述試劑盒進(jìn)行構(gòu)造，從而供應(yīng)用于體內(nèi)治療、用于體外診斷或者用于體外或體內(nèi)研究的凍干血小板。通常，所述試劑盒將包括一些或者所有進(jìn)行一種或者多種對(duì)照反應(yīng)的供應(yīng)源和試劑，從而確保試劑盒適當(dāng)?shù)剡M(jìn)行和提供可以與試驗(yàn)樣品進(jìn)行對(duì)比的基線結(jié)果。在實(shí)施方案中，以足量提供血小板以治療需要血小板的對(duì)象，如進(jìn)行手術(shù)或者具有流血傷口的患者。在其它實(shí)施方案中，以足量提供血小板以對(duì)血小板或者血小板由來(lái)自其的動(dòng)物物種的血液凝固系統(tǒng)進(jìn)行研究。
在另一方面，本發(fā)明提供治療需要或者懷疑需要一種或者多種血液凝固系統(tǒng)組分的對(duì)象，如需要或者懷疑需要血小板的個(gè)體的方法。通常，所述方法包括，獲得凍干血小板(純化的或者為組合物的一部分的)，和將它們給藥至需要的對(duì)象。給藥可以通過(guò)任何已知方法進(jìn)行，但是一般是通過(guò)輸注、注射或者直接施用至出血位置。在將它們給藥至所述對(duì)象之前，所述方法可以包括任選的再水化血小板的步驟。所述對(duì)象可以是任何需要的對(duì)象，如遭受傷口流血的對(duì)象或者患有出血疾病或病癥的對(duì)象。在多種實(shí)施方案中，所述個(gè)體是血友病患者或者經(jīng)受抗凝血?jiǎng)┲委煹幕颊?。在其它?shí)施方案中，所述個(gè)體是經(jīng)由一些其它方式如由于肝功能衰竭、透析或者由于暴露于環(huán)境劑使其凝固系統(tǒng)受到損害的患者。通常，本發(fā)明此方面的方法包括，以足以將個(gè)體的血液止血性能升高至可檢測(cè)地高于給藥之前水平的量將本發(fā)明組合物給藥至個(gè)體。所述方法可以進(jìn)一步包括給予其它生物活性劑如凝血因子和用于治療癌癥的化學(xué)治療劑。它還可以包括用物理方式如利用輻射進(jìn)行治療。可以設(shè)想，如果使用新鮮的、在有效期內(nèi)的血小板，人們可以任選活化血小板，從而對(duì)凝固病癥的治療提供更好的止血效果。所述凍干血小板、再水化血小板或者組合物可以與其它止血?jiǎng)┤缰亟MFVIIa聯(lián)用，從而增強(qiáng)以另外的亞藥理學(xué)量(sub-pharmacologicamounts)的后者的效果，由此節(jié)約成本和簡(jiǎn)化給藥和治療。
本發(fā)明的這方面提供治療患有先天性或者獲得性出血的對(duì)象的方法，所述先天性或者獲得性出血如具有抑制劑的先天性或者獲得性血友病；血小板缺陷疾病，如伯-蘇氏綜合征和格蘭茨曼血小板機(jī)能不全；自身免疫血小板減少癥、同種免疫的血小板減少癥、藥物誘發(fā)的血小板減少癥、血栓性血小板減少性紫癜和其它血小板相關(guān)病癥。還提供用于預(yù)防性預(yù)防或者治療與抗凝血療法或者導(dǎo)致抑制凝固級(jí)聯(lián)的其它療法或環(huán)境影響相關(guān)的活性大量出血的組合物和方法。
在另一方面中，本發(fā)明提供了血小板、微粒和組合物作為活性劑的應(yīng)用，從而對(duì)個(gè)體，包括但不限于對(duì)血友病患者，提供常規(guī)或者假常規(guī)止血性能，和對(duì)個(gè)體，包括但不限于受到導(dǎo)致出血的外傷的血友病患者提供止血性能。本發(fā)明進(jìn)一步提供將血小板、微粒和/或組合物用于治療藥物誘發(fā)的凝血病和用于促進(jìn)促凝血藥物效果的應(yīng)用。由此，本發(fā)明提供了血小板、微粒和組合物與其它止血?jiǎng)┤缰亟MFVIIa的聯(lián)用，從而增強(qiáng)以另外的亞藥理學(xué)量的后者的效果，由此節(jié)約成本和簡(jiǎn)化給藥和治療。
在另一方面，本發(fā)明提供用于診斷或者研究目的的凍干血小板(或者由其得到的重構(gòu)血小板)、微粒和/或組合物的使用方法。由此，本發(fā)明提供了診斷血液凝固系統(tǒng)疾病或者病癥的方法。所述方法通常包括，獲得凍干血小板、微粒和/或含有它們的組合物(或者再水化血小板、微粒和/或組合物)，將它們與從患有或者懷疑患有血液凝固系統(tǒng)疾病或者病癥的患者中除去的血小板和/或血漿合并從而形成混合物，和通過(guò)測(cè)定所述混合物的一種或者多種生物學(xué)或者生物化學(xué)功能來(lái)確定所述個(gè)體是否患有血液凝固系統(tǒng)缺陷，其中所述缺陷降低或者消除了患者血液凝固系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)正常功能或者使得凝塊在預(yù)定時(shí)間段內(nèi)形成的能力。一般，確定患者的血液凝固系統(tǒng)是否具有缺陷包括測(cè)定上述混合物的凝固時(shí)間。該診斷方法一般在體外進(jìn)行，但是如果期望，也可以在試驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行。通常進(jìn)行所述診斷方法以確定出血病癥和那些病癥的原因。研究方法通常涉及發(fā)現(xiàn)出血病癥的原因，如特定個(gè)體不能響應(yīng)創(chuàng)傷或者其它損傷而正?？刂瞥鲅姆肿右罁?jù)。所述研究方法還可以涉及藥物治療對(duì)個(gè)體血液凝固系統(tǒng)的效果研究(例如，消極影響血液凝固的副作用)。
在另一方面，本發(fā)明提供了監(jiān)控血液凝固系統(tǒng)疾病或者病癥進(jìn)展的方法。該方法通常包括，獲得凍干血小板或者由凍干血小板得到的再水化血小板，將它們與從患有所述疾病或者病癥的患者中除去的血小板和/或血漿合并從而形成混合物，和確定所述混合物的血液凝固能力。一般地，確定混合物的血液凝固能力表明患者血液的血液凝固能力，并且其包括測(cè)定混合物的凝固時(shí)間。此外，一般隨時(shí)間流逝進(jìn)行多個(gè)測(cè)定，從而得到疾病發(fā)展隨時(shí)間流逝的指征。
在另一方面，本發(fā)明提供了監(jiān)控患者治療方案對(duì)該患者血液凝固系統(tǒng)的影響的方法。該方法通常包括，獲得凍干血小板或者由凍干血小板得到的再水化血小板，將它們與從經(jīng)受所述治療方案的患者中除去的血小板和/或血漿合并從而形成混合物，和確定所述混合物的血液凝固能力。一般地，確定混合物的血液凝固能力表明患者血液的血液凝固能力，并且其包括測(cè)定混合物的凝固時(shí)間。此外，一般隨時(shí)間流逝進(jìn)行多個(gè)測(cè)定，從而得到治療方案的效果隨時(shí)間流逝的指征。


引入說(shuō)明書(shū)并且構(gòu)成說(shuō)明書(shū)一部分的附圖與說(shuō)明書(shū)一起說(shuō)明本發(fā)明的數(shù)種實(shí)施方案，用于說(shuō)明本發(fā)明某些方面的某些原理。
圖1是示出根據(jù)本領(lǐng)域已知方法和根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案方法制備凍干血小板中所涉及步驟的流程圖。
圖2是示出本發(fā)明實(shí)施方案的凍干血小板以劑量依賴方式促進(jìn)血漿凝固的效果的圖表。
圖3是示出本發(fā)明實(shí)施方案的凍干血小板在促進(jìn)血液凝縮中的效果的圖表。
圖4顯示了表示根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案制備的重構(gòu)熱處理的凍干血小板的大小和粒度測(cè)定結(jié)果的熒光激活的細(xì)胞分類(lèi)(FACS)分析。圖A示出多種熱處理之后的重構(gòu)凍干血小板和新鮮血小板的尺寸。圖B示出多種熱處理之后的重構(gòu)凍干血小板和新鮮血小板的粒度。
圖5示出FACS分析，其表明在從75℃(圖B)至80℃(圖C)至85℃(圖D)的多種溫度下，冷凍干燥后進(jìn)行熱處理步驟24小時(shí)對(duì)血小板大小的影響，使用不受熱樣品作為對(duì)照(圖A)。
圖6顯示了FACS分析，其表明在從75℃(圖B)至80℃(圖C)至85℃(圖D)的多種溫度下，冷凍干燥后熱處理步驟24小時(shí)對(duì)血小板?；挠绊?，使用不受熱樣品作為對(duì)照(圖A)。
圖7表示新鮮血小板的FACS分析(圖A)、根據(jù)本領(lǐng)域已知的先導(dǎo)方案制備的凍干血小板的FACS分析(圖B)和本發(fā)明方案制備的凍干血小板的FACS分析(圖C)。
圖8示出了重構(gòu)凍干血小板的FACS分析和在糖負(fù)載緩沖液和凍干緩沖液中乙醇存在的影響。
圖9圖示出根據(jù)本發(fā)明其中包括酸處理的實(shí)施方案制備時(shí)，凍干血小板表面上的HLA標(biāo)記物的相對(duì)量的FACS分析。
圖10描繪了圖示出顯示凍干血小板對(duì)成纖維細(xì)胞增殖影響的圖表(圖A)和對(duì)人類(lèi)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖影響的圖表(圖B)。
圖11圖示出使用本發(fā)明凍干血小板再造的膠原-成纖維細(xì)胞基體的膠原收縮測(cè)定的結(jié)果圖。
圖12圖示出顯示三種不同制備凍干血小板的方案對(duì)微粒濃度影響的圖表。
圖13圖示出表示更高微粒濃度對(duì)局部傷口愈合的有益效果的圖表。圖A表示微粒濃度對(duì)全血凝固時(shí)間的影響。圖B表示微粒濃度對(duì)血漿的影響。
圖14示出比較SurgicelTM、QuikClotTM和本發(fā)明組合物之間出血控制的圖。圖A表示腹部的主動(dòng)脈刺穿位置；圖B表示QuikClotTM對(duì)主動(dòng)脈出血的影響；圖C表示SurgicelTM對(duì)出血的影響；和圖D表示本發(fā)明組合物對(duì)出血的影響。
圖15示出腹主動(dòng)脈已經(jīng)被刺穿、隨后用本發(fā)明凍干血小板、SurgicelTM、QuikClotTM處理以及未用止血?jiǎng)┗蛘呶聪虺鲅糠质┘訅毫?對(duì)照)的嚙齒動(dòng)物血壓圖。
圖16圖示出用封閉敷裹、本發(fā)明凍干血小板或者VEGF處理的傷口位置創(chuàng)傷層(wound beds)的微觀圖。
圖17圖示出圖16中所示的血管形成結(jié)果的定量分析圖。
圖18圖示出不同傷口愈合治療方案的對(duì)比圖。
圖19圖示出作為凍干血小板源的有效期內(nèi)和過(guò)期血小板在處理傷口效果中的對(duì)比圖。
圖20圖示出再水化凍干血小板、本發(fā)明組合物和新近分離血小板的尺寸分布。
圖21圖示出利用正常收集血漿的凍干血小板與凝固時(shí)間的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
圖22圖示出利用乏血小板血漿的凍干血小板與凝固時(shí)間的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
圖23圖示出血友病血漿中的凝固缺陷的檢測(cè)。
圖24圖示出凝血和抑制凝血的一般模式。
圖25圖示出區(qū)分全血中凝血蛋白質(zhì)缺陷的測(cè)定結(jié)果。
圖26圖示出本發(fā)明凍干血小板與抗凝血?jiǎng)┑奶禺愋苑磻?yīng)。
圖27示出利用離子載體(ionophore)活化的凍干血小板，其為使FITC-膜聯(lián)蛋白V結(jié)合凍干血小板暴露了另外的結(jié)合位點(diǎn)。
圖28示出與50nM FITC-膜聯(lián)蛋白V結(jié)合的凍干血小板可以與過(guò)量100倍的未標(biāo)記膜聯(lián)蛋白V競(jìng)爭(zhēng)。
圖29示出25nM的標(biāo)記FVIIa不能與未活化和離子載體活化的新鮮血小板結(jié)合。
圖30圖示出25nM FVIIa與凍干血小板的直接結(jié)合，并且示出該結(jié)合可以競(jìng)爭(zhēng)過(guò)使用2500nM未標(biāo)記的FVIIa。
圖31圖示出100nM FXa與凍干血小板的直接結(jié)合，并且示出該結(jié)合可以競(jìng)爭(zhēng)過(guò)使用10000nM的未標(biāo)記Fxa。
圖32圖示出凍干血小板、新鮮血小板和二者的組合物對(duì)膠原-介導(dǎo)的聚集的影響。
圖33圖示出由凍干血小板、新鮮血小板和二者組合物的單細(xì)胞數(shù)判斷的對(duì)膠原-介導(dǎo)的聚集的影響。
圖34圖示出暴露于花生四烯酸、膠原、腎上腺素、凝血酶受體活化肽(TRAP)和瑞斯托菌素介導(dǎo)的凍干血小板聚集體時(shí)對(duì)凍干血小板的影響。該圖還圖示出由單細(xì)胞數(shù)判斷的凍干血小板聚集百分比。
圖35A示出通過(guò)將凝固時(shí)間由約300秒提高至差不多500秒，因子X(jué)I的單克隆抗體誘發(fā)假獲得性血友病C。
圖35B示出含有再水化血小板衍生物的本發(fā)明組合物在獲得性血友病C的全血模型中縮短了凝固時(shí)間(因子X(jué)I抑制劑)。
圖36示出因子IX的單克隆抗體誘發(fā)假獲得性血友病B，以及再水化血小板衍生物在獲得性血友病B的全血模型中縮短了凝固時(shí)間(因子X(jué)I抑制劑)。
圖37示出因子VIII的單克隆抗體誘發(fā)假獲得性血友病A，以及再水化血小板衍生物在獲得性血友病A的全血模型中縮短了凝固時(shí)間(因子VIII抑制劑)。
圖38示出再水化血小板衍生物縮短了由真實(shí)血友病血漿得到的重構(gòu)全血的凝固時(shí)間。
圖39A示出作為藥物誘發(fā)凝血病模型的牛胰蛋白酶抑制劑(Aprotinin)抑制作用。
圖39B示出牛胰蛋白酶抑制劑抑制作用可以通過(guò)再水化血小板衍生物(RHP)而逆轉(zhuǎn)。
圖40A示出作為藥物誘發(fā)凝血病模型的肝素抑制作用。
圖40B示出肝素抑制作用可以通過(guò)再水化血小板衍生物而逆轉(zhuǎn)。
圖41A示出，RHP增強(qiáng)亞藥理學(xué)量重組人類(lèi)因子VIIa(NovoSeven，來(lái)源于Novo Nordisk)的活性。
圖41B表明了FITC-PPACK因子VII與RHP的特異性相互作用。
圖42示出由膜聯(lián)蛋白V結(jié)合判斷的RHP促凝血性能。
具體實(shí)施例方式
現(xiàn)在詳細(xì)參照本發(fā)明的多種示例性實(shí)施方案進(jìn)行詳述，其實(shí)施例圖解說(shuō)明于附圖中。
在一方面中，本發(fā)明提供凍干血小板、再水化凍干血小板和包含凍干血小板或者再水化凍干血小板的組合物。除了所述血小板之外，所述組合物可以但非必須含有微粒，并且這些微粒可以作為制備凍干血小板的結(jié)果來(lái)包含，或者可以有意作為組合物組分加入。與所述組合物如何進(jìn)行制備無(wú)關(guān)，根據(jù)用于制備凍干血小板的方法，所述血小板可以與新近分離的血小板或者已經(jīng)短期貯存的血小板例如少于六天(有效期內(nèi)血小板)具有不同程度的類(lèi)似性。在示例性的實(shí)施方案中，所述血小板保持了所有在血液中正常血小板存在下對(duì)血小板凝固功能而言不可缺少的特性。在其它示例性實(shí)施方案中，血小板缺少或者缺失一種或多種特性。
凍干血小板和源于這些凍干血小板的再水化血小板可以由新近分離的血小板(從供血對(duì)象身體分離之后少于幾小時(shí))、有效期內(nèi)血小板(從供血對(duì)象身體分離后少于六天)或者過(guò)期血小板(從供血對(duì)象身體分離后六天或者更多天)制備?，F(xiàn)已令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，可以將過(guò)期血小板用作凍干血小板源，并且所述血小板或者由它們得到的再水化血小板不僅可以用于研究目的，而且也可以用于治療出血和出血病癥。
本發(fā)明血小板可以具有基本上所有正常的、從血液中新近獲得的血小板的總體形態(tài)特征。例如，在其中存在重構(gòu)凍干血小板的某些組合物中，當(dāng)將所述組合物濾過(guò)保持一般血小板大小的顆粒的篩眼尺寸時(shí)，組合物中約70％的顆粒得到了保持。同樣地，所述血小板顆粒通常表現(xiàn)出與新鮮、未處理血小板相同的細(xì)胞表面蛋白質(zhì)排列。例如，尺寸、粒度和表面受體如GPIb和GPIIb/IIIa可以以與新鮮血小板相當(dāng)?shù)乃奖３只蛘卟糠直３衷趦龈裳“宓谋砻?。所述血小板還可以包括在新鮮血小板中不常發(fā)現(xiàn)的特性，如表達(dá)填充脂質(zhì)和顆粒蛋白質(zhì)，如P-選擇蛋白和因子V。由于上述原因，所述血小板可以給予新鮮血小板不能實(shí)現(xiàn)的附加功能，如結(jié)合維生素K依賴型蛋白等等。在特定實(shí)施方案中，所述血小板保持了大多數(shù)，如果不是全部的話，進(jìn)行充分血液凝固所需要的特性。由此，例如，本發(fā)明凍干血小板可以保持正常尺寸(通過(guò)再水化)、完整的膜、正常的聚集性能、正確的表面蛋白排列和參與凝固級(jí)聯(lián)的內(nèi)在因子。也就是說(shuō)，本發(fā)明所述凍干血小板和保持大多數(shù)，如果不是全部，當(dāng)被引入到需要血小板功能的患者或者對(duì)象時(shí)所需的血小板血液凝固功能的特性。
所述血小板可以從任何來(lái)源中得到，包括但不限于哺乳動(dòng)物，如人類(lèi)、犬或者其它犬齒動(dòng)物、貓或者其它貓科動(dòng)物、小鼠、大鼠或者其它嚙齒類(lèi)動(dòng)物；豬、馬、綿羊、山羊、?；蛘咂渌r(nóng)畜；和猴子、黑猩猩、猿或者其它靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物。也就是說(shuō)，所述組合物可以含有得自于包括但不限于人類(lèi)、靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物、犬齒動(dòng)物、貓科動(dòng)物、牛類(lèi)動(dòng)物、羊類(lèi)動(dòng)物、豬類(lèi)動(dòng)物、馬類(lèi)動(dòng)物和嚙齒類(lèi)動(dòng)物的任何哺乳動(dòng)物物種的血小板。此外，相對(duì)于在本發(fā)明方法中與之混和的血液，所述血小板可以為自源性或者異源性血小板。例如，在實(shí)施方案中，本發(fā)明方法通常包括將血小板如凍干血小板與從患者中新近獲得的血液混合。所述血小板優(yōu)選，但非必需，得自于與血液相同的患者(即，自源性血小板)。然而，在實(shí)施方案中，所述血小板得自于除患者之外的一個(gè)或者多個(gè)個(gè)體(即，異源性血小板)。在某些實(shí)施方案中，所述凍干血小板來(lái)自于由兩個(gè)或者更多個(gè)供血者得到的血小板庫(kù)。在某些涉及含有凍干血小板和新鮮血小板的組合物的實(shí)施方案中，所述新鮮血小板來(lái)自于由兩個(gè)或者更多個(gè)供血者得到的血小板庫(kù)。
如上所述，用于本發(fā)明中的血小板可以由有效期內(nèi)或者過(guò)期血小板得到。有效期內(nèi)血液是新近從供血者獲得的血液，包括短于六天的血液。與此相比，過(guò)期血液是六天或者更多天之前從供血者獲得的血液，因此一些政府管理機(jī)構(gòu)認(rèn)為它不再適于用作處理大量出血的治療劑(例如，用于輸血)。在某些實(shí)施方案中，將從一個(gè)或者多個(gè)供血源獲得的過(guò)期血液(單獨(dú)使用或者用作從不同來(lái)源獲得的血液混合物)用作凍干血小板源，從而用作“正常的”或者“標(biāo)準(zhǔn)的”對(duì)照。
此外，在用于治療對(duì)象之前，可以對(duì)所述血小板進(jìn)行多種處理。通常，從全血中濃縮血小板。可以通過(guò)包括但不限于離心和過(guò)濾的任何適宜的方法對(duì)它們進(jìn)行濃縮，。除了濃縮之外，可以用鹽水或者其它適宜的溶液對(duì)它們進(jìn)行一次或者多次洗滌，從而除去一些或者全部其它血液組分。同樣地，可以將它們作為在它們周?chē)哂泻苌倩蛘呋旧蠜](méi)有液體介質(zhì)的填裝濃縮物保持，或者可以將它們懸浮在可以含有穩(wěn)定劑或者其它與血小板相容的物質(zhì)的適宜含水溶液或者緩沖液中。
在實(shí)施方案中，將濃縮血小板凍干或者冷凍干燥。許多凍干血液制品和其它生物學(xué)物質(zhì)的工藝都是已知的，并且任何一種都可以用于制備根據(jù)本發(fā)明的凍干血小板。示例性的工藝提供于以下和實(shí)施例中。在其它實(shí)施方案中，用水或者生物學(xué)上相容的含水溶液如鹽水對(duì)凍干血小板進(jìn)行再水化。所述再水化血小板組合物可以直接應(yīng)用，或者在用于治療需要所述血小板的個(gè)體之前，可以將其它物質(zhì)如血液組分或者藥物加入。
在實(shí)施方案中，本發(fā)明由凍干血小板組成。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包括凍干血小板或者由凍干血小板得到的血小板的組合物，所述由凍干血小板得到的血小板如，例如為凍干然后用水、鹽水或者血漿重構(gòu)的血小板(在此還稱(chēng)為重構(gòu)或者再水化血小板)。
因此，根據(jù)本發(fā)明的組合物含有血小板。所述血小板可以為凍干血小板或者再水化凍干血小板。除了血小板之外，所述組合物還可以含有多種物質(zhì)，包括但不限于血小板微粒。由此，本發(fā)明組合物可以為固體或者液體。當(dāng)為液體形式時(shí)，所述組合物可以含有水或者其它含水溶劑，如含水緩沖液、血液或者血液組分或者成分(如血漿)、鹽水、緩沖鹽水(例如，磷酸鹽緩沖鹽水)等等。相應(yīng)地，本發(fā)明的再水化凍干血小板可以用任何所述液體，包括但不限于水、含水緩沖液和血液或者血漿進(jìn)行再水化。所述液體還可以含有一種或者多種有機(jī)溶劑，如一種或者多種醇。所述組合物可以適用于體內(nèi)治療出血或者出血病癥、可以適用于體外或者體內(nèi)診斷學(xué)或者可以適用于體外或者體內(nèi)研究。
在將血小板凍干之前、期間或者之后，根據(jù)本發(fā)明的組合物還可以含有一種或者多種與血小板一起存在的物質(zhì)。由此，所述含有血小板的組合物還可以含有一種或者多種鹽，如磷酸鹽、鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽、鎂鹽和任何其它可以在血液或者血液制品中發(fā)現(xiàn)或者已知可以用于凍干血小板或者真核細(xì)胞的鹽，或者兩種或者更多種這些的任意組合。其它示例性的可以存在于所述組合物中的物質(zhì)包括但不限于糖，如單糖和二糖(例如，麥芽糖、葡萄糖、甘露糖、海藻糖、蔗糖、蔗糖聚合物、葡萄糖)；聚糖，如Ficoll-70和Ficoll-400；甘油；甘油三酸酯；多糖；脂質(zhì)；葡聚糖；聚乙烯吡咯烷酮(PVP)；淀粉；和羥乙基淀粉(HES)等等。其它示例性的物質(zhì)包括源于人類(lèi)或者動(dòng)物源的生物分子，如多肽(例如，白蛋白，如牛血清白蛋白和人血清白蛋白)、酪蛋白、層粘連蛋白和血纖蛋白原等等。當(dāng)然，因?yàn)樗鰞龈蛇^(guò)程會(huì)導(dǎo)致若干數(shù)目的血小板溶胞，因此，相對(duì)于完整血小板外部，本發(fā)明組合物還可以含有一些或者全部存在于血小板內(nèi)部的組分。
可以存在于本發(fā)明組合物中的一組具體物質(zhì)組為起藥物作用的化學(xué)和生物學(xué)化合物。另一組為起食品作用的物質(zhì)。其它組為起草藥補(bǔ)充劑作用的物質(zhì)。在實(shí)施方案中，所述物質(zhì)為抗凝血?jiǎng)?。本發(fā)明的組合物可以，但非必要含有纖維蛋白。例如，當(dāng)將本發(fā)明組合物用于治療不可壓縮的(non-compressible)創(chuàng)傷時(shí)，不含有纖維蛋白的根據(jù)本發(fā)明的組合物可以提供優(yōu)于本領(lǐng)域已知組合物的優(yōu)點(diǎn)。
正如以下更為詳盡地討論，本發(fā)明的組合物和方法特別適用于檢測(cè)和監(jiān)控血液樣品中的藥物、食品和草藥補(bǔ)充劑，和檢測(cè)和監(jiān)控這些物質(zhì)對(duì)給予藥物等等的患者的血液凝固系統(tǒng)的作用。所述藥物包括Warafin(Coumadin)、肝素、氯吡格雷(clopidogrel)(Plavix)、雙嘧哌胺醇(Dipyridamole)(Persantine)、依諾肝素(Lovenox)、阿地肝素(Normiflo)、達(dá)肝素(Fragmin)、噻氯匹定(Ticlid)、達(dá)那肝素(Orgaran)、亭扎肝素(Innohep)、阿斯匹林和凝血酶抑制劑等等。所述物質(zhì)還包括含有潛在抗凝血作用的香豆素的某些食品和草藥補(bǔ)充劑，如苜蓿、當(dāng)歸(Don Quai)、山金車(chē)(Arnica)、睡菜、辣椒、芹菜、蒲公英、馬栗、辣根、繡線菊(Meadowsweet)、蕁麻、歐芹、西番蓮、花卉(Flower)、紅三葉草、草木樨、野生胡蘿卜、野生萵苣。此外，所述物質(zhì)可以為具有抗血小板性能的那些，如龍牙草、蘆薈膠質(zhì)體(Aloe gel)、黑升麻(Black cohosh)、睡菜、丁香、蒲公英、大蒜、姜、銀杏、人參(人參屬)、甘草、繡線菊、洋蔥、普利醇(Policosanol)、白楊、美遠(yuǎn)志、羅望子和柳冬青(Willow Wintergreen)等等。
由此，所述組合物可以含有其它血液組分，并且特別是可以含有其它處于正?；蛘呋罨瘧B(tài)的凝血因子，如因子VII和因子VIII。這些其它組分可以作為濃縮血小板的結(jié)果存在或者可以將它們作為分別純化的組分加入到血小板中。這些其它血液組分可以單獨(dú)存在(即，僅僅一種存在于組合物中)，或者可以將多種其它血液組分與血小板一起包含在組合物中。一般地，將其它血液組分以血小板的選定量給藥至個(gè)體時(shí)，其以提供在至少一種所述治療個(gè)體的生理過(guò)程中可檢測(cè)變化或者提供已知益處的量或者濃度來(lái)包含。
例如，在每微升50,000個(gè)血小板或者血小板衍生物存在下，可以將重組因子VIIa以對(duì)患者提供10μg/kg體重的劑量的量包含在所述組合物中(或者單獨(dú)給藥)；該量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于用抑制劑治療血友病患者的標(biāo)準(zhǔn)90μg/kg。關(guān)于本發(fā)明的該實(shí)施方案，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明含有血小板的組合物，當(dāng)將其與純化重組因子VIIa一起提供時(shí)，將活性所需因子VIIa的量降低5～10倍。即，如下文所述，已發(fā)現(xiàn)，當(dāng)將重組因子VIIa與本發(fā)明的濃縮冷凍干燥和再水化血小板一起使用時(shí)，在正常時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)凝固所需的重組因子VIIa的量比單獨(dú)使用重組因子VIIa時(shí)低5～10倍。
同樣地，所述組合物可以含有其它非正常血液組分的組分。所述組分可以為對(duì)溶液提供多種有益性能如穩(wěn)定溶液中的蛋白質(zhì)、制成生物學(xué)上相容的溶液等等的鹽、洗滌劑和其它非生物學(xué)物質(zhì)。所述組分還可以為具有已知生物活性的物質(zhì)，如化學(xué)治療劑、抗生素、維生素等等。如同所述血液組分，優(yōu)選存在于溶液中的非血液組分以提供預(yù)期功能的量包含。例如，優(yōu)選以穩(wěn)定組合物中蛋白質(zhì)或者提供與受體血液相容的量加入鹽。此外，將抗生素或者化學(xué)治療劑(等等)以使得當(dāng)以選定量血小板給藥至個(gè)體時(shí)，提供在被治療個(gè)體的至少一種生理過(guò)程中可檢測(cè)變化或者提供已知益處(例如，以已知適用于對(duì)抗細(xì)菌感染的量將已知抗生素提供給被治療個(gè)體)的量加入。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明組合物含有血小板、微?；蛘呱鲜鰞煞N物質(zhì)，但不含有其它形成凝塊的生物學(xué)上的活性物質(zhì)。因此，本發(fā)明提供這樣的組合物，該組合物當(dāng)只含有血小板時(shí)或者當(dāng)它們含有血小板和其它凝血因子時(shí)都促進(jìn)凝固活性。
在其中所述組合物含有微粒的實(shí)施方案中，在所述組合物中，所述血小板一般包括約10％～約70％的顆?？倲?shù)，特別是血小板或者源于血小板的顆粒。例如，血小板可以含有約10％～約60％，約10％～約50％的顆粒，約20％～約50％的顆粒，約20％～約40％的顆粒，或者約20％～30％的顆粒。在實(shí)施方案中，當(dāng)將所述組合物濾過(guò)保持一般血小板大小的顆粒的篩眼尺寸時(shí)，組合物中約70％的顆粒得到了保持。由此，在實(shí)施方案中，組合物中高達(dá)約70％的顆粒為血小板。因此，本發(fā)明組合物可以包含70％血小板和30％微粒、60％血小板和40％微粒、50％血小板和50％微粒、40％血小板和60％微粒、20％血小板和80％微粒或者10％血小板和90％微粒。在示例性的實(shí)施方案中，所述組合物含有作為基本上僅僅為血液凝固系統(tǒng)一部分顆粒的血小板和微粒，并且以總顆粒數(shù)的約10％、約20％、約30％、約40％、約50％、約60％或者約70％的量含有血小板。當(dāng)然，本發(fā)明組合物可以含有在上述范圍內(nèi)的任何具體百分?jǐn)?shù)或其分?jǐn)?shù)的血小板或者微粒。因?yàn)楸绢I(lǐng)域熟練技術(shù)人員馬上意識(shí)到每種眾多可能的血小板和微粒的量的組合，因此在此沒(méi)有必要明確公開(kāi)各個(gè)組合。
此時(shí)應(yīng)當(dāng)指出，在此公開(kāi)中所述的各個(gè)值，除非另有說(shuō)明，并不意指準(zhǔn)確限于該具體值。相反地，它是指表示設(shè)定值和它周?chē)娜魏螣o(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的值。通常，除非另作說(shuō)明或者從本公開(kāi)的上下文明顯得出，各個(gè)值包括高于和低于設(shè)定值5％的固有范圍。有時(shí)，該概念通過(guò)使用術(shù)語(yǔ)“約”而獲得。然而，關(guān)于數(shù)字不存在術(shù)語(yǔ)“約”并不表示該值意味著“精確”或者“準(zhǔn)確”。相反地，僅僅當(dāng)術(shù)語(yǔ)“精確”或者“準(zhǔn)確”(或者其它清楚表示精確的術(shù)語(yǔ))使用時(shí)，才可以將其理解為對(duì)該值進(jìn)行如此限定。在此情況下，該設(shè)定值將通過(guò)基于所述有效數(shù)字的取整的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)則進(jìn)行確定。由此，例如，數(shù)值“50”的敘述是指45～55之間的任何整數(shù)值或者分?jǐn)?shù)值，而數(shù)值“準(zhǔn)確是50”的敘述是指49.5～50.4。
在此還應(yīng)當(dāng)注意，關(guān)于本發(fā)明組合物，在本文中使用的“血小板”和“血小板衍生物”可以互換使用，并且包括含有全部或者基本上全部的血小板、全部或者基本上全部的血小板衍生物(由血小板得到的顆粒，如血小板碎片、微粒和外翻血小板)或者它們各自任意量的混合物的組合物。
所述血小板可以在任何適宜的組合物或者制劑中并以任何適用于本發(fā)明方法的濃度存在。由此，可以使用通過(guò)離心正常血液獲得的血小板，或者可以使用從血液中獲得的血小板的部分或者組分(如，從0.5升、1升或者1品脫人類(lèi)血液中獲得的血小板部分)。因?yàn)閭€(gè)體的整個(gè)身體將用本發(fā)明組合物進(jìn)行治療，因此所述組合物不包括全血。也就是說(shuō)，因?yàn)槔萌斠褐委焸€(gè)體是不切實(shí)際和不必要的，因此同全血相比，根據(jù)本發(fā)明的組合物含有濃縮形式的血小板。雖然可以接受大的濃度范圍，但是優(yōu)選提供其中血小板衍生物以比全血濃縮大約10倍或者更多倍的形式提供的組合物，并且其中它們提供從約50,000至約500,000個(gè)血小板/μl的基本血小板數(shù)的升高。由此，它們可以以是或者約是比正常全血濃縮2倍或者更低、5倍、10倍、15倍、20倍、25倍或者更高的濃度存在。它們還可以以提供患者血液中基礎(chǔ)血小板數(shù)從或者約從50,000或者更少、60,000、70,000、80,000、90,000、100,000、125,000、150,000、200,000、250,000、300,00 0、350,000、400,000、450,000、500,00或者更高量升高的量存在。所述血小板衍生物還可以為基于它們的全部磷脂含量的劑量，而不是或者除了通過(guò)列舉數(shù)字度量的量之外。提供于組合物中的量和給藥量可以不同，這取決于目標(biāo)受者(嬰兒、兒童、成年人)和進(jìn)行劑量計(jì)算的基礎(chǔ)。所述計(jì)算在本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)是熟知的，由此不需要過(guò)度的試驗(yàn)即可進(jìn)行。
由此，所述凍干血小板或者再水化凍干血小板可以以1×105～1×1011的量存在于組合物中。在其中新鮮血小板也存在于組合物中的實(shí)施方案中，所述新鮮血小板一般以1×105～1×1011的量存在。在示例性實(shí)施方案中，上述一種或者兩種類(lèi)型的血小板以約1×108～1×1010，如約1×109的量存在于組合物中。在含有新鮮血小板和凍干血小板二者的組合物中，各種血小板的量可以相同或者不同。
如下所詳述，本發(fā)明某些實(shí)施方案的方法通常包括，將凍干血小板和新鮮血液或者可能含有或可能不含有血小板的新鮮血液成分(例如，血漿)混合，從而制備混合物。認(rèn)為所述混合物為根據(jù)本發(fā)明的組合物。由此，在實(shí)施方案中，本發(fā)明組合物包括從供血者獲得并且未經(jīng)受任何凍干工藝的新鮮血小板。同樣地，本發(fā)明組合物可以含有新鮮血小板和凍干血小板的組合。這些類(lèi)型的血小板中的每一種可以以任何量或者濃度存在于所述組合物中，與其它血小板的量或者濃度無(wú)關(guān)。各自的適宜量可以由專(zhuān)業(yè)人員至少部分基于本文關(guān)于本發(fā)明方法的實(shí)踐所述的事項(xiàng)進(jìn)行選擇。
所述組合物的pH值可以為任何適用于血小板的穩(wěn)定和功能的pH值。因此，它可以從弱酸性延伸到弱堿性，如從pH4.0到pH8.5。在多種實(shí)施方案中，所述組合物的pH值為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0或者8.5。在其它實(shí)施方案中，所述pH值為4.0～8.5范圍內(nèi)的任何其它pH值。在其中血小板處于固體(干燥)狀態(tài)的實(shí)施方案中，所述組合物可以含有一種或者多種當(dāng)水化時(shí)導(dǎo)致所得液體組合物的pH值在適宜范圍內(nèi)的物質(zhì)。
可以將海藻糖和/或另一種蔗糖包括在組合物中，并且所述海藻糖和/或其它蔗糖可以存在于血小板外、血小板內(nèi)或者二者中。雖然任何量都可以是適宜的，但是海藻糖或者蔗糖的量一般為50mM～150mM。在多種實(shí)施方案中，海藻糖的濃度為50mM、75mM、100mM、125mM或者150mM。在其它實(shí)施方案中，海藻糖的濃度為50mM～150mM范圍內(nèi)的任何其它濃度。在其中血小板處于固體(干燥)狀態(tài)的實(shí)施方案中，所述組合物可以含有一種或者多種當(dāng)水化時(shí)導(dǎo)致所得液體組合物的海藻糖濃度在適宜范圍內(nèi)的物質(zhì)。
適用于將海藻糖和/或另一種蔗糖負(fù)載入血小板內(nèi)的組合物可以含有乙醇。在所述組合物中，乙醇范圍可以為0.1％～5.0％(v/v)。在多種實(shí)施方案中，乙醇濃度為0.1％、0.5％、1％、2.5％或者5％。在其它實(shí)施方案中，乙醇的濃度為0.1％～5％范圍內(nèi)的任何其它濃度。
在其中血小板處于固體(干燥)狀態(tài)的實(shí)施方案中，可以對(duì)血小板或者其中存在它們的組合物在如室溫、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃或者90℃下進(jìn)行加熱。在實(shí)施方案中，所述溫度為室溫至約90℃的范圍內(nèi)的任何溫度。加熱處理可以促進(jìn)適用于血小板功能測(cè)定的血小板的形成。
在其中血小板處于固體(干燥)狀態(tài)的實(shí)施方案中，可以將它們加熱少于一分鐘至長(zhǎng)達(dá)24小時(shí)或者更長(zhǎng)時(shí)間。因此，加熱時(shí)間可以為0、2、4、8、12或者24小時(shí)。在其它實(shí)施方案中，所述加熱時(shí)間為少于1分鐘～24小時(shí)的范圍內(nèi)的任何時(shí)間，包括該范圍內(nèi)的任何分鐘數(shù)或者其時(shí)間段。
正如從本發(fā)明公開(kāi)中明顯看出的，除根據(jù)某些實(shí)施方案的組合物中某些藥物和抗血小板化合物之外，存在于本發(fā)明組合物中的任何和全部物質(zhì)優(yōu)選以與正常血小板至少一種功能相容的量存在。也就是說(shuō)，除了血小板之外，本發(fā)明組合物可以含有多種物質(zhì)，但是各種物質(zhì)和所述物質(zhì)的所有組合，優(yōu)選至少相對(duì)于一種血小板功能，以使得血小板正常發(fā)揮功能的量存在。在其中一種或者多種物質(zhì)以抑制正常血小板功能的量存在的實(shí)施方案中，為了使得該方法作用良好，優(yōu)選在將血小板用于本發(fā)明的方法之前將上述物質(zhì)除去或者調(diào)節(jié)其濃度。當(dāng)然，這些考慮與有意包含在組合物內(nèi)從而確定所述物質(zhì)對(duì)血小板或者凝結(jié)系統(tǒng)功能影響的藥物和其它抗血小板物質(zhì)無(wú)關(guān)。
本發(fā)明所述凍干血小板、再水化凍干血小板和組合物適用于多種目的，包括但不限于在體外診斷和研究目的以及在體內(nèi)治療學(xué)目的中使用。例如，可以對(duì)所述凍干血小板進(jìn)行再水化和用于治療遭受大量出血或者患有出血病癥的對(duì)象。另外，可以將它們用于研究實(shí)驗(yàn)室條件下的血小板功能，或者用于研究血小板或者血小板組分對(duì)血液凝固系統(tǒng)的影響。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員可以設(shè)想到多種可以用血小板治療的具體疾病和病癥，所有這些疾病和病癥都可以用本發(fā)明凍干血小板進(jìn)行治療。
本發(fā)明的血小板和組合物是非常穩(wěn)定的，在室溫或者更低溫度下其貯存期限至少為六個(gè)月。例如，在室溫或者更低溫度下，所述凍干血小板可以穩(wěn)定長(zhǎng)達(dá)一年、在室溫或者更低溫度下穩(wěn)定長(zhǎng)達(dá)18個(gè)月或者更長(zhǎng)時(shí)間。關(guān)于“穩(wěn)定”，其是指血小板再水化時(shí)，在有效期內(nèi)血小板的正常參數(shù)范圍內(nèi)發(fā)揮功能，并且當(dāng)給藥至需要的對(duì)象時(shí)提供充分的血液凝固功能。該穩(wěn)定性是將血小板制品提供給需要的對(duì)象，特別是那些距離血液收集中心一段距離的位置發(fā)現(xiàn)的那些是非常有利的。此外，因?yàn)樗鰞龈裳“蹇梢栽谑覝叵沦A存，因此不再需要復(fù)雜、龐大或者昂貴的貯存容器(例如，冷藏器)。此外，因?yàn)樗鲅“蹇梢栽诿撍疇顟B(tài)下貯存，因此同新鮮、濃縮的血小板相比，可以在體積和重量上獲得顯著降低。
本發(fā)明的凍干血小板，即使在暴露于50kGY高γ輻射劑量或者在80℃下熱處理24小時(shí)時(shí)也非常穩(wěn)定。該性能的有利之處在于它使得能夠?yàn)闇p少病原體而處理血小板。
此外，根據(jù)本發(fā)明方法制備的凍干血小板通過(guò)再水化，顯示出新鮮或者期內(nèi)血小板的性能。例如，通過(guò)再水化，它們顯示出新鮮或者有效期內(nèi)、未活化血小板的渦旋特征。此外，通過(guò)再水化，它們顯示出了與新鮮或者有效期內(nèi)血小板類(lèi)似的大小和粒度。通過(guò)再水化，所述凍干血小板的其它特性如上所述。
在實(shí)施方案中，所述組合物含有從血液中濃縮的血小板，其中已經(jīng)將血小板凍干或者冷凍干燥和用水基溶液如鹽水對(duì)其重構(gòu)。多種血源都是可利用的，并且可以使用任何一種血源，包括但不限于一般公眾血液供給源和自體血液供給源。同樣地，多種凍干血小板的方法都是本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知的，并且可以使用任何適合的工藝。下面介紹示例性的凍干工藝。
可以將本發(fā)明的血小板用作治療出血患者的可注射或者可注入物質(zhì)，或者可以將其用作可以從體外達(dá)到的直接出血治療。同樣可以將它們用于體內(nèi)或體外診斷目的或者用于體內(nèi)或體外研究，如用于血液凝固過(guò)程研究。所述凍干血小板或者由它們制成的再水化血小板可以具有足以提供凝固功能的新鮮獲得或者有效期內(nèi)的血小板的性能，和促進(jìn)傷口愈合。
本發(fā)明凍干血小板、再水化血小板和組合物實(shí)施方案的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于血小板微粒可以促進(jìn)凝塊形成，可能至少部分通過(guò)其自身性能促進(jìn)tenase和凝血酶原酶的活性，從而增強(qiáng)受傷害位置的凝血酶產(chǎn)生能力和促進(jìn)凝塊快速發(fā)展。此外，由于所述組合物可以含有源于血小板的材料并且可以含有多種重要的生長(zhǎng)因子的事實(shí)，因此它們還可以有助于傷口愈合和組織再生過(guò)程。研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，促有絲分裂脂質(zhì)和生長(zhǎng)因子如血小板源傷口愈合因子(PDWHF)、血小板源性生長(zhǎng)因子(PDGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)和胰島素生長(zhǎng)因子(IGF)在傷口愈合級(jí)聯(lián)的不同階段是尤其重要的，并且會(huì)極大地影響促有絲分裂的和細(xì)胞分化活性。由此，在實(shí)施方案中，將一種或者多種這些因子包括在組合物中或者提供于治療方法中。
在另一方面，本發(fā)明提供制備凍干血小板的方法。通常，所述方法包括，提供血小板，將血小板暴露于至少一種糖，從而形成組合物，在凍結(jié)以上溫度下將組合物培養(yǎng)至少足夠的時(shí)間以使至少一種糖與血小板進(jìn)行接觸，加入冷凍保護(hù)劑從而形成第二組合物，和冷凍干燥第二組合物。將血小板暴露于至少一種糖可以在緩沖液如鹽緩沖液中完成。所述血小板和糖接觸時(shí)間可以足以將糖吸收入血小板內(nèi)。通過(guò)暴露于含水液體(如水或者含水緩沖液)，可以對(duì)所述凍干血小板進(jìn)行重構(gòu)或者再水化(在此可以互換使用)。另外地，可以將所述凍干血小板制劑直接用于治療方法、診斷方法或者研究方法中。制備凍干血小板的具體示例性方法提供如下。
提供血小板的行為可以為任何導(dǎo)致制備的血小板以適用于所述方法的形式應(yīng)用于所述方法中的行為。由此，所述提供可以包括，從對(duì)象中除去血液和從其它血液組分中分離或者純化(至任何適宜的程度)血小板。可以使用任何從其它血液組分中分離血小板的已知方法。因此，它可以通過(guò)利用血漿除去法或者血液的順序差速離心法獲得血小板的工藝。例如，可以將差速離心法用于通過(guò)兩步法從其它血液組分中分離或者純化血小板，該兩步法中，在3000×g下將血液離心45分鐘；將乏血小板的液體除去；將富含血小板丸粒懸浮在含水緩沖液中，和在200×g下將所得混合物離心5分鐘，從而使血小板成為丸粒。另外地，可以使用單離心步驟，如在100×g下離心10分鐘。在獲得血小板的過(guò)程中，可以將一種或者多種物質(zhì)加入到含有血小板的組合物中，如一種或者多種抗凝血?jiǎng)┗蛘叻€(wěn)定劑。其它方法是本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員所熟知的，不需要不適當(dāng)或者過(guò)度試驗(yàn)即可使用任何所述方法。
血小板可以來(lái)自于任何來(lái)源。因此，它們可以得自于動(dòng)物，如豬、馬、狗、母牛、綿羊、山羊、兔、大鼠、小鼠、猴子或者貓。它們還可以來(lái)自于人類(lèi)。在某些情況下，血小板可以作為兩種或者更多來(lái)源的混合物提供，如從向公眾血庫(kù)的隨機(jī)獻(xiàn)血者得到的兩個(gè)或者更多個(gè)血液?jiǎn)挝坏幕旌衔铩Ｔ谄渌鼘?shí)施方案中，如其中血小板意欲用于日后輸注回供血者的實(shí)施方案中，所述血小板可以得自于已知來(lái)源，由此將其視為用于在此公開(kāi)的治療方法目的的自源性血小板。更具體而言，所述血小板可以最初得自于凍干血小板或者重構(gòu)血小板的最終接受者。通常，所述血小板由新鮮來(lái)源(即，在凍干之前少于6天時(shí)從供血者得到的血液中的有效期內(nèi)血小板)提供，不過(guò)在某些情形中可以使用過(guò)期血小板，特別是用于制備目的是用于體內(nèi)和體外診斷或者研究的凍干血小板，如用作止血?jiǎng)┮杂兄谠诰唧w創(chuàng)傷位置停止出血。
將提供的血小板懸浮在包括至少一種糖的鹽緩沖液中，從而形成了含血小板組合物。所述鹽緩沖液可以為任何在緩沖液中保持至少大部分血小板處于完整、功能態(tài)的緩沖液。優(yōu)選所述緩沖液在約6.2～約7.8的pH值下保持血小板。由此，所述鹽緩沖液可以為含有由血小板天然接觸的鹽的等滲鹽緩沖液，如包括鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽等等以及所述鹽的組合的那些。另外地，它可以含有一種或者多種與血小板并不天然接觸的鹽。緩沖液中所述鹽的同一性并不是至關(guān)重要的，只要它們以對(duì)血小板無(wú)毒性和在緩沖液中保持至少大多數(shù)血小板處于完整、功能態(tài)的量存在即可。同樣地，所述緩沖組分可以是任何對(duì)血小板無(wú)毒性和在本發(fā)明方法期間暴露組合物的溫度下對(duì)組合物提供充分緩沖能力的緩沖液。由此，所述緩沖液可以含有任何市售的已知的生物學(xué)上相容的緩沖液如HEPES、磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)和Tris-基緩沖液如TBS。同樣，它可以包括一種或者多種以下緩沖液丙烷-1，2，3-三羧酸(丙三羧酸)；苯五羧酸；馬來(lái)酸；2，2-二甲基丁二酸；EDTA；3，3-二甲基戊二酸；雙(2-羥乙基)亞氨基-三(羥甲基)-甲烷(BIS-TRIS)；苯六羧酸(苯六酸)；N-(2-乙酰胺基)亞氨基-二乙酸(ADA)；丁烷-1，2，3，4-四羧酸；焦磷酸；1，1-環(huán)戊烷二乙酸(3，3四亞甲基-戊二酸)；1，40哌嗪雙-(乙磺酸)(PIPES)；N-(2-乙酰胺基)-2-氨基乙磺酸(ACES)；1，1-環(huán)己烷二乙酸；3，6-內(nèi)亞甲基-1，2，3，6-四氫化鄰苯二甲酸(EMTA；ENDCA)；咪唑；2-(氨乙基)三甲基氯化銨(CHOLAMINE)；N，N-雙(2-羥乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)；2-甲基丙烷-1，2，3-三羧酸(β-甲基丙三羧酸)；2-(N-嗎啉代)丙烷-磺酸(MOPS)；磷酸；N-三(羥甲基)甲基-2-氨基乙磺酸(TES)；和N-2-羥基乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸(HEPES)。此外，所述緩沖系統(tǒng)可以在pH4～pH8的范圍內(nèi)提供緩沖能力。
所述鹽緩沖液包括至少一種糖。所述糖可以為任何適宜的糖，包括單糖或者二糖或者多糖。所述糖可以為任何與保持血小板生存能力和功能相容的糖，并且可以以任何對(duì)血小板無(wú)毒性的量存在。通常，所述糖可以為任何能夠穿過(guò)細(xì)胞膜如血小板膜的糖。適宜的糖的實(shí)例為蔗糖、麥芽糖、海藻糖、葡萄糖、甘露糖、木糖、Ficoll-70和分子量截止為小于約100千道爾頓的水凝膠。熟知所述糖可以有利地包括在組合物內(nèi)以用于凍干或者冷凍干燥血小板，本發(fā)明希望使用至少一種糖以用于穩(wěn)定或者另外促進(jìn)經(jīng)過(guò)凍干和重構(gòu)過(guò)程的血小板的存活。優(yōu)選用于制備凍干血小板的方法中的糖為海藻糖。所述糖可以以任何適宜的量存在于緩沖液中。例如，它可以以1mM～1M的量存在。在實(shí)施方案中，它以10mM 10～500mM的量存在。在一些實(shí)施方案中，它以20mM～200mM的量存在。在實(shí)施方案中，它以40mM～100mM的量存在。在某些特定的實(shí)施方案中，所述糖以至少或者約任何以下濃度的量存在于緩沖液中40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM和100mM。當(dāng)然，在多種實(shí)施方案中，所述糖可以以上述范圍內(nèi)的不同的具體濃度存在，本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員可以立即理解所述多種濃度，在此不需要對(duì)每一種具體描述。當(dāng)多于一種糖存在于緩沖液中時(shí)，各種糖可以以根據(jù)以上所述范圍和特定濃度的量存在。
所述鹽緩沖液可以含有其它組分，只要這些組分以它們存在于緩沖液中的濃度下對(duì)血小板無(wú)毒性即可。由此，可以將聚合物如蛋白質(zhì)和多糖包括在緩沖液中。同樣地，可以包括醇如乙醇或者多元醇如甘油和糖醇。類(lèi)似地，可以包括有機(jī)溶劑如二甲亞砜。此外，凝血或者血小板抑制劑，如肝素、EGTA、檸檬酸鹽和前列腺素E(PGE)。
在實(shí)施方案中，所述緩沖液包括含有50mM海藻糖、pH值為6.8的無(wú)陽(yáng)離子HEPES-Tyrodes緩沖液(95mM HEPES，1MNaCl，48mM KCl，120mM NaHCO3)。在其它實(shí)施方案中，所述緩沖液包括含有100mM海藻糖和1％(v/v)乙醇、pH值為6.8的無(wú)陽(yáng)離子HEPES-Tyrodes緩沖液。
對(duì)含血小板的組合物進(jìn)行培養(yǎng)，從而至少部分地使糖負(fù)載到血小板上。通常，在凍結(jié)以上溫度下將所述組合物培養(yǎng)足夠的時(shí)間以使糖與血小板接觸。由此，所述培養(yǎng)可以是在1℃、4℃、10℃、20℃、22℃、25℃、37℃、42℃、50℃、55℃或者更高溫度下。在實(shí)施方案中，所述培養(yǎng)在37℃下進(jìn)行。此外，所述培養(yǎng)可以進(jìn)行任何適宜長(zhǎng)的時(shí)間，只要所述時(shí)間，連同所采用的溫度，足以使糖與血小板進(jìn)行接觸即可，并且優(yōu)選至少在某種程度上將糖引入到血小板中。在實(shí)施方案中，所述培養(yǎng)進(jìn)行至少或者約10分鐘、20分鐘、30分鐘、40分鐘、50分鐘、60分鐘、70分鐘、80分鐘、90分鐘、100分鐘、110分鐘、120分鐘、130分鐘、140分鐘、150分鐘、160分鐘、170分鐘、180分鐘或者更長(zhǎng)時(shí)間。在某些實(shí)施方案中，所述培養(yǎng)在20℃～42℃下進(jìn)行100分鐘～150分鐘。例如，在實(shí)施方案中，所述培養(yǎng)在35℃～40℃(例如，37℃)下進(jìn)行110～130(例如，120)分鐘。雖然已發(fā)現(xiàn)在比約37℃更高的溫度下培養(yǎng)是適宜的，但是已經(jīng)確定所述更高溫度是不必要的，并且在實(shí)施方案中，不能提供更優(yōu)良的結(jié)果。此外，雖然現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)大于約2小時(shí)的培養(yǎng)時(shí)間是適宜的，但是已經(jīng)確定所述更長(zhǎng)時(shí)間是不必要的，并且在實(shí)施方案中，不能提供更優(yōu)良的結(jié)果。此外，將時(shí)間從例如4小時(shí)降低至2小時(shí)，這降低了生產(chǎn)凍干血小板所需的時(shí)間，并且對(duì)專(zhuān)業(yè)人員提供優(yōu)于一些本領(lǐng)域可利用的其它方法的優(yōu)點(diǎn)。在期望得到活化血小板的實(shí)施方案中，在海藻糖存在下，可以應(yīng)用接近或者超過(guò)4小時(shí)的培養(yǎng)時(shí)間。然而，為了降低活化量和使結(jié)構(gòu)完整性的損失最小化，短于4小時(shí)如2小時(shí)的培養(yǎng)時(shí)間是更為適宜的。
凍干血小板的方法包括將冷凍保護(hù)劑加入到血小板組合物中，從而形成第二組合物，在此之后將其稱(chēng)為冷凍干燥緩沖液。除了上述組分之外，所述冷凍干燥緩沖液還包括冷凍保護(hù)劑(在此還稱(chēng)為賦形劑)。所述冷凍保護(hù)劑可以為任何在隨后凍結(jié)和融化過(guò)程期間至少在某種程度上保護(hù)血小板的適宜物質(zhì)。多種冷凍保護(hù)劑在本領(lǐng)域中都是已知的，并且這些之中的任何物質(zhì)都可以以有效并且對(duì)血小板無(wú)毒性的量使用。適宜的冷凍保護(hù)劑的實(shí)例包括但不限于牛血清白蛋白、人血清白蛋白、葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、淀粉、羥乙基淀粉(HES)以及聚糖如Ficoll-70和Ficoll-400。將所述冷凍保護(hù)劑以1％～50％(w/v)，如5％～40％、5％～30％、5％～20％和5％～10％的量包括在冷凍干燥緩沖液中，。在實(shí)施方案中，所述冷凍保護(hù)劑以最終濃度為1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或者10％存在于冷凍干燥緩沖液中。在某些實(shí)施方案中，所述冷凍保護(hù)劑以4％-8％的最終濃度存在于冷凍干燥緩沖液中。在實(shí)施方案中，所述賦形劑為血清白蛋白，如牛血清白蛋白或者人血清白蛋白。在其它實(shí)施方案中，所述賦形劑不是來(lái)自于動(dòng)物或者人類(lèi)來(lái)源。在這些實(shí)施方案中，對(duì)賦形劑進(jìn)行選擇，從而降低將雜質(zhì)如傳染性顆粒引入到血小板制劑中的可能性。例如，當(dāng)使用人血清白蛋白時(shí)，白蛋白可能會(huì)受一種或者多種傳染性顆粒(例如，病毒)的污染。同樣地，如果使用牛血清白蛋白，白蛋白就可能含有如果給藥至人類(lèi)患者會(huì)產(chǎn)生有害反應(yīng)的免疫原性顆粒。由此，在某些實(shí)施方案中，優(yōu)選使用不是來(lái)自于生物來(lái)源的賦形劑，如Ficoll-400。冷凍保護(hù)劑向負(fù)載緩沖液中的加入不需要介入離心或者其它分離步驟即可實(shí)現(xiàn)。即，將冷凍保護(hù)劑(和其它任選組分)直接加入到負(fù)載緩沖液中，從而形成適用于直接冷凍干燥的第二緩沖液。這與本領(lǐng)域中的在糖加載和冷凍干燥之間需要分離步驟的現(xiàn)有方案形成對(duì)比。
制備凍干血小板的方法包括冷凍干燥或者凍干第二組合物。在本領(lǐng)域中已知多種用于冷凍干燥真核細(xì)胞和細(xì)胞樣顆粒(包括血小板)的方案，可以使用任何適宜的方案。正如在此使用的，冷凍干燥或者凍干是聯(lián)用低溫和真空的干燥物質(zhì)的過(guò)程。一般所述過(guò)程使用下述步驟凍結(jié)所述物質(zhì)，隨后通過(guò)利用真空升華和/或解吸水和其它液體進(jìn)行干燥。通常所述冷凍干燥將形成水含量低于10％的血小板。在實(shí)施方案中，所述冷凍干燥形成水含量低于5％，如4％、3％、2％、1％或者更低的血小板。在本領(lǐng)域中已知，通常達(dá)到的水含量越低，得到的凍干血小板就越穩(wěn)定(例如，貯存壽命更長(zhǎng))。由此，在實(shí)施方案中，優(yōu)選將水含量降低至盡可能低的量。優(yōu)選將水含量降低至2％或者更低，其是使冷凍干燥后加熱步驟(使用時(shí))的有害作用最小化和促進(jìn)長(zhǎng)期穩(wěn)定貯存所述凍干血小板的量。
一種適宜的冷凍干燥方案的實(shí)例包括，在-45℃下凍結(jié)所述冷凍干燥組合物2小時(shí)，在約100mTorr的真空下，在-40℃下將所述凍結(jié)組合物保持150分鐘并且以10℃的增量在六小時(shí)時(shí)間內(nèi)將溫度緩慢升高至25℃(在大約100mTorr的真空中)。另一種適宜的冷凍干燥方案的實(shí)例包括在-45℃下凍結(jié)所述冷凍干燥組合物約4.5小時(shí)，在約100mTorr的真空下，在-45℃至-40℃下將所述已凍結(jié)組合物保持一小時(shí)，并且在100mTorr真空下，以10℃的增量在24小時(shí)的時(shí)間內(nèi)將溫度緩慢升高至30℃。其它具體方案在下表3中給出。
在一些實(shí)施方案中，制備凍干血小板的方法進(jìn)一步包括加熱所述冷凍干燥血小板?，F(xiàn)已令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，冷凍干燥之后的熱處理步驟提高了凍干血小板的穩(wěn)定性，并且提供通過(guò)再水化的高度活化的血小板。所述加熱可以在25℃以上的任何溫度下進(jìn)行。優(yōu)選所述熱處理在高于40℃的溫度下，如在高于50℃的溫度下、高于60℃的溫度下、高于70℃的溫度下或者高于80℃的溫度下進(jìn)行。在具體實(shí)施方案中，加熱在70℃～85℃，如75℃、80℃、85℃或者75℃～85℃內(nèi)的任何其它具體溫度下進(jìn)行。結(jié)合要進(jìn)行加熱的時(shí)間對(duì)所述加熱溫度進(jìn)行選擇。雖然可以使用任何適宜的時(shí)間，但是一般將冷凍干燥血小板加熱至少1小時(shí)，但不超過(guò)36小時(shí)。由此，在實(shí)施方案中，加熱進(jìn)行至少2小時(shí)、至少6小時(shí)、至少12小時(shí)、至少18小時(shí)、至少20小時(shí)、至少24小時(shí)或者至少30小時(shí)。例如，可以將冷凍干燥血小板加熱18小時(shí)、19小時(shí)、20小時(shí)、21小時(shí)、22小時(shí)、23小時(shí)、24小時(shí)、25小時(shí)、26小時(shí)、27小時(shí)、28小時(shí)、29小時(shí)或者30小時(shí)。非限制性的示例性組合物包括在高于30℃的溫度下將凍干血小板加熱至少30分鐘；在高于50℃的溫度下將凍干血小板加熱至少10小時(shí)；在高于75℃的溫度下將凍干血小板加熱至少18小時(shí)；和在80℃下將凍干血小板加熱24小時(shí)。雖然不是必需，但是優(yōu)選對(duì)在密封容器如封蓋的管形瓶中的冷凍干燥血小板進(jìn)行加熱。此外，雖然不是必需，但是優(yōu)選在加熱之前使所述密封容器進(jìn)行真空處理。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，特別是在冷凍保護(hù)劑如白蛋白或者Ficoll-400的存在下的熱處理步驟提高了凍干血小板的穩(wěn)定性和貯存壽命。實(shí)際上，同未進(jìn)行熱處理步驟的那些冷凍保護(hù)劑相比，利用血清白蛋白或者Ficoll-400和冷凍干燥后熱處理步驟的特定組合已經(jīng)得到了有利的結(jié)果。例如，通過(guò)應(yīng)用濃度為大約6％的Ficoll-400和在約80℃下的冷凍干燥后熱處理步驟約24小時(shí)的組合，已經(jīng)得到了有利結(jié)果。
在實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明制備凍干血小板的方法在鹽緩沖液中培養(yǎng)血小板和冷凍干燥之間不需要離心步驟。相反，所述冷凍干燥組合物可以由鹽緩沖液組合物直接產(chǎn)生，和凍干血小板可以由冷凍干燥組合物直接產(chǎn)生。這與當(dāng)前應(yīng)用的方法形成對(duì)比，當(dāng)前應(yīng)用的方法中使用兩種不同的緩沖液制備冷凍干燥血小板(例如，“負(fù)載緩沖液”和“冷凍干燥緩沖液”)，和其中在暴露于第二緩沖液之前將血小板從第一緩沖液中除去(并且一般進(jìn)行洗滌)。
在制備凍干血小板的方法的實(shí)施方案中，所述方法包括減少HLA步驟。該步驟是任選的和可以用于生產(chǎn)低HLA含量的血小板。已經(jīng)報(bào)道，低HLA含量的血小板對(duì)于對(duì)血小板治療具有強(qiáng)免疫原性反應(yīng)的對(duì)象的體內(nèi)治療學(xué)應(yīng)用是有益處的。在其中包括減少HLA的步驟的實(shí)施方案中，用于該減少步驟的緩沖液可以為任何適宜的緩沖液，如pH值為4的無(wú)陽(yáng)離子HEPES-Tyrodes緩沖液(95mM HEPES，1M NaCl，48mM KCl，120mM NaHCO3)和10mM EGTA。為了實(shí)現(xiàn)HLA的減少，可以在緩沖液中將血小板培養(yǎng)適宜的時(shí)間，如兩小時(shí)。雖然所述HLA減少步驟可以在該過(guò)程中的任何時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行，但是優(yōu)選其在糖負(fù)載步驟之前進(jìn)行。由此，在實(shí)施方案中，HLA-缺失的血小板可以通過(guò)以下方法得到在糖負(fù)載之前，在適當(dāng)?shù)木彌_液中培養(yǎng)，然后洗滌和在負(fù)載緩沖液中培養(yǎng)，如包括含有100mM海藻糖和1％(v/v)乙醇的pH值為6.8的無(wú)陽(yáng)離子HEPES-Tyrodes緩沖液的緩沖液。
此外，所述方法可以任選包括再水化所述凍干血小板。當(dāng)包括所述再水化步驟時(shí)，可以將該方法認(rèn)為是制備血小板的方法或者認(rèn)為是制備再水化凍干血小板(或者含有它們的組合物)的單獨(dú)的和不同的方法部分。更具體而言，因?yàn)楸景l(fā)明凍干血小板可以以穩(wěn)定形式長(zhǎng)期貯存，因此所述再水化方法可以在制備凍干血小板的方法數(shù)月或者數(shù)年后實(shí)踐，并且由此可以將其認(rèn)為是不同方法。所述再水化可以通過(guò)任何適宜的技術(shù)，如本領(lǐng)域通常應(yīng)用的那些進(jìn)行。一般地，所述再水化包括，將凍干血小板暴露于足以以部分或者完全再水化血小板的量的水或者含水溶液，從而提供正常的形狀和流體含量和/或正常功能。適宜的再水化溶液在本領(lǐng)域中是已知的，包括但不限于磷酸鹽緩沖的含水組合物(例如，PBS)。本文中提供某些具體的再水化組合物。在實(shí)施方案中，所述再水化緩沖液可以具有與冷凍干燥緩沖液相似的配方，從而可以使得水的任何對(duì)凍干血小板的初始有害作用最小化。示例性的再水化緩沖液可以是，但不限于全血、血漿、血清和含牛血清白蛋白、人血清白蛋白、葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、淀粉、羥乙基淀粉(HES)和聚糖如Ficoll-70和Ficoll-400的含水溶液。它們可以以1％～50％(w/v)，如5％～40％、5％～30％、5％～20％和5％～10％的量加入到所述含水再水化緩沖液中。在實(shí)施方案中，它們以1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或者10％的最終濃度存在于再水化緩沖液中。在某些實(shí)施方案中，它們以4％-8％的最終濃度存在于所述再水化緩沖液中。
根據(jù)再水化方法，使所述凍干血小板暴露于含水溶液。所述含水液體可以為水，或者它可以為含有水和一種或多種其它物質(zhì)如鹽或者緩沖液的液體。一般所述液體可以為含水緩沖液如PBS、含有另一種生物學(xué)上相容的緩沖液(例如，HEPES)的含水組合物或者全血、血漿、血清或者任何滲透平衡的生物學(xué)緩沖液。在實(shí)施方案中，所述再水化緩沖液含有高分子量聚合物，如聚糖。這些聚合物中包括Ficoll-400。在實(shí)施方案中，所述再水化緩沖液還可以含有牛血清白蛋白、人血清白蛋白、葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、淀粉和羥乙基淀粉(HES)。優(yōu)選所述再水化緩沖液含有促使血小板完整性得以保持的組分，如提供適當(dāng)滲透壓的那些。
將血小板暴露于足量的液體足夠長(zhǎng)的時(shí)間，從而再水化所述血小板，例如使得它們恢復(fù)正常形狀和流體含量。所述液體的量和持續(xù)時(shí)間將根據(jù)期望的血小板的最終濃度、緩沖液和血小板進(jìn)行再水化的溫度而變化。在實(shí)施方案中，含水液體的量為干燥血小板體積的兩倍。雖然可以應(yīng)用任何溫度，但是通常在周?chē)覝叵?例如，20℃～25℃)再水化血小板最為便利。所述再水化時(shí)間可以為任何適當(dāng)?shù)臅r(shí)間。由此，它的范圍可以從10秒至超過(guò)一小時(shí)。例如，它可以為約一分鐘或者更短、約五分鐘或者更短、約十分鐘或者更短、約三十分鐘或者更短和約六十分鐘或者更短。在實(shí)施方案中，所述再水化可以通過(guò)以下方式得到完成物理再懸浮所述血小板(例如，通過(guò)渦旋或者移液)10～30秒，然后在室溫下將所述血小板靜置5分鐘。
此外，再水化可以利用任何已知的通用方案進(jìn)行。由此，所述血小板可以用再水化液體直接再水化或者可以間接或被動(dòng)地再水化。直接方法可以包括，直接對(duì)所述凍干血小板施用一定體積的液體，如通過(guò)將液體加入到血小板丸粒中，和使得所述液體接觸血小板足夠長(zhǎng)時(shí)間和再水化它們。直接再水化還可以包括在與液體接觸的同時(shí)將血小板物理分散一次或者多次，如通過(guò)溫和地渦旋或者移液。在直接再水化的實(shí)施方案中，將再水化緩沖液溫和地加入到凍干血小板中和使得它們保持靜態(tài)接觸10～60秒，如保持30秒，然后將血小板溫和渦旋幾秒，從而將它們分配在液體中，然后在室溫下將它們靜置1～10分鐘。如果期望，在再水化期間可以通過(guò)渦旋或者移液將所述血小板溫和地?cái)嚢枰淮位蛘叨啻?。在其它?shí)施方案中，通過(guò)以下方式對(duì)血小板進(jìn)行再水化直接加入再水化緩沖液，然后立即進(jìn)行溫和移液直至觀察到完全分散為止。然后，可以使上述血小板保持靜置1～10分鐘以上，可以進(jìn)行或者不進(jìn)行一次或者多次短期溫和攪拌。在其它實(shí)施方案中，可以使用被動(dòng)再水化。被動(dòng)再水化的實(shí)例包括，通過(guò)暴露于再水化緩沖液蒸汽然后將其暴露于再水化緩沖液體進(jìn)行再水化。專(zhuān)業(yè)人員熟知多種再水化凍干血小板的方法，并可以應(yīng)用任何適宜的方法。
從以上公開(kāi)內(nèi)容可以明顯看出，本發(fā)明包括再水化血小板和制備它們的方法。當(dāng)被引入到需要血液凝固功能的對(duì)象時(shí)，本發(fā)明的再水化血小板可以具有進(jìn)行正常血液凝固所需要的全部血小板特性。然而它們也可以缺少一種或者多種可能有利于進(jìn)行診斷測(cè)定的特征。由此，所述再水化血小板可以與新鮮血小板具有相同的大小。它們還可以與新鮮血小板具有相同的通常圓盤(pán)形狀和相同的體積。所述再水化血小板表面上分子的補(bǔ)體可以與新鮮血小板的相同，因?yàn)榭梢跃哂杏蛇@些分子提供的功能。因此，在體外條件下和當(dāng)再引入到體內(nèi)環(huán)境時(shí)，所述再水化血小板通常都可以參與凝固過(guò)程。
取決于用于生產(chǎn)它們的方法，本發(fā)明的再水化血小板制劑可以含有很少或者許多微粒。通常，本領(lǐng)域已知的凍干工藝形成重構(gòu)時(shí)提供充分血小板功能的凍干血小板。然而，它們一般會(huì)導(dǎo)致大量微粒存在，這顯然是由于在凍干和/或再水化工藝期間的許多血小板的溶胞作用而產(chǎn)生。與本領(lǐng)域凍干方法不同，確信本發(fā)明方法提供具有相對(duì)少量微粒的重構(gòu)血小板制劑。這些實(shí)施方案中完整的、適當(dāng)尺寸的血小板與微粒的高比例對(duì)于將血小板制劑用于治療學(xué)方案中是有利的。此外，因?yàn)楸景l(fā)明提供如何控制血小板和微粒的相對(duì)量的認(rèn)識(shí)，由此可以產(chǎn)生具有期望量的各種物質(zhì)的組合物。
在另一方面中，本發(fā)明提供制備組合物的方法。通常，本發(fā)明該方面的方法包括獲得血小板和凍干它們。所述方法可以進(jìn)一步包括再水化所述血小板和/或在凍干或者再水化之前或者之后，將一種或者多種其它組分加入到所述血小板中。
在某些實(shí)施方案中，制備組合物的方法包括，提供含有血小板和/或微粒的材料，全部或者基本上全部除去可能存在于所述材料中的紅血球和白血球，將所得無(wú)細(xì)胞材料的pH值調(diào)節(jié)至酸性pH值，將血小板、微?；蛘叨吲c存在于所述材料中的所有或者基本上所有的其它組分分離，將血小板、微?；蛘叨咴賾腋∮谝后w中，和冷凍干燥。在實(shí)施方案中，在冷凍干燥之前，將一種或者多種一般包含在冷凍干燥過(guò)程中的試劑如糖加入到再懸浮的血小板和/或微粒中。示例性的糖包括但不限于單糖、二糖(例如，蔗糖、乳糖、麥芽糖、異麥芽糖、纖維二糖和海藻糖)或者多糖。在實(shí)施方案中，所述方法包括利用任何已知的適用于對(duì)冷凍干燥材料進(jìn)行滅菌的工藝，包括但不限于輻照，對(duì)所述冷凍干燥材料進(jìn)行滅菌。
在制備本發(fā)明組合物的基本方法中，將血小板懸浮在含有海藻糖的緩沖液中，從而得到約1×109/ml的濃度。在環(huán)境溫度下(約20℃～25℃)將所述組合物培養(yǎng)兩小時(shí)，在此時(shí)間內(nèi)將5％(最終濃度)牛血清白蛋白或者任何其它膨脹蛋白質(zhì)(如酪蛋白)或者其它冷凍保護(hù)劑加入，并且使用標(biāo)準(zhǔn)冷凍干燥方案對(duì)血小板進(jìn)行冷凍干燥。另外地，在另一基本方法中，將6.0％的可以替換蛋白質(zhì)作為膨脹試劑的碳水化合物如Ficoll-400或者任何其它膨脹碳水化合物(如水凝膠)加入(最終濃度)，并且利用標(biāo)準(zhǔn)冷凍干燥方案對(duì)血小板進(jìn)行冷凍干燥。
根據(jù)上面的討論，所述血小板可以得自于任何適宜的來(lái)源、可以為有效期內(nèi)的或者過(guò)期的并且可以為自體或者異體的血小板(相對(duì)于在本發(fā)明方法中與它們進(jìn)行混合的血小板)。因此，它們可以來(lái)自于隨機(jī)供血者單位或者單采血液成分術(shù)(aphereisis)單位。血小板的量可以為任何適宜的量，如以上所述的那些。在實(shí)施方案中，所述血小板得自于一個(gè)或者多個(gè)獻(xiàn)血者并且存在于全血中。然而，優(yōu)選從一種或者多種其它血液組分中將所述血小板純化至至少某種程度。對(duì)于凍干血小板尤其如此。從其它血液組分中純化或者分離血小板的方法對(duì)于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員是熟知的，由此在此不必詳述。在示例性實(shí)施方案中，通過(guò)包括離心的方法從其它血液組分中對(duì)血小板進(jìn)行純化。
獲得步驟可以包括任何導(dǎo)致血小板從供血者身體中除去和將血小板轉(zhuǎn)移至接受容器的行為。用于實(shí)現(xiàn)此結(jié)果的多種工藝在本領(lǐng)域中都是已知的，本發(fā)明包括任何方法或者方法的組合。在某些實(shí)施方案中，獲得包括從供血者靜脈中抽取血液和將抽取的血液置入管中，如由塑料或者玻璃制成的管。該步驟相當(dāng)于上述的“提供”步驟，它們各自可以與另一種互換使用。
凍干可以通過(guò)任何適用于凍干真核細(xì)胞的工藝實(shí)現(xiàn)。在此詳述了示例性的工藝。通常，凍干包括，在施加真空的同時(shí)將細(xì)胞暴露于低于0℃的溫度，并使其升華的過(guò)程，從而將原來(lái)存在于血小板和它們環(huán)境中的水全部或者基本上全部除去。所得血小板為固體(干燥)形式，并且可以直接或者在再水化之后用于以下本發(fā)明方法中。
制備組合物的方法可以進(jìn)一步包括再水化(或者重構(gòu))所述凍干血小板。再水化可以包括，以足以恢復(fù)血小板的至少一種物理或者生物學(xué)性能的量將水或者含水溶液加入到凍干血小板中。所述再水化可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何適宜方法，包括但不限于，直接將液體水加入到血小板中并緩慢進(jìn)行蒸汽重構(gòu)。所述含水溶液可以以它們存在于組合物中的量含有任何與血小板功能相容的物質(zhì)。
制備本發(fā)明組合物的方法可以進(jìn)一步包括合并凍干血小板和其它血小板，從而形成混合物。所述其它血小板可以為凍干血小板或者可以為存在于液體組合物中的血小板，如血液或者血液組分(例如，血漿)。所述混合物一般，但非永遠(yuǎn)，在其中可以檢測(cè)凝結(jié)的反應(yīng)容器中制備。即，雖然可以通過(guò)將凍干血小板注射入體內(nèi)制備混合物，但是一般在體外將所述凍干血小板與其它血小板合并，如在適于檢測(cè)血塊的反應(yīng)容器中。
該方法可以進(jìn)一步包括加入一種或者多種具有生物活性的物質(zhì)。例如，該方法可以包括加入含有凍干血小板可能具有抗血小板活性的一種或者多種藥物或者其它物質(zhì)的組合物。示例性的具有抗血小板活性的藥物和物質(zhì)如上所述。由此，該方法可以進(jìn)一步包括加入一種或者多種具有酶活性的生物分子。例如，該方法可以包括加入含有凍干血小板、一種或者多種凝血蛋白或者其它可能減弱血小板活性的物質(zhì)的組合物。
該方法可以進(jìn)一步包括將一種或者多種熒光分子加入到凍干血小板中。例如，該方法可以包括加入含有凍干血小板、可以增強(qiáng)血小板活性信號(hào)的一種或者多種熒光素或者其它熒光物質(zhì)的組合物。
為了制備凍干和重構(gòu)的血小板和含有它們的組合物，優(yōu)選初始血小板來(lái)自于有效期內(nèi)的來(lái)源。然而，在有效期內(nèi)血小板供應(yīng)受到限制的情形中，可以使用過(guò)期血小板，這是因?yàn)榭梢詫?duì)利用本發(fā)明產(chǎn)生的血小板進(jìn)行不損害血小板功能的減少病原體和減少HLA步驟。為了提供最有利的結(jié)果，過(guò)期血小板應(yīng)當(dāng)在過(guò)期3天內(nèi)使用(即，截止至從供血者中除去后9天)。也就是說(shuō)，如果血小板在第五天到期，那么利用本發(fā)明的過(guò)程可以使用在第六天、第七天或者第八天的過(guò)期血小板。
應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明包括用于生產(chǎn)血小板、微?；蛘叨叩膯我环椒ê陀糜谏a(chǎn)組合物的單一方法的實(shí)踐?？梢詫?duì)各種方法進(jìn)行調(diào)整，從而獲得血小板與微粒的期望比例。還應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明包括實(shí)踐生產(chǎn)凍干血小板的兩種或者更多種不同方法，各種方法都導(dǎo)致血小板與微粒的不同比例，然后以期望的比例合并兩種所得組合物，從而獲得血小板與微粒的期望比例。
基于在此公開(kāi)的參數(shù)，可以進(jìn)行所述基本方法的多種改進(jìn)，從而提高與微粒相比的血小板的相對(duì)量或者提高與血小板相比的微粒的相對(duì)量。已發(fā)現(xiàn)，因?yàn)榻M合物的活化水平相對(duì)較低，因此升高量的完整血小板提高了組合物對(duì)于體內(nèi)輸注和注射應(yīng)用的適用性，所述組合物顯示了更多的正常、新鮮或者有效期內(nèi)血小板的特性。與此相比，在期望凝固增強(qiáng)物質(zhì)的體內(nèi)特定位點(diǎn)給藥時(shí)，含有升高量微粒的組合物愈加地更為理想。據(jù)信，與通過(guò)完整血小板提供這些物質(zhì)可能需要花費(fèi)長(zhǎng)時(shí)間來(lái)釋放它們相比，提高組合物中微粒的相對(duì)數(shù)目加快了凝固時(shí)間，這是因?yàn)樗⒓催f送增加量的凝固促進(jìn)物質(zhì)。根據(jù)診斷測(cè)定或者研究測(cè)定的目的，本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員可以選擇適當(dāng)?shù)闹苽鋬龈裳“宓姆椒?，從而增加或者限制微粒在含有凍干血小板的組合物中或者在含有再水化凍干血小板的組合物中的相對(duì)量。
本發(fā)明方法提供優(yōu)于制備凍干血小板和含有它們的組合物的現(xiàn)有方法的優(yōu)點(diǎn)。一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是省去血小板活化抑制劑的能力。因?yàn)橥F(xiàn)有技術(shù)方法中應(yīng)用的時(shí)間相比，培養(yǎng)可以進(jìn)行較短的時(shí)間，因此沒(méi)有必要對(duì)血小板進(jìn)行活化，或者如果進(jìn)行活化，僅僅將其活化至相對(duì)較低的水平。由此，在本發(fā)明方法的實(shí)施方案中，在用糖負(fù)載它們的同時(shí)，不必加入血小板活化抑制劑抑制血小板的活化。這不僅降低了該方法的成本和復(fù)雜性，而且消除了使用前的后一段時(shí)間如在冷凍干燥之前或者再水化之后除去抑制劑的需要。
根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案制備凍干血小板的方法提供具有涉及多種血小板功能如粘附在皮下基體上從而引發(fā)和參與凝固過(guò)程完整的表面受體的血小板，如糖蛋白IIb-IIIa和糖蛋白Ib。根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的制備凍干血小板的方法還提供具有完整胞內(nèi)細(xì)胞器的血小板，如涉及多種血小板功能如胞內(nèi)信號(hào)、促進(jìn)血管收縮和釋放進(jìn)一步促進(jìn)血小板活化和聚集在創(chuàng)傷位置的分子的密集和α顆粒。因此，該方法可以對(duì)其它無(wú)核真核細(xì)胞或者細(xì)胞片斷(包括但不限于紅細(xì)胞)實(shí)施。在此使用的術(shù)語(yǔ)“血小板”是指所述其它無(wú)核的真核細(xì)胞和細(xì)胞片斷。同樣地，該方法可以用于制備穩(wěn)定的大分子或者大分子配合物，如但不限于蛋白質(zhì)、核酸和病毒等等。事實(shí)上，因?yàn)楸景l(fā)明方法提供可以在室溫和不需要冷凍或者凍結(jié)的條件下以穩(wěn)定形式長(zhǎng)期得到貯存的穩(wěn)定產(chǎn)品，因此可以對(duì)多種生物學(xué)或者化學(xué)物質(zhì)，包括明確記載在本文中的那些和其它類(lèi)似物質(zhì)實(shí)踐該方法，。
例如，在實(shí)施方案中，該方法可以包括制備含有微粒的組合物。該方法可以包括用血小板激動(dòng)劑(如TRAP、膠原、凝血酶或者離子載體)預(yù)活化血小板，然后在37℃下將血小板培養(yǎng)約30分鐘。在負(fù)載和冷凍干燥之前如此活化血小板，這提高了微粒在凍干組合物中的相對(duì)百分比。一種用于產(chǎn)生具有高相對(duì)比例微粒(在此情形中，約60～90％的微粒)的組合物的具體例證方案包括將PRP收集入管中；在1000×g下離心15分鐘；傾析出上清液；將丸粒懸浮在10ml含有10mM EDTA的pH6.5的PBS中，在pH6.5的PBSE中洗滌；將丸粒再懸浮于PMP緩沖液(137mM NaCl，4mM KCl，0.5mM MgCl2，0.5mM Na2HPO4，5.5mM葡萄糖，10mM HEPES，2mM CaCl2)中，從而獲得2.5×109個(gè)血小板/毫升的血小板濃縮物；加入15μm SFLLRN并且在37℃下培養(yǎng)10分鐘；在750×g下離心剩余丸粒20分鐘；除去上清液和在4℃下在10,000×g下將其離心30分鐘；除去上清液和將PMP再懸浮于等體積的150mM海藻糖緩沖液(0.0095M HEPES，0.05M NaCl，0.0048M KCl，0.012M NaHCO3，0.15M海藻糖，0.005M葡萄糖，pH值6.8)中；加入1/4體積的30％ficoll，將液體等分為0.5ml部分；和進(jìn)行冷凍干燥。
另一方面，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案制備凍干血小板的方法可提供含血小板組合物，同微粒和其它由血小板溶胞得到的物質(zhì)相比，所述組合物具有高含量的完整血小板。由此，類(lèi)似于當(dāng)前依賴于使用DMSO或者甲醛從而生產(chǎn)冷凍干燥的或者另外干燥的血小板制劑的工藝，本發(fā)明可以提供具有高含量完整血小板的組合物。然而，與使用DMSO或者甲醛的方案不同，在使用之前不必洗滌本發(fā)明的重構(gòu)血小板。
在通過(guò)單一細(xì)胞計(jì)數(shù)的聚集百分比進(jìn)行測(cè)定的聚集功能測(cè)定中，發(fā)現(xiàn)由本發(fā)明實(shí)施方案(參見(jiàn)以下實(shí)施例1和2)制備的重構(gòu)血小板具有有利的性能，如表1所示。
表1重構(gòu)血小板的聚集特性

當(dāng)對(duì)新近制備的凍干血小板和已經(jīng)在室溫下貯存6個(gè)月的凍干血小板進(jìn)行重構(gòu)和測(cè)定某些特定時(shí)，發(fā)現(xiàn)它們均具有以下特性粘附在內(nèi)皮下膜基體蛋白質(zhì)上；響應(yīng)于多種激動(dòng)劑的聚集；保持主要受體；與自體血小板功能一致；促凝血活性；保持總體尺寸和粒度；在全血和血漿模型中促進(jìn)體外凝結(jié)；對(duì)加熱和γ照射處理保持功能活性；和穩(wěn)定性大于90％(即時(shí)重構(gòu))。由此，可以預(yù)期已經(jīng)在室溫下貯存6個(gè)月的凍干血小板以與新近制備的凍干血小板相同的方式發(fā)揮作用。
至于表面標(biāo)志(surface marker)，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的重構(gòu)凍干血小板具有表2所示的表面標(biāo)志水平。如果將HLA降低步驟并入制備血小板的方法中，可以將HLA的水平降低至5％(100％)。同利用通過(guò)本領(lǐng)域其它已知方法制備的重構(gòu)凍干血小板獲得的值相比，這些數(shù)值是有利的。表2中示出的結(jié)果是基于通過(guò)本發(fā)明的方法(參見(jiàn)以下實(shí)施例1和2)制備的重構(gòu)凍干血小板和新鮮血小板。
表2選擇的表面標(biāo)志在由多個(gè)隨機(jī)供血者單位制備的凍干血小板上的表達(dá)

在不同的實(shí)施方案中，所述重構(gòu)血小板可以具有不同的活化水平。取決于多種因素，包括溫度和糖負(fù)載的持續(xù)時(shí)間、凍干后的血小板含濕量和是否包括冷凍干燥后加熱步驟，已經(jīng)證實(shí)本發(fā)明的血小板表現(xiàn)出了低活化水平至高活化水平。通過(guò)實(shí)施本發(fā)明某些實(shí)施方案的步驟，可以獲得通過(guò)重構(gòu)未得到完全活化的凍干血小板。這是一種不同于其它通過(guò)本領(lǐng)域已知凍干工藝提供的血小板制劑的性能。由此，在實(shí)施方案中，通過(guò)視覺(jué)觀察，本發(fā)明的重構(gòu)血小板顯示了渦旋血小板。通過(guò)暴露于激動(dòng)劑，如花生四烯酸、膠原、腎上腺素、TRAP肽和瑞斯托菌素，上述渦旋特性消失。此外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，通過(guò)暴露于激動(dòng)劑重構(gòu)血小板聚集成了可以目測(cè)檢測(cè)到的凝塊。另外，保持高的表面標(biāo)志GPIb水平(～60-100％)。
活化血小板停止渦旋并且與蛋白膜聯(lián)蛋白V結(jié)合。活化血小板的表面表達(dá)其它蛋白質(zhì)(如P-選擇蛋白)，并且將表面蛋白GPIb的水平降低至初始水平的約10％。在本發(fā)明的凍干血小板上，僅僅檢測(cè)到P-選擇蛋白的表達(dá)和與膜聯(lián)蛋白V的結(jié)合。由此，基于這些簡(jiǎn)要說(shuō)明，表2中試驗(yàn)的重構(gòu)凍干血小板保持了大多數(shù)未活化特性和一些通常在正常血小板中發(fā)現(xiàn)的活化特性。
由此，重要的是認(rèn)可本發(fā)明提供以干燥形式長(zhǎng)期保存和存儲(chǔ)血小板的方法，其中所述血小板易于貯存和運(yùn)輸并且便于使用。同樣重要的是認(rèn)可本發(fā)明提供穩(wěn)定血小板和通過(guò)用適宜的緩沖液重構(gòu)提供功能化血小板的方案。應(yīng)當(dāng)理解，在此公開(kāi)的方法還給予具有與新鮮血小板類(lèi)似的生物學(xué)能力的無(wú)核真核細(xì)胞。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明方法構(gòu)成了保持無(wú)核真核細(xì)胞和細(xì)胞片斷處于干燥狀態(tài)同時(shí)通過(guò)重構(gòu)保持它們的生物學(xué)功能的新方法。同樣地，本發(fā)明方法可以用于凍干低復(fù)雜性的生物材料，如脂質(zhì)、脂囊泡、病毒顆粒、病毒衣殼、蛋白質(zhì)和核酸。
本發(fā)明的凍干血小板和再水化凍干血小板適用于多種應(yīng)用。事實(shí)上，因?yàn)樗鼈兛梢跃哂行迈r或者有效期內(nèi)血小板的特性，因此它們可以用于新鮮或者有效期內(nèi)血小板可以用于的任何治療學(xué)目的。例如，可以將本發(fā)明的再水化血小板用作治療大量出血如在受傷對(duì)象或者進(jìn)行手術(shù)的對(duì)象中出現(xiàn)的大量出血的血液替代品或者補(bǔ)充品。此外，可以將所述凍干血小板作為傷口愈合繃帶的一部分(例如，約1×108-1×109個(gè)血小板/cm3)來(lái)包含，從而對(duì)傷口位置提供血小板功能。它們同樣可以用于治療與血小板功能降低或者消失相關(guān)的病癥。此外，因?yàn)樗鲅“蹇梢跃哂行迈r或者有效期內(nèi)血小板的特性，因此可以將它們用于診斷測(cè)定，從而確定對(duì)象血液凝固系統(tǒng)的多種功能。此外，可以將它們用于研究設(shè)置中，從而闡明血小板的特性、研究凝固級(jí)聯(lián)和鑒定涉及血液止血和其它生物學(xué)功能的細(xì)胞組分。
在另一方面，本發(fā)明提供試劑盒。通常，本發(fā)明試劑盒包含本發(fā)明的凍干血小板和/或重構(gòu)血小板。鑒于本發(fā)明凍干血小板的儲(chǔ)存穩(wěn)定性，優(yōu)選試劑盒含有凍干血小板。試劑盒一般含有足量的血小板以根據(jù)本發(fā)明的方法實(shí)施至少一種實(shí)施方案。
以其最簡(jiǎn)單形式，根據(jù)本發(fā)明的試劑盒是含有根據(jù)本發(fā)明的凍干血小板、重構(gòu)凍干血小板或者至少一種組合物的容器。由此，在實(shí)施方案中，本發(fā)明試劑盒包括含有凍干血小板的容器。在實(shí)施方案中，所述試劑盒包括含有重構(gòu)凍干血小板的容器。在實(shí)施方案中，所述試劑盒包括含有本發(fā)明組合物的容器，所述組合物中含有凍干血小板或者重構(gòu)凍干血小板。在實(shí)施方案中，所述試劑盒含有人類(lèi)凍干血小板。
在試劑盒的某些構(gòu)造中，所述試劑盒包括多個(gè)容器，其各個(gè)容器可以含有凍干血小板、重構(gòu)凍干血小板、含有凍干血小板或者重構(gòu)凍干血小板的組合物、或者可以用于進(jìn)行本發(fā)明方法的一種或者多種實(shí)施方案的其它物質(zhì)。在其中試劑盒包括其它組分或者物質(zhì)的實(shí)施方案中，它們可以與血小板和/或組合物包含在相同容器中或者一種或多種不同容器中。在含有多個(gè)容器或者一個(gè)容器和其它組分的試劑盒中，所述容器和組分據(jù)稱(chēng)是位于試劑盒中的包裝組合中。在存在多個(gè)容器的情形中，各個(gè)容器可以含有足以用于本發(fā)明單個(gè)方法實(shí)施的血小板，如含有用于治療的單個(gè)劑量。另外，各個(gè)容器可以含有足以用于實(shí)施所述方法兩次或者更多次的血小板，如含有兩個(gè)或者更多個(gè)劑量。不同容器可以含有不同量的本發(fā)明血小板和/或組合物。
在實(shí)施方案中，所述試劑盒包括其它組分，如純化的凝結(jié)級(jí)聯(lián)組分等等。所述試劑盒可以進(jìn)一步含有一些或者全部制備和給藥本發(fā)明組合物所需的供應(yīng)品和材料，如大孔針和注射器、泵、無(wú)菌布和用于對(duì)注射位置進(jìn)行滅菌的溶液等等。在實(shí)施方案中，所述試劑盒包括一種或者多種液體，從而對(duì)試劑盒組合物進(jìn)行水化。所述液體可以為任何適宜的液體，但是一般為水基液體，如水、鹽水或者二者的混合物。優(yōu)選所述液體是無(wú)菌的。由此，所述試劑盒可以是診斷試劑盒、用于凝結(jié)蛋白質(zhì)或者血小板的血液凝固監(jiān)控試劑盒或者藥物治療監(jiān)控試劑盒。
因此，可以對(duì)試劑盒進(jìn)行構(gòu)造，從而提供用于體內(nèi)治療、用于體外診斷或者用于體外或體內(nèi)研究的凍干血小板或者重構(gòu)凍干血小板(或者包含它們的組合物)。由此，與所述血小板的水合狀態(tài)無(wú)關(guān)，在實(shí)施方案中，所述試劑盒包括多個(gè)容器，其各個(gè)容器可以含有用于進(jìn)行一種或者多種診斷方案、一種或者多種治療方案、或者一種或者多種研究試驗(yàn)的血小板或者其它物質(zhì)。在其它實(shí)施方案中，所述試劑盒包括可以包含在相同容器中或者包含在一個(gè)或多個(gè)不同的容器中的另外的組分。通常，所述試劑盒將包括一些或者所有進(jìn)行一種或者多種對(duì)照反應(yīng)的供應(yīng)品和試劑，從而確保試劑盒運(yùn)行正確和從而提供可以與試驗(yàn)樣品進(jìn)行對(duì)比的基線結(jié)果。
同其容納的組合物一樣，以其多種形式，本發(fā)明試劑盒可以含有用于血小板研究的物質(zhì)，如體外研究以檢測(cè)和/或研究多種血小板的特性和功能；校準(zhǔn)儀器；分離和純化血小板細(xì)胞漿分子(cytolasmic molecules)或者血小板顆粒(α和致密顆粒)；研究血小板和微粒自身之間以及與血液凝固系統(tǒng)的其它組分之間的相互作用；研究抗血小板藥物和血小板或者凝結(jié)抑制劑；校準(zhǔn)血小板大??；校準(zhǔn)不同梯度的分離工藝；作為研究工具以測(cè)定血小板受體和它們的配體的相互作用；研究表面介導(dǎo)的酶促反應(yīng)，包括但不限于tenase復(fù)合物、凝血酶原酶復(fù)合物等等；研究血小板凝聚，不論是機(jī)械誘發(fā)還是生物化學(xué)誘發(fā)；研究血小板生物學(xué)和存儲(chǔ)；分離血小板相關(guān)的表面分子；確定適用于個(gè)體的血小板抑制劑；研究神經(jīng)心里藥理學(xué)；研究炎癥、凝結(jié)、細(xì)胞修復(fù)和再生；研究血小板治療中的新抗原性；表征促進(jìn)對(duì)血細(xì)胞產(chǎn)生免疫響應(yīng)的非MHC抗原；研究血液攜帶病原體(blood-borne pathogens)的影響；映象正常和受損傷的血管；和研究血管形成、動(dòng)脈粥樣硬化癥、血栓形成和心血管疾病。
所述容器可以為任何適用于容納本發(fā)明血小板或者組合物的材料，如管形瓶或者安瓿。它可以由任何適宜的材料制造，如玻璃、塑料、金屬或者紙張或者紙制品。在實(shí)施方案中，它為可以例如通過(guò)塞子、塞子和卷邊封蓋(crimp seal)或者塑料帽或者金屬帽如螺帽來(lái)密封的玻璃或者塑料安瓿或者管形瓶。通常，所述容器和密封由可以通過(guò)加熱(干式加熱或者濕式加熱)、輻照(紫外線、γ射線等等)或者暴露于化學(xué)品進(jìn)行滅菌的材料制成。優(yōu)選地，在將本發(fā)明血小板或者組合物引入到容器之前對(duì)容器進(jìn)行滅菌。一般地，所述容器將具有足以容納本發(fā)明血小板或者組合物的大小，另外具有允許加入另外的可以用于再水化容器中血小板或者組合物的物質(zhì)如為無(wú)菌水或者鹽水或者二者混合物的頂部空間。在實(shí)施方案中，所述容器含有足量的血小板以進(jìn)行根據(jù)本發(fā)明方法的至少一個(gè)實(shí)施方案。由此，在實(shí)施方案中，所述容器含有足量的血小板以用于治療遭受出血或者出血病癥的個(gè)體的一個(gè)劑量、兩個(gè)劑量或者更多個(gè)劑量，或者足量的血小板以用于至少一次診斷測(cè)定。包含于所述容器中的血小板的量可以由本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員基于多種參數(shù)在不過(guò)度試驗(yàn)的情況下進(jìn)行選擇，所述參數(shù)包括但不限于，患者體重、治療的出血或者出血病癥的類(lèi)型、在給定時(shí)間內(nèi)將要給藥的劑量(例如，在組合物水化后24小時(shí)時(shí)間內(nèi))和診斷設(shè)備的敏感性。
在實(shí)施方案中，所述容器作為試劑盒的組件進(jìn)行提供，其包括適宜的包裝和任選的與試劑盒內(nèi)容物相關(guān)的說(shuō)明書(shū)和/或其它信息。一般地，所述試劑盒由堅(jiān)固材料如紙板或者塑料制造而成并且可以含有直接印刷在其上的說(shuō)明書(shū)或者其它信息。在實(shí)施方案中，所述容器或者試劑盒包含其它組分，如一種或者多種凝固級(jí)聯(lián)的純化組分、影響凝固級(jí)聯(lián)的藥物、一個(gè)或者多個(gè)涂藥器、一個(gè)或者多個(gè)用于血小板給藥位置的覆蓋物(covering)或者包衣等等。所述試劑盒可以包括含有本發(fā)明血小板和/或組合物的多個(gè)容器。在這種試劑盒中，各個(gè)容器可以大小相同，并且含有與其它各個(gè)容器相同量的血小板或者組合物。另外，不同容器可以大小不同和/或含有不同量的血小板、組合物或者具有不同組分的組合物。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)可以馬上意識(shí)到，可以根據(jù)本發(fā)明設(shè)想許多不同構(gòu)型的容器尺寸和容量，由此不需要在此對(duì)所有變化進(jìn)行明確說(shuō)明。
雖然為了其中將血小板直接給藥至出血位置的體內(nèi)治療學(xué)目的，可以將任何適宜量的血小板提供在試劑盒的各個(gè)特定容器中或以總量在試劑盒中，但所述試劑盒一般將含有至少一個(gè)含有至少或者約1×108～1×1011個(gè)血小板的容器。在實(shí)施方案中，至少一個(gè)容器含有至少或者約1×108個(gè)血小板、1×109個(gè)血小板、1×1010個(gè)血小板或者1×1011個(gè)血小板。對(duì)于其中將血小板作為可注入或者可注射止血?jiǎng)┙o藥的體內(nèi)治療學(xué)目的，一般至少一個(gè)容器將含有至少約1×108～1×109個(gè)血小板。同樣地，對(duì)于體外診斷或者研究目的，一般至少一個(gè)容器將含有至少約1×108～1×109個(gè)血小板。應(yīng)當(dāng)注意，上述量一般為各個(gè)容器的一般含量，還可以預(yù)期其它更高或者更低的量。由此，在實(shí)施方案中，所述試劑盒將提供足量的血小板從而治療需要血小板的對(duì)象，如進(jìn)行手術(shù)或者具有流血傷口的患者。例如，所述試劑盒可以包括一個(gè)或者多個(gè)各自含有1×108～1×109個(gè)用于傷口治療的血小板的管形瓶。應(yīng)用所述試劑盒的治療方案可以包括給藥10個(gè)劑量的血小板(在再水化之后)。在其它實(shí)施方案中，血小板以足量提供在試劑盒中以對(duì)血小板或者血小板來(lái)自其的動(dòng)物物種的血液凝固系統(tǒng)進(jìn)行研究。在其它實(shí)施方案中，血小板以足量提供在試劑盒中以對(duì)血液凝固系統(tǒng)的至少一個(gè)功能如血小板功能進(jìn)行至少一種診斷測(cè)定。例如，用于診斷目的的試劑盒可以包含多個(gè)管形瓶，所述管形瓶各自含有200,000～1,000,000個(gè)血小板。在某些實(shí)施方案中，所述試劑盒僅僅是含有與一升或者一品脫血液的血小板量等量的凍干血小板的容器。
在另一方面，本發(fā)明提供治療需要血小板或者一種或多種血小板功能的對(duì)象的方法。通常，所述方法包括獲得血小板、源于血小板的微?；蛘叨撸缓蛯⑺鼈兘o藥至需要血小板或者一種或多種血小板功能的對(duì)象。本發(fā)明此方面的有利特征在于它提供具有不同應(yīng)用的不同實(shí)施方案?？傮w而言，可以將所述方法理解為包括，以足以將個(gè)體血液的止血性能升高至可檢測(cè)地高于給藥之前水平的量將本發(fā)明血小板或者組合物給藥至個(gè)體。由此，本發(fā)明方法通常包括將本發(fā)明組合物給藥至個(gè)體，從而將足以克服折磨所述個(gè)體的疾病或者病癥、或者創(chuàng)傷或者外傷的缺陷的血小板量遞送至所述個(gè)體。例如，在實(shí)施方案中，提供使用血小板、微粒和/或組合物治療涉及出血的創(chuàng)傷或者傷口的方法，其中所述血小板、微粒和組合物能夠通過(guò)直接施加(如通過(guò)局部給藥)而不是本領(lǐng)域典型的輸注新鮮或者有效期內(nèi)血小板，給藥至需要的患者。另一方面，本發(fā)明提供使用血小板、微粒和/或組合物治療涉及出血的創(chuàng)傷或者傷口的方法，其中所述組合物、微粒和/或組合物能夠通過(guò)輸注或者注射凍干血小板、微粒或者組合物給藥至需要的患者，而不是通過(guò)本領(lǐng)域典型的輸注新鮮或者有效期內(nèi)血小板。
基于發(fā)明人的知識(shí)，本發(fā)明首次提供凍干血小板用于體內(nèi)治療學(xué)目的的應(yīng)用。它還提供再水化凍干血小板用于體內(nèi)治療學(xué)目的的應(yīng)用。同樣地，本發(fā)明提供凍干微粒和再水化凍干微粒用于體內(nèi)治療學(xué)目的的應(yīng)用?，F(xiàn)已出乎意料地發(fā)現(xiàn)，當(dāng)給藥表現(xiàn)多種形式血友病或者藥物誘發(fā)凝血病的臨床特征的個(gè)體時(shí)，所述再水化凍干血小板倒轉(zhuǎn)了臨床作用并且由此降低了在這些個(gè)體中凝固所需的時(shí)間。這是令人驚訝地，因?yàn)樗鰝€(gè)體一般不會(huì)表現(xiàn)出低血小板數(shù)或者異常血小板功能。
根據(jù)治療方法，給藥可以通過(guò)直接將血小板或者一種或多種組合物應(yīng)用至出血位置而得到實(shí)現(xiàn)。同樣地，所述給藥可以通過(guò)直接將血小板或者一種或多種組合物應(yīng)用至緊接出血位置的位置而得到實(shí)現(xiàn)。由此，它可以通過(guò)將血小板、微?；蛘呓M合物提供在繃帶或者其它載體中得到實(shí)現(xiàn)，所述繃帶或者其它載體可以與出血位置相接觸而放置。它還可以通過(guò)將血小板或者一種或多種組合物輸注入進(jìn)行治療的對(duì)象血液系統(tǒng)中而得到實(shí)現(xiàn)。另外地，它還可以通過(guò)將血小板或者一種或多種組合物注射入進(jìn)行治療的對(duì)象血液系統(tǒng)中而得到實(shí)現(xiàn)。
本發(fā)明的方法可以用于治療涉及出血的創(chuàng)傷或者傷害。它們還可以用于多種其它如本文所述的治療中。所述出血可以是由于何種原因出血，但是一般是由于創(chuàng)傷或者其它外傷(包括手術(shù))或者出血疾病或病癥出血。所述方法可以用于通過(guò)例如在出血位置形成凝塊完全止血，或者它們可以通過(guò)降低所述位置的出血量促進(jìn)傷口愈合，在某些情形中，通過(guò)充當(dāng)患者血液系統(tǒng)提供的凝固形成過(guò)程中的添加劑或者助劑促進(jìn)傷口愈合。
所述對(duì)象可以為任何需要血小板或者一種或多種血小板功能的對(duì)象。例如，所述對(duì)象可以是遭受流血傷口的對(duì)象或者患有出血疾病或病癥的對(duì)象。所述對(duì)象或者患者可以為動(dòng)物，如陪伴寵物(例如，狗、貓、嚙齒動(dòng)物、鳥(niǎo))或者家畜(例如奶牛、綿羊、馬、山羊、雞)。它還可以是實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物，如嚙齒動(dòng)物(例如，大鼠、小鼠)、兔或者猴子。它可以是人類(lèi)。通常，它可以是任何動(dòng)物，包括但不限于哺乳動(dòng)物。
本發(fā)明包括凍干處理的血小板和血小板微粒的混合物、或者再水化血小板和由它們獲得或者得到的微粒的混合物的二元應(yīng)用。由此，在一方面，可以將本發(fā)明的血小板和組合物用作非注入止血?jiǎng)鲋寡獎(jiǎng)┎粌H可以在脈管系統(tǒng)的低壓區(qū)域用于迅速止血，而且也可以在高壓區(qū)域如腹主動(dòng)脈、股動(dòng)脈、頸動(dòng)脈和其它不服從當(dāng)前止血控制方法如人工擠壓和/或應(yīng)用止血器的血管，用于迅速止血。
在多種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供體現(xiàn)以下思想的組合物和治療方法含有凍干血小板、凍干微?；蛘邇龈裳“搴蛢龈晌⒘５慕M合物，和包括其任何形式，包括凍干粉末、氣霧劑系統(tǒng)、蒸氣合劑、繃帶等等形式的衍生品和變型的所述組合物的用途，通過(guò)將所述組合物施用至傷口或者創(chuàng)傷用于治療涉及出血的傷口或者創(chuàng)傷；組合物和其作為止血?jiǎng)┳柚钩鲅挠猛?，包括低壓?或高壓血管的嚴(yán)重出血，所述血管例如但不限于腹主動(dòng)脈、冠動(dòng)脈、股動(dòng)脈、頸動(dòng)脈、肝動(dòng)脈、腹動(dòng)脈、腎動(dòng)脈、髂(iliac)動(dòng)脈和其它主要血管，其中將止血?jiǎng)┲苿┲苯咏o藥至出血位置或者其附近，而不是給藥至較遠(yuǎn)位置如輸注和系統(tǒng)遞送組合物的情形；和在治療方法中意欲用作非注入止血?jiǎng)┑谋景l(fā)明組合物、其衍生物和任何變型，以應(yīng)用至外科手術(shù)/外傷位置，從而降低出血總量和降低對(duì)輸血的需要。本發(fā)明還提供體現(xiàn)以下思想的組合物和治療方法意欲用作非注入止血?jiǎng)┑慕M合物、其衍生物和任何變型，以用于控制先天性或者獲得性凝血病出血；意欲用作非注入止血?jiǎng)┑慕M合物、其衍生物和任何變型，以用于控制進(jìn)行抗血栓性藥物治療的患者出血；意欲應(yīng)用在侵入性手術(shù)如但不限于脾手術(shù)、肝切除術(shù)、胰十二指腸切除術(shù)和膽囊切除中用作封閉劑的組合物、其衍生物和任何變型，從而控制出血和促進(jìn)組織再生；意欲用作病理學(xué)條件如但不限于糖尿病性潰瘍、皮膚潰瘍和其它非愈合性傷口的局部/傷口愈合應(yīng)用的組合物、其衍生物和任何變型。本發(fā)明進(jìn)一步提供體現(xiàn)以下思想的組合物和治療方法意欲用作促進(jìn)局部傷口愈合試劑的組合物、其衍生物和任何變型；意欲用作減少瘢痕形成的試劑的組合物、其衍生物和任何變型；意欲用作吻合適應(yīng)癥試劑(anastomosis indications)的組合物、其衍生物和任何變型；和用于治療與削弱的或者不適當(dāng)?shù)难苄纬上嚓P(guān)的條件和涉及脈管系統(tǒng)或者內(nèi)皮細(xì)胞的疾病的組合物、其衍生物和任何變型。這些可以為，但不限于與老化相關(guān)的黃斑變性、冠狀動(dòng)脈病、末梢血管病、小島細(xì)胞移植、骨折和肌腱恢復(fù)、再造手術(shù)、組織工程、再狹窄、癌、糖尿病性視網(wǎng)膜病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、血管瘤/AIDS-相關(guān)的卡波濟(jì)氏肉瘤(Kaposi’s sarcoma)和動(dòng)脈粥樣硬化血小板破裂等等。由此，在多種應(yīng)用中，本發(fā)明組合物可以用作止血?jiǎng)┖陀糜诩铀賯谟线^(guò)程。
因此，本發(fā)明提供使用血小板、微粒和組合物用于在此所討論的體內(nèi)和體外目的的使用方法，如治療需要至少一種血液凝固組分的對(duì)象的方法。
在實(shí)施方案中，本發(fā)明提供治療需要或者懷疑需要一種或者多種正常血液凝固系統(tǒng)組分的對(duì)象的方法。因?yàn)楸景l(fā)明血小板提供至少一種足以克服血友病和治療誘發(fā)的凝血病形式的缺失的因子，因此本發(fā)明組合物可以用于治療患有血友病或者凝血病形式的個(gè)體。通常，所述方法包括，以足以將個(gè)體的血液止血性能升高至可檢測(cè)地高于給藥之前水平的量將本發(fā)明組合物給藥至個(gè)體。由此，本發(fā)明的方法通常包括將本發(fā)明組合物給藥至個(gè)體，從而將足以克服折磨所述個(gè)體的疾病或者病癥的缺失的量的血小板遞送至所述個(gè)體。
在實(shí)施方案中，所述方法治療患有血友病的個(gè)體。所述血友病患者可以患有血友病A、血友病B、血友病C或者具有抑制劑的獲得性血友病。同樣地，任何水平的血友病(完全、嚴(yán)重或者中等)都可以根據(jù)本發(fā)明的方法得到治療。
在其它實(shí)施方案中，所述方法治療正在用抗凝血?jiǎng)┗蛘咂渌噭┻M(jìn)行治療或者導(dǎo)致凝固系統(tǒng)受到損害的療法的患者。由此，在實(shí)施方案中，所述方法為治療化學(xué)療法誘發(fā)的血液凝固病癥、與血小板減少癥不同的輻射誘發(fā)的血液凝固病癥、或者由于暴露于一種或者多種有害環(huán)境劑而產(chǎn)生的血液凝結(jié)凝固病癥的方法。優(yōu)選以產(chǎn)生的血小板數(shù)不超過(guò)剩余血小板數(shù)兩倍的量給藥本發(fā)明組合物。換言之，如果受者的基準(zhǔn)數(shù)為200,000個(gè)血小板/μl，那么應(yīng)當(dāng)以約1011個(gè)血小板的劑量給藥所述產(chǎn)品，設(shè)計(jì)的該劑量將基準(zhǔn)數(shù)增加至約每劑量50,000個(gè)血小板/μl。取決于出血的本性、位置和嚴(yán)重程度，為了實(shí)現(xiàn)止血可能需要兩個(gè)或者更多個(gè)劑量。
由此，本發(fā)明預(yù)期本發(fā)明血小板用于治療出血病癥，特別是其中患者血小板數(shù)正?；蛘卟徽J(rèn)為臨床異常的那些出血的應(yīng)用。由此，本發(fā)明預(yù)期本發(fā)明血小板用于治療所有形式的先天性血友病、具有抑制劑的血友病、獲得性血友病和藥物誘發(fā)凝血病的應(yīng)用。它進(jìn)一步預(yù)期所述血小板用于在例如介入心臟病學(xué)過(guò)程期間中和肝素的應(yīng)用，和作為低分子量肝素的解毒劑和直接或者間接因子X(jué)a抑制劑的應(yīng)用。本發(fā)明可以進(jìn)一步將所述血小板用于增強(qiáng)重組因子VIIa效果的輔助療法中。同樣發(fā)現(xiàn)了例如在輕鏈淀粉樣變性期間，其在獲得性因子X(jué)缺失治療中的應(yīng)用。還發(fā)現(xiàn)了它在治療凝血因子缺失而不是治療因子II(凝血酶原)或者因子I(血纖蛋白原)缺失中的用途。本發(fā)明和公開(kāi)的血小板還可以在作為肝功能失常的結(jié)果存在的瞬時(shí)凝血病如與肝功能衰竭或者肝移植相關(guān)的瞬時(shí)凝血病和作為可以導(dǎo)致尿毒癥的腎衰竭的結(jié)果存在的瞬時(shí)凝血病的治療中具有用途。本發(fā)明血小板的其它應(yīng)用包括在GPIIb/IIIa拮抗劑療法治療(例如，作為解毒劑)和vWD治療中的用途。
由此，本發(fā)明所述方法可以進(jìn)一步包括二次或者更多次給藥本發(fā)明組合物。因此，本發(fā)明方法包括其中重復(fù)給藥一次或者多次的治療方案。連續(xù)給藥可以包括相同量或者不同量的血小板衍生物，并且可以含有或者不含有另外的組分。其量和組合物組分的選擇可以由本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員基于多種參數(shù)如對(duì)象年齡、重量、病史、臨床報(bào)告和輔助臨床報(bào)告等等進(jìn)行選擇。對(duì)治療方案進(jìn)行的適當(dāng)變化和調(diào)整在本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員的能力范圍之內(nèi)，不需要進(jìn)行過(guò)度試驗(yàn)。由此，本發(fā)明方法可以包括多次給藥本發(fā)明組合物，各次給藥通過(guò)預(yù)定時(shí)間進(jìn)行間隔。例如，對(duì)于血友病的預(yù)防性治療，本發(fā)明組合物可以每周給藥一次或者每?jī)芍芙o藥一次?；谥委煹募膊』蛘卟“Y，其它適宜的方案將是明顯的。
所述方法可以進(jìn)一步包括給藥其它生物活性劑如凝固因子和用于治療癌癥的化學(xué)治療劑。它還可以包括用物理方式如利用輻射進(jìn)行治療。存在多種和不同的對(duì)于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的附加治療，可以將任何所述治療包括在本發(fā)明方法中。
在將它們給藥至所述對(duì)象之前，所述方法可以包括任選的再水化凍干血小板和/或微粒的步驟。
本發(fā)明的一方面是將非自體性血液制品用作本發(fā)明組合物的來(lái)源。更具體而言，當(dāng)前可利用的用于治療出血的基于血小板的止血產(chǎn)品使用從需要治療的患者中抽取的血液(即，自體性獻(xiàn)血)。本發(fā)明不需要本發(fā)明組合物來(lái)源的自體性供血。事實(shí)上，本發(fā)明甚至不必依賴新鮮或者有效期內(nèi)血小板。也就是說(shuō)，現(xiàn)已令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，當(dāng)作為凍干血小板、凍干血小板組合物(可以或者不必含有大量微粒)或者含有再水化凍干血小板的組合物提供時(shí)，如供血后六天到九天之間的那些過(guò)期血小板可以提供適宜的血小板功能。
鑒于本發(fā)明所述方法，本發(fā)明提供本發(fā)明組合物在制備治療有效的組合物或者制劑中的用途。這些組合物或者制劑可以用于治療出血以及用于治療血友病或者其它導(dǎo)致缺少正常凝固、或者涉及低水平或者不存在一種或者多種凝固因子的疾病或者病癥。因此，本發(fā)明提供本發(fā)明組合物或者制劑在治療血友病或者其它特征為低水平或者不存在一種或多種凝固因子的疾病或者病癥中的用途。其它非限制性例證實(shí)施方案包括血小板衍生物用于治療與肝損傷、肝功能衰竭或者肝移植以及腎衰竭(尿毒癥)相關(guān)的出血素質(zhì)的用途。
用于治療遺傳性或者獲得性出血病癥的生效和有效止血?jiǎng)┍仨毺峁┭杆倏刂瞥鲅?，從而防止由于?chuàng)傷或者手術(shù)所造成的無(wú)法接受的出血，和最小化由于微生物侵入或者消極影響其它身體組織(包括關(guān)節(jié))的血液蛋白活化而對(duì)身體其它位置的伴發(fā)性損傷。在此方面，通過(guò)提供用于治療需要一種或者多種涉及凝固過(guò)程的因子的個(gè)體的組合物和方法，本發(fā)明滿足了本領(lǐng)域需求?？梢愿鶕?jù)本發(fā)明進(jìn)行治療的疾病或者病癥包括所有形式的血友病，包括血友病A、血友病B、血友病C和具有抑制劑的獲得性血友病和由于用抗凝血療法治療而產(chǎn)生的不充分凝固。本發(fā)明至少部分基于以下發(fā)現(xiàn)，血小板衍生物可以用于治療具有完全正常的血小板數(shù)和血小板功能的人中的凝固病癥。本發(fā)明將多種形式的血小板用作活性劑，從而對(duì)血友病患者和其它需要的對(duì)象提供正?；蛘呒僬Ｖ寡阅?，和對(duì)血友病患者以及其它受到導(dǎo)致出血的外傷的需要對(duì)象提供止血性能。由此，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于治療藥物誘發(fā)的凝血病和用于促進(jìn)促凝血藥物效果的凍干(冷凍干燥)的海藻糖穩(wěn)定的血小板。根據(jù)本發(fā)明，凝固至少部分得到了促進(jìn)，因?yàn)樗鲅“搴写龠M(jìn)與內(nèi)源性因子如維生素K-依賴型凝固因子(即，因子II、VII、IX和X))結(jié)合的天然帶負(fù)電荷的磷脂表面。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明利用冷凍干燥促凝血血小板和血小板衍生物以產(chǎn)生或者促使凝塊形成，推定其通過(guò)將凝血因子結(jié)合到血小板衍生物表面，從而促進(jìn)凝血酶產(chǎn)生和凝塊形成。在不受任何具體理論限制的同時(shí)，當(dāng)前獲取的數(shù)據(jù)與一種或多種凝結(jié)蛋白或者由血小板貯存顆粒內(nèi)部產(chǎn)生，即，源于血小板，或者外部結(jié)合血漿(即源于凍干之前的血漿)的理論一致。
本發(fā)明進(jìn)一步包括使用血小板和再水化血小板逆轉(zhuǎn)藥物誘發(fā)的凝血病，特別是通過(guò)心肺直視手術(shù)(cardiopulmonary bypasssurgery)期間通常應(yīng)用的牛胰蛋白酶抑制劑(Trasylol，Bayer)或者肝素誘發(fā)的那些。因此，本發(fā)明包括治療正在進(jìn)行抗凝血療法或者最近進(jìn)行了抗凝血療法的患者。
推定該系統(tǒng)通過(guò)以下方式產(chǎn)生作用提供失去的凝固因子或者直接在血小板表面上的凝固因子，其中它可以克服缺少的凝固因子或者直接繞過(guò)抗體抑制劑或者有缺陷的凝結(jié)蛋白的作用，從而促進(jìn)止血。
在本發(fā)明提供多種優(yōu)點(diǎn)中，一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是成本節(jié)約和可用性。熟知用于血友病患者的大多數(shù)療法的每個(gè)有效劑量的成本約$10,000。由此，對(duì)于該病癥的治療，血友病患者一般每年花費(fèi)超過(guò)$100,000。
在另一方面，本發(fā)明提供將凍干血小板或者由此得到的重構(gòu)血小板用于診斷或者研究目的的方法。所述診斷方法一般在體外進(jìn)行，但是如果期望，也可以在試驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行。通常進(jìn)行所述診斷方法以診斷出血病癥和引起那些病癥的原因。研究方法通常涉及發(fā)現(xiàn)出血病癥的原因，如特定個(gè)體不能響應(yīng)于創(chuàng)傷或者其它損傷正?？刂瞥鲅姆肿右罁?jù)。所述研究方法還可以涉及藥物治療對(duì)于個(gè)體血液凝固系統(tǒng)的影響(例如，不利地影響血液凝固的副作用)的研究或者對(duì)血液凝固一般過(guò)程或者明確關(guān)于該過(guò)程中一個(gè)或者多個(gè)特定步驟的影響的研究。
在診斷方法中，所述方法可以為診斷血液凝固系統(tǒng)疾病或者病癥的方法。這些方法通常包括，獲得凍干血小板，將所述凍干血小板與從患有或者懷疑患有血液凝固系統(tǒng)疾病或者病癥的患者中除去的血小板和/或血漿合并從而形成混合物，和通過(guò)測(cè)定所述混合物的一種或者多種生物學(xué)或者生物化學(xué)功能來(lái)確定所述個(gè)體是否患有血液凝固系統(tǒng)缺陷，其中所述缺陷降低或者消除了患者血液凝固系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)正常功能或者使得凝塊在預(yù)定時(shí)間段內(nèi)形成的能力。一般，確定患者的血液凝固系統(tǒng)是否具有缺陷包括測(cè)定所述混合物的凝固時(shí)間。可以在使用之前對(duì)所述凍干血小板進(jìn)行再水化。
所述凍干血小板可以得自于凝結(jié)系統(tǒng)狀態(tài)已知(例如，具有完全功能的凝固系統(tǒng)或者在一種或者多種凝固因子中存在缺陷)的一個(gè)或者多個(gè)供血者。當(dāng)所述凍干血小板得自于公眾血庫(kù)中的血小板混合物時(shí)，關(guān)于血小板功能，可以假定它們是“正常”或者“功能完全的”。另外，所述凍干血小板可以得自于正在進(jìn)行或者將要進(jìn)行可能影響血小板功能的治療方案的患者。同樣地，所述凍干血小板可以得自于已經(jīng)完成了影響或者可能影響血小板功能的治療方案的患者(無(wú)論是完成了全部治療方案還是由于不利的副作用而早期放棄了該治療方案的患者)。
類(lèi)似于所述凍干血小板，所述新鮮血小板或者血漿可以得自于凝固系統(tǒng)狀態(tài)已知(例如，具有完全功能的凝固系統(tǒng)或者在一種或者多種凝固因子中存在缺陷)的一個(gè)或者多個(gè)供血者。當(dāng)所述新鮮血小板或者血漿得自于公眾血庫(kù)中的血小板混合物時(shí)，關(guān)于血小板功能或者血漿補(bǔ)體，可以假定它們具有“正常的”或者“功能完全的”。另外，所述新鮮血小板或者血漿可以得自于正在進(jìn)行或者將要進(jìn)行可能影響血小板功能的治療方案的患者。同樣地，所述新鮮血小板或者血漿可以得自于已經(jīng)完成了影響或者可能影響血小板功能的治療方案的患者(無(wú)論是完成了全部治療方案還是由于不利的副作用而早期放棄了該治療方案的患者)。
不論凍干血小板和新鮮血小板或者血漿源如何，所述方法都包括合并二者從而形成混合物。然后對(duì)混合物進(jìn)行測(cè)定，從而獲得所述混合物的一種或者多種生物學(xué)或者生物化學(xué)功能。優(yōu)選對(duì)凝固系統(tǒng)的一種或者多種功能如聚集能力進(jìn)行測(cè)定。所選擇的功能或者活性與“正?！彼降墓δ芑蛘呋钚运降膶?duì)比使人們確定這些水平是否存在差異。水平上存在差異說(shuō)明存在血液凝固系統(tǒng)疾病或者病癥。
在示例性的實(shí)施方案中，所述方法包括將由公眾血庫(kù)得到的凍干血小板與從患有或者懷疑患有血液凝固系統(tǒng)疾病或者病癥的患者中分離的新鮮血小板合并，從而形成混合物，和通過(guò)測(cè)定所得混合物的一種或者多種生物學(xué)或者生物化學(xué)功能確定該個(gè)體是否具有血液凝固系統(tǒng)缺陷。根據(jù)本發(fā)明的該方面，如果存在缺陷，那么該缺陷降低或者消除了患者血液凝固系統(tǒng)正常發(fā)揮作用或者使得凝塊在預(yù)定時(shí)間內(nèi)形成的能力。
在其它示例性實(shí)施方案中，所述方法包括，將從開(kāi)始治療方案之前的患者得到的凍干血小板與從治療方案期間或者治療方案完成之后的患者中一次或者多次得到的新鮮血小板或者血漿合并，從而形成混合物。該方法進(jìn)一步包括確定上述混合物的凝固能力，該能力表明所述治療方案是否誘發(fā)凝固系統(tǒng)疾病或病癥，或者是否惡化潛在的但從未意識(shí)到的患者凝固系統(tǒng)的疾病或者病癥。
根據(jù)以上的討論，所述來(lái)自于患者的凍干血小板和血小板可以由任何來(lái)源提供。可以通過(guò)任何適宜的方法如本領(lǐng)域熟知的合并兩種真核細(xì)胞的那些合并二者。此外，確定患者是否患有一種或者多種血液凝固系統(tǒng)缺陷可以通過(guò)任何適宜的技術(shù)完成，如上所述。
在實(shí)施方案中，所述確定包括檢測(cè)混合物中血小板的存在或者聚集量。通常，低水平的聚集表明血液凝固活性中的缺陷或者缺失，而高水平的聚集表明正?；蛘呖山邮芩降幕钚?。一般，確定患者的血液凝固系統(tǒng)是否具有缺陷包括測(cè)定所述混合物的凝固時(shí)間。
除了上述公開(kāi)的基本步驟之外，所述方法還可以包括其它步驟。例如，在將它們與血液合并之前，所述方法可以包括獲得凍干血小板的步驟。在實(shí)施方案中，所述凍干血小板得自于正在進(jìn)行測(cè)定的患者，和所述凍干血小板為早些時(shí)候如在開(kāi)始藥物方案之前獲得的血小板。所述方法還可以包括將一種或者多種對(duì)血小板或者凝固系統(tǒng)的其它參與細(xì)胞或者分子具有已知影響的藥物或者其它物質(zhì)加入到血小板中，和確定所述加入對(duì)凝固功能的影響。通過(guò)選擇具有已知活性的具體藥物，有可能確定導(dǎo)致疾病或者病癥的準(zhǔn)確原因。利用上述知識(shí)，可以實(shí)現(xiàn)適當(dāng)?shù)闹委煼桨浮?br> 在某些應(yīng)用中，所述方法可以為監(jiān)控血液凝固系統(tǒng)疾病或者病癥發(fā)展的方法。這些方法通常包括，獲得凍干血小板，將所述凍干血小板與從患有所述疾病或者病癥的患者中除去的血小板和/或血漿合并從而形成混合物，和確定所述混合物的血液凝固能力。一般地，確定混合物的血液凝固能力表明患者血液的血液凝固能力，并且其包括測(cè)定混合物的凝固時(shí)間。此外，一般隨時(shí)間流逝進(jìn)行多個(gè)測(cè)定，從而得到疾病發(fā)展隨時(shí)間流逝的指征。通過(guò)比較兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，可以確定在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)之間是否存在疾病或者病癥(如果存在的話)狀態(tài)變化。該信息尤其可以幫助醫(yī)生或者患者確定是否繼續(xù)進(jìn)行特定的治療方案。可以在使用之前對(duì)所述凍干血小板進(jìn)行再水化。
所述方法還可以為監(jiān)控患者治療方案對(duì)該患者血液凝固系統(tǒng)的影響的方法。通常，這些方法包括，獲得凍干血小板，將所述凍干血小板與從進(jìn)行所述治療方案的患者中除去的血小板和/或血漿合并從而形成混合物，和確定所述混合物的血液凝固能力。一般地，確定混合物的血液凝固能力表明患者血液的血液凝固能力，并且其包括測(cè)定混合物的凝固時(shí)間。此外，一般隨時(shí)間流逝進(jìn)行多個(gè)測(cè)定，從而得到治療方案的效果隨時(shí)間流逝的指征?？梢栽谑褂弥皩?duì)所述凍干血小板進(jìn)行再水化。
由此，在實(shí)施方案中，本發(fā)明提供監(jiān)控患者治療方案對(duì)該患者血液凝固系統(tǒng)的影響的方法。通常，所述方法包括，合并凍干血小板和新鮮血小板兩次或者更多次(對(duì)于凍干血小板、新鮮血小板和/或血漿中的一者或者二者)，和確定血液凝固系統(tǒng)疾病或者病癥是否存在于獲得凍干血小板或者新鮮血小板或者血漿的個(gè)體中。通過(guò)兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的比較，可以監(jiān)控治療方案對(duì)所述個(gè)體血液凝固系統(tǒng)的影響。在該方法中，凍干血小板、新鮮血小板或者血漿中、或者其二者可以得自于相同個(gè)體(即，患者)。通過(guò)比較兩個(gè)或者更多個(gè)時(shí)間點(diǎn)獲得的信息，尤其可以幫助醫(yī)生或患者確定是否繼續(xù)特定的治療方案。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供監(jiān)控血小板一種或者多種功能的方法。通常，所述方法包括，獲得凍干血小板，將它們暴露于一種或者多種可以對(duì)血小板功能產(chǎn)生影響的物質(zhì)，和確定所述物質(zhì)是否影響一種或者多種血小板功能。該方法可以在將凍干血小板暴露于上述物質(zhì)之前、期間或者之后，進(jìn)一步包括重構(gòu)凍干血小板。獲得凍干血小板和對(duì)它們重構(gòu)可以通過(guò)任何上述方法或者本領(lǐng)域已知適用于所述目的的方法實(shí)現(xiàn)。
確定所述物質(zhì)對(duì)血小板功能的影響可以通過(guò)本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員熟知的任何寬范圍的工藝。所述工藝對(duì)于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員是熟知的，由此在此不必詳敘。確定所述物質(zhì)對(duì)血小板的影響的示例性工藝包括但不限于，測(cè)定血小板參與凝塊形成(在此還指體外測(cè)定時(shí)的聚集)能力的技術(shù)。聚集可以通過(guò)組合物的光散射量進(jìn)行確定，并且可以使用簡(jiǎn)單光電電池或者專(zhuān)門(mén)的凝集計(jì)進(jìn)行確定?？梢杂糜跈z測(cè)聚集的分子包括但不限于腎上腺素、ADP、凝血酶、凝血酶受體活化肽(TRAP)、膠原和凝血噁烷(thromboxane)。
確定所述物質(zhì)對(duì)血小板功能的影響可以包括，檢測(cè)含有凍干血小板和新鮮血小板的含血小板組合物的聚集量。如下詳述，本發(fā)明凍干血小板具有多種，如果不是全部的話，新鮮血小板的功能特性。然而，其中多種功能以不足以促進(jìn)凝固的水平存在。有趣地，雖然所述功能可能在不足以促進(jìn)正常水平凝固的水平上，但是如果其它可以提供不充分功能的血小板存在，那么凍干血小板可以參與正?；蛘呓咏５哪?。由此，在實(shí)施方案中，新鮮血小板提供一種或者多種在凍干血小板中不足夠的或者缺少的功能，并且可以檢測(cè)到凝固。
在本發(fā)明實(shí)施方案中，本發(fā)明凍干血小板在沒(méi)有其它血小板如新鮮血小板輔助時(shí)具有降低的凝固能力的事實(shí)，提供了新鮮血小板不能單獨(dú)提供的優(yōu)點(diǎn)。實(shí)際上，該特性使得凍干血小板和凍干血小板與新鮮血小板的組合物對(duì)凝固系統(tǒng)抑制劑更為敏感和對(duì)凝固系統(tǒng)缺陷敏感。由此，通過(guò)利用凍干血小板，可以檢測(cè)凝固系統(tǒng)中的缺陷。所述系統(tǒng)，并且特別是凍干血小板的測(cè)定，使得用戶可以調(diào)節(jié)試驗(yàn)樣品的凝固系統(tǒng)和形成對(duì)在凝結(jié)能力中小變化高度敏感的系統(tǒng)。
此外，合并取自于影響血小板功能的治療之前的供血者的預(yù)定量的凍干血小板，與取自于開(kāi)始治療后(例如，在治療期間或者停止治療之后)的供血者的預(yù)定量的新鮮血小板將產(chǎn)生具有等于或者大于單獨(dú)新鮮血小板的凝固性能的組合物。實(shí)際上，這使得凍干血小板和新鮮血小板的組合物對(duì)凝固系統(tǒng)抑制劑敏感，并且使得組合物對(duì)凝固系統(tǒng)缺陷更為敏感。由此，通過(guò)利用含有凍干血小板和新鮮血小板的組合物，可以以比單獨(dú)使用新鮮血小板更高的敏感性測(cè)定凝固系統(tǒng)缺陷。
在本發(fā)明實(shí)施方案中，所述凍干血小板保持了新鮮血小板的表面標(biāo)志。實(shí)際上，這使得血小板尤其對(duì)糖蛋白IIb/IIIa、糖蛋白Ib、血管性血友病因子和血纖蛋白原中的缺陷以及其它缺陷敏感。這還使得所述血小板對(duì)無(wú)纖維蛋白原血癥、Thromlasthenia、vWF病、巨大血小板綜合癥、分泌/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的受體缺陷病癥、貯藏池病(Strorage Pool Deficiency)、減少的凝血噁烷合成、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)/基本分泌缺陷(Primary SecretionDefects)和血小板凝血活性缺失更為敏感。由此，通過(guò)利用凍干血小板，可以檢測(cè)血小板缺陷和凝結(jié)系統(tǒng)中的缺陷。
所述監(jiān)控方法可以包括，從一個(gè)供血者獲得多個(gè)樣品和將樣品彼此和/或與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)照，從而確定一種或者多種血小板功能的存在和/或功能水平?？梢噪S時(shí)間流逝獲得樣品和進(jìn)行對(duì)比，從而確定一種或者多種治療方案對(duì)一般血小板功能或者凝結(jié)固統(tǒng)的影響。還可以對(duì)它們進(jìn)行分析，從而確定在供血者血液中存在支持手術(shù)或者其它可能出血液過(guò)程的足夠數(shù)目的血小板?？梢詫@得的樣品作為新鮮樣品短期貯存起來(lái)，或者可以對(duì)所述樣品進(jìn)行處理，從而產(chǎn)生后來(lái)進(jìn)行重構(gòu)和測(cè)定的凍干血小板樣品。
此外，所述監(jiān)控可以包括，從一個(gè)供血者獲得多個(gè)樣品和將樣品彼此和/或與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)照，從而確定一種或者多種血小板功能的存在和/或功能水平。例如，可以測(cè)定無(wú)纖維蛋白原血癥、Thromlasthenia、vWF病、巨大血小板綜合癥、分泌/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的受體缺陷病癥、存儲(chǔ)庫(kù)缺失、減少的凝血噁烷合成、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)/基本分泌缺陷或者血小板凝血活性缺失。
正如本發(fā)明的其它方法一樣，可以將多種藥物或者其它物質(zhì)加入到測(cè)定混合物中，從而確定疾病或者病癥中的具體缺陷。對(duì)具體缺陷源的認(rèn)識(shí)可以使得治療方案得到發(fā)展。
在實(shí)施方案中，所述方法包括，從公眾血源或者開(kāi)始治療方案之前的患者中獲得凍干血小板，從開(kāi)始治療方案之前的患者或者公眾血源中獲得新鮮血小板或血漿，和進(jìn)行治療方案期間的患者中一次或者多次獲得新鮮血小板或者血漿。所述方法進(jìn)一步包括確定凍干和新鮮組分的組合物的血液凝固能力。一般地，確定混合物的血液凝固能力表明患者血液的血液凝固能力，并且其包括測(cè)定混合物的凝固時(shí)間。此外，一般隨時(shí)間流逝進(jìn)行多個(gè)測(cè)定，從而得到治療方案的效果隨時(shí)間流逝的指征。
公眾可以采用用于各種疾病和病癥的多種治療方法。這些治療中的一些，在有效治療特定疾病或者病癥的同時(shí)，產(chǎn)生降低或者消除血液凝固系統(tǒng)一種或者多種功能的不期望的作用(即，副作用)。其它治療明確設(shè)計(jì)為促進(jìn)或者抑制患者血液凝固系統(tǒng)的活性。在任何情況下，通常理想的是監(jiān)控患者血液中藥物的存在和/或濃度，并且特別是監(jiān)控那些藥物對(duì)患者血液凝固活性的影響。本發(fā)明方法使得人們可以簡(jiǎn)單和迅速地監(jiān)控這樣的影響。
應(yīng)當(dāng)注意，所有監(jiān)控和診斷方法都可以包括一個(gè)或者多個(gè)對(duì)照反應(yīng)。對(duì)照反應(yīng)的概念是本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員所熟知的，可以將多種對(duì)照反應(yīng)類(lèi)型包括在本發(fā)明的方法中，從而監(jiān)控所述方法中一步或者多步的有效性和成功性。在可以進(jìn)行的更普遍的對(duì)照反應(yīng)中，所述反應(yīng)為涉及凍干血小板作為血小板唯一來(lái)源的反應(yīng)、涉及新鮮血小板作為血小板唯一來(lái)源的反應(yīng)、其中將一種或者多種已知物質(zhì)(對(duì)血小板功能或者凝固系統(tǒng)功能具有已知影響)暴露于新鮮血小板(例如，陽(yáng)性對(duì)照)的反應(yīng)和其中除了血小板之外沒(méi)有物質(zhì)加入的反應(yīng)(例如，陰性對(duì)照)。所述對(duì)照反應(yīng)包括形成標(biāo)準(zhǔn)曲線的反應(yīng)。因?yàn)楸景l(fā)明方法當(dāng)利用精確測(cè)定量的正常凍干血小板和正常血清或者血液進(jìn)行時(shí)，提供可重復(fù)的聚集特性，因此可以產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線并且可以將這些標(biāo)準(zhǔn)曲線用作比較試驗(yàn)樣品多種特性，包括但不限于，血小板數(shù)/濃度、血小板參與凝固的能力和在血小板上存在或者不存在功能表面蛋白的基礎(chǔ)。
還應(yīng)當(dāng)注意，雖然在此公開(kāi)的方法適于使用凍干血小板和新鮮血小板或者血漿，但是凍干血小板可以根據(jù)本發(fā)明的方法與全血、血小板、血漿、純化的凝結(jié)蛋白和血液系統(tǒng)其它組分合并。使用的術(shù)語(yǔ)“新鮮血小板”和/或“新鮮血漿”應(yīng)當(dāng)理解為包括所有其它類(lèi)型的新鮮血液制品。此外，術(shù)語(yǔ)“新鮮”并不必須要求嚴(yán)格的時(shí)間相關(guān)性。相反地，它僅僅用于區(qū)分凍干血小板和非凍干物質(zhì)。
本發(fā)明方法還可以包括，在相同條件下對(duì)相同樣品實(shí)施該方法超過(guò)一次。如本領(lǐng)域所知，對(duì)多個(gè)等同樣品進(jìn)行所述方法提供了所述方法可靠性和可重復(fù)性的指征。根據(jù)本發(fā)明，可以根據(jù)本發(fā)明的此實(shí)施方案對(duì)所述方法的每一步驟或者僅僅是該方法中的某些步驟進(jìn)行重復(fù)。
從以上說(shuō)明書(shū)可以明顯看出，所有檢測(cè)和監(jiān)控方法都可以包含通過(guò)測(cè)定凝固時(shí)間確定血小板數(shù)和功能水平的一般概念。由此，在實(shí)施方案中，可以將本發(fā)明方法認(rèn)為是確定含有血小板的樣品的血小板數(shù)的方法。同樣地，在實(shí)施方案中，可以將本發(fā)明的方法認(rèn)為是確定含有血小板的樣品的血小板功能的方法。一般，血小板功能通過(guò)參與凝固過(guò)程的能力進(jìn)行測(cè)定。
本發(fā)明凍干血小板可以表現(xiàn)出新鮮血小板的多種特性。這些特性之一為大小。本發(fā)明實(shí)施方案的凍干血小板與新鮮血小板具有大致相等的大小。由此，所述凍干血小板可以用于校準(zhǔn)用于檢測(cè)和研究血小板的儀器。在凍干后，本發(fā)明血小板被有利地用于校準(zhǔn)儀器，因?yàn)榇藭r(shí)校準(zhǔn)可以在任何適宜的時(shí)間進(jìn)行，而不是在由新鮮血小板提供的小機(jī)會(huì)窗口時(shí)間內(nèi)進(jìn)行。
本發(fā)明首次認(rèn)識(shí)到了凍干血小板在檢測(cè)和監(jiān)控影響血液凝固系統(tǒng)的疾病和病癥中的有效性。本發(fā)明還首次認(rèn)識(shí)到了凍干血小板在監(jiān)控藥物和藥物治療方案對(duì)給予所述藥物的個(gè)體的血液凝固系統(tǒng)影響的有效性。實(shí)質(zhì)上，本發(fā)明認(rèn)識(shí)到凍干血小板適用于由新鮮血小板提供的全部診斷能力，包括監(jiān)控任何和全部血小板功能。由此，本發(fā)明認(rèn)識(shí)到了凍干血小板在監(jiān)控個(gè)體血液的血液凝固能力中的有效性。凍干血小板可以在多種測(cè)定中用作新鮮血小板的替代物的發(fā)現(xiàn)，使得所述方法能夠監(jiān)控血液樣品的血液凝固能力，并且提供對(duì)個(gè)體健康和壽命重要和關(guān)鍵性的信息。
實(shí)施例本發(fā)明將通過(guò)以下實(shí)施例進(jìn)行進(jìn)一步說(shuō)明，這些實(shí)施例意欲為純粹的本發(fā)明的示例性說(shuō)明，不應(yīng)當(dāng)認(rèn)為其以任何方式限制本發(fā)明。
除非另作說(shuō)明，以下試驗(yàn)使用的血小板是購(gòu)自于BRTLabs(Baltimore，MD)，在抽取4～24小時(shí)內(nèi)使用或者在抽取后6～7天時(shí)使用；收集入酸性檸檬酸鹽葡萄糖溶液(ACD)抗凝血緩沖液(1.5體積血小板+8.5體積血液)的新鮮血小板；或者過(guò)期不超過(guò)5天的過(guò)期血小板(George Washington University血庫(kù)，Washington DC)。
實(shí)施例1凍干血小板的制備開(kāi)發(fā)制備凍干血小板的方法，從而提供具有長(zhǎng)期貯存期限和通過(guò)再水化的適宜特性的血小板。發(fā)現(xiàn)該方法提供具有有利于體外研究和體內(nèi)治療學(xué)應(yīng)用的性能的凍干血小板和由所述凍干血小板重構(gòu)的血小板。
制備凍干血小板的方法包括以下步驟初始糖負(fù)載方法，包括對(duì)所有溶液、緩沖液、設(shè)備等等進(jìn)行檢查，從而確保每一種均處于或者接近室溫，從而最小化低溫對(duì)血小板的不利影響；獲得富血小板血漿(PRP)；通過(guò)檢查渦旋對(duì)血小板的適用性進(jìn)行檢驗(yàn)，如果沒(méi)有觀察到渦旋，那么血小板被舍棄；對(duì)血小板組合物的pH值進(jìn)行檢查，pH值低于6.2的樣品受到排斥；當(dāng)可應(yīng)用時(shí)，將不同的血小板樣品(例如，PRP)收集入塑料燒杯中；對(duì)所述血小板組合物進(jìn)行攪拌和測(cè)量pH值，如果必要，用ACD緩沖液(85mM檸檬酸鈉；65mM檸檬酸；111mM葡萄糖；在去離子超濾水中；過(guò)濾)將其pH值調(diào)節(jié)至6.6～6.8；在ACT-10儀器上對(duì)血小板數(shù)進(jìn)行確定，并且對(duì)其進(jìn)行稀釋?zhuān)瑥亩寡“逦挥贏CT-10的線性范圍內(nèi)(約10～1000)；將血小板相等地分入不同的離心瓶中；必要時(shí)，通過(guò)在固定角離心機(jī)中，在500×g下離心5分鐘將紅血球(RBC)除去，然后將富血小板血漿組分轉(zhuǎn)移到新的干凈燒瓶中并得到新的血小板數(shù)；需要時(shí)，得到PRP樣品以用于后續(xù)分析(5～10ml)；通過(guò)在1500×g下離心15分鐘將血小板制成丸粒；如果需要，通過(guò)抽吸將乏血小板血漿除去并且存儲(chǔ)以用于以后應(yīng)用；將所得丸粒化的血小板再懸浮于少量體積(等于先前步驟中除去的乏血小板血漿體積的約5％)的負(fù)載緩沖液(9.5mMHEPES；100mM NaCl；4.8mM KCl；5.0mM葡萄糖；12mMNaHCO3；50mM海藻糖；pH值6.8)中；測(cè)量再懸浮血小板的血小板數(shù)，并且將其濃度調(diào)節(jié)至大約1250(1.25×109/ml，通過(guò)ACT-10設(shè)備進(jìn)行測(cè)定)；對(duì)其體積進(jìn)行記錄；在水浴中，在37℃下將血小板培養(yǎng)2小時(shí)；在培養(yǎng)期間，對(duì)血塊凝縮進(jìn)行測(cè)定，從而比較PRP和乏血小板血漿，如果同乏血小板血漿相比，血小板不能凝縮凝塊，那么血小板制劑被舍棄；在培養(yǎng)之后，將人血清白蛋白加入至最終濃度5％(w/v)；在ACT-10設(shè)備上對(duì)最終血小板濃度進(jìn)行測(cè)量；和將所述血小板組合物如下冷凍干燥表3冷凍干燥方案

實(shí)施例2凍干血小板的制備開(kāi)發(fā)制備凍干血小板的第二方法，從而提供具有長(zhǎng)的貯存期限和通過(guò)再水化的適宜特性的血小板。發(fā)現(xiàn)該方法提供具有對(duì)體外研究和體內(nèi)治療學(xué)應(yīng)用非常有利的的性能的凍干血小板和由所述凍干血小板重構(gòu)的血小板。
制備凍干血小板的方法包括以下步驟
初始糖負(fù)載方法，包括對(duì)所有溶液、緩沖液、設(shè)備等等進(jìn)行檢查，從而確保每一種均處于或者接近室溫，從而最小化低溫對(duì)血小板的不利影響；獲得富血小板血漿(PRP)；通過(guò)檢查渦旋對(duì)血小板的適用性進(jìn)行檢驗(yàn)，如果沒(méi)有觀察到渦旋，那么血小板被舍棄；對(duì)血小板組合物的pH值進(jìn)行檢查，pH值低于6.2的樣品受到排斥；當(dāng)可應(yīng)用時(shí)，將不同的血小板樣品(例如，PRP)收集入塑料燒杯中；對(duì)所述血小板組合物進(jìn)行攪拌和測(cè)量pH值，如果必要，用ACD緩沖液(85mM檸檬酸鈉；65mM檸檬酸；111mM葡萄糖；在去離子超濾水中；過(guò)濾)將其pH值調(diào)節(jié)至6.6～6.8；在ACT-10儀器上對(duì)血小板數(shù)進(jìn)行確定，并且對(duì)其進(jìn)行稀釋?zhuān)瑥亩寡“逦挥贏CT-10的線性范圍內(nèi)(約10～1000)；必要時(shí)，通過(guò)在固定角離心機(jī)上，在500×g下離心5分鐘將紅血球(RBC)除去，然后將富血小板血漿組分轉(zhuǎn)移到新的干凈燒瓶中和得到新的血小板數(shù)；需要時(shí)，得到PRP樣品以用于后續(xù)分析(5～10ml)；通過(guò)在1500×g下離心15分鐘將血小板制成丸粒；如果需要，通過(guò)抽吸將乏血小板血漿除去并且將其存儲(chǔ)以用于以后應(yīng)用；將所得丸?；难“逶賾腋∮谏倭矿w積(等于先前步驟中除去的乏血小板血漿體積的約10％)的負(fù)載緩沖液(9.5mMHEPES；100mM NaCl；4.8mM KCl；5.0mM葡萄糖；12mMNaHCO3；50mM海藻糖；pH值6.8)中；測(cè)量再懸浮血小板的血小板數(shù)，并且將其濃度調(diào)節(jié)至大約1250(1.25×109/ml，通過(guò)ACT-10設(shè)備進(jìn)行測(cè)量)；對(duì)其體積進(jìn)行記錄；在水浴中，在37℃下將血小板培養(yǎng)2小時(shí)；在培養(yǎng)期間，對(duì)血塊凝縮進(jìn)行測(cè)定，從而比較PRP和乏血小板血漿，如果同乏血小板血漿相比，血小板不能收縮凝塊，那么血小板制劑被舍棄；在培養(yǎng)之后，將Ficoll 400加入到血小板中，從而得到最終濃度6％(w/v)；在ACT-10設(shè)備上對(duì)最終血小板數(shù)進(jìn)行測(cè)量(該數(shù)量一般是大約1000(1×109/ml)；對(duì)上述血小板進(jìn)行等分，并且利用與表3中所述的相同的冷凍干燥方案將其冷凍干燥；在冷凍干燥之后，在真空下將在其中冷凍干燥血小板的管形瓶塞住、立即封蓋并且在烘箱中在多種溫度和時(shí)間下對(duì)其進(jìn)行烘烤。
需要時(shí)，用與冷凍干燥前的體積等體積的再水化緩沖液加入到干燥血小板中對(duì)血小板進(jìn)行再水化。例如，如果對(duì)1ml組合物進(jìn)行冷凍干燥，那么為了再水化，將加入1ml重構(gòu)緩沖液。
所述再水化過(guò)程通常涉及以下物質(zhì)加入蒸餾水；蒸餾水溶液中的6％Ficoll-400；蒸餾水溶液中的6％Ficoll-400、2mM氯化鈣；或者蒸餾水溶液中的6％Ficoll-400、2mM氯化鈣、1mM氯化鎂。
在使用之前，使再水化血小板在室溫下平衡30秒～300秒。
實(shí)施例3本發(fā)明組合物的制備非自體性血小板購(gòu)自于BRT Labs(Baltimore，MD)并且在抽取4～24小時(shí)內(nèi)使用。通過(guò)低速離心(135×g)15分鐘除去紅血球，獲得富血小板血漿(PRP)。通過(guò)加入1/14體積的ACD(酸性檸檬酸鹽葡萄糖溶液)將離心的PRP(沒(méi)有紅血球)酸化至pH6.5，然后通過(guò)在1000×g下離心10分鐘將其制成丸粒。將乏血小板血漿傾倒出，并且將沉積的細(xì)胞在紙巾上弄干，從而除去血漿蛋白質(zhì)?？蛇x擇地，通過(guò)用塑料移液吸管抽吸將剩余液體除去。將血小板再懸浮于pH值為6.8的含有50mM海藻糖的1ml無(wú)陽(yáng)離子Tyrodes緩沖液中，將血小板濃度調(diào)節(jié)至～1.0×109/ml。在37℃下將混合物培養(yǎng)2小時(shí)，每半個(gè)小時(shí)將其混合一次。最后，將白蛋白(BSA)濃度調(diào)節(jié)至用于冷凍干燥的血小板制劑的5％(w/v)。根據(jù)表3進(jìn)行冷凍干燥。
在0、5、30和50kGy下對(duì)所得冷凍干燥組合物進(jìn)行輻照、包裝并且將其密封，以用于多種應(yīng)用。
實(shí)施例4制造凍干血小板的備選方法開(kāi)發(fā)制備凍干血小板的方法，從而提供具有長(zhǎng)的貯存期限和通過(guò)再水化的適宜特性的血小板。發(fā)現(xiàn)該方法提供具有有利于體外研究和體內(nèi)治療學(xué)應(yīng)用的性能的凍干血小板和由所述凍干血小板重構(gòu)的血小板。
制備凍干血小板的方法包括以下步驟初始糖負(fù)載方法，包括對(duì)所有溶液、緩沖液、設(shè)備等等進(jìn)行檢查，從而確保每一種均處于或者接近室溫，從而最小化低溫對(duì)血小板的不利影響；獲得富血小板血漿(PRP)；通過(guò)檢查渦旋對(duì)血小板的適用性進(jìn)行檢驗(yàn)，如果沒(méi)有觀察到渦旋，那么血小板被舍棄；對(duì)血小板組合物的pH值進(jìn)行檢查，pH值低于6.2的樣品被舍棄；當(dāng)可應(yīng)用時(shí)，將不同的血小板樣品(例如，PRP)收集入塑料燒杯中；
對(duì)所述血小板組合物進(jìn)行攪拌和測(cè)量其pH值，如果必要，用ACD緩沖液(85mM檸檬酸鈉；65mM檸檬酸；111mM葡萄糖；在去離子超濾水中；過(guò)濾)將其pH值調(diào)節(jié)至6.6～6.8；在ACT-10儀器上對(duì)血小板數(shù)進(jìn)行測(cè)定，并且對(duì)其進(jìn)行稀釋?zhuān)瑥亩寡“逦挥贏CT-10的線性范圍內(nèi)(約10～1000)；將血小板相等地分入不同的離心瓶中；必要時(shí)，通過(guò)在固定角離心機(jī)上，在500×g下離心5分鐘將紅血球(RBC)除去，然后將富血小板血漿組分轉(zhuǎn)移到新的干凈燒瓶中和得到新的血小板數(shù)；需要時(shí)，得到PRP樣品以用于后續(xù)分析(5～10ml)；通過(guò)在1500×g下離心15分鐘將血小板制成丸粒；如果需要，通過(guò)抽吸將乏血小板血漿除去并且將其存儲(chǔ)以用于以后應(yīng)用；將所得丸粒化的血小板再懸浮于少量體積(等于先前步驟中除去的乏血小板血漿體積的約5％)的負(fù)載緩沖液(9.5mMHEPES；100mM NaCl；4.8mM KCl；5.0mM葡萄糖；12mMNaHCO3；50mM海藻糖；pH值6.8)中；測(cè)量再懸浮血小板的血小板數(shù)，并且將其濃度調(diào)節(jié)至大約1250(1.25×109/ml，通過(guò)ACT-10設(shè)備進(jìn)行測(cè)量)；對(duì)其體積進(jìn)行記錄；在水浴中，在37℃下將血小板培養(yǎng)2小時(shí)；在培養(yǎng)期間，對(duì)血塊凝縮進(jìn)行測(cè)定，從而比較PRP和乏血小板血漿，如果同乏血小板血漿相比，血小板不能凝縮凝塊，那么血小板制劑被舍棄；在培養(yǎng)之后，將人血清白蛋白加入至最終濃度5％(w/v)；在ACT-10設(shè)備上對(duì)最終血小板濃度進(jìn)行測(cè)量；和如上表3所示將血小板組合物冷凍干燥；
實(shí)施例5制造具有升高百分比微粒的凍干血小板的備選方法開(kāi)發(fā)制備凍干血小板的方法，從而提供具有長(zhǎng)的貯存期限和通過(guò)再水化的適宜特性的血小板。發(fā)現(xiàn)該方法提供具有對(duì)體外研究和體內(nèi)治療學(xué)應(yīng)用有利的性能并且具有高百分比微粒的凍干血小板和由所述凍干血小板重構(gòu)的血小板。
制備凍干血小板的方法包括以下步驟初始糖負(fù)載方法，包括對(duì)所有溶液、緩沖液、設(shè)備等等進(jìn)行檢查，從而確保每一種均處于或者接近室溫，從而最小化低溫對(duì)血小板的不利影響；獲得富血小板血漿(PRP)；通過(guò)檢查渦旋對(duì)血小板的適用性進(jìn)行檢驗(yàn)，如果沒(méi)有觀察到渦旋，那么血小板被舍棄；對(duì)血小板組合物的pH值進(jìn)行檢查，pH值低于6.2的樣品被舍棄；當(dāng)可應(yīng)用時(shí)，將不同的血小板樣品(例如，PRP)收集入塑料燒杯中；對(duì)所述血小板組合物進(jìn)行攪拌和測(cè)量其pH值，如果必要，用ACD緩沖液(85mM檸檬酸鈉；65mM檸檬酸；111mM葡萄糖；在去離子超濾水中；過(guò)濾)將其pH值調(diào)節(jié)至6.6～6.8；在ACT-10儀器上對(duì)血小板數(shù)進(jìn)行確定，并且對(duì)其進(jìn)行稀釋?zhuān)瑥亩寡“逦挥贏CT-10的線性范圍內(nèi)(約10～1000)；將血小板相等地分入不同的離心瓶中；必要時(shí)，通過(guò)在固定角離心機(jī)上，在500×g下離心5分鐘將紅血球(RBC)除去，然后將富血小板血漿組分轉(zhuǎn)移到新的干凈燒瓶中和得到新的血小板數(shù)；需要時(shí)，得到PRP樣品以用于后續(xù)分析(5～10ml)；
通過(guò)在1500×g下離心15分鐘將血小板制成丸粒；如果需要，通過(guò)抽吸將乏血小板血漿除去并且將其存儲(chǔ)以用于以后應(yīng)用；將所得丸?；难“逶賾腋∮谏倭矿w積(等于先前步驟中除去的乏血小板血漿體積的約5％)的負(fù)載緩沖液(9.5mMHEPES；100mM NaCl；4.8mM KCl；5.0mM葡萄糖；12mMNaHCO3；50mM海藻糖；pH值6.8)中；測(cè)量再懸浮血小板的血小板數(shù)，并且將其濃度調(diào)節(jié)至大約1250(1.25×109/ml，通過(guò)ACT-10設(shè)備進(jìn)行測(cè)定)；對(duì)其體積進(jìn)行記錄；在水浴中，在37℃下將血小板培養(yǎng)2小時(shí)；在培養(yǎng)期間，對(duì)血塊凝縮進(jìn)行測(cè)定，比較PRP和乏血小板血漿，如果同乏血小板血漿相比，血小板不能收縮凝塊，那么血小板制劑被舍棄；在培養(yǎng)之后，將人血清白蛋白加入至最終濃度5％(w/v)；在ACT-10儀器上對(duì)最終血小板濃度進(jìn)行測(cè)量；通過(guò)浸入液氮(-190℃)中60秒，對(duì)血小板濃縮物進(jìn)行快速凍結(jié)；和如上表3所示將血小板組合物冷凍干燥。
實(shí)施例6本領(lǐng)域用于產(chǎn)生凍干血小板的方法的比較例為了產(chǎn)生用于與根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案制備的凍干血小板進(jìn)行比較的凍干血小板，使用本領(lǐng)域已知的方案制備凍干血小板。該方法包括通過(guò)使用吊桶式轉(zhuǎn)頭(swinging bucket rotor)和非離心破碎，在320×g下將血液(在CPD或者CPDA抗凝血溶液中)離心14分鐘，獲得PRP；將PRP除去和轉(zhuǎn)入新鮮試管中，注意避免RBC污染；
從100X原液中加入PGE1的乙醇溶液至10μg/ml，并且對(duì)血小板進(jìn)行計(jì)數(shù)；在480×g下將血小板離心25分鐘；通過(guò)抽吸將乏血小板上清液除去；以1×109/ml將血小板再懸浮于pH值為6.8的含有5mM葡萄糖和40mM海藻糖與2mM Mg2+加上10μg/mL PGE1(從1mg/ml原液以1∶100加入)的Tyrodes磷酸鹽緩沖液中(即，4.63mMNa2HPO4，5.37mM NaH2PO4，120mM NaCl，2.67mM KCl，2mMNaHCO3，5mM葡萄糖，2mM MgCl2，40mM海藻糖，pH值6.8(從在乙醇中的1mg/ml的原液加入PGE1至10μg/ml)；如果需要，保存少量以用于進(jìn)一步測(cè)定；在37℃下將樣品培養(yǎng)4小時(shí)，通過(guò)每半小時(shí)的溫和倒置將其混合；如果需要，將樣品除去，從而進(jìn)行功能測(cè)試(例如，凝集計(jì)和FACS)；在480×g下將所述組合物離心15分鐘；通過(guò)抽取將上清液除去；將所得丸粒以1～2×109/ml再懸浮于含有5％人血清白蛋白、100mM海藻糖和1mM MgCl2的pH值為6.8的等滲HEPES鹽水中(即，9.5mM HEPES，75mM NaCl，4.8mM KCl，1.00mMMgCl2，100mM海藻糖，5％人血清白蛋白，pH6.8)；在ACT-10設(shè)備上對(duì)血小板進(jìn)行計(jì)數(shù)，并且記錄血小板數(shù)和體積；需要時(shí)，將樣品移走并且將其存儲(chǔ)，以用于后期試驗(yàn)中(例如，功能試驗(yàn))；將血小板轉(zhuǎn)入到具有阻塞封蓋的冷凍干燥管形瓶中，并且對(duì)各個(gè)管形瓶中的內(nèi)容物進(jìn)行稱(chēng)重；
利用與實(shí)施例1中相同的冷凍干燥周期將血小板冷凍干燥；在真空下將冷凍干燥血小板密封在冷凍干燥管形瓶中；在缺少干燥劑下，將冷凍干燥血小板貯存在室溫或者2～8℃下；和需要時(shí)，用無(wú)菌水對(duì)所述凍干血小板進(jìn)行再水化如下加入的水的體積＝冷凍干燥之前的管形瓶重量減去冷凍干燥之后的管形瓶重量，假定1ml水＝1.0g。
為了確定根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案制備的凍干血小板的特性，將根據(jù)以上實(shí)施例2制備的凍干血小板再水化于蒸餾水中，并且測(cè)試其多種物理和功能性能。
存在于實(shí)施例1和2中的方案、以及任選的HLA減少步驟(以下進(jìn)行詳述)和實(shí)施例6的對(duì)比方案的圖解流程圖對(duì)照示于圖1中。
實(shí)施例7根據(jù)實(shí)施例2制備的凍干血小板的表征為了確定根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案制備的凍干血小板的特性，如上所述對(duì)根據(jù)以上實(shí)施例2制備的凍干血小板進(jìn)行再水化，并且測(cè)試多種物理和功能性能。
在一組試驗(yàn)中，以劑量依賴型的方式對(duì)重構(gòu)血小板促進(jìn)血漿凝固時(shí)間的能力進(jìn)行測(cè)定。對(duì)于這些試驗(yàn)，將100μl APCT(活化血漿凝固時(shí)間，Analytical Control Systems，Inc.，F(xiàn)ishers，IN)試劑與25μl多種濃度的水-重構(gòu)凍干血小板和25μl得自于商業(yè)供應(yīng)商的血漿進(jìn)行混合。在水浴中，在37℃下將上述混合物培養(yǎng)3分鐘，然后將100μl 0.02M的CaCl2(37℃)加入并且對(duì)凝固時(shí)間進(jìn)行確定。
從圖2中可以看出，根據(jù)實(shí)施例2制備的重構(gòu)凍干血小板以類(lèi)似于新鮮血小板的形式，以劑量依賴方式促進(jìn)血漿凝固時(shí)間。更具體而言，圖2顯示了多種制劑的凝固時(shí)間，包括富血小板血漿(PRP；欄1)、乏血小板血漿(PPP)和本發(fā)明多種濃度的凍干血小板(FDP)?？梢钥闯?，F(xiàn)DP表現(xiàn)出至少與PRP一樣好的凝固能力，但是當(dāng)血小板數(shù)目降低時(shí)凝固有效性下降。
在另一組試驗(yàn)中，對(duì)通過(guò)實(shí)施例2的方案制備的重構(gòu)FDP促進(jìn)血塊凝縮的能力進(jìn)行試驗(yàn)。簡(jiǎn)要而言，所述過(guò)程涉及將約4.5×107個(gè)重構(gòu)血小板/ml加入到1ml乏血小板血漿中。向此溶液中加入0.02M的CaCl2，并且在37℃下對(duì)其進(jìn)行培養(yǎng)。對(duì)初始形成的凝塊進(jìn)行測(cè)量，并且在30分鐘時(shí)，對(duì)此凝塊的長(zhǎng)度再次測(cè)量?；诹銜r(shí)和30分鐘時(shí)的凝塊長(zhǎng)度對(duì)血塊凝縮量進(jìn)行計(jì)算。
從圖3中可以看出，本發(fā)明的重構(gòu)凍干血小板可以以與新鮮血小板相同的方式促進(jìn)血塊凝縮。更具體而言，在重構(gòu)FDP中的相對(duì)血塊凝縮量高于PPP，并稍低于類(lèi)似量的PRP。
實(shí)施例8冷凍干燥后加熱步驟對(duì)凍干血小板尺寸和粒度的影響為了確定實(shí)施例2中所述方案的冷凍干燥后處理步驟的作用，對(duì)通過(guò)該方案制備的重構(gòu)血小板的尺寸和粒度進(jìn)行測(cè)定，并且將其與以相同方式處理的新鮮血小板的尺寸和粒度進(jìn)行比較。使用log-log設(shè)定，在Becton Dickenson FACS caliber儀器上進(jìn)行試驗(yàn)。血小板的特征在于它們代表性的向前和側(cè)向散射光線圖(使用凝膠過(guò)濾的血小板進(jìn)行)和與FITC抗人CD41的結(jié)合。在分離的試管中，在HBMT中將血小板稀釋至～50,000/μl，并且在環(huán)境溫度下，以飽和劑量加入熒光-標(biāo)記抗體30分鐘。用2mlHMBT稀釋樣品并且收集10,000個(gè)個(gè)體事件。對(duì)熒光柱形圖和陽(yáng)性細(xì)胞百分比進(jìn)行記錄，這表示與熒光標(biāo)記的抗體結(jié)合的血小板數(shù)目。所得結(jié)果示于圖4～6中。
圖4示出了表示測(cè)定根據(jù)實(shí)施例2制備的重構(gòu)凍干血小板的尺寸和粒度的試驗(yàn)結(jié)果的圖表，該制備使用和未使用冷凍干燥后熱處理步驟。熱處理的重構(gòu)FDP(在80℃下加熱24小時(shí))的尺寸分布(圖4A)和粒度(圖4B)事實(shí)上與新鮮血小板相同，然而未熱處理的重構(gòu)FDP尺寸較小并且脫顆?；?br> 圖5示出在從75℃至80℃至85℃的多種溫度下，冷凍干燥后熱處理步驟對(duì)血小板尺寸的影響，使用未加熱樣品作為對(duì)照。更具體而言，根據(jù)實(shí)施例2中所述過(guò)程制備的凍干血小板彼此等同地形成，直至熱處理點(diǎn)。在熱處理步驟中，在75℃、80℃或者85℃下將樣品加熱24小時(shí)，或者在室溫下將其保持24小時(shí)。正好在進(jìn)行對(duì)比分析之前制備在血漿中的新鮮血小板。將各個(gè)溫度下各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的樣品合并，并且使用FACS分析對(duì)血小板尺寸進(jìn)行測(cè)定。示于圖5中的結(jié)果表明，在高達(dá)80℃的溫度下加熱凍干血小板18～24小時(shí)增大了血小板尺寸(即，同新鮮血小板相比，促進(jìn)了尺寸保持)，但是在85℃或者更高溫度下加熱會(huì)降低有益效果。處理18小時(shí)得到了類(lèi)似的結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)。
圖6是示出在從75℃至80℃至85℃的多個(gè)溫度下，24小時(shí)的冷凍干燥后熱處理步驟對(duì)血小板粒度的影響的圖表，使用未加熱樣品作為對(duì)照。更具體而言，根據(jù)實(shí)施例2中所述過(guò)程制備的凍干血小板彼此等同地產(chǎn)生，直至熱處理點(diǎn)。在熱處理步驟中，在75℃、80℃或者85℃下將樣品加熱24小時(shí)，或者在室溫下將其保持24小時(shí)。在進(jìn)行分析之前制備在血漿中的新鮮血小板。將各個(gè)溫度下各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的樣品合并，并且使用FACS分析對(duì)血小板制劑的粒度進(jìn)行測(cè)定。示于圖6中的結(jié)果表明，在高達(dá)80℃的溫度下，特別是在約80℃下加熱凍干血小板18～24小時(shí)增大了血小板粒度(即，類(lèi)似于新鮮血小板的粒度)，但是在85℃或者更高溫度下加熱會(huì)降低有益效果。培養(yǎng)18小時(shí)得到了類(lèi)似的結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)。
實(shí)施例9同其它方法相比，冷凍干燥后熱處理對(duì)凍干血小板尺寸的影響為了確定本發(fā)明凍干血小板的適用性，并且特別是利用實(shí)施例2中公開(kāi)的熱處理步驟產(chǎn)生的那些凍干血小板的適用性，測(cè)定三個(gè)樣品的尺寸。第一個(gè)樣品包含在血漿中的新鮮血小板。第二個(gè)樣品包括根據(jù)實(shí)施例6的對(duì)比方法制備的重構(gòu)血小板，其中所述凍干血小板用蒸餾水進(jìn)行重構(gòu)。第三個(gè)樣品包括根據(jù)實(shí)施例2制備的重構(gòu)凍干血小板，在80℃下應(yīng)用冷凍干燥后熱處理24小時(shí)并且用蒸餾水進(jìn)行重構(gòu)。對(duì)各個(gè)樣品進(jìn)行如上所述的FACS分析，所得結(jié)果示于圖7中。
圖7中的結(jié)果示出了各個(gè)樣品的平均尺寸和粒度。對(duì)含有新鮮血小板的樣品進(jìn)行分析(圖7A)，位于FACS圖上的門(mén)或者窗口表示定位基本上所有血小板的區(qū)域。對(duì)含有根據(jù)實(shí)施例6的比較例制備的重構(gòu)凍干血小板的樣品進(jìn)行類(lèi)似地分析，位于FACS圖上的門(mén)或者窗口定位于與圖7A中相同的位置。最后，對(duì)含有根據(jù)實(shí)施例2中公開(kāi)的方案制備的重構(gòu)凍干血小板的樣品進(jìn)行類(lèi)似地分析，位于FACS圖上的門(mén)或者窗口定位于與圖7A中相同的位置。從圖7A、7B和7C對(duì)比中可以看出，同新鮮血小板相比，含有根據(jù)本發(fā)明重構(gòu)凍干血小板的樣品表現(xiàn)出幾乎相同的尺寸和粒度分布，然而通過(guò)由比較例制備的重構(gòu)血小板顯著移出了新鮮血小板定位的區(qū)域。該實(shí)施例表明，根據(jù)本發(fā)明方法制備的重構(gòu)凍干血小板比通過(guò)本領(lǐng)域已知方案制備的重構(gòu)凍干血小板更類(lèi)似于新鮮血小板。
實(shí)施例10根據(jù)實(shí)施例2制備的凍干血小板的生物學(xué)活性表征為了證明重構(gòu)凍干血小板可以響應(yīng)激動(dòng)劑的加入進(jìn)行聚集，將多種激動(dòng)劑(0.5mg/ml的花生四烯酸、10μg/ml的膠原、300μm腎上腺素、10mM凝血酶受體活化肽(TRAPSFLLRN)和1mg/ml瑞斯托菌素加上20％檸檬酸化血漿和鹽水加入到在400μl的250,000個(gè)血小板/μl的HEPES-Tyrodes緩沖液中的重構(gòu)凍干血小板中至最終體積為500μl，所述緩沖液含有0.3％牛血清白蛋白(BSA)。5分鐘之后，在室溫下對(duì)血小板的聚集進(jìn)行確定。使用標(biāo)準(zhǔn)全血細(xì)胞計(jì)數(shù)設(shè)備(得自于Beckman coulter的ACT 10)對(duì)血小板進(jìn)行計(jì)數(shù)。結(jié)果表明，響應(yīng)花生四烯酸、膠原、腎上腺素、凝血酶受體活化肽(TRAP)和瑞斯托菌素聚集的凍干血小板的聚集百分比經(jīng)測(cè)定分別為77、83、86、93、97和10(參見(jiàn)以上表1)。
實(shí)施例11通過(guò)重構(gòu)的血小板表面標(biāo)志的表征在另一系列試驗(yàn)中，對(duì)根據(jù)實(shí)施例2制備的重構(gòu)凍干血小板，在80℃下進(jìn)行熱處理步驟24小時(shí)，測(cè)定通用的血小板表面標(biāo)志。試驗(yàn)使用如上所述的FACS分析利用以下熒光抗體進(jìn)行同種型 BD Pharminagen鼠IgG kappaHLA BD Pharminagen抗人HLA-A-B-CGPIb DakoCytomation鼠抗人CD42b克隆AN51IIbIIIa DakoCytomation鼠抗人CD41克隆5b12P-選擇蛋白BD Pharminagen抗人CD62P(cat#555523)。
為了確定本發(fā)明凍干血小板保持與血小板功能相關(guān)的表面受體的能力，對(duì)剛好在試驗(yàn)前制備的新鮮血小板、利用實(shí)施例2中公開(kāi)的熱處理步驟生產(chǎn)的血小板和根據(jù)實(shí)施例6的對(duì)比方法生產(chǎn)的血小板進(jìn)行FACS分析。所有凍干血小板都用蒸餾水進(jìn)行重構(gòu)。
如上所指出，對(duì)于新鮮血小板的基線計(jì)算，將以下數(shù)值進(jìn)行再調(diào)節(jié)并標(biāo)準(zhǔn)化成百分比。對(duì)于新鮮血小板，將組成表達(dá)的受體GP1b、GPIIb/IIIa和HLA的百分比設(shè)定為100％。對(duì)于P-選擇蛋白，當(dāng)血小板休眠(resting)時(shí)該蛋白不表達(dá)(一般來(lái)說(shuō)5～10％表達(dá))，當(dāng)血小板活躍時(shí)完全表達(dá)(100％)。
相對(duì)于新鮮血小板，利用實(shí)施例2中公開(kāi)的熱處理步驟生產(chǎn)的凍干血小板顯示，結(jié)構(gòu)表達(dá)受體GP1b和GPIIb/IIIa的百分比分別為65～75％和100％。對(duì)于HLA，相對(duì)于新鮮血小板，當(dāng)進(jìn)行酸處理時(shí)，HLA表達(dá)的水平被降低至5％，當(dāng)未進(jìn)行酸處理時(shí)它們保持在100％。對(duì)于P-選擇蛋白，該蛋白結(jié)構(gòu)表達(dá)了凍干血小板是否活躍或者休眠。所得結(jié)果以表格形式示于以上表2中。
由此，在實(shí)施例2中所示的熱處理步驟可以有助于保持GPIb表達(dá)，這是用于止血的重要蛋白質(zhì)。
實(shí)施例12乙醇在糖-負(fù)載緩沖液和冷凍干燥緩沖液中的作用根據(jù)本發(fā)明一種實(shí)施方案的方案將乙醇包含在糖-負(fù)載緩沖液和冷凍干燥緩沖液中。為了確定這些緩沖液中乙醇存在的影響，根據(jù)實(shí)施例2的方法制備凍干血小板，在多個(gè)溫度下熱處理24小時(shí)，重構(gòu)和測(cè)定其大小和粒度。更具體而言，對(duì)新鮮血小板(對(duì)照)、在負(fù)載緩沖液或者冷凍干燥緩沖液中沒(méi)有乙醇的情況下用海藻糖負(fù)載的重構(gòu)凍干血小板，和在1％乙醇存在下用海藻糖負(fù)載和0.8％乙醇存在下冷凍干燥的重構(gòu)凍干血小板進(jìn)行FACS分析。結(jié)果示于圖8中。
從圖8中可以看出，同乙醇不存在下進(jìn)行的類(lèi)似方案相比，在負(fù)載緩沖液和冷凍干燥緩沖液兩者中乙醇的存在改善了重構(gòu)凍干血小板的尺寸分布。與此相比，它對(duì)重構(gòu)血小板的粒度沒(méi)有顯著影響。本發(fā)明首次提供證據(jù)表明在負(fù)載緩沖液特別是冷凍干燥緩沖液中包含乙醇有助于穩(wěn)定血小板和促進(jìn)負(fù)載步驟中血小板的糖吸收。
實(shí)施例13HLA降低制備本發(fā)明凍干血小板的方法的一個(gè)實(shí)施方案包括任選的HLA降低步驟。為了確定該任選步驟連同實(shí)施例1和2所述方法的有效性，在這些實(shí)施例中的每一個(gè)剛好在初始丸?；“逯筮M(jìn)行該任選步驟。各個(gè)實(shí)施例的HLA降低細(xì)節(jié)提供如下。
將實(shí)施例1和2的丸?；“逶賾腋∮诤苌袤w積的還原緩沖液(9.5mM HEPES；100mM NaCl；4.8mM KCl；5.0mM葡萄糖；12mM NaHCO3；100mM EGTA；pH4.0)中，其中該步驟中定義的很少體積的還原緩沖液等于從先前步驟中除去的乏血小板血漿的體積的約10％。在室溫下培養(yǎng)2小時(shí)之后，將血小板用與還原緩沖液相同體積的洗滌緩沖液(9.5mM HEPES；100mMNaCl；4.8mM KCl；5.0mM葡萄糖；12mM NaHCO3；pH6.8)洗滌三次，并且如前所述對(duì)其進(jìn)行丸粒化。
可以將任選步驟加入方案中，從而提供降低組合物免疫原性的靈活性。在蒸餾水中對(duì)根據(jù)以上實(shí)施例2制備的凍干血小板進(jìn)行在再水化，并且測(cè)定HLA在血小板表面上的量。為了分析HLA在凍干血小板表面上的含量，在Becton Dickenson FACScaliber儀器上利用log-log設(shè)置進(jìn)行上述試驗(yàn)。血小板的特征在于它們代表性的向前和側(cè)向散射光線圖(使用凝膠過(guò)濾的血小板進(jìn)行)和與FITC抗人HLA-A-B-C的結(jié)合。在分離的試管中，在HBMT中將血小板稀釋至～50,000/μl，并且在環(huán)境溫度下，以飽和劑量加入熒光-標(biāo)記抗體30分鐘。用2ml HMBT稀釋樣品并且收集10,000個(gè)個(gè)體事件(event)。對(duì)熒光柱形圖和陽(yáng)性細(xì)胞百分比進(jìn)行記錄，這表示與熒光標(biāo)記的抗體結(jié)合的血小板數(shù)目。
從圖9中可以看出，在不經(jīng)過(guò)酸處理下，對(duì)照血小板表達(dá)了強(qiáng)熒光信號(hào)，然而，對(duì)于如實(shí)施例2中所述的用酸性緩沖液處理的血小板，熒光信號(hào)降低差不多95％。
實(shí)施例14基于細(xì)胞的增殖測(cè)定使用根據(jù)實(shí)施例4制備的組合物進(jìn)行成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞增殖測(cè)定。簡(jiǎn)要而言，所述凍干血小板制備如下將血小板收集入酸性檸檬酸鹽葡萄糖溶液(ACD)抗凝血緩沖液(1.5體積+8.5體積血液)中。通過(guò)低速離心(135×g下15分鐘)除去紅血球，獲得富血小板血漿(PRP)。通過(guò)加入1/14體積的ACD將PRP酸化至pH6.5，然后通過(guò)在1000×g下離心10分鐘將其制成丸粒。將血小板丸粒再懸浮于pH值為6.8的含有50mM海藻糖的1ml無(wú)陽(yáng)離子Tyrodes緩沖液中，將其調(diào)節(jié)至～1.0×109個(gè)血小板/ml。在37℃下將混合物培養(yǎng)2小時(shí)，每半個(gè)小時(shí)將其混合一次。最后將白蛋白加入，至最終濃度為占全部血小板制劑體積的5％，并且對(duì)血小板制劑進(jìn)行冷凍干燥。
在沒(méi)有胎牛血清補(bǔ)充物的情況下使用介質(zhì)，將分別在通道3和7的成纖維細(xì)胞和人類(lèi)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)饑餓24小時(shí)。24小時(shí)之后，使細(xì)胞傳代并且以10,000個(gè)細(xì)胞/孔播種在96孔平底培養(yǎng)皿中，使其連接2～3小時(shí)。一旦細(xì)胞得到連接，加入樣品并在37℃、5％CO2的潤(rùn)濕培養(yǎng)器中培養(yǎng)48小時(shí)。48小時(shí)時(shí)，通過(guò)MTT測(cè)定(ATCC)對(duì)細(xì)胞增殖進(jìn)行測(cè)量，其中細(xì)胞還原的MTT染料可以由590～650nm下的吸光率測(cè)定。簡(jiǎn)要而言，以1∶10的比例將MTT顏料加入到孔中，并且將該培養(yǎng)皿在37℃、5％CO2的潤(rùn)濕培養(yǎng)器中培養(yǎng)2～3小時(shí)。培養(yǎng)之后，將100μl去垢劑加入并且在590～650nm下測(cè)定其光強(qiáng)度。將從A590-650中讀取的數(shù)值用作參比增殖指數(shù)。
增殖測(cè)定結(jié)果示于圖10中，這表明本發(fā)明凍干血小板對(duì)成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞增殖具有基本上與新鮮血小板相同的影響。
實(shí)施例15膠原-成纖維細(xì)胞收縮測(cè)定為了更進(jìn)一步表征實(shí)施例3生產(chǎn)的血小板，使用這些血小板進(jìn)行膠原收縮測(cè)定。對(duì)于膠原收縮測(cè)定，通過(guò)用0.05％胰蛋白酶/0.02％EDTA處理對(duì)80％融合的成纖維細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行收集。通過(guò)在含有0.2％BSA的PBS中加入大豆胰蛋白酶抑制劑對(duì)胰蛋白酶進(jìn)行滅活。用DMEM+10％FBS將上述細(xì)胞洗滌兩次并且以1×106個(gè)細(xì)胞/ml的濃度再懸浮。將成纖維細(xì)胞與10％FBS混合，中和膠原和濃縮DMEM，從而使得DMEM和碳酸氫鈉的最后濃度為1X。在一些試驗(yàn)中，將FBS由30ng/ml PDGF-BB和2％BSA或者本發(fā)明重構(gòu)組合物與2％BSA的稀釋物替代。將所述細(xì)胞混合物的樣品(0.6ml)加入到24孔組織培養(yǎng)皿上的孔中，所述孔預(yù)涂有2％BSA，并且在37℃下使膠原進(jìn)行聚合。膠原的最終濃度為約1.8mg/ml，并且各種凝膠含有6×104個(gè)細(xì)胞。在進(jìn)行兩個(gè)小時(shí)的培養(yǎng)之后，將凝膠溫和地從塑料表面上分離從而使其進(jìn)行收縮，向各個(gè)孔中加入0.5ml DMEM+10％FBS，并且在37℃下在5％CO2中將凝膠培養(yǎng)過(guò)夜。如果通過(guò)加入PDGF-BB使膠原凝膠進(jìn)行收縮，那么向加入的介質(zhì)中補(bǔ)充30ng/mlPDGF-BB+2％BSA而不是FBS。
膠原收縮測(cè)定的結(jié)果示于圖11中。更具體而言，圖11示出用本發(fā)明凍干血小板改造的膠原-成纖維細(xì)胞基體圖。當(dāng)將鼠尾I型膠原(rat tail type I collagen)和成纖維細(xì)胞的混合物僅僅培養(yǎng)在介質(zhì)(對(duì)照)中、富血小板血漿(新鮮血小板)和根據(jù)本發(fā)明使用實(shí)施例4制備的組合物(FDP)中時(shí)，含有本發(fā)明組合物的樣品、FDP和新鮮血小板都表現(xiàn)了膠原重建和收縮，然而對(duì)照樣品沒(méi)有顯示收縮。
顯示在圖11中的試驗(yàn)用于評(píng)價(jià)本發(fā)明組合物對(duì)傷口愈合和重建的影響。雖然難于表現(xiàn)組織體外重建，但是已經(jīng)將在三維天然I型膠原凝膠中的成纖維細(xì)胞培養(yǎng)用于示范傷口愈合中的傷疤形成和組織重建。多項(xiàng)先前研究表明，PDGF和新鮮血小板可以促進(jìn)膠原凝膠的體外收縮。如圖11所示，本發(fā)明組合物在24小時(shí)培養(yǎng)中促進(jìn)膠原收縮。由此，本發(fā)明組合物促進(jìn)膠原基體再組織(reorganization)和成纖維細(xì)胞增殖，并且可以實(shí)現(xiàn)、促進(jìn)或者幫助傷口愈合。
實(shí)施例16組合物的物理特性評(píng)價(jià)使用Beckman Multisizer 3 COULTER COUNTER(Fullerton，CA)對(duì)根據(jù)實(shí)施例3制備的組合物的結(jié)構(gòu)組成進(jìn)行測(cè)定，特別是分析其粒徑。所述multisizer提供尺寸和體積分布，范圍高達(dá)10μm內(nèi)。在此使用的血小板的體積為2～4μm，其中小于1μm的任何物質(zhì)都認(rèn)為是血小板微粒。
圖12顯示了血小板制劑的multisizer分析圖。該圖表明該組合物由使用實(shí)施例4和5的血小板制劑內(nèi)的血小板微粒的百分比組成。從圖12中可以看出，通過(guò)實(shí)施例4所述方法產(chǎn)生的顆粒總數(shù)的約10～50％為微粒(標(biāo)記為FDP-2和FDP-3的樣品)，然而，通過(guò)實(shí)施例5所述方法產(chǎn)生的顆?？倲?shù)超過(guò)70％為微粒(FDP-1)。由此，該實(shí)施例表明，根據(jù)本發(fā)明的組合物在冷凍干燥之前暴露于極度低溫或用水重構(gòu)都表現(xiàn)為血小板微粒和完整血小板的混合物。
另外，在根據(jù)實(shí)施例4和5制備的樣品中，GPIIb/IIIa和其它血小板表面標(biāo)志的表達(dá)可以在血小板和微粒表面上得到檢測(cè)(數(shù)據(jù)未顯示)，其介導(dǎo)組合物組分以可逆和明確方式對(duì)涂有血纖蛋白原的固體表面的結(jié)合(數(shù)據(jù)未顯示)。
實(shí)施例17凍干血小板的凝固功能為了進(jìn)一步表征本發(fā)明組合物，對(duì)通過(guò)實(shí)施例4和5制備的凍干血小板進(jìn)行試驗(yàn)，從而測(cè)定它們提供凝固功能的能力。
圖13A表明了如圖12中所示的含有不同量的微粒的凍干血小板對(duì)全血樣品凝固能力的影響。圖13A中所示數(shù)據(jù)如下獲得對(duì)含有400μl ACD全血、25μl 0.2M的CaCl2、25μl鹽水和50μl多種濃度的重構(gòu)(再水化)凍干血小板的混合物，使用樣品FDP-1、FDP-2和FDP-3確定其凝固時(shí)間。
從圖13A中可以看出，全血測(cè)定結(jié)果表明，同含有較低百分比微粒的樣品FDP-2和FDP-3相比，含有最高量微粒的FDP-3樣品提供最短的凝固時(shí)間。
圖13B表明如圖12中所示的含有不同量的微粒的凍干血小板對(duì)正常庫(kù)血漿樣品凝結(jié)能力的影響。為了測(cè)定凝結(jié)時(shí)間，將100μl APCT(活化血漿凝結(jié)時(shí)間，Analytical Control Systems，Inc.，F(xiàn)ishers，IN)試劑與25μl來(lái)自不同制劑FDP-1、FDP-2或者FDP-3中的多種濃度的水-重構(gòu)凍干血小板和25μl得自于商業(yè)供應(yīng)商的因子-缺失血漿進(jìn)行混合。在水浴中，在37℃下將上述混合物培養(yǎng)3分鐘，然后將100μl 0.02M的CaCl2(37℃)加入并且對(duì)凝結(jié)時(shí)間進(jìn)行確定。
從圖13B中可以看出，基于血漿的測(cè)定結(jié)果表明，同含有較低百分比微粒的樣品FDP-2和FDP-3相比，含有最高量微粒的FDP-3樣品提供最短的凝結(jié)時(shí)間。
實(shí)施例18利用本發(fā)明組合物的體內(nèi)研究進(jìn)行該試驗(yàn)以研究本發(fā)明組合物的止血能力和將其與廣泛應(yīng)用的QuikclotTM和SurgicelTM產(chǎn)品進(jìn)行比較。該試驗(yàn)在QualTech Labs，NJ進(jìn)行。用于研究的Sprague Dawley大鼠得自于Hilltop Lab Animals。試驗(yàn)動(dòng)物為雄性、成熟、等年齡和重量為350g左右。到貨后，將所述動(dòng)物隔離48小時(shí)，在此之后，將所述動(dòng)物成對(duì)罩在具有滿足NIH需求的線罩(lid)的聚丙烯籠中。對(duì)動(dòng)物室的溫度進(jìn)行每日記錄。保持12小時(shí)的明/暗周期。自由進(jìn)食Purina嚙齒動(dòng)物食物和自來(lái)水，但是在研究之前停止食品供應(yīng)過(guò)夜。對(duì)用氯胺酮/甲苯噻嗪7∶1混合物進(jìn)行麻醉的大鼠進(jìn)行研究，所述混合物以0.05ml/100克體重的劑量進(jìn)行肌內(nèi)注射給藥。將各個(gè)試驗(yàn)動(dòng)物置于手術(shù)板上并且將其固定。將頸部和腹部的毛發(fā)除去，并且用betadine對(duì)手術(shù)位置進(jìn)行清洗。然后，暴露頸動(dòng)脈并且將其分離。利用縫合絲線，將所述動(dòng)脈進(jìn)行動(dòng)脈扎緊并且在實(shí)際可遠(yuǎn)離扎緊處夾持。在扎緊和具有20計(jì)量導(dǎo)管放置單元的夾鉗之間，向動(dòng)脈內(nèi)插入導(dǎo)管。對(duì)導(dǎo)管進(jìn)行固定并且將其連接至WECO血壓監(jiān)控器。將夾鉗除去，使得血壓得到穩(wěn)定。在腹壁上實(shí)施約20mm長(zhǎng)的中線切割。將腹部動(dòng)脈分離，使縫合絲線在動(dòng)脈下穿過(guò)，以在研究期間有助于進(jìn)行定位。在此之后，用23計(jì)量針刺穿腹主動(dòng)脈。將多種止血?jiǎng)?，包括本發(fā)明組合物，應(yīng)用到出血位置上。將此與對(duì)照組進(jìn)行比較。對(duì)存活進(jìn)行評(píng)價(jià)，并且監(jiān)控生命特征如收縮血壓、心率和氧飽和30分鐘時(shí)間。在研究結(jié)束時(shí)，對(duì)該嚙齒類(lèi)動(dòng)物實(shí)施安樂(lè)死。
圖14顯示了比較SurgicelTM、QuikClot和本發(fā)明組合物之間出血控制的圖。圖14A提供表明動(dòng)脈創(chuàng)傷位置的參照照片。如圖14B所示，當(dāng)用針刺穿動(dòng)脈和然后將QuikClotTM(2克)立即施加到創(chuàng)傷位置時(shí)，即使進(jìn)行該方法2分鐘之后，由此時(shí)在傷口的血液滲出證實(shí)，該止血?jiǎng)┎荒茏柚钩鲅?。如圖14C所示，作為止血?jiǎng)┑腟urgicelTM的應(yīng)用顯示了相同的圖案，在應(yīng)用該止血?jiǎng)┲笕匀怀掷m(xù)出血超過(guò)兩分鐘。與此相反，當(dāng)使用根據(jù)實(shí)施例5的方法生產(chǎn)的本發(fā)明組合物時(shí)，出血迅速減少，并且在應(yīng)用至傷口位置兩分鐘之內(nèi)，出血被完全停止(圖14D)。基于該數(shù)據(jù)，可以推斷出本發(fā)明止血?jiǎng)﹥?yōu)于本領(lǐng)域已知的其它試劑，并且能夠止血，甚至是嚴(yán)重的動(dòng)脈出血，然而其它止血?jiǎng)┎荒軐?shí)現(xiàn)。
為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)本發(fā)明組合物的體內(nèi)作用，通過(guò)在30分鐘時(shí)間內(nèi)監(jiān)控收縮血壓、平均血壓和心率，對(duì)用于上述試驗(yàn)中的大鼠的生命特征進(jìn)行監(jiān)控。圖15表示腹主動(dòng)脈已經(jīng)被刺穿、隨后用本發(fā)明凍干血小板、SurgicelTM和QuikClotTM與對(duì)照(未向出血位置施壓)處理的嚙齒動(dòng)物平均血壓圖。使用WECO監(jiān)控器測(cè)量血壓30分鐘。在該過(guò)程之后，將所述動(dòng)物殺死。
如圖15所示，在刺穿過(guò)程之后，在SurgicelTM組和對(duì)照組(未向出血位置施壓)中的動(dòng)物的平均血壓一直沒(méi)有恢復(fù)。QuikClotTM組中的動(dòng)物的確重新獲得了一些壓力，但是不能恢復(fù)至正常。與此相反，當(dāng)用本發(fā)明組合物處理時(shí)，在刺穿過(guò)程之后1200～1400秒內(nèi)恢復(fù)了正常壓力，并且該壓力在研究期間都保持穩(wěn)定。
對(duì)嚙齒類(lèi)動(dòng)物的心率進(jìn)行監(jiān)控，僅僅發(fā)現(xiàn)用本發(fā)明組合物處理的組的心率迅速恢復(fù)了正常(對(duì)照組、SurgicelTM和QuikClotTM不能恢復(fù))。
在整個(gè)過(guò)程中，對(duì)動(dòng)物進(jìn)行持續(xù)視覺(jué)監(jiān)控。盡管所有動(dòng)物都存活超過(guò)了30分鐘，但是SurgicelTM、QuikClotTM和對(duì)照組的動(dòng)物盡力呼吸，并且其心率非常微弱。與此相反，用本發(fā)明組合物處理的動(dòng)物呼吸正常并且具有幾乎正常的心率?；谠摂?shù)據(jù)可以推斷出，本發(fā)明組合物可以為有效體內(nèi)止血?jiǎng)?br> 由該數(shù)據(jù)可以看出，本發(fā)明組合物保持了其物理表面結(jié)構(gòu)的大部分及完整性。此外，本組合物可以參與膠原重建和成纖維細(xì)胞增殖(參見(jiàn)先前實(shí)施例)。不受任何具體理論的限制，天然生長(zhǎng)因子庫(kù)可能已經(jīng)包括在本發(fā)明組合物內(nèi)，并且會(huì)有助于傷口處理以及細(xì)胞和組織再生。
所有這些跡象可以表明，本發(fā)明組合物含有限定比例的血小板和血小板微粒的獨(dú)特混合物。此外，這些數(shù)據(jù)還表明，本發(fā)明組合物當(dāng)應(yīng)用它時(shí)能夠迅速和有效封閉高壓出血的主動(dòng)脈。此外，該止血?jiǎng)┗钚詢?yōu)于QuikClotTM或者SurgicelTM，并且被證實(shí)其作為能夠在高壓、不可壓縮出血位置停止出血的止血?jiǎng)┦怯杏煤陀行У摹?br> 實(shí)施例19體內(nèi)特性的進(jìn)一步分析為了進(jìn)一步測(cè)定根據(jù)實(shí)施例4制備的組合物的性能，進(jìn)一步進(jìn)行體內(nèi)傷口愈合研究，和進(jìn)行來(lái)自這些研究中的細(xì)胞的分析。對(duì)于體內(nèi)傷口愈合研究，使用糖尿病性小鼠(雄性Lepr db+/+)。將三十只動(dòng)物排序，并且保持每籠五只，直至切開(kāi)傷口位置為止。以60mg/kg的劑量對(duì)麻醉劑(戊巴比妥鈉/戊巴比妥)進(jìn)行腹膜內(nèi)給藥。通過(guò)掐動(dòng)物腳趾和評(píng)價(jià)其屈肌退縮對(duì)麻醉深度進(jìn)行評(píng)價(jià)。使用電動(dòng)剃刀對(duì)麻醉小鼠的背部進(jìn)行修剪。通過(guò)將除毛洗劑(基于氫氧化鈣)短暫應(yīng)用到皮膚和然后用溫鹽水沖洗除去任何殘余的毛發(fā)。在手術(shù)之前，用betadine對(duì)修剪皮膚進(jìn)行清潔，然后用70％EtOH對(duì)其進(jìn)行擦拭。從小鼠的無(wú)發(fā)背部切開(kāi)1×1cm2的完全厚度傷口，如下所述。用鉗子將皮膚夾起，用剪刀將其剪開(kāi)。將皮膚提起從而確保剪切通過(guò)肉膜移動(dòng)。在第一次剪切之后，用鉗子將部分除去的表皮區(qū)域固定，通過(guò)進(jìn)行二次或者三次另外剪切完成切割。在切割傷口完成之后，將動(dòng)物分成多個(gè)試驗(yàn)組(每組十只動(dòng)物)，將相應(yīng)的試驗(yàn)物質(zhì)施用到傷口層。十只動(dòng)物僅僅接受封閉敷裹；十只動(dòng)物在手術(shù)當(dāng)天接受5×108FDP的單次用藥；十只動(dòng)物在手術(shù)當(dāng)天和手術(shù)后第2、5、9和12天接受5×108FDP的用藥。將安息香酊化合物放置在傷口邊緣周?chē)头胖肨egaderm覆蓋傷口。在手術(shù)之后，以0.05mg/Kg2/12小時(shí)對(duì)小鼠給藥丁丙諾啡24小時(shí)，從而使其在術(shù)后喪失痛覺(jué)，然后根據(jù)需要進(jìn)行每日給藥。在從麻醉中恢復(fù)過(guò)來(lái)之后，將小鼠轉(zhuǎn)入Animal Core Facility中，在此將它們單獨(dú)地關(guān)入籠中，然后每天監(jiān)控兩次。對(duì)小鼠的不活動(dòng)性和食欲降低進(jìn)行監(jiān)控，并且對(duì)其傷口進(jìn)行檢查。在研究期間，每隔一天進(jìn)行一次傷口測(cè)定。這些天中，通過(guò)氣體CO2吸入將各組中的一只動(dòng)物殺死。從這些動(dòng)物中采集血液、腎和肝樣品進(jìn)行免疫原性研究，并且將傷口位置除去進(jìn)行免疫組織分析。從所述研究中除去任何產(chǎn)生傷口感染的動(dòng)物。
傷口層的免疫組織分析示于圖16中。數(shù)據(jù)通過(guò)以下方式得到每三天將傷口層的組織從各組中一只動(dòng)物中除去，進(jìn)行著色。以小功率對(duì)著色部分進(jìn)行掃描，從而鑒定具有最密集的新血管形成的區(qū)域。為了測(cè)定新血管形成，在40x放大率下系統(tǒng)地獲得每個(gè)滑片的3個(gè)區(qū)域，一個(gè)在損傷中央，兩個(gè)在傷口邊緣。
在顯微鏡下進(jìn)行的傷口層組織的細(xì)致測(cè)試顯示，接受FDP、新鮮血小板和VEGF的組產(chǎn)生強(qiáng)烈的新血管形成。新近形成的血管可以在傷口邊緣以及中間部分發(fā)現(xiàn)。當(dāng)對(duì)血管的絕對(duì)數(shù)目進(jìn)行計(jì)數(shù)時(shí)，接受FDP、新鮮血小板和VEGF的樣品中的血管數(shù)目幾乎相等。從圖16中可以看出，封閉敷裹、單劑量和多劑量處理組的傷口層在第1、9和15天時(shí)的微觀觀察顯示了升高的血管形成作用。
圖17圖示了圖16的數(shù)據(jù)。更具體而言，圖17顯示了量化傷口層組織中血管數(shù)目的柱狀圖。因?yàn)閭诮M織需要血管進(jìn)行愈合，因此凍干血小板施于傷口層不僅提供用于組織再生的生長(zhǎng)因子，而且刺激了新血管的生長(zhǎng)。該數(shù)據(jù)表明，通過(guò)本發(fā)明組合物產(chǎn)生的血管數(shù)目類(lèi)似于新鮮血小板和VEGF對(duì)照。由此，所述凍干血小板為有效的傷口愈合劑。
實(shí)施例20傷口閉合速率和多劑量的評(píng)價(jià)對(duì)于此實(shí)施例，進(jìn)行研究以確定與僅僅在手術(shù)當(dāng)天接受1次劑量的動(dòng)物和僅僅接受封閉敷裹的動(dòng)物相比，多次施用凍干血小板對(duì)傷口愈合的影響。對(duì)于多劑量FDP組，動(dòng)物在手術(shù)當(dāng)天和手術(shù)后第2、5、9和12天接受5次5×108的血小板。對(duì)于單劑量FDP組，動(dòng)物在手術(shù)當(dāng)天接受1次5×108血小板的給藥。封閉敷裹組中的動(dòng)物不接受任何血小板。
研究結(jié)果示于圖18中。該圖表明，多劑量FDP組動(dòng)物顯示了更快的傷口閉合速率，對(duì)于完全閉合僅僅需要16天。單劑量和封閉敷裹組的傷口閉合速率較慢，對(duì)于完全閉合需要17天和21天。更具體而言，每隔一天(或者每隔兩天)進(jìn)行傷口測(cè)定。到第16天，多劑量組幾乎實(shí)現(xiàn)了完全傷口閉合，然而單劑量和封閉敷裹組分別需要至少17天和21天。同樣重要的是，貫穿研究持續(xù)期間，多劑量組顯示了比單劑量和封閉敷裹組更小的平均傷口面積。
實(shí)施例21傷口閉合速率和使用有效期內(nèi)和過(guò)期血小板的單劑量給藥的評(píng)價(jià)為了確定多種類(lèi)型的血小板和血小板制劑對(duì)于體內(nèi)治療學(xué)應(yīng)用的適宜性，以單劑量測(cè)定血小板閉合傷口的能力。首先，根據(jù)實(shí)施例4制備過(guò)期一天的血小板。簡(jiǎn)要而言，將血小板收集入酸性檸檬酸鹽葡萄糖溶液(ACD)抗凝血緩沖液(1.5體積+8.5體積血液)中。通過(guò)135×g低速離心15分鐘除去紅血球，獲得富血小板血漿(PRP)。通過(guò)加入1/14體積的ACD將PRP酸化至pH6.5，然后通過(guò)在1000×g下離心10分鐘將其制成丸粒。將血小板丸粒再懸浮于pH值為6.8的含有50mM海藻糖的1ml無(wú)陽(yáng)離子Tyrodes緩沖液中，將其調(diào)節(jié)至～1×109個(gè)血小板/ml。在37℃下將混合物培養(yǎng)2小時(shí)，每半個(gè)小時(shí)將其混合一次。最后，將白蛋白濃度調(diào)節(jié)至用于冷凍干燥的血小板制劑的5％。
對(duì)于該研究，將向動(dòng)物單劑量應(yīng)用有效期內(nèi)或者過(guò)期FDP對(duì)傷口愈合的影響與僅僅應(yīng)用封閉敷裹的影響進(jìn)行對(duì)比。對(duì)于FDP組，動(dòng)物在手術(shù)當(dāng)天接受5×108血小板的一次施用。封閉敷裹組中的動(dòng)物不接受任何血小板。每隔一天(或者每隔兩天)進(jìn)行傷口測(cè)定。從圖19中可以看出，單劑量的本發(fā)明有效期內(nèi)或者過(guò)期凍干血小板需要17天以完全愈合傷口。與此相反，與以上存在的結(jié)果一致，封閉敷裹組需要21天才能完全愈合傷口。由此，有效期內(nèi)和過(guò)期血小板之間的傷口愈合能力不存在差異，它們都優(yōu)于封閉敷裹方法。
實(shí)施例22本發(fā)明組合物的遞送系統(tǒng)對(duì)根據(jù)本發(fā)明的組合物進(jìn)行配制，從而將其懸浮于壓縮空氣以用于氣霧劑系統(tǒng)中。在此系統(tǒng)中，壓縮空氣充當(dāng)推進(jìn)劑以將血小板組合物推動(dòng)到出血位置。在此系統(tǒng)中，該空氣向下推動(dòng)組合物，迫使組合物穿過(guò)氣霧劑系統(tǒng)的封液管和當(dāng)閥門(mén)開(kāi)放時(shí)穿過(guò)閥門(mén)。所述噴霧器含有插入到穿過(guò)傷口位置的腹腔中的噴嘴。所得含有本發(fā)明組合物的噴霧劑在出血位置發(fā)揮作用，從而止血。
實(shí)施例23組合物的物理特性評(píng)價(jià)使用Beckman Multisizer 3 COULTER COUNTER(Fullerton，CA)對(duì)根據(jù)實(shí)施例2制備的組合物的結(jié)構(gòu)組成進(jìn)行進(jìn)一步研究，特別是分析其粒徑。所述multisizer提供尺寸和體積分布，范圍在高達(dá)10μm。在此使用的血小板的體積為2～4μm，其中小于1μm的任何物質(zhì)都認(rèn)為是血小板微粒。
從圖20中示出的數(shù)據(jù)可以清楚看出，其印證了圖4中的數(shù)據(jù)，本發(fā)明組合物，通過(guò)用水進(jìn)行重構(gòu)，保持與新鮮血小板類(lèi)似的大小。此外，從圖20中可以看出，制備凍干血小板的方案可以形成主要含有血小板和在一定程度上含有一些微粒的組合物。更具體而言，圖20圖示了根據(jù)實(shí)施例2中公開(kāi)的方法制備的組合物的尺寸范圍分析結(jié)果。通過(guò)再水化，再水化顆粒表現(xiàn)為血小板和血小板微粒的混合物，通過(guò)定徑數(shù)據(jù)可以證實(shí)(圖20)。據(jù)估計(jì)，微粒的百分比為在組合物中全部顆?？倲?shù)的約1～20％之間的值。
實(shí)施例24凍干血小板作為正常收集的血漿的校準(zhǔn)試劑的用途如上所述，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)凍干血小板可以用于監(jiān)控血小板的功能。在此血管中，對(duì)凍干血小板參與血液凝固的能力進(jìn)行確定。為了進(jìn)行上述試驗(yàn)，將多種量的凍干血小板與從多個(gè)正常供血者收集的血漿混合，并且對(duì)產(chǎn)生凝塊所需的時(shí)間進(jìn)行確定。
為了確定凝固時(shí)間，將100μl APCT(活化血漿凝固時(shí)間，Analytical Control Systems，Inc.，F(xiàn)ishers，IN)試劑與25μl多種濃度的水-重構(gòu)凍干血小板和25μl得自于商業(yè)供應(yīng)商的正常收集血漿進(jìn)行混合。在水浴中，在37℃下將該混合物培養(yǎng)3分鐘，然后將100μl 0.02M的CaCl2(37℃)加入并且對(duì)凝固時(shí)間進(jìn)行確定。
從圖21中可以看出，加入到給定量正常血漿中的凍干血小板的量形成了標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中凝固時(shí)間與凍干血小板的量成正比。由此，凍干血小板不僅可以參與凝塊形成，而且可以用于鑒定血漿的正常凝固時(shí)間。通過(guò)比較對(duì)于給定量?jī)龈裳“搴脱獫{的凝固的正常時(shí)間，可以確定個(gè)體樣品血液凝固能力的異常，所述樣品如為得自于患有或者懷疑患有血液凝固系統(tǒng)疾病或者病癥的患者的那些樣品。
標(biāo)準(zhǔn)凝固測(cè)定依賴于血小板因子3(磷脂)以活化內(nèi)源性凝血機(jī)制。其它測(cè)定法使用新鮮血小板提供磷脂組分。在本發(fā)明中，磷脂由凍干血小板而不是新鮮血小板提供。由此，所述試驗(yàn)表明凍干血小板不僅具有與新鮮血小板相似的物理性能，而且它們也具有類(lèi)似的功能性。
實(shí)施例25凍干血小板作為乏血小板血漿的校準(zhǔn)試劑的用途對(duì)凍干血小板與正常血漿混合時(shí)獲得標(biāo)準(zhǔn)凝固時(shí)間反應(yīng)的能力的概念進(jìn)行延伸，從而確定凍干血小板是否可以充當(dāng)乏血小板血漿的校準(zhǔn)試劑。也就是說(shuō)，先前試驗(yàn)證明，凍干血小板可以以可重現(xiàn)和可預(yù)期的方式參與含正常血漿的混合物的血液凝固。進(jìn)行試驗(yàn)，從而確定凍干血小板是否同樣能夠與缺少血小板的異常血漿一起參與凝固反應(yīng)。有意將血小板從血漿中除去，和將凍干血小板加入其中以替換新鮮血小板。樣品中的新鮮血小板數(shù)可忽略(約5000血小板/μl)。
從圖22中可以看出，加入到給定量乏血小板血漿中的凍干血小板的量產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中凝固時(shí)間與凍干血小板的量成正比。由此，凍干血小板不僅可以參與乏血小板血漿中的凝塊形成，而且可以用于鑒定所述血漿的凝固時(shí)間。通過(guò)比較凝固給定量?jī)龈裳“搴驼Ｑ獫{的正常時(shí)間，不僅可以確定個(gè)體樣品如得自于患有或者懷疑患有血液凝固系統(tǒng)疾病或者病癥的患者的那些的血液凝固能力的異常，而且還可以對(duì)乏血小板樣品中的血小板數(shù)進(jìn)行量化。事實(shí)上，可以由該試驗(yàn)得出的一個(gè)結(jié)論是，在沒(méi)有任何血小板的血漿(或者具有極低血小板數(shù)的血漿)中，凍干血小板可以用作校準(zhǔn)試劑以校準(zhǔn)其它血液組分(即，凝血因子抑制劑或者凝結(jié)過(guò)程中的任何其它缺陷)。在正常血漿中，凍干血小板也可以因?yàn)橄嗤康挠米餍?zhǔn)試劑。在此公開(kāi)的系統(tǒng)使用凍干血小板作為在與血小板無(wú)關(guān)的任何給定血漿樣品中的試劑，以檢測(cè)凝結(jié)蛋白缺陷或者檢測(cè)某些凝結(jié)抑制劑。例如，在血友病血漿中，凍干血小板在具有多種缺陷的凍結(jié)血漿上應(yīng)用，并且其能夠鑒定和矯正因子IX、X和XI缺陷，而不是因子VIII和II缺陷。其價(jià)值之一是實(shí)驗(yàn)室可以接受凍結(jié)血漿和使用該凍干血小板試劑以迅速確定凝結(jié)蛋白缺陷。
該實(shí)施例表明，在沒(méi)有任何血小板的血漿(或者具有極低血小板數(shù)的血漿)中，凍干血小板可以用作校準(zhǔn)試劑校準(zhǔn)其它血液組分(即，凝血因子抑制劑或者凝結(jié)路徑中的任何其它缺陷)。那么，很顯然在正常血漿中，凍干血小板也可以基于相同目的用作校準(zhǔn)試劑。該系統(tǒng)可以使用凍干血小板作為在與血小板是否存在無(wú)關(guān)的任何給定血漿樣品中的試劑，以檢測(cè)凝結(jié)蛋白缺陷或者檢測(cè)某些凝結(jié)抑制劑。例如，在血友病血漿中，凍干血小板與具有多種缺陷的凍結(jié)血漿一起使用。該組合能夠確定和矯正因子IX、X和XI缺陷。然而，因子VIII和II的缺陷矯正沒(méi)有得到表明。該系統(tǒng)的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于，實(shí)驗(yàn)室可以接受凍結(jié)血漿并使用該凍干血小板和本發(fā)明系統(tǒng)迅速確定凝血蛋白缺陷。
實(shí)施例26凍干血小板作為凝血因子缺陷診斷劑的用途根據(jù)凍干血小板可以用于鑒定血漿凝固能力的缺陷的知識(shí)，設(shè)計(jì)試驗(yàn)以確定凍干血小板是否可以用于鑒定血液凝固路徑中的具體缺陷。為了確定凝固時(shí)間，將100μl APCT(活化血漿凝固時(shí)間，Analytical Control Systems，Inc.，F(xiàn)ishers，IN)試劑與25μl多種濃度的水-重構(gòu)凍干血小板和25μl得自于商業(yè)供應(yīng)商的因子缺失血漿進(jìn)行混合。在37℃的水浴中將該混合物培養(yǎng)3分鐘，然后將100μl 0.02M的CaCl2(37℃)加入并且對(duì)凝固時(shí)間進(jìn)行確定。
從圖23中可以看出，凍干血小板可以克服凝血因子X(jué)I、X和IX而不是VIII中缺陷的凝固缺失。由此，可以進(jìn)行測(cè)定以與因子X(jué)I、X和IX相比較，以在基于因子VIII的凝固缺陷之間加以區(qū)別，并且可以鑒定凝塊形成固有途徑中的缺陷。因?yàn)閮龈裳“蹇梢钥朔蜃覺(jué)I、X和IX缺陷，因此可以設(shè)定校準(zhǔn)曲線，從而準(zhǔn)確確定這些因子在血液中的存在量或者不存在。同理，對(duì)于進(jìn)行其中維生素-K依賴因子受到損傷的華法林(coumadin芐丙酮香豆素鈉)治療的患者，凍干血小板可以用于監(jiān)控該缺失。
實(shí)施例27凍干血小板作為診斷工具確定具體凝血因子缺陷的用途根據(jù)凍干血小板可以用于鑒定基于血漿的系統(tǒng)中的固有凝血因子缺陷的認(rèn)識(shí)，對(duì)凍干血小板用作精確定位全血系統(tǒng)中相同類(lèi)型缺陷的診斷工具的能力進(jìn)行測(cè)試。進(jìn)行上述試驗(yàn)的能力可以區(qū)別基于凍干血小板的診斷學(xué)和其它市售測(cè)定法(例如，aPTT、PT、ELISA、PCR等等)，其中必須對(duì)全血進(jìn)行處理，從而提取血漿、血清或者個(gè)體血液組分以定量確定具體缺陷。為了便于參比，圖24示出凝血系統(tǒng)和血液凝結(jié)抑制劑的綜述。
圖25示出凍干血小板對(duì)在血液凝固組分中具有已知缺陷的血樣的凝固能力的影響。該圖中所示數(shù)據(jù)如下獲得確定含有400μl ACD全血(或者用目標(biāo)為抗特定凝血因子的多種抗體或者用當(dāng)前用于衛(wèi)生保健設(shè)施中的抗凝血藥物進(jìn)行培養(yǎng))、25μl0.2M的CaCl2、25μl鹽水和50μl多種濃度的重構(gòu)(再水化)凍干血小板的混合物的凝固時(shí)間。
從該圖中可以看出，全血測(cè)定結(jié)果與基于血漿的測(cè)定結(jié)果一致。凍干血小板對(duì)于在因子IX、X和XI但非因子VIII中的缺陷能夠降低凝固時(shí)間。該結(jié)果表明，所述凍干血小板可以與血漿和全血一起用于鑒定因子IX、X和XI中的缺陷，并且區(qū)別因子VIII的那些缺陷。其一個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于所述凍干血小板可以與全血充分作用，由此避免加工血漿的并發(fā)癥。
該實(shí)施例證明，當(dāng)將特定抗體加入到全血中時(shí)，凍干血小板的反應(yīng)形式與基于血漿的系統(tǒng)幾乎相同。此外，當(dāng)用多種抗凝血藥物處理全血時(shí)，發(fā)現(xiàn)凍干血小板還以不同的動(dòng)力學(xué)和反應(yīng)模式(profiles)對(duì)這些抗凝血?jiǎng)┟舾?參見(jiàn)下文)。
由此，發(fā)現(xiàn)所述凍干血小板的應(yīng)用具有數(shù)個(gè)獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，包括可以將凍干血小板用作鑒定涉及固有途徑的因子中的缺陷的完備試劑(stand alone reagent)；凍干血小板可以與任何已知適于與新鮮血小板一起應(yīng)用的現(xiàn)有臨床設(shè)備一起使用；凍干血小板可以與離去診斷試劑盒一起用作校準(zhǔn)試劑；和凍干血小板可以與全血或者血漿一起使用，從而鑒定固有途徑中涉及的因子缺陷。
實(shí)施例28凍干血小板顯示出與全血的特異反應(yīng)模式根據(jù)凍干血小板可以用于鑒定血液凝固系統(tǒng)中具體缺陷的知識(shí)，對(duì)所述血小板鑒定多種抗凝血?jiǎng)┐嬖诨蛘哂绊懙哪芰M(jìn)行試驗(yàn)。用指定量的抑制劑對(duì)ACD中新近抽出的血液進(jìn)行培養(yǎng)。將多種濃度的凍干血小板加入，并且在室溫下將其培養(yǎng)30秒。然后，用10mM CaCl2對(duì)所述血液進(jìn)行再鈣化，并且對(duì)其凝固時(shí)間進(jìn)行確定。
從圖26中可以看出，凍干血小板可以用于鑒定抗凝血?jiǎng)┰谌械拇嬖诤?或影響。因?yàn)閮龈裳“鍟?huì)以特異模式與具體抗凝血?jiǎng)┓磻?yīng)，因此它們不僅可以用于檢測(cè)抗凝血?jiǎng)┑拇嬖?，而且可以用于確定血液中存在多少抗凝血?jiǎng)?。照此方式，可以?duì)血液中的抗凝血?jiǎng)┻M(jìn)行監(jiān)控，從而例如，確保施用的適當(dāng)劑量。這特別有益于進(jìn)行肝素治療的心肺支管(CBP)患者?？梢栽诖策厡?duì)這些患者的血液進(jìn)行監(jiān)控，從而確定血液中的肝素水平和手術(shù)的安全時(shí)機(jī)。
實(shí)施例29凍干血小板用于監(jiān)控維生素-K依賴型凝固因子的用途在凝固級(jí)聯(lián)中的很多凝固因子都是維生素-K依賴型的，并且它們結(jié)合細(xì)胞膜上的帶負(fù)電荷的磷脂。此外，膜聯(lián)蛋白-V標(biāo)記物為血小板前凝血活性的標(biāo)記物，這是因?yàn)樗灶?lèi)似于維生素-K依賴型蛋白的Ca2+-依賴型方式與帶負(fù)電荷磷脂結(jié)合。為了分析這些蛋白質(zhì)與凍干血小板的結(jié)合，在Becton DickensonFACS caliber儀器上利用log-log設(shè)置進(jìn)行以下試驗(yàn)。血小板的特征在于它們代表性的向前和側(cè)向散射光線圖(使用凝膠過(guò)濾的血小板進(jìn)行)和/或與熒光-標(biāo)記蛋白質(zhì)的結(jié)合。在分離的試管中，在HBMT中將血小板稀釋至～50,000/μl，并且在環(huán)境溫度下，以飽和劑量加入熒光-標(biāo)記蛋白質(zhì)30分鐘。用2ml HMBT稀釋樣品并且收集10,000個(gè)個(gè)體事件。對(duì)熒光柱形圖和陽(yáng)性細(xì)胞百分比進(jìn)行記錄，這表示與熒光標(biāo)記蛋白結(jié)合的血小板數(shù)目。
從圖27中可以看出，凍干血小板結(jié)合至25mM的FITC-標(biāo)記膜聯(lián)蛋白-V(表示膜聯(lián)蛋白V休眠(resting))。通過(guò)加入20μmTRAP肽(SFLLRN)，凍干血小板暴露于另外的帶負(fù)電荷的磷脂，從而導(dǎo)致與另外的膜聯(lián)蛋白V結(jié)合(表示膜聯(lián)蛋白V活性)。為了確定將FITC-膜聯(lián)蛋白V與休眠凍干血小板的結(jié)合是特異的，將100倍過(guò)量的未標(biāo)記膜聯(lián)蛋白V加入。從圖28中可以看出，F(xiàn)ITC-膜聯(lián)蛋白V的結(jié)合會(huì)受到未標(biāo)記膜聯(lián)蛋白V的競(jìng)爭(zhēng)，這表明凍干血小板的帶負(fù)電荷的表面使用特定結(jié)合點(diǎn)構(gòu)造。
更具體而言，可以將維生素K依賴型蛋白質(zhì)用于結(jié)合測(cè)定中。當(dāng)對(duì)FITC-標(biāo)記的PPACK-FVIIa(活性部位抑制的FVIIa)測(cè)定結(jié)合時(shí)，發(fā)現(xiàn)，在25nM的濃度下，F(xiàn)VIIa不能與新鮮未激活血小板以及新鮮的活化血小板結(jié)合(圖29)。然而，當(dāng)使用凍干血小板時(shí)，在25nM下FITC-FVIIa表現(xiàn)出特異結(jié)合，并且該結(jié)合可以與未標(biāo)記FVIIa競(jìng)爭(zhēng)(圖30)。
還對(duì)FITC-標(biāo)記的EGR-FXa(活性部位抑制的FXa)與凍干血小板的結(jié)合進(jìn)行研究。從圖31可以看出，F(xiàn)Xa與凍干血小板的結(jié)合是特異性的，因?yàn)樗鼤?huì)受到超過(guò)100倍的未標(biāo)記FXa的競(jìng)爭(zhēng)。
由此，根據(jù)這些試驗(yàn)可知，使用凍干血小板監(jiān)控全血或者血漿中的維生素K依賴型凝血因子功能性或者濃度的優(yōu)點(diǎn)是顯然的。這些凝血因子以特異的方式結(jié)合至凍干血小板的表面。此外，可以對(duì)與凍干血小板的表面的所述特異結(jié)合進(jìn)行修飾。例如，可以將凍干血小板的表面連接在對(duì)每一種維生素K依賴型因子具有特異性的試劑(熒光或者其它)上。其信號(hào)(熒光或者其它)可以解釋缺失因子或在抗凝血作用藥物的影響下的因子的精確鑒定。
實(shí)施例30凍干血小板作為鑒定血小板缺陷的診斷劑的用途其它試驗(yàn)表明，本發(fā)明凍干血小板具有與新鮮血小板相似的物理和功能特性。為了更好地表征其物理性能，對(duì)凍干血小板試驗(yàn)它們對(duì)多種已知對(duì)新鮮血小板凝結(jié)具有抑制作用的激動(dòng)劑的響應(yīng)。
該實(shí)施例如下進(jìn)行在含有0.3％牛血清白蛋白(B SA)的HEPES-Tyrodes緩沖液中，將新鮮血小板和/或凍干血小板稀釋至最終濃度為250,000個(gè)血小板/μl。將多種激動(dòng)劑加入到各個(gè)組合物中，如下所述。將400μl組合物置于聚集計(jì)量池(aggregometry cuvettes)中，血小板隨時(shí)間流逝聚集。
α-FIIa0.05-1U/ml；γ-FII0.03μg/ml；A2318710mM；凝血酶受體活化肽(TRAP)SFLLRN10mM；Risto+1mg/ml(20％自體檸檬酸鹽(citrated)血漿)；Risto-1mg/ml；膠原(Chronolog)10μg/ml；腎上腺素300μM；花生四烯酸0.5mg/ml；
ADP20μm；對(duì)照無(wú)激動(dòng)劑。
利用膠原的測(cè)定的結(jié)果示于圖32中。欄A表示使用100％凍干血小板時(shí)的聚集百分比。該欄顯示了低量聚集(約10％)，這表示所述凍干血小板僅僅部分對(duì)膠原敏感。與此相反，欄D示出膠原對(duì)新鮮洗滌的血小板的影響。在欄D中，在導(dǎo)致凍干血小板稍高于10％的聚集的相同時(shí)間周期中觀察到幾乎90％的聚集。從欄C和D中可以看出，不同量?jī)龈裳“搴托迈r血小板的混合物產(chǎn)生了中等水平的聚集，所述量取決于加入的凍干血小板和新鮮血小板的相對(duì)量。
在第二組設(shè)計(jì)用于確定凍干血小板對(duì)新鮮血小板聚集功能的影響的試驗(yàn)中，使不同量的凍干血小板(再水化血小板或者RH)與不同量的新鮮血小板合并。將重構(gòu)血小板以所示濃度與新鮮血小板混合。向這些中的每一種中，分別將10μg/ml(400μl血小板+4μl 200mM的MgCl(2mM)+4μl 1mg/ml的膠原(10μg/ml))加入到混合物中。在室溫下5分鐘之后，使用標(biāo)準(zhǔn)全血細(xì)胞計(jì)數(shù)設(shè)備(得自于Beckman coulter的ACT10)對(duì)血小板進(jìn)行計(jì)數(shù)。
從圖33中可以看出，多種凍干血小板和新鮮血小板的混合物都具有中等聚集特性，這取決于各自存在于混合物中的相對(duì)量。
此外，還可以看出，凍干血小板響應(yīng)花生四烯酸、膠原、腎上腺素、凝血酶受體活化肽(TRAP)和瑞斯托菌素進(jìn)行聚集，聚集百分比經(jīng)測(cè)定分別為77、83、86、93和97(圖34)。
圖32、33和34的結(jié)果表明，凍干血小板含有響應(yīng)上述所有激動(dòng)劑的至少部分官能化的受體，并且具有低的但是可檢測(cè)水平的自聚集作用。在其中將凍干血小板與新鮮血小板混合的反應(yīng)中，我們證實(shí)所述混合物能夠以劑量依賴方式協(xié)同進(jìn)行聚集。由此，在多種實(shí)施方案中，作為血小板具體診斷工具的凍干血小板的應(yīng)用提供以下數(shù)個(gè)優(yōu)點(diǎn)進(jìn)行這樣測(cè)定的獨(dú)特工藝與甲醛粘合固定的血小板不聚集，而根據(jù)本發(fā)明的凍干血小板聚集；凍干血小板保持了可以用于監(jiān)控血小板功能缺陷的相關(guān)表面標(biāo)志，所述血小板功能缺陷如格蘭茨曼血小板機(jī)能不全、伯-蘇氏綜合征、灰色(Gray)血小板綜合癥、魁北克(Quebec)血小板病癥、赫曼斯基-普德拉克綜合癥(Hermansky-PudlakSyndrome)、切-希二氏綜合征(Chediak-Higashi syndrome)、威-奧二氏綜合癥(Wiskott-Aldrich syndrome)、釋放缺陷、vWF病癥、無(wú)纖維蛋白原血癥(Afibrinogenenia)、斯克特綜合癥(Scottsyndrome)和其它先天性病癥；可以將患者自身的血小板凍干，和在治療方案期間用作監(jiān)控患者自身血小板功能的控制劑；可以將收集的血小板凍干和用作用于相同目的的通用血小板試劑；和本發(fā)明組合物可以為獨(dú)立產(chǎn)品，它可以在任何適用于血小板分析的現(xiàn)有設(shè)備中使用。
實(shí)施例31假血友病C的誘導(dǎo)和用血小板進(jìn)行的治療開(kāi)發(fā)用于血友病C治療的模型，從而確定本發(fā)明血小板是否可以治療該病癥。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，將血液收集入1/10體積的3.8％檸檬酸鈉中，將其合并并且分成1ml的等分。將因子X(jué)I的單克隆抗體(Hematologic Technologies，Inc，Essex JunctionVT)或者鹽水對(duì)照加入至0～30μg/ml，并且在環(huán)境溫度下將其培養(yǎng)～15分鐘。將400μl血液轉(zhuǎn)入到含有25μl 0.2M氯化鈣(最終10mM)和75μl緩沖對(duì)照或者再水化血小板的試管中，從而引發(fā)凝固。將試管立即放入Actalyke-活化凝固時(shí)間設(shè)備(HelenaLabs，Beaumont，TX)中，并且自動(dòng)記錄其凝固時(shí)間。示于圖35A和35B中的數(shù)據(jù)表明，在血友病C誘發(fā)的模型中，本發(fā)明血小板可以克服因子X(jué)I的抑制或者損失，并且可以將凝固時(shí)間恢復(fù)到正常范圍。
實(shí)施例32假血友病B的誘導(dǎo)和用血小板的治療開(kāi)發(fā)用于血友病B治療的模型，從而確定本發(fā)明血小板是否可以治療該病癥。除了使用因子IX的綿羊多克隆抗體或者非免疫性綿羊抗體對(duì)照之外，如實(shí)施例31所述進(jìn)行試驗(yàn)。示于圖36中的數(shù)據(jù)表明，在血友病B誘發(fā)的模型中，本發(fā)明血小板可以克服因子IX的抑制，并且將凝結(jié)時(shí)間恢復(fù)到正常范圍。
實(shí)施例33具有抑制劑的獲得性血友病的誘導(dǎo)和用血小板的治療開(kāi)發(fā)用于具有抑制劑的獲得性血友病治療的模型，從而確定本發(fā)明血小板是否可以治療該病癥。如實(shí)施例31所述進(jìn)行試驗(yàn)，除了使用因子VIII的綿羊多克隆抗體或者非免疫性綿羊抗體對(duì)照。示于圖37中的數(shù)據(jù)表明，在具有抑制劑的獲得性血友病誘發(fā)的模型中，本發(fā)明血小板可以克服因子VIII的抑制，并且將凝固時(shí)間恢復(fù)到正常范圍。
實(shí)施例34用血小板對(duì)血友病患者血液的治療為了試驗(yàn)本發(fā)明血小板對(duì)真實(shí)血友病血液的影響，對(duì)已知受到多種血友病形式影響的個(gè)體血液樣品以及正常血液和血漿進(jìn)行試驗(yàn)。患有先天性血友病A、血友病B、血友病C或者低滴度(1 Bethesda Unit)和高滴度(140 Bethesda Units)的患者的血漿和對(duì)照收集的正常血漿都得自于George KingBiomedical(Overland Park，Kansas)。從正常O型供血者新鮮獲得檸檬酸鹽血，將其分為2ml等分，并且在2000×g下將其離心15分鐘，從而將細(xì)胞制成丸粒。將血漿除去，用等體積的上述獲得的自體血漿將自旋細(xì)胞重構(gòu)至血細(xì)胞比容為45％。將該重構(gòu)血液(400μl)置于凝固試管中，如上所述，在再水化血小板衍生物存在或者不存在下通過(guò)再鈣化啟動(dòng)凝固。示于圖38中的數(shù)據(jù)表明，本發(fā)明血小板可以克服血友病患者血液中因子X(jué)I、IX和VIII的損失和因子VIII通過(guò)體內(nèi)抑制劑產(chǎn)生的抑制作用，并且將凝固時(shí)間恢復(fù)到正常范圍。由此，該數(shù)據(jù)確定在實(shí)施例31～33中存在的模型系統(tǒng)中獲得的結(jié)果和證實(shí)用于這些實(shí)施例中的模型。
實(shí)施例35用牛胰蛋白酶抑制劑進(jìn)行的凝固缺失誘導(dǎo)和用血小板的治療開(kāi)發(fā)用于治療由于抗凝固劑治療而產(chǎn)生的延遲凝固的模型，從而確定本發(fā)明血小板是否可以處理該影響。將正常的檸檬酸鹽血與0～2000U/ml牛胰蛋白酶抑制劑(Calbiochem)或者鹽水對(duì)照一起培養(yǎng)，然后取400μl置入凝固試管中，如上所述在再水化血小板存在或者不存在下，通過(guò)再鈣化啟動(dòng)凝固。示于圖39A和39B中的數(shù)據(jù)表明，在由于抗凝血?jiǎng)┲委煻T發(fā)的延遲血液凝固模型中，本發(fā)明血小板可以克服抗凝血因子的作用，并且可以將凝固時(shí)間恢復(fù)到正常范圍。
實(shí)施例36用肝素誘導(dǎo)的凝固缺失(藥物誘發(fā)的凝血病)和用血小板的治療開(kāi)發(fā)用于治療由于抗凝固劑治療而產(chǎn)生的延遲凝固的第二模型，從而確定本發(fā)明血小板是否可以處理該影響。在此模型中，用肝素處理全血，從而延遲或者抑制凝固。除了使用未分級(jí)鋰肝素代替牛胰蛋白酶抑制劑之外，如例如實(shí)施例35所述進(jìn)行試驗(yàn)。示于圖40A和40B中的數(shù)據(jù)表明，在由于抗凝血?jiǎng)┲委煻T發(fā)的延遲血液凝固模型中，本發(fā)明血小板可以克服抗凝血因子的作用，并且將凝固時(shí)間恢復(fù)到正常范圍。
實(shí)施例37血小板對(duì)重組因子VIIa活性的影響為了確定本發(fā)明血小板對(duì)用于治療血友病的已知凝固劑活性的影響，單獨(dú)使用或者在本發(fā)明血小板存在下，用亞藥理學(xué)濃度(5nM)的重組因子VIIa對(duì)再鈣化全血進(jìn)行處理。試驗(yàn)結(jié)果示于圖41中。使用的試驗(yàn)系統(tǒng)是，在缺少任何外源性凝固促進(jìn)劑如高嶺土、硅藻土或者玻璃下，使用定制測(cè)定試管在標(biāo)準(zhǔn)Activated Clotting Time(ACT)設(shè)備上進(jìn)行再鈣化全血凝固時(shí)間測(cè)定。
示于圖41A中的數(shù)據(jù)如下產(chǎn)生。從正常供血者新鮮獲得檸檬酸鹽血，將其分為2ml等分，并且在2000×g下將其離心15分鐘，從而將細(xì)胞制成丸粒。將血漿除去，用等體積的自體血漿(PPP，無(wú)plts)、自體PRP(PRP)或者兩個(gè)獨(dú)立批次的含有再水化血小板制劑的PPP(RH批1，RH批2)對(duì)自旋細(xì)胞進(jìn)行重構(gòu)。所有樣品中的最終血小板數(shù)為150,000/μl和45％血細(xì)胞比容。如上所述，將重構(gòu)血液(400μl)置于凝固試管中，在再水化血小板衍生物存在或者不存在下通過(guò)再鈣化啟動(dòng)凝固。
示于圖41B和41C中的數(shù)據(jù)如下產(chǎn)生。在含有0.35％牛白蛋白和不補(bǔ)充任何物質(zhì)以及補(bǔ)充1mM MgCl2、2mM CaCl2或者二者的無(wú)二價(jià)陽(yáng)離子HEPES Tyrodes緩沖液中，將再水化血小板稀釋至50,000～100,000/μl。在環(huán)境溫度下，將50μl稀釋血小板單獨(dú)培養(yǎng)或者與5nM(亞藥理學(xué)劑量)或者25nM(藥理學(xué)劑量)FITC-PPACK-FVIIa一起培養(yǎng)30分鐘，然后用2ml相同緩沖液對(duì)其進(jìn)行洗滌，通過(guò)log-log設(shè)置的流式細(xì)胞計(jì)進(jìn)行分析，和僅僅在柵極(gate)上獲得血小板數(shù)據(jù)。
從圖41A、41B和41C中可以看出，本發(fā)明再水化血小板將重組因子VIIa的活性升高至亞藥理學(xué)量重組人因子VIIa可以將凝固時(shí)間有效降低至它們正常范圍的程度。此外，該圖表明，在通過(guò)Ca2+增強(qiáng)的反應(yīng)中，因子FVII變體直接連接到再水化血小板表面上。鑒于重組因子VIIa和其它凝血因子的成本，這是意義重大的發(fā)現(xiàn)，無(wú)疑將顯著降低治療血友病的成本。
實(shí)施例38膜聯(lián)蛋白-V與本發(fā)明血小板的結(jié)合為了進(jìn)一步表征本發(fā)明血小板的性能，對(duì)膜聯(lián)蛋白-V與本發(fā)明血小板的結(jié)合進(jìn)行測(cè)定。膜聯(lián)蛋白-V是血小板促凝血活性的標(biāo)記物，因?yàn)轭?lèi)似于維生素K依賴型凝血因子，它以鈣-依賴方式結(jié)合帶負(fù)電荷的磷脂。圖42示出了表明膜聯(lián)蛋白-V結(jié)合本發(fā)明再水化血小板的流式細(xì)胞計(jì)剖面數(shù)據(jù)。
對(duì)于本領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員而言，在實(shí)踐本發(fā)明時(shí)很顯然可以進(jìn)行多種改變和變化，而不背離本發(fā)明的范圍或者精神。通過(guò)考慮說(shuō)明書(shū)和實(shí)踐本發(fā)明，本發(fā)明的其它實(shí)施方案對(duì)于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。應(yīng)當(dāng)將說(shuō)明書(shū)和實(shí)施例僅僅視為示例性的，本發(fā)明的真正范圍和精神由以下權(quán)利要求表明。
引用的參考文獻(xiàn)Christenson，JT，A Kalangos，2004，Autologous fibrin gluereinforced by platelets in surgery of ascending aorta*Thorac.Cardiovasc.Surg.，v.52，p.225-229.
Gilbert，GE，P J Sims，T Wiedmer，B Furie，B C Furie，S JShattil，1991，Platelet-derived microparticles express highaffinity receptors for factor VIIIJ.Biol.Chem.，v.266，p.17261-17268.
Giles AR，Mann K G，Nesheim ME，″A combination of factorXa and phosphatidylcholine-phosphatidylserine vesicles bypassesfactor VIII in vivo″，Br.J.Haematol.69(4)4917，Aug.1988.
Hoffman，M，D M Monroe，H R Roberts，1992，Coagulationfactor IXa binding to activated platelets and platelet-derivedmicroparticlesa flow cytometric studyThromb.Haemost.，v.68，p.74-78.
Holme，PA，F(xiàn) Brosstad，N O Solum，1995，Platelet-derivedmicrovesicles and activated platelets express factor Xa activityBlood Coagul.Fibrinolysis，v.6，p.302-310.
Hrachovinova I，Cambien B，HafeziMoghadam A，Kappelmayer J，Camphausen RT，Widom A，Xia L，Kazazian HHJr，Schaub R G，McEver RP，Wagner DD，″Interaction of P-selectinand PSGL1 generates microparticles that correct hemostasis in amouse model of hemophilia A″，Nat Med.9(8)10205，Aug.2003.
Kirby CJ，Gregoriadis G.，″Preparation of liposomescontaining factor VIII for oral treatment of haemophilia″，J.Microencapsul.1(1)3345，Jan.-Mar.1984.
Mazzucco，L，D Medici，M Serra，R Panizza，G Rivara，SOrecchia，R Libener，E Cattana，A Levis，P G Betta，P Borzini，2004，The use of autologous platelet gel to treat difficult-to-healwoundsa pilot studyTransfusion，v.44，p.1013-1018.
Nieuwland，R，R J Berckmans，R C Rotteveel-Eijkman，K NMaquelin，K J Roozendaal，P G Jansen，K ten Have，L Eijsman，CE Hack，A Sturk，1997，Cell-derived microparticles generated inpatients during cardiopulmonary bypass are highly procoagulantCirculation，v.96，p.3534-3541.
Oikarinen，KS，G K Sandor，V T Kainulainen，MSalonen-Kemppi，2003，Augmentation of the narrow traumatizedanterior alveolar ridge to facilitate dental implant placementDent.Traumatol.，v.19，p.19-29.
Pierce，GF，T A Mustoe，J Lingelbach，V R Masakowski，G LGriffin，R M Senior，T F Deuel，1989，Platelet-derived growthfactor and transforming growth factor-beta enhance tissue repairactivities by unique mechanismsJ.Cell Biol.，v.109，p.429-440.
Prior，JJ，D G Wallace，A Harner，N Powers，1999，Asprayable hemostat containing fibrillar collagen，bovine thrombin，and autologous plasmaAnn.Thorac.Surg.，v.68，p.479-485.
Rosing，J，E M Bevers，P Comfurius，H C Hemker，G vanDieijen，H J Weiss，R F Zwaal，1985，Impaired factor X andprothrombin activation associated with decreased phospholipidexposure in platelets from a patient with a bleeding disorderBlood，v.65，p.1557-1561.
Serebruany，VL，J V Ordonez，V V Yurovsky，P A Gurbel，1998，Crossreactivity of Human versus Swine Platelet SurfaceAntigens Is Similar for Glycoproteins Ib and IIIa，but Not for theGlycoprotein IIb/IIIa ComplexJ.Thromb.Thrombolysis.，v.5，p.37-41.
Sims，PJ，E M Faioni，T Wiedmer，S J Shattil，1988，Complement proteins C5b-9 cause release of membrane vesiclesfrom the platelet surface that are enriched in the membranereceptor for coagulation factor Va and express prothrombinaseactivityJ.Biol.Chem.，v.263，p.18205-18212.
Sims，PJ，S A Rollins，T Wiedmer，1989，Regulatory controlof complement on blood platelets.Modulation of plateletprocoagulant responses by a membrane inhibitor of the C5b-9complexJ.Biol.Chem.，v.264，p.19228-19235.
Steed，DL，1997，The role of growth factors in wound healingSurg.Clin.North Am.，v.77，p.575-586.
Tans，G，J Rosing，M C Thomassen，M J Heeb，R F Zwaal，J HGriffin，1991，Comparison of anticoagulant and procoagulantactivities of stimulated platelets and platelet-derivedmicroparticlesBlood，v.77，p.2641-2648.
Wajon，P，J Gibson，R Calcroft，C Hughes，B Thrift，2001，Intraoperative plateletpheresis and autologous platelet gel do notreduce chest tube drainage or allogeneic blood transfusion afterreoperative coronary artery bypass graftAnesth.Analg.，v.93，p.536-542.
Yarovoi HV，Kufrin D，Eslin DE，Thornton MA，HaberichterSL，Shi Q，Zhu H，Camire R，F(xiàn)akharzadeh SS，Kowalska MA，Wilcox DA，Sachais B S，Montgomery RR，Poncz M，″Factor VIIIectopically expressed in plateletsefficacy in hemophilia Atreatment″，Blood 102(12)400613，Dec.1，2003.
所有在此引用的參考文獻(xiàn)都在此引入作為參考。
權(quán)利要求
1.一種在遭受出血的對(duì)象中治療出血的方法，所述方法包括將含有凍干血小板的組合物給藥至對(duì)象，其中給藥至所述對(duì)象的血小板的量足以治療出血。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述給藥包括將凍干血小板或者含凍干血小板組合物直接施用到出血位置。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，該出血來(lái)自于高壓動(dòng)脈。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其進(jìn)一步包括在將其給藥之前再水化該凍干血小板。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述給藥包括將凍干血小板或者含凍干血小板組合物注射或者輸注入該對(duì)象的血液系統(tǒng)中。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其進(jìn)一步包括在將其給藥之前再水化該凍干血小板。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，該方法為治療急性出血的方法。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中，該出血由于傷口或者外傷。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，該方法為治療出血病癥的方法。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中，該出血病癥為血友病。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中，該出血病癥為用于除出血疾病或者病癥之外的疾病或者病癥的治療方案的副作用。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中，該出血病癥為抗癌治療的副作用。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，將血小板或者組合物給藥至與出血位置緊密鄰接的位置。
14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，該出血是由于手術(shù)而引起出血。
15.一種治療患有出血病癥的對(duì)象的方法，所述方法包括將含有血小板、血小板衍生物或者二者的組合物給藥至該對(duì)象，其中，在給藥時(shí)，所述給藥在不存在活性出血下進(jìn)行。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中，該對(duì)象患有先天性血友病。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中，該對(duì)象患有血友病A。
18.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中，該對(duì)象患有血友病B。
19.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中，該對(duì)象患有血友病C。
20.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中，訪該對(duì)象患有獲得性血友病。
21.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中，該對(duì)象患有具有抑制劑的血友病。
22.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中，該對(duì)象患有藥物誘發(fā)的凝血病。
23.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中，該對(duì)象患有vWD。
24.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中，該對(duì)象患有肝或者腎功能障礙或者衰竭。
25.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中，該方法抵消了肝素或者低分子量肝素的不利血液凝固作用。
26.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中，該方法抵消了牛胰蛋白酶抑制劑的不利血液凝固作用。
27.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中，該方法抵消了因子X(jué)a抑制劑的不利血液凝固作用。
28.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中，該方法抵消了獲得性因子X(jué)缺失的不利血液凝固作用。
29.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中，該方法治療除因子I或者因子II的凝血因子缺失之外的凝血因子的缺失。
30.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中，該方法抵消了GPIIb/IIIa拮抗劑治療的不利血液凝固作用。
31.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中，給藥在不存在導(dǎo)致出血的新外傷或者創(chuàng)傷下進(jìn)行。
32.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中，該方法是對(duì)于該對(duì)象恢復(fù)正常血液凝固性能的預(yù)防性方法。
33.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中，該組合物含有凍干血小板、血小板衍生物或其二者，或者含有再水化凍干血小板、血小板衍生物或其二者。
34.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中，給藥包括向該對(duì)象遞送足量的血小板、血小板衍生物或其二者，從而使血小板數(shù)達(dá)到約50,000血小板/微升至約500,000血小板/微升。
35.一種體外組合物，其包括凍干血小板和全血、血漿或者全血或血漿的組分。
36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的組合物，其包括凍干血小板和新鮮血小板。
37.根據(jù)權(quán)利要求35所述的組合物，其中，將該凍干血小板進(jìn)行重構(gòu)。
38.根據(jù)權(quán)利要求35所述的組合物，其中，該凍干血小板為來(lái)自于公眾血源的血小板。
39.根據(jù)權(quán)利要求35所述的組合物，其中，該凍干血小板來(lái)自于正在經(jīng)受或者預(yù)期經(jīng)受可能影響該患者血液凝固活性的治療的患者。
40.一種確定含有血液或者血液組分的樣品的血液凝固能力的方法，所述方法包括合并凍干血小板與新鮮血液或者血液組分，從而形成混合物；和評(píng)價(jià)該混合物的表現(xiàn)一種或者多種血液凝固功能的一種或者多種生物學(xué)或者生物化學(xué)功能。
41.根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，其中，該方法是診斷血液凝固系統(tǒng)疾病或者病癥的方法。
42.根據(jù)權(quán)利要求40的方法，其中，該凍干血小板得自于在其血液凝固系統(tǒng)中有或者懷疑有缺陷的患者。
43.根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，其中，該新鮮血液或者血液組分得自于在其血液凝固系統(tǒng)中有或者懷疑有缺陷的患者。
44.根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，其中，該方法是監(jiān)控血液凝固系統(tǒng)疾病或者病癥發(fā)展的方法。
45.根據(jù)權(quán)利要求44所述的方法，其中該方法包括合并時(shí)間點(diǎn)為零時(shí)從患者獲得的凍干血小板和后一時(shí)間點(diǎn)從患者中除去的血小板，從而形成混合物，和確定該混合物的血液凝固能力。
46.根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，其進(jìn)一步包括在第二后來(lái)時(shí)間點(diǎn)除去第二量的血小板，將它們與凍干血小板合并，和確定該混合物的血液凝固能力。
47.根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，其是監(jiān)控用于患者的治療方案對(duì)該患者血液凝固系統(tǒng)的影響的方法。
48.一種試劑盒，其含有凍干血小板和影響血液凝固系統(tǒng)的至少一種物質(zhì)。
49.根據(jù)權(quán)利要求48所述的試劑盒，其中，該物質(zhì)為藥物。
50.根據(jù)權(quán)利要求49所述的試劑盒，其中，該藥物具有抗血小板活性。
51.根據(jù)權(quán)利要求50所述的試劑盒，其中，該藥物降低了患者血液凝固的能力。
52.根據(jù)權(quán)利要求48所述的試劑盒，其中，該凍干血小板為來(lái)自于公眾血源的血小板。
53.根據(jù)權(quán)利要求48所述的試劑盒，其包括多個(gè)含有凍干血小板的容器。
54.根據(jù)權(quán)利要求48所述的試劑盒，其包括多個(gè)含有兩種或者更多種不同物質(zhì)的容器。
55.一種制備凍干血小板的方法，所述方法包括提供血小板，將該血小板懸浮在含有至少一種糖的鹽緩沖液中，從而形成第一組合物，在凍結(jié)以上溫度下將所述第一組合物培養(yǎng)至少足夠的時(shí)間，以使至少一種糖與該血小板接觸，加入冷凍保護(hù)劑，從而制成第二組合物，其中在將冷凍保護(hù)劑加入之前，對(duì)第一組合物不進(jìn)行離心或者其它分離方法，和冷凍干燥第二組合物，從而制成凍干血小板。
56.根據(jù)權(quán)利要求55所述的方法，其進(jìn)一步包括在高于50℃的溫度下加熱該凍干血小板至少10小時(shí)。
57.根據(jù)權(quán)利要求55所述的方法，其進(jìn)一步包括在高于75℃的溫度下加熱該凍干血小板至少18小時(shí)。
58.根據(jù)權(quán)利要求55所述的方法，其進(jìn)一步包括在80℃下加熱該凍干血小板24小時(shí)。
59.根據(jù)權(quán)利要求55所述的方法，其進(jìn)一步包括將乙醇加入到該第二組合物或者該第一組合物和該第二組合物二者中。
60.根據(jù)權(quán)利要求59所述的方法，其中，以1％(v/v)的量將乙醇加入到該第一組合物中，且乙醇以0.8％的量存在于該第二組合物中。
61.根據(jù)權(quán)利要求55所述的方法，其中，該冷凍保護(hù)劑為人血清白蛋白或者Ficoll 400。
62.根據(jù)權(quán)利要求55所述的方法，其中，該冷凍保護(hù)劑為Ficoll 400。
63.一種制備凍干血小板的方法，所述方法包括提供血小板，將該血小板懸浮在含有100mM海藻糖和1％(v/v)乙醇的鹽緩沖液中，從而制成第一組合物，在37℃下將該第一組合物培養(yǎng)2小時(shí)，加入Ficoll 400至最終濃度為6％(w/v)，從而形成第二組合物，冷凍干燥該第二組合物，從而制成凍干血小板，和在80℃下加熱該凍干血小板24小時(shí)。
64.通過(guò)以下方法制成的凍干血小板，該方法包括提供血小板，將該血小板懸浮在含有至少一種糖的鹽緩沖液中，從而制成第一組合物，在凍結(jié)以上溫度下，將該第一組合物培養(yǎng)至少足夠的時(shí)間，以使至少一種糖與血小板接觸，加入冷凍保護(hù)劑，從而制成第二組合物，其中在將冷凍保護(hù)劑加入之前，對(duì)該第一組合物不進(jìn)行離心或者其它分離方法，和冷凍干燥該第二組合物，從而制成凍干血小板。
65.根據(jù)權(quán)利要求64所述的凍干血小板，其中，該血小板在室溫下穩(wěn)定至少六個(gè)月。
66.再水化凍干血小板，其尺寸和粒度基本上等同于新鮮血小板。
67.根據(jù)權(quán)利要求66所述的再水化血小板，其中，該血小板存在于進(jìn)一步包括Ficoll 400的組合物中。
68.根據(jù)權(quán)利要求66所述的再水化血小板，其中，該血小板沒(méi)有得到活化。
69.一種包括凍干血小板的試劑盒，其中，所述血小板通過(guò)以下方法生產(chǎn)，該方法包括提供血小板，將該血小板懸浮在含有至少一種糖的鹽緩沖液中，從而制成第一組合物，在凍結(jié)以上溫度下將該第一組合物培養(yǎng)至少足夠的時(shí)間，以使至少一種糖與血小板接觸，加入冷凍保護(hù)劑，從而制成第二組合物，其中在將該冷凍保護(hù)劑加入之前，對(duì)該第一組合物不進(jìn)行離心或者其它分離方法，和冷凍干燥該第二組合物，從而制成凍干血小板。
70.根據(jù)權(quán)利要求69所述的試劑盒，其中，該試劑盒包括多于一個(gè)含有該凍干血小板的容器。
71.根據(jù)權(quán)利要求69所述的試劑盒，其中，該試劑盒是含有與一升或者一品脫血液中的血小板量等量的凍干血小板的容器。
72.根據(jù)權(quán)利要求69所述的試劑盒，其中，該試劑盒含有人類(lèi)凍干血小板。
73.根據(jù)權(quán)利要求69所述的試劑盒，其中，該試劑盒包括一個(gè)或者多個(gè)容器，各自含有1×108～1×109個(gè)血小板。
74.根據(jù)權(quán)利要求69所述的試劑盒，其中，該試劑盒包括一個(gè)或者多個(gè)用于局部接觸傷口的含有血小板的繃帶，其中，該繃帶包含1×108～1×109個(gè)血小板/cm3的意欲與傷口接觸的繃帶部分的表面區(qū)域。
全文摘要
本發(fā)明提供了制備凍干血小板的方法，通過(guò)這些方法制備的凍干血小板，由這些凍干血小板重構(gòu)的血小板，將血小板用于治療、診斷和研究目的的方法，和含有所述凍干血小板的試劑盒。
文檔編號(hào)A01N63/00GK101072506SQ200580034873
公開(kāi)日2007年11月14日 申請(qǐng)日期2005年8月12日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月12日
發(fā)明者大衛(wèi)·何, 仙蒂·S·奧瑟爾, 阿蘭·S·魯?shù)婪? 凱絲·A·莫斯可維奇, 耶石華·帝 申請(qǐng)人:塞爾菲樂(lè)有限公司