專利名稱：來源于真菌的脂肪酸脫氫酶的制作方法
背景技術(shù)：
本申請(qǐng)要求申請(qǐng)?zhí)枮?0/382,391、申請(qǐng)日為2002年5月22日，以及申請(qǐng)?zhí)枮?0/453,125、申請(qǐng)日為2003年3月7日的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)。特別將上述每個(gè)申請(qǐng)公開的全部內(nèi)容都作為本申請(qǐng)的參考。
1.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明主要涉及調(diào)節(jié)長鏈多不飽和脂肪酸(LC-PUFA’s)中雙鍵的數(shù)目和位置的脫氫酶、及其使用方法和組合物。特別的是，本發(fā)明涉及利用脫氫酶改善脂肪酸的特性和在真菌中已確定的編碼這些脫氫酶的核酸。
2.相關(guān)技術(shù)的描述在絕大多數(shù)有機(jī)體中，脂肪酸生物合成的主要產(chǎn)物是16-和18-碳的化合物。這些脂肪酸的鏈長度與不飽和程度的相對(duì)比率隨物種不同而相差很大。例如哺乳動(dòng)物主要產(chǎn)生飽和的和單飽和的脂肪酸，然而絕大多數(shù)高等植物產(chǎn)生含有一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)雙鍵的脂肪酸，后面兩個(gè)就包括多不飽和脂肪酸(PUFA’s)。
PUFA’s的兩種主要類別是Ω-3脂肪酸(也用“n-3”脂肪酸代表)，以二十碳五烯酸為例(EPA，204，n-3)；以及Ω-6脂肪酸(也用“n-6”脂肪酸代表)，以花生四烯酸為例(ARA，204，n-6)為例。PUFAs是細(xì)胞質(zhì)膜和脂肪組織的重要成分，其中它們各自以磷脂和甘油三酯的形式存在。PUFAs對(duì)于哺乳動(dòng)物的正常發(fā)育，特別是對(duì)嬰兒大腦的發(fā)育以及組織的形成、修復(fù)來說是必需的。
脂肪酸能夠治療一些疾病。已經(jīng)表明補(bǔ)充PUFAs可降低血管成形術(shù)后的再狹窄比率。也有文獻(xiàn)詳細(xì)報(bào)道了某些食用的Ω-3脂肪酸對(duì)心血管疾病和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的有益效果(Simopoulos，1997；James etal.，2000)。此外，PUFAs已被建議用來治療哮喘和牛皮癬。有證據(jù)表明PUFAs可能參與了鈣代謝，這提示PUFAs可以用于治療或預(yù)防骨質(zhì)疏松和腎或尿路結(jié)石。有益于健康的主要證據(jù)來自于長鏈Ω-3脂肪，魚和魚油中的EPA和DHA。基于這些證據(jù)，加拿大(ScientificReview Committee，1990，Nutrition Recommendations，Minister ofNational Health and Welfare，Canada，Ottowa)、歐洲(de Deckereret al.，1998)、英國(The British Nutrition Foundation，1992，Unsaturatedfatty-acids-nutritional and physiological significanceThe report of theBritish Nutrition Foundation’s Task Force，Chapman and Hall，London)和美國(Simopoulos et al.，1999)的健康機(jī)構(gòu)和營養(yǎng)學(xué)家已建議提高膳食中這些PUFAs的用量。
PUFAs也可用來治療糖尿病(U.S.Pat.No.4,826,877；Horrobin etal.，1993)。已經(jīng)證實(shí)在糖尿病動(dòng)物中，脂肪酸代謝和組成發(fā)生了改變。這提示這些改變與一些糖尿病引起的長期并發(fā)癥，包括視網(wǎng)膜病、神經(jīng)病、腎病和生殖系統(tǒng)損傷有關(guān)。含有GLA的櫻草油已顯示出能夠預(yù)防和治療糖尿病神經(jīng)損傷。
PUFAs，例如亞油酸(LA，182，Δ9，12)和α-亞油酸(ALA，183，Δ9，12，15)，被認(rèn)為是飲食中必需的脂肪酸，因?yàn)椴溉閯?dòng)物缺少合成這些酸的能力。然而哺乳動(dòng)物有能力將攝取的LA和ALA代謝成長鏈多不飽和脂肪酸(LC-PUFA)中n-6和n-3的形式。這些LC-PUFA’s是重要的細(xì)胞成分，其作為調(diào)節(jié)正常生理功能的生物活性類二十烷的前體，如前列腺素、環(huán)前列腺素和白細(xì)胞三烯，賦予膜的流動(dòng)性和功能性。
在哺乳動(dòng)物中，LC-PUFA的形成的限速步驟是Δ6脫氫化，其中將LA轉(zhuǎn)化為γ-亞油酸(GLA，183，Δ6，9，12)，將ALA轉(zhuǎn)變?yōu)镾DA(184，Δ6，9，12，15)。已經(jīng)表明許多生理和病理狀況能抑制該代謝步驟，最終抑制LC-PUFA的生成。然而，通過飲食補(bǔ)充EPA或DHA而避開Δ6脫氫化可以有效的緩解許多與PUFA低水平有關(guān)的病理性疾病。然而，如下面更詳細(xì)的闡述，由于多種原因，目前可使用PUFA的來源是不令人滿意的。對(duì)于一個(gè)可靠的和經(jīng)濟(jì)的PUFA’s的來源的需要已引發(fā)了對(duì)PUFA’s的可供選擇的來源的興趣。
重要的長鏈PUFAs主要包括主要在不同類型的魚油中發(fā)現(xiàn)的二十二碳六烯酸(DHA，226，n-3)和EPA，以及在絲狀真菌中發(fā)現(xiàn)的花生四烯酸(ARA，204，n-6)。對(duì)DHA而言，已有的多種用于商業(yè)化生產(chǎn)的來源包括多種的海洋有機(jī)體、冷水海洋魚類的油和蛋黃部分。商業(yè)化生產(chǎn)SDA的來源包括Trichodesma和Echium屬。然而，由天然來源進(jìn)行商業(yè)化生產(chǎn)PUFAs有幾個(gè)缺點(diǎn)。PUFAs的天然來源，例如動(dòng)物和植物，往往具有很高的不同種類的油組成。例如，從Echium種子中獲得的油，除了SDA以外，幾乎含有相當(dāng)水平的Ω-6脂肪酸GLA。因此從這些來源中得到的油需要進(jìn)一步純化以分離得到一種或多種的目標(biāo)PUFAs或生產(chǎn)富含一種或多種PUFA的油。
天然來源的PUFAs在可用性方面也遭遇了無法控制的波動(dòng)。魚群有可能經(jīng)歷自然的變動(dòng)或可能由于捕撈過度而耗盡。此外，即使有大量證據(jù)表明它們的治療效果，關(guān)于Ω-3脂肪酸飲食的推薦并沒有引起注意。魚油具有不可能從目標(biāo)產(chǎn)物中經(jīng)濟(jì)地去除的令人不愉快的味道和氣味，使這些產(chǎn)品不能作為食品添加劑被接受。動(dòng)物油，特別是魚油，能夠造成環(huán)境污染物累積。食物可以添加魚油，但是需再次指出的是，由于成本和世界范圍的魚群衰減，這種添加也是有問題的。問題還在于消耗和攝取全魚是有困難的。雖然如此，如果增加魚的食用量的健康信息被社會(huì)所接受，滿足魚的需求就很可能成為問題。此外，問題還在于這個(gè)產(chǎn)業(yè)持續(xù)發(fā)展能力嚴(yán)重依賴于用于水產(chǎn)飼養(yǎng)的野生魚群(Naylor et al.，2000)。
其它的自然限制促使尋找一種新的生產(chǎn)Ω-3脂肪酸的方法。氣候和疾病能夠造成依靠魚和植物資源的產(chǎn)量的波動(dòng)。用于交替的產(chǎn)油農(nóng)作物生長的農(nóng)田正面臨著競爭，競爭來自于人口持續(xù)擴(kuò)增和相應(yīng)的對(duì)在現(xiàn)存的可耕土地上生產(chǎn)食物的需求增加。農(nóng)作物確實(shí)產(chǎn)生PUFAs，例如琉璃苣，但不適合進(jìn)行商業(yè)化生產(chǎn)，不能很好的實(shí)施單一種植。與利潤更大、更易于種植的農(nóng)作物相比，種植這種農(nóng)作物不具備經(jīng)濟(jì)上的競爭性。大規(guī)模發(fā)酵如Mortierella的生物體的費(fèi)用也是昂貴的。天然的動(dòng)物組織含有少量的ARA并且難以加工處理。微生物如Porphyidium和Mortierella很難進(jìn)行商業(yè)規(guī)模的培養(yǎng)。
許多酶參與PUFA生物合成。通過Δ12-脫氫酶由油酸(OA，181，Δ9)生成LA(182，Δ9，12)，而通過Δ15去飽和酶由LA生成ALA(183)。通過Δ6去飽和酶由LA和ALA生成SDA(184，Δ6，9，12，15)和GLA(183，Δ6，9，12)。然而，如上所述，哺乳動(dòng)物不能在比Δ9位更遠(yuǎn)的位置上脫氫化，因此不能將油酸轉(zhuǎn)變成LA。同樣的，哺乳動(dòng)物不能合成ALA。其它真核生物，包括真菌和植物，含有在碳12和碳15的位置上脫氫的酶。因此動(dòng)物中的大多數(shù)多不飽和脂肪酸來自于飲食并通過隨后的脫氫化和飲食中的LA和ALA的延長獲得的。
U.S.Pat.No.5,952,544描述了從Brassica napus中分離和克隆的編碼脂肪酸脫氫酶的核酸片段?！?44專利的核酸片段的表達(dá)在植物中進(jìn)行，結(jié)果積累ALA。然而，在表達(dá)植物Δ15-脫氫酶的轉(zhuǎn)基因植物中，大量的LA仍然沒有被脫氫酶轉(zhuǎn)化?？梢詫⒏嗟腖A轉(zhuǎn)變成ALA的活性更好的酶將是很有利的。增加從LA到ALA的轉(zhuǎn)化可以產(chǎn)生更大量的ALA。當(dāng)與編碼Δ15-脫氫酶的核酸共表達(dá)時(shí)，升高的ALA的水平會(huì)促使Δ6-脫氫酶作用于ALA，從而產(chǎn)生更高水平的SDA。由于使用SDA的多種有益作用，需要大幅度提高SDA產(chǎn)量。已經(jīng)在各種來源的核酸進(jìn)行探索以提高SDA產(chǎn)量。然而仍只能很大程度寄期望于改善土地上的農(nóng)作物的商業(yè)化生產(chǎn)的革新(見，e.g.，Reed et al.，2000)。此外，使用來源于Caenorhabditis elegans(Meesapyodsuk et al.，2000)的脫氫酶多核苷酸對(duì)于富集的植物種子油的商業(yè)化生產(chǎn)是不理想的。
編碼Δ15-脫氫酶的核酸已從藍(lán)藻目和植物的幾個(gè)種中分離，包括擬南芥、大豆和歐芹。這些脫氫酶推斷的氨基酸序列顯示高度的相似性，最顯著的是在被認(rèn)為參與鐵結(jié)合的3個(gè)富集組氨酸的基序區(qū)域，這不受任何一個(gè)理論限制。然而，從任何一種真菌中都沒有分離到Δ15-脫氫酶。此外，即使將幾種真菌的基因組測(cè)序，使用復(fù)雜的運(yùn)算法則，利用已知的Δ15-脫氫酶cDNA和氨基酸序列在Aspergillus以及NeurosporaDNA數(shù)據(jù)庫比對(duì)也沒有發(fā)現(xiàn)Δ15-脫氫酶。
因此，獲得參與PUFA生物合成的遺傳物質(zhì)和在植物體系，特別是在地面生長的陸地農(nóng)作物體系中表達(dá)分離的物質(zhì)是有利的，此體系能夠提供商業(yè)化產(chǎn)量的一種或多種PUFA’s。由于需要增加人和動(dòng)物Ω-3脂肪的攝取量，需要提供多種的富含Ω-3的食品和食品添加劑，從而使人們可以選擇飼料、飼料成分、食品和食品配料來滿足他們的日常飲食習(xí)慣。目前，只有一種Ω-3脂肪酸，ALA，可在植物油中獲得。然而，攝取的ALA只有少量轉(zhuǎn)變成如EPA和DHA的長鏈Ω-3脂肪酸。這一點(diǎn)在未結(jié)案的美國申請(qǐng)10/384,639“炎癥紊亂的治療和預(yù)防”中證實(shí)，通過使用亞麻子油將人均ALA攝取量從1克/每天提高到14克/每天，只是適度增加了胞質(zhì)磷脂EPA的水平。ALA攝取量增加14倍只造成胞質(zhì)磷脂EPA增加2倍(Manzioris et al.，1994)。
因此，最終還需要利用脂肪酸脫氫酶、編碼它們的基因和產(chǎn)生它們的重組方法高效和商業(yè)化可實(shí)施的生產(chǎn)PUFAs。需要生產(chǎn)含有相對(duì)比例更高的和/或富含特定PUFA’s的油，含有它們的食品組合物和添加劑。也需要發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生特定PUFA’s的可靠的經(jīng)濟(jì)的方法。
盡管如上所述低效率和低產(chǎn)量，通過陸生食物鏈生產(chǎn)Ω-3脂肪酸，特別是生產(chǎn)SDA還是一項(xiàng)對(duì)公共健康有益的事業(yè)。如上所述，只有少量ALA轉(zhuǎn)變成EPA，因此SDA特別重要。這是因?yàn)樵谶@三種酶促反應(yīng)過程中(需要Δ6，Δ12，和Δ15)，起始酶Δ6-脫氫酶在人體中活性很低，限制了速度。Δ6-脫氫酶限制速度的證據(jù)來自于證明了在小鼠和大鼠中轉(zhuǎn)化其底物ALA，要比轉(zhuǎn)化其產(chǎn)物SDA到EPA的效率更低的研究(Yamazaki et al.，1992；Huang，1991)。
基于這些研究，表明在商業(yè)化含油種子農(nóng)作物，例如雙低油菜、大豆、玉米、向日葵、紅花或亞麻中，將它們種子油中典型的單和多不飽和脂肪酸的某一部分轉(zhuǎn)變成SDA，需要多種脫氫酶的種子特異性的表達(dá)，包括Δ6-和Δ12并且有Δ15-脫氫酶活性的酶。來自于Δ6、Δ12和Δ15-脫氫酶表達(dá)水平提高的植物的油中富含SDA和其它Ω-3脂肪酸。這些油可以用來生產(chǎn)富含Ω-3脂肪酸的食品和食品添加劑，并且消耗這樣的食品可有效的提高組織中EPA和DHA的水平。完全用富含Ω-3的油制作和準(zhǔn)備的食品和食品原料，如牛奶、人造黃油和香腸將產(chǎn)生治療性的益處。已顯示人們不改變飲食習(xí)慣，利用富含Ω-3脂肪酸的食品可攝取相當(dāng)于每天至少1.8克EPA和DHA的Ω-3(Naylor，supra.)。因此，非常需要新的Δ15-脫氫酶的核酸用于轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物中以制備富含PUFAs的油。需要富含PUFAs，特別是如十八碳四烯酸的Ω-3脂肪酸的新植物種子油。
發(fā)明概述一方面，本發(fā)明提供了編碼能在脂肪酸分子碳15位脫氫的多肽(Δ15-脫氫酶)的分離的核酸。這些可用來轉(zhuǎn)化細(xì)胞或改善植物或植物產(chǎn)生的油的脂肪酸組成。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是從具有獨(dú)特的脫氫酶活性的真菌種中分離的分離的多核苷酸序列。該分離的多核苷酸優(yōu)選從屬于選自由接合菌門(zygomycota)，擔(dān)子茵門(basidiomycota)和子囊菌門(ascomycota)組成的組中的一個(gè)門中的真菌種中分離。在某些實(shí)例中，分離的多核苷酸是從選自由粗糙脈孢菌(粗糙鏈孢霉)，構(gòu)巢曲霉(構(gòu)巢曲霉)和灰霉(灰葡萄孢)構(gòu)成的組中的真菌種中分離的。
另一方面，本發(fā)明提供選自下列的分離的多核苷酸(a)編碼SEQID NO3、SEQ ID NO5或SEQ ID NO34的多肽的多核苷酸；(b)含有SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO4或SEQ ID NO33的核酸序列的多核苷酸；(c)與SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ IDNO4或SEQ ID NO33或其互補(bǔ)物中的一種或多種，在5×SSC、50％甲酰胺和42℃條件下雜交的多核苷酸；和(d)編碼帶有至少一個(gè)下列氨基酸基序的多肽的真菌多核苷酸TrpIleLeuAlaHisGluCysGlyHisGlyAlaSerPhe(WILAHECGHGASF)(SEQ IDNO6)；LeuAlaHisGluCysGlyHis (LAHECGH) (SEQ ID NO7)；HisSerPheLeuLeuValProTyrPheSerTrpLys (HSFLLVPYFSWK) (SEQ ID NO8)；LeuLeuValProTyrPheSerTrpLys (LLVPYFSWK) (SEQ ID NO9)；His(His/Ala)ArgHisHisArg(Phe/Tyr)ThrThr(H(H/A)RHHR(F/Y)TT)(SEQ ID NO10，SEQ IDNO19，SEQ ID NO20，或SEQ ID NO21)；TrpValHisHisTrpLeuValAlaIleThrTyrLeu(His/Gln)HisThrHis(WVHHWLVAITYL(H/Q)HTH)(SEQ ID NO11)；AlaIleThrTyrLeu(His/Gln)HisThr(AITYL(H/Q)HT)(SEQ ID NO12)；GlyAlaLeuAlaThrValAspArg (GALATVDR) (SEQ ID NO13)或HisValValHisHisLeuPheXaaArgIleProPheTyr(HVVHHLFXRIPFY)(SEQ ID NO14 or SEQID NO22).
然而，在另一方面，本發(fā)明提供含有本發(fā)明所述的分離的多核苷酸的重組載體。在這里使用術(shù)語“重組載體”，包括任何一種希望將它引入到一個(gè)宿主細(xì)胞、組織和/或有機(jī)體中的DNA重組片段，特別包括從起始多核苷酸分離的表達(dá)盒。重組載體可以是線性的或環(huán)狀的。在各種不同的方面，重組載體可以包含至少一個(gè)從下組中選擇的額外的序列與多核苷酸可操作性連接的調(diào)控序列；與多核苷酸可操作性連接的篩選標(biāo)記；和多核苷酸可操作性連接的標(biāo)記序列；和多核苷酸可操作性連接的純化部分；和多核苷酸可操作性連接的靶序列。
在另一方面，本發(fā)明提供用本發(fā)明的多核苷酸轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，例如哺乳動(dòng)物、植物、昆蟲、酵母和細(xì)菌細(xì)胞。在進(jìn)一步實(shí)施方案中，使用除本發(fā)明的多核苷酸之外還含有結(jié)構(gòu)性和組織特異性啟動(dòng)子的重組載體轉(zhuǎn)化細(xì)胞。在本發(fā)明某些特定實(shí)例中，這些細(xì)胞被進(jìn)一步限定為被編碼多肽的核酸序列轉(zhuǎn)化，該多肽具有在脂肪酸碳6位上脫氫的脫氫酶活性。
在另一方面，本發(fā)明提供具有在脂肪酸分子碳15位脫氫的脫氫酶活性的多肽，包括片段和蛋白。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)例中，多肽含有至少一種下列氨基酸基序TrpIleLeuAlaHisGluCysGlyHisGlyAlaSerPhe (WILAHECGHGASF) (SEQ ID NO6)；LeuAlaIIisGluCysGlyHis (LAHECGH) (SEQ ID NO7)；HisSerPheLeuLeuValProTyrPheSerTrpLys (HSFLLVPYFSWK) (SEQ ID NO8)；LeuLeuValProTyrPheSerTrpLys (LLVPYFSWK) (SEQ ID NO9)；His(His/Ala)ArgHisHisArg(Phe/Tyr)ThrThr(H(H/A)RHHR(F/Y)TT)(SEQ ID NO10，SEQ IDNO19，SEQ ID NO20，或SEQ ID NO21)；TrpValHisHisTrpLeuValAlaIleThrTyrLeu(His/Gln)HisThrHis(WVHHWLVAITYL(H/Q)HTH)(SEQ ID NO11)；AlaIleThrTyrLeu(His/Gln)HisThr(AITYL(H/Q)HT)(SEQ ID NO12)；GlyAlaLeuAlaThrValAspArg (GALATVDR) (SEQ ID NO13) 或HisValValHisHisLeuPheXaaArgIleProPheTyr(HVVHHLFXRIPFY)(SEQ ID NO14 or SEQID NO22).
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，多肽進(jìn)一步被限定為含有所有上述氨基酸基序。本發(fā)明也提供含有SEQ ID NO3、SEQ ID NO5，或SEQ IDNO34的氨基酸序列的真菌多肽或其片段，其具有在脂肪酸分子碳15位脫氫的脫氫酶活性。
另一方面，本發(fā)明提供一種由植物種子中生產(chǎn)含Ω-3脂肪酸的種子油的方法，包括步驟(a)獲得本發(fā)明所述植物的種子；和(b)從所述種子中提取油。這些植物種子包括雙低油菜、大豆、黃豆、油菜籽、向日葵、棉花、可可豆、花生、紅花、椰子、亞麻、油椰子、油籽油菜和玉米。優(yōu)選的轉(zhuǎn)化這些植物細(xì)胞的方法包括使用農(nóng)桿菌的Ti和Ri質(zhì)粒、電穿孔和高速彈道轟擊。
另一方面，提供了包括向一種產(chǎn)油植物中引入本發(fā)明所述的重組載體，而生產(chǎn)含有改變了的Ω-3脂肪酸水平的種子油的植物的方法。在此方法中，導(dǎo)入重組載體可以包括植物的栽培以及步驟(a)用重組載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞；和(b)由所述植物細(xì)胞再生植物，其中植物的Ω-3脂肪酸水平被改變。在此方法中，植物可以從包括例如擬南芥、油籽蕓苔屬、油菜籽、向日葵、紅花、雙低油菜、玉米、大豆、棉花、亞麻、加州希蒙得木、中國烏桕樹、煙草、可可豆、花生、果樹，柑桔類植物、產(chǎn)生堅(jiān)果和漿果的植物組成的組中選擇。該植物可以被進(jìn)一步限定為用編碼具有在脂肪酸分子碳6位脫氫的脫氫酶活性的多肽的核酸序列轉(zhuǎn)化，并且植物中SDA的含量增加。此方法也可以進(jìn)一步包括將重組載體引入到多種產(chǎn)油植物中，篩選遺傳了具有預(yù)期的Ω-3脂肪酸特性的植物重組載體的植物或子代。
另一方面，本發(fā)明提供一種內(nèi)源的雙低油菜籽油，其SDA含量從大約8％到約27％，油酸的含量從大約40％到約70％。在某些實(shí)例中，雙低油菜籽油可以進(jìn)一步限定為含有小于10％的混合的ALA酸、LA和GLA。該油包含SDS含量還可以進(jìn)一步限定為從大約10％到約20％，包括從約12％到約20％，大約15％到約20％，約10％到約17％，約12％到約17％。在本發(fā)明的進(jìn)一步的實(shí)施方案中，雙低油菜籽油的油酸含量可以進(jìn)一步限定為從大約45％到約65％，包括從約50％到約65％，大約50％到約60％，約55％到約65％。在本發(fā)明更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，SDA的含量進(jìn)一步限定為從大約12％到約17％，油酸含量進(jìn)一步限定為從大約55％到約65％。在一個(gè)具體的實(shí)例中，該雙低油菜籽油來自于歐洲油菜(Brassica napus)或蕪菁(Brassica rapa)種子。在某些實(shí)例中，提供的油中Ω-6與Ω-3脂肪酸的比率是從約1∶1到約1∶4，包括從約1∶2到約1∶4。
另一方面，本發(fā)明提供一種提高人和動(dòng)物消耗的可食用產(chǎn)品的營養(yǎng)價(jià)值的方法，包括將本發(fā)明提供的雙低油菜籽油添加到可食用產(chǎn)品中。在具體實(shí)例中，產(chǎn)品是人和/或動(dòng)物的食品。可食用產(chǎn)品也可以是動(dòng)物飼料和/或食品添加劑。在該方法中，雙低油菜籽油可以提高可食用產(chǎn)品的SDA含量和/或降低可食用產(chǎn)品中Ω-6與Ω-3脂肪酸的比率?？墒秤檬称房梢栽谔砑与p低油菜籽油之前缺少SDA。
另一方面，本發(fā)明提供生產(chǎn)食品或飼料的方法，包括將本發(fā)明提供的雙低油菜籽油添加到原料食品或飼料成分中生產(chǎn)食品和飼料。在某些的實(shí)例中，本方法被進(jìn)一步限定為生產(chǎn)食品和/或飼料的方法。本發(fā)明也提供由本方法制成的食品或飼料。
另一方面，本發(fā)明包括向人和動(dòng)物提供SDA的方法，包括給予所述人或動(dòng)物權(quán)利要求1所述的雙低油菜籽油。在本方法中，雙低油菜籽油可以以可食用的組合物的形式給予，其包括食品或飼料。食品的例子包括飲料、浸漬食品、沙司、調(diào)味品、色拉調(diào)料、果汁、糖漿、甜點(diǎn)、糖衣和餅餡、軟冷凍品、甜食或中間食品?？墒秤媒M合物可以基本上是液體或固體?？墒秤媒M合物也可以是食品添加劑和/或保健品。在本方法中，可以給予人和/或動(dòng)物雙低油菜籽油。給予油的動(dòng)物的例子可以包括家畜或家禽。
附圖簡述下述附圖構(gòu)成了本說明書的一部分并且進(jìn)一步證明本發(fā)明的某些方面。通過參考一個(gè)或多個(gè)這些圖并結(jié)合在此記載的特定實(shí)例的詳細(xì)描述可以更好的理解本發(fā)明。從下列圖的描述中可以更充分的理解本發(fā)明


圖1顯示在pCR2.1盒(pMON67004)中真菌Δ15-脫氫酶NcD15D的編碼區(qū)域。
圖2顯示在酵母表達(dá)載體pYES2.1(pMON77208)中真菌Δ15-脫氫酶NcD15D的編碼區(qū)域。
圖3顯示在200個(gè)半個(gè)種子中(種子被分成兩半)ALA的水平，按ALA從最低到最高的次序。
圖4顯示得到質(zhì)粒pMON77214和pMON77217的流程圖或質(zhì)粒圖譜。
圖5顯示脫氫酶多肽包括N.crassaΔ15-脫氫酶的典型系統(tǒng)樹圖。
圖6顯示典型的脫氫酶多肽與N.crassaΔ15-脫氫酶的序列比對(duì)結(jié)果。
圖7A-7H顯示制備構(gòu)建體的質(zhì)粒圖。
發(fā)明詳述本發(fā)明通過提供制備具有改善的PUFA含量的植物的方法和組合物，克服了現(xiàn)有技術(shù)的局限性。對(duì)例如植物的有機(jī)體中脂肪酸含量的調(diào)整產(chǎn)生有許多益處，包括對(duì)營養(yǎng)和健康有益的改善。調(diào)整脂肪酸含量可用來在植物、植物的部分和植物產(chǎn)品、包括植物種子油中獲得預(yù)期的有益的PUFA’s的水平或狀況。例如，當(dāng)在植物的種子組織中產(chǎn)生預(yù)期的PUFA’s時(shí)，可以從特定的種子中分離出油，從而得到高含量的預(yù)期的PUFAs的油或具有預(yù)期的脂肪酸含量或狀況的油，它們隨后可以用來提供食品原料和其它產(chǎn)品有益的特性。本發(fā)明特別提供含有SDA和有益油酸含量的內(nèi)源性雙低油菜籽油。
本發(fā)明的不同方面包括調(diào)整細(xì)胞PUFA含量的方法和組合物，例如，調(diào)整植物細(xì)胞的PUFA含量。與本發(fā)明相關(guān)的組合物包括新分離的多核苷酸序列、多核苷酸構(gòu)建體和用本發(fā)明的多核苷酸轉(zhuǎn)化的植物和/或植物的部分。該分離的多核苷酸可以編碼真菌脂肪酸脫氫酶和特別的是可以編碼真菌Δ15-脫氫酶?？梢允褂盟拗骷?xì)胞來表達(dá)編碼催化脂肪酸脫氫的脫氫酶多肽的多核苷酸。
本發(fā)明的一些方面包括各種各樣的脫氫酶多肽和其編碼多核苷酸。本發(fā)明的不同實(shí)施方式為可以將脫氫酶多核苷酸及其編碼的特異性依賴宿主細(xì)胞的多肽、底物的可用性，以及目標(biāo)終產(chǎn)物聯(lián)合起來應(yīng)用?！懊摎涿浮笔侵敢环N多肽，它能使一個(gè)或多個(gè)脂肪酸的連續(xù)碳原子之間脫氫或催化雙鍵形成，而產(chǎn)生單或多-不飽和脂肪酸或其前體。特別值得注意的是能夠催化硬脂酸轉(zhuǎn)變成油酸，油酸轉(zhuǎn)變成LA，LA轉(zhuǎn)變成ALA，或ALA轉(zhuǎn)變成SDA的多肽，其中包括了在12，15或6位脫氫的酶。術(shù)語“多肽”是指任何氨基酸鏈，不考慮其長度或翻譯后的修飾(例如，糖基化或磷酸化)。選擇一種具有脫氫酶活性的特定的多肽要考慮但不局限于多肽的最適pH，是否多肽是限速酶或其成分，是否使用的脫氫酶是預(yù)期的PUFA的合成所必需的，和/或多肽所需要的輔助因子。表達(dá)的多肽優(yōu)選具有與其在宿主細(xì)胞的位置上的生化環(huán)境相容的特性。例如，多肽或許不得不競爭底物。
對(duì)多肽的Km和特異性活性的分析可以用來決定一種指定的多肽是否適合在指定宿主細(xì)胞中調(diào)整PUFAs的生產(chǎn)、水平或狀況。在特定情況下使用的多肽是一種可以在預(yù)期的宿主細(xì)胞中已有條件下發(fā)揮特異性作用的多肽，然而在其他方面，在此還可以探討任何具有預(yù)期的特性或能夠修飾預(yù)期的PUFA(s)相應(yīng)生產(chǎn)、水平或性質(zhì)或任何其它預(yù)期性狀的脫氫酶多肽。表達(dá)的酶的底物可以由宿主細(xì)胞產(chǎn)生或由外源提供。為了實(shí)現(xiàn)表達(dá)，本發(fā)明的多肽通過下述的多核苷酸編碼。
本發(fā)明者已分離和制備了真菌來源的顯示Δ15-脫氫酶活性的酶。真菌來源包括但不局限于曲霉屬(Aspergillus)，例如構(gòu)巢曲霉；葡萄孢屬(Botrytis)，例如灰葡萄孢；鏈孢酶屬(Neurospora)，例如粗糙鏈孢菌；以及其它的顯示Δ15-脫氫酶活性的真菌。
特別值得感興趣的是粗糙脈孢茵和/或構(gòu)巢曲霉Δ15-脫氫酶。N.crassaΔ15-脫氫酶的氨基酸序列由SEQ ID NO3列出，由SEQ ID NO1和SEQ ID NO2的核酸序列編碼，測(cè)定其分子量大約為49,123.37道爾頓。序列由429個(gè)氨基酸組成；其中32個(gè)是強(qiáng)堿性氨基酸(賴氨酸，精氨酸)；其中35個(gè)是強(qiáng)酸性氨基酸(天冬氨酸，谷氨酸)；170個(gè)疏水性氨基酸(丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、纈氨酸)；和100個(gè)極性氨基酸(天冬酰氨、半胱氨酸、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸)。SEQ ID NO3的等電點(diǎn)是7.187；在pH7.0時(shí)電荷為1.634；Davis，Botsein，Roth熔解溫度為89.65℃，Wallace溫度為5098.00。
A.nidulansΔ15-脫氫酶的氨基酸序列由SEQ ID NO5列出，編碼它的核酸序列由SEQ ID NO4列出，經(jīng)測(cè)定分子量大約為46,300道爾頓。該序列由401個(gè)氨基酸組成；其中有31個(gè)是強(qiáng)堿性的(賴氨酸，精氨酸)；34個(gè)是強(qiáng)酸性的(天冬氨酸，谷氨酸)；161個(gè)疏水氨基酸(丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、纈氨酸)；和1 00個(gè)極性氨基酸(天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸)。SEQ ID NO5的等電點(diǎn)是6.83。
編碼粗糙脈孢菌和/或構(gòu)巢曲霉Δ15-脫氫酶的序列可在轉(zhuǎn)基因植物、微生物或動(dòng)物中表達(dá)，而使LA到ALA的合成增加，SDA也同樣如此。也可以使用其它的多核苷酸，只要其基本上與N.crassa和/或A.nidulansΔ15-脫氫酶多核苷酸一樣，或其編碼的多肽基本上與N.crassa和/或A.nidulansΔ15-脫氫酶多肽一樣?！盎旧弦粯印笔侵赴被嵝蛄谢蚝怂嵝蛄斜憩F(xiàn)出與N.crassa和/或A.nidulansΔ15-脫氫酶氨基酸序列或編碼氨基酸序列的核酸序列按優(yōu)選地遞增順序具有至少80％、90％或95％的一致性?？梢赃\(yùn)用序列分析軟件來比較多肽或多核苷酸，例如，序列分析軟件包GCG Wisconsin包(Accelrys，San Diego，CA)、MEGAlign(DNAStar，Inc.，1228S，Park St.，Madison，Wis.56-3715)，和Mac載體(Oxford Molecular Group，2105 S.BascomAvenue，Suite 200，Campbell，Calif，95008)。這些軟件通過確定相似或一致的程度匹配相似的序列。
本發(fā)明包含來自于相同或其它相關(guān)的有機(jī)體的相關(guān)的脫氫酶。這些相關(guān)的脫氫酶包括在相同或不同的真菌種中自然生成的已知的Δ15-脫氫酶的變體。相應(yīng)的脫氫酶可以通過其發(fā)揮與已知的脫氫酶基本相同作用的能力而鑒定；即能夠有效的將LA轉(zhuǎn)變?yōu)锳LA，將GLA轉(zhuǎn)變?yōu)镾DA。相應(yīng)的脫氫酶還可以通過以下方法鑒定，通過篩選序列數(shù)據(jù)庫尋找與已知脫氫酶同源的序列，通過基于已知脫氫酶的探針與原有機(jī)體構(gòu)建的文庫雜交，或通過利用有機(jī)體來源的mRNA與基于已知脫氫酶的引物進(jìn)行RT-PCR。
本發(fā)明的某一方面包括真菌Δ15-脫氫酶多肽的片段和變種，以及編碼那些具有脫氫酶活性的多肽的核苷酸。本發(fā)明的另一個(gè)方面是含有核酸或其片段的載體，其中含有啟動(dòng)子、Δ15-脫氫酶編碼序列和終止區(qū)域，該載體能轉(zhuǎn)移至啟動(dòng)子和終止子發(fā)揮功能的有機(jī)體中。本發(fā)明相應(yīng)的提供產(chǎn)生重組Δ15-脫氫酶的有機(jī)體。本發(fā)明的另一方面提供分離的Δ15-脫氫酶，它可以通過標(biāo)準(zhǔn)的蛋白純化的方法從重組有機(jī)體中純化(例如，見Ausubel et al.，1987)。
本發(fā)明的不同方面包括所述編碼脫氫酶的核酸序列。核酸可以從真菌包括，但不局限于粗糙鏈孢霉、構(gòu)巢曲霉、灰葡萄孢等中分離。這些真菌的染色體都已經(jīng)過測(cè)序，已知每一種都富含ALA?；谟糜跀U(kuò)增作為潛在的脂肪酸脫氫酶的序列的寡核苷酸引物以及N.crassa基因組DNA數(shù)據(jù)庫的BLAST搜索的克隆策略可以被用來測(cè)定單個(gè)克隆的序列。這些克隆然后就可以得到功能表征。
核酸構(gòu)建體可以通過被整合到宿主細(xì)胞的基因組中或在宿主細(xì)胞中自主復(fù)制(例如附加復(fù)制)提供。為了生產(chǎn)ALA和/或SDA，通常使用的表達(dá)盒(即編碼蛋白的多核苷酸，其可操作地與核酸序列連接，指導(dǎo)多核苷酸表達(dá))包括給編碼Δ15-脫氫酶的多核苷酸提供表達(dá)的表達(dá)盒。在某些實(shí)例中，宿主細(xì)胞可以具有野生型油酸的含量。
當(dāng)考慮到本發(fā)明提供的教導(dǎo)，構(gòu)建表達(dá)載體的方法和組合物來表達(dá)真菌脫氫酶是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員顯而易見的。所述表達(dá)載體是被設(shè)計(jì)成用來可控表達(dá)目的多核苷酸的DNA或RNA分子，例如編碼Δ15-脫氫酶的多核苷酸。載體的例子包括質(zhì)粒、噬菌體、粘粒或病毒。根據(jù)本發(fā)明也考慮穿梭質(zhì)粒例如(Wolk et al.，1984；Bustos et al.，1991)。載體的綜述和制備使用載體的方法可以在Sambrook et al.(1989)、Goeddel(1990)和Perbal(1988)中找到。能有效表達(dá)多核苷酸的序列元件包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、上游激活序列、轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)和多酰苷化位點(diǎn)。
編碼脫氫酶的多核苷酸可以置于強(qiáng)啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制之下。在一些情況下，這會(huì)導(dǎo)致表達(dá)的脫氫酶的量的增加，并且伴隨酶催化反應(yīng)生成的脂肪酸的產(chǎn)量也增加。有多種植物啟動(dòng)子序列可用來促使轉(zhuǎn)基因植物中編碼脫氫酶的多核苷酸的組織特異性表達(dá)。例如，napin啟動(dòng)子和乙酰載體蛋白啟動(dòng)子先前通過表達(dá)脫氫酶的反義形式被用來調(diào)整種子油的組成(Knutzon et al.，1999)。類似的，大豆β-伴球蛋白的β-亞基的啟動(dòng)子已顯示出高的活性并且形成在除了大豆以外的種的轉(zhuǎn)基因植物中的組織特異性表達(dá)(Bray et al.，1987)。Arondel et al.(1992)通過將內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位的fad3基因置于強(qiáng)組成型花椰菜鑲嵌病毒35S啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制下，在轉(zhuǎn)基因植物擬南介的組織中提高亞麻酸的含量(183)。
普通技術(shù)人員可以確定適合在特定宿主細(xì)胞中表達(dá)的載體和調(diào)控元件(包括可操作連接的啟動(dòng)子和編碼區(qū)域)。本文中“可操作連接”是指啟動(dòng)子和終止子序列有效發(fā)揮調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄功能。進(jìn)一步的例子是，在轉(zhuǎn)基因植物中適于表達(dá)Δ15-脫氫酶的載體可以包括種子特異性的啟動(dòng)子序列，其來源于可操作連接到Δ15-脫氫酶編碼區(qū)域，以及進(jìn)一步可操作連接到種子貯藏蛋白終止信號(hào)或胭脂堿合成酶終止信號(hào)的向日葵甲基橙素、napin或大豆球蛋白。進(jìn)一步的例子為，用來在植物中表達(dá)Δ15-脫氫酶的載體可包含與Δ15-脫氫酶編碼區(qū)域可操作連接的，以及進(jìn)一步與組成型或組織特異性終止子或胭脂堿合成酶終止信號(hào)可操作連接的組成型的啟動(dòng)子或組織特異性啟動(dòng)子。
具有本發(fā)明所述的功能的核苷酸序列或在此披露的調(diào)節(jié)因素的修飾都在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。這樣的修飾包括插入、替換和刪除，以及反應(yīng)出遺傳密碼簡并性的特定替換。
構(gòu)建此類重組載體的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，可以參考如Sam brook et al.(1989)，或任何一種廣范使用的關(guān)于重組DNA技術(shù)的實(shí)驗(yàn)操作手冊(cè)。各種用于連接DNA片段的策略應(yīng)根據(jù)DNA片段末端的特性來選擇。根據(jù)本發(fā)明需要進(jìn)一步考慮的是將用于克隆、表達(dá)或加工的核苷酸序列元件，例如編碼信號(hào)肽的序列、編碼用于蛋白滯留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的KDEL的序列或編碼指導(dǎo)Δ15-脫氫酶轉(zhuǎn)運(yùn)到葉綠體中的轉(zhuǎn)運(yùn)肽的序列，引入核酸載體中。這些序列是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所知道的。例如Van den Broeck等人(1985)描述了一種優(yōu)選的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。如Michaelis等人(1982)披露了原核和真核信號(hào)序列。
在某些實(shí)施方案中，表達(dá)盒可以包括用于特別是分別在產(chǎn)生或攝取LA或ALA宿主細(xì)胞中提供Δ6-和/或Δ15-脫氫酶活性的盒。不能產(chǎn)生ALA的宿主有機(jī)體對(duì)Ω-6型不飽和脂肪酸如LA的生成是有利的。通過抑制Δ15-脫氫酶活性宿主ALA的產(chǎn)生是可以被除去，降低和/或抑制的。這可以利用提供Δ15-脫氫酶反義表達(dá)盒，通過插入、缺失、替換部分或全部靶基因而破壞靶Δ15-脫氫酶基因，或通過添加Δ15-脫氫酶抑制劑的標(biāo)準(zhǔn)篩選方法完成。相似地，利用Δ6反義轉(zhuǎn)錄的表達(dá)盒，通過破壞Δ6-脫氫酶基因，或通過使用Δ6-脫氫酶抑制劑，使具有Δ6-脫氫酶活性的微生物或動(dòng)物更有利于產(chǎn)生LA或ALA。
編碼目的脫氫酶的多核苷酸可以通過多種方法鑒定。例如，目的脫氫酶的來源，例如用可檢測(cè)的酶促反應(yīng)或化學(xué)合成的探針篩選Neurospora來源的基因組或cDNA文庫，該探針可以由DNA、RNA或非天然出現(xiàn)的核苷酸或其混合物制備。探針可以從已知的脫氫酶多核苷酸酶促合成，用于在標(biāo)準(zhǔn)的或降低嚴(yán)謹(jǐn)性的雜交方法中使用。寡核苷酸探針也可以用來篩選來源，該探針是基于已知的脫氫酶序列，包括已知脫氫酶中的保守序列，或基于純化的目的蛋白獲得的肽序列?；诎被嵝蛄械墓押塑账崽结樋梢酝嘶涟z傳密碼的簡并，或可以偏好成有機(jī)體的優(yōu)選密碼子。寡核苷酸也可以用作從已知或疑似來源的逆轉(zhuǎn)錄mRNA的PCR引物；PCR產(chǎn)物可以是全長的cDNA或可用來制備得到全長的目的cDNA的探針?？蛇x擇的是，目的蛋白可以被全部測(cè)序以及全合成編碼此多肽的DNA。
一旦目的基因組或cDNA被分離，就可以通過已知的方法測(cè)序。本領(lǐng)域公認(rèn)這些方法會(huì)出錯(cuò)，所以對(duì)相同區(qū)域的多重測(cè)序是必須的，而且預(yù)計(jì)在得到的推測(cè)序列中仍然存在一定比例的錯(cuò)誤，特別是在有重復(fù)區(qū)域、大量的二級(jí)結(jié)構(gòu)，或不同尋常的堿基組成，例如高GC堿基含量的區(qū)域中。當(dāng)出現(xiàn)差異時(shí)，可以再次測(cè)序并且可以使用特殊的方法。特殊的方法包括改變使用的測(cè)序條件不同的溫度、不同的酶、改變寡核苷酸形成更高有序結(jié)構(gòu)能力的蛋白；改變的核苷酸例如ITP或甲基化的dGTP、不同的凝膠組成例如加入甲酰胺、不同的引物或與問題區(qū)域距離不同的引物或不同的模板，例如單鏈DNAs。也可以對(duì)mRNA進(jìn)行測(cè)序。
編碼有脫氫酶活性的多肽的一些或全部序列可以從天然來源獲得。然而在一些情況下，希望修飾全部或部分密碼子，例如通過使用宿主偏好密碼子來增強(qiáng)表達(dá)。根據(jù)在特定的目標(biāo)宿主種類中大量表達(dá)蛋白時(shí)出現(xiàn)最高頻率的密碼子來確定宿主偏好密碼子。這樣，編碼有脫氫酶活性的多肽的序列可以被全合成或部分合成。也可以合成全部DNA或其部分DNA來除去在轉(zhuǎn)錄mRNA中出現(xiàn)的任何不穩(wěn)定序列或二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)域。也可以合成全部或部分DNA來改變堿基組成以使其在目的宿主細(xì)胞中更偏好。合成序列和將序列合在一起的方法在文獻(xiàn)中已有充分記載?？梢允褂皿w外突變和篩選，定點(diǎn)突變，或其它手段來獲得天然存在的脫氫酶基因的突變基因，用來制備在宿主細(xì)胞體內(nèi)有更好的物理和動(dòng)力學(xué)功能參數(shù)的脫氫酶活性的多肽，例如目的具有更長的半衰期或更高的產(chǎn)率的多不飽和脂肪酸。
一旦得到編碼脫氫酶多肽的多核苷酸，可將它放入能在宿主細(xì)胞中復(fù)制的載體中，或在體外通過PCR或長PCR技術(shù)擴(kuò)增。復(fù)制載體可以包括質(zhì)粒、噬菌體、病毒、粘粒等。希望的載體包括那些有利于對(duì)目的基因進(jìn)行突變或目的基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)的載體。長PCR技術(shù)已使在體外擴(kuò)增大的構(gòu)建體成為可能，這樣，對(duì)目的基因進(jìn)行修飾，例如突變或添加表達(dá)信號(hào)和擴(kuò)增產(chǎn)生的構(gòu)建可以完全在體外進(jìn)行而不使用復(fù)制載體或宿主細(xì)胞。
為了表達(dá)脫氫酶多肽，將有功能的轉(zhuǎn)錄和翻譯起始和終止區(qū)域可操作地與編碼脫氫酶多肽的多核苷酸連接。多肽編碼區(qū)域的表達(dá)可以在體外發(fā)生或在宿主細(xì)胞中發(fā)生。轉(zhuǎn)錄和翻譯起始和終止區(qū)域從多種的非單一的來源獲得，包括要表達(dá)的多核苷酸、已知基因或在預(yù)期體系中預(yù)期能表達(dá)的基因、表達(dá)載體、化學(xué)合成或來自于宿主細(xì)胞中內(nèi)源位點(diǎn)。
在宿主細(xì)胞中的表達(dá)可以是瞬時(shí)的或穩(wěn)定的完成。引入的含有在宿主中有功能的表達(dá)信號(hào)的構(gòu)建體，在構(gòu)建體不能復(fù)制也幾乎不整合到宿主細(xì)胞中，或宿主細(xì)胞不能增值時(shí)，發(fā)生瞬時(shí)表達(dá)。也可以通過誘導(dǎo)可調(diào)控的與目的基因可操作地連接的啟動(dòng)子的活性來完成瞬時(shí)表達(dá)，盡管這樣的可誘導(dǎo)的體系時(shí)常顯示低水平的本底表達(dá)。通過引入能夠整合到宿主基因組或可以在宿主細(xì)胞中自主復(fù)制構(gòu)建體來完成穩(wěn)定表達(dá)。目的基因的穩(wěn)定表達(dá)可以通過利用定位的可篩選標(biāo)記或用表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)染，接著篩選表達(dá)標(biāo)記物的細(xì)胞來篩選。當(dāng)通過整合產(chǎn)生穩(wěn)定表達(dá)時(shí)，在宿主基因組可隨機(jī)發(fā)生構(gòu)建體的整合，或通過使用含有有效的與宿主位點(diǎn)進(jìn)行靶向重組并與宿主基因組同源的區(qū)域的構(gòu)建體而實(shí)現(xiàn)定位。在構(gòu)建體靶向定位到內(nèi)源位點(diǎn)時(shí)，全部或部分轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)區(qū)域可以由內(nèi)源位點(diǎn)提供。
當(dāng)希望有機(jī)體中的脫氫酶多肽的表達(dá)增加時(shí)，可以使用幾種方法?？梢栽谒拗饔袡C(jī)體中引入額外的編碼脫氫酶多肽的基因?？梢酝ㄟ^同源重組增加源自原有的脫氫酶位點(diǎn)的表達(dá)，例如通過在宿主基因組中插入一個(gè)更強(qiáng)的啟動(dòng)子來造成表達(dá)的增加，通過刪去宿主基因組的信息除去mRNA或編碼的蛋白的不穩(wěn)定序列，或通過給mRNA添加穩(wěn)定序列(U.S.Pat.No.4,910,141)。
可以考慮在宿主細(xì)胞中通過使用附加體或整合的表達(dá)載體引入和擴(kuò)增多個(gè)編碼一種脫氫酶的多核苷酸或編碼多種脫氫酶的多核苷酸。當(dāng)兩個(gè)或更多的基因由各自獨(dú)立的復(fù)制載體表達(dá)時(shí)，理想地是每一個(gè)載體都有不同的復(fù)制手段。每一個(gè)引入的構(gòu)建體，無論整合與否，都應(yīng)有不同的篩選方法并且都與其它構(gòu)建體缺少同源性以保持穩(wěn)定的表達(dá)以及防止構(gòu)建體中的元件重新分配。引入的構(gòu)建體的調(diào)節(jié)區(qū)域、篩選手段和擴(kuò)增方法的明智選擇可以通過實(shí)驗(yàn)來確定，這樣所有引入的多核苷酸在必需的水平上表達(dá)來滿足目的產(chǎn)物的合成。
當(dāng)需要轉(zhuǎn)化時(shí)，本發(fā)明的Δ15-脫氫酶編碼序列可以插入到植物轉(zhuǎn)化載體，例如Bevan(1984)所描述的二元載體。植物轉(zhuǎn)化載體可以通過修飾天然的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)根癌農(nóng)桿菌而獲得。天然系統(tǒng)包括含有一個(gè)大片段的大Ti(腫瘤-誘導(dǎo))-質(zhì)粒，即已知的T-DNA，其可以被轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)化的植物中。另一個(gè)Ti質(zhì)粒片段，vir區(qū)域，用于T-DNA的轉(zhuǎn)移。T-DNA區(qū)域與末端重復(fù)毗連。在修飾的二元載體中，腫瘤誘導(dǎo)的基因已被刪去，利用vir區(qū)域的功能來轉(zhuǎn)移由T-DNA邊界序列毗連的外來DNA。T-區(qū)域也包含耐受抗生素的篩選標(biāo)記，和用來插入轉(zhuǎn)移序列的多克隆位點(diǎn)。這些工程化的菌株被命名為“卸甲(disarmed)”A.tumefaciens菌株，能夠?qū)⒂蒚-區(qū)域界定的序列有效的轉(zhuǎn)入植物的核基因組中。
本發(fā)明發(fā)現(xiàn)許多應(yīng)用。發(fā)現(xiàn)基于本發(fā)明多核苷酸的探針可以在分離相關(guān)分子的方法中或檢測(cè)表達(dá)脫氫酶的有機(jī)體的方法中使用。當(dāng)作為探針使用時(shí)，多核苷酸或寡核苷酸必須是可檢測(cè)的。這通常是通過在內(nèi)部位點(diǎn)或在5’端或3’端連上標(biāo)記來實(shí)現(xiàn)，例如通過摻入修飾的殘基。這樣的標(biāo)記可以直接檢測(cè)到，可以結(jié)合到可檢測(cè)的標(biāo)記的二級(jí)分子上，或可以結(jié)合到無標(biāo)記的二級(jí)分子上和可檢測(cè)的標(biāo)記的三級(jí)分子上；只要操作中不出現(xiàn)無法接受的背景信號(hào)，而且獲得滿意的可檢測(cè)的信號(hào)，這個(gè)過程就可以持續(xù)進(jìn)行。二級(jí)、三級(jí)或橋系統(tǒng)可以包括使用直接抗任何其它分子的抗體，包括標(biāo)記或其它抗體；或可以包含任何可相互結(jié)合的分子，例如生物素-鏈親和素/抗生物素蛋白系統(tǒng)。典型的可檢測(cè)的標(biāo)記包括放射性同位素，化學(xué)合成的或酶法產(chǎn)生的或改變發(fā)光的分子，產(chǎn)生可檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物的酶、磁性分子、熒光分子或根據(jù)結(jié)合改變熒光或發(fā)射光特性的分子。標(biāo)記方法的例子可以參考U.S.Pat.No.5,011,770。或者通過等溫滴定熱量測(cè)定探針結(jié)合到目標(biāo)上時(shí)溶液熱量的變化，或通過將探針或目標(biāo)涂在表面上并檢測(cè)目標(biāo)或探針結(jié)合時(shí)產(chǎn)生的表面光散射的變化，這些可以各自通過BIAcore系統(tǒng)完成。
包含目標(biāo)基因的構(gòu)建體可以通過常規(guī)技術(shù)引入到宿主細(xì)胞中。為了方便，在此將通過任何方法處理的含有DNA序列或構(gòu)建體的宿主細(xì)胞命名為“轉(zhuǎn)化的”或“重組的”。例如根據(jù)基因是否整合到基因組，擴(kuò)增或出現(xiàn)在帶有多拷貝數(shù)的附加染色體元件，目標(biāo)宿主會(huì)含有至少一份表達(dá)構(gòu)建體的拷貝，也可以含有兩個(gè)或更多的拷貝。
轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞可以通過引入的構(gòu)建體上含有的篩選標(biāo)記來鑒定?？晒┻x擇的，單獨(dú)的標(biāo)記構(gòu)建體可以和目的構(gòu)建體一起被引入，正如許多轉(zhuǎn)化技術(shù)引入許多DNA分子到宿主細(xì)胞中一樣。具有代表性的是可以根據(jù)轉(zhuǎn)化的宿主在選擇培養(yǎng)基上的生長能力而篩選轉(zhuǎn)化的宿主。選擇培養(yǎng)基中可以摻入抗生素或缺乏未轉(zhuǎn)化宿主生長必需的因子，例如營養(yǎng)因子或生長因子。因此引入的標(biāo)記基因可以賦予抗生素耐性，或編碼必需的生長因子或酶，并在轉(zhuǎn)化的宿主表達(dá)時(shí)能在選擇培養(yǎng)基上生長。當(dāng)檢測(cè)到表達(dá)的標(biāo)記蛋白時(shí)，可直接或間接進(jìn)行轉(zhuǎn)化宿主的篩選。標(biāo)記蛋白可以單獨(dú)表達(dá)或和其它蛋白融合表達(dá)?？梢愿鶕?jù)酶活性檢測(cè)標(biāo)記蛋白；例如，β-半乳糖苷酶可以將底物X-gal轉(zhuǎn)變成有顏色的產(chǎn)物，而且熒光素酶可以將熒光素轉(zhuǎn)變成光發(fā)射產(chǎn)物。標(biāo)記蛋白可以通過它的產(chǎn)光或修飾特性來檢測(cè)；例如，Aequorea Victoria綠色熒光蛋白用藍(lán)光照射時(shí)發(fā)熒光?？梢允褂每贵w來檢測(cè)目的蛋白上的標(biāo)記蛋白或分子標(biāo)簽?？梢院Y選表達(dá)標(biāo)記蛋白或標(biāo)簽的細(xì)胞，例如通過目測(cè)，或通過如FACS或利用抗體的淘選技術(shù)。值得注意的是對(duì)卡那霉素和氨基糖苷G418的耐受，以及在缺少尿嘧啶、亮氨酸、賴氨酸或色氨酸的培養(yǎng)基中的生長能力。
特別感興趣的是在真核宿主細(xì)胞中Δ15-脫氫酶-介導(dǎo)的PUFA’s的產(chǎn)生。真核細(xì)胞包括植物細(xì)胞，例如來自于產(chǎn)油的農(nóng)作物的植物細(xì)胞，和其它包括真菌細(xì)胞的可基因操作的細(xì)胞。細(xì)胞可以培養(yǎng)成為或形成部分或全部包括植物在內(nèi)的有機(jī)體宿主。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)例中，宿主是產(chǎn)生和/或可以吸收外源供給的Δ15-脫氫酶底物，并優(yōu)選產(chǎn)生大量的一種或多種的底物的植物細(xì)胞。
轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞在適當(dāng)?shù)倪m于目的終產(chǎn)物的條件下生長。為了使宿主細(xì)胞在培養(yǎng)基中生長，優(yōu)化條件以得到最大量或最經(jīng)濟(jì)的PUFA’s產(chǎn)量，這與篩選的脫氫酶活性相關(guān)?？杀粌?yōu)化的培養(yǎng)基條件包括碳源、氮源、添加底物、添加的底物終濃度、添加的底物形式、需氧或厭氧生長、生長溫度、誘導(dǎo)劑、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時(shí)的生長期、收獲時(shí)的生長期、pH、密度和篩選的保持。
本發(fā)明的另一方面提供含有分離的本發(fā)明的DNA的轉(zhuǎn)基因植物或植物后代。單子葉植物和雙子葉植物都可以考慮。使用上述的任何一種植物轉(zhuǎn)化方法將植物細(xì)胞用分離的編碼Δ15-脫氫酶的DNA轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞通常在一個(gè)愈合組織培養(yǎng)基中或葉盤上，它通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的方法可再生成完全的轉(zhuǎn)基因植物(例如，Horsch etal.，1985)。在一個(gè)實(shí)例中，轉(zhuǎn)基因植物選自由擬南芥、雙低油菜、大豆、黃豆、油菜籽、向日葵、棉花、可可豆、花生、紅花、椰子、亞麻、油椰、油籽蔓莖、玉米、加州希蒙得木、中國烏桕樹、煙草、果樹、柑桔類的植物或產(chǎn)堅(jiān)果和漿果的植物的組。由于轉(zhuǎn)化的植物的后代遺傳了編碼Δ15-脫氫酶的多核苷酸，轉(zhuǎn)化植物的種子或插條都可以用來保持轉(zhuǎn)基因植物系。
本發(fā)明進(jìn)一步提供使轉(zhuǎn)基因帶有升高的ALA和/或SDA含量的方法。該方法包括，例如將編碼Δ15-脫氫酶的DNA引入到缺少或具有低水平的ALA或SDA但含有LA的植物細(xì)胞中，從轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞可再生ALA和/或SDA含量增加的的植物。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，編碼Δ6-和/或Δ12-脫氫酶的DNA可以被引入到植物細(xì)胞中。這些植物也可以包含或不包含內(nèi)源的Δ6-和/或Δ12-脫氫酶活性。在某些實(shí)施方案中，考慮將改造的商業(yè)化的種植農(nóng)作物作為轉(zhuǎn)基因有機(jī)體，包括但不局限于擬南芥、雙低油菜、大豆、黃豆、油菜籽、向日葵、棉花、可可豆、花生、紅花、椰子、亞麻、油椰、油籽蕓苔和玉米、加州希蒙得木、是中烏桕樹、煙草、果樹、柑桔類的植物或產(chǎn)堅(jiān)果和漿果的植物。
本發(fā)明進(jìn)一步提供可以使轉(zhuǎn)基因植物含有提高水平的ALA和/或SDA的方法，其中所說的提高水平是比未轉(zhuǎn)化的植物中存在的水平高。本方法可以包括將一種或多種編碼Δ15-脫氫酶的多核苷酸引入到缺少或低水平ALA，但含有LA的植物中。含編碼Δ15-脫氫酶或Δ15-脫氫酶和Δ6-脫氫酶的DNA的表達(dá)載體可通過本領(lǐng)域普通技術(shù)技術(shù)人員已知的重組技術(shù)的方法構(gòu)建(Sambrook et al.，1989)。特別的是，商業(yè)化的種植農(nóng)作物被考慮作為轉(zhuǎn)基因有機(jī)體，包括但不限定于，擬南芥、雙低油菜、大豆、黃豆、油菜籽、向日葵、棉花、可可豆、花生、紅花、椰子、亞麻、油椰、油籽蕓苔和玉米。
對(duì)于食物添加劑而言，純化的PUFAs、轉(zhuǎn)化的植物或植物部分，或其衍生物，可以被摻入烹飪油、脂肪或合成的人造黃油中，以便食用者在正常使用中就能得到希望的量。PUFAs也可以摻入到嬰兒制劑、營養(yǎng)添加劑或其它食品產(chǎn)品中，還可以用作抗炎或降低膽固醇劑。
在此使用的“可食用組合物”被定義為可被哺乳動(dòng)物攝取的組合物，如食品原料、營養(yǎng)物質(zhì)和藥用組合物。在此使用的“食品原料”是指能夠被用于或準(zhǔn)備哺乳動(dòng)物的食品的物質(zhì)，包括可以用于制備食品(例如油炸油)或食品添加劑的物質(zhì)。例如，食品原料包括用于人食用的動(dòng)物或由其來源的產(chǎn)品，例如雞蛋。典型的食品原料包括但不限定于飲料(例如不含酒精的飲料、汽水、用于混合的飲料)、腌漬食品(例如水果和蔬菜)、沙司、調(diào)味品、色拉調(diào)料、果汁、糖漿、甜食(例如布丁、明膠、糖衣和餅餡、烘烤食物和例如冰激凌和冰凍果子露的冷凍甜點(diǎn))、軟冷凍產(chǎn)品(例如軟冷凍奶油、軟冷凍冰激凌和酸奶酪、軟冷凍澆頭食物上面的調(diào)料，例如奶制品或非奶制品攪拌的澆頭食物上面的調(diào)料)、油和乳化制品(例如使面點(diǎn)酥松的油脂、人造黃油、蛋黃醬、黃油、烹飪油和色拉調(diào)料)和中間的潮濕食品(例如大米和狗糧)。
此外，在此描述的可食用組合物也可以作為在食品和飲料中含有的添加劑或增補(bǔ)劑而被攝取。這些可以和營養(yǎng)物質(zhì)如各種不同的維生素和礦物質(zhì)一起配制，并摻入到基本上為液體的組合物中，例如營養(yǎng)飲料、豆奶和湯；基本上為固體的組合物中；以及明膠或以粉狀形式摻入到不同的食品中應(yīng)用。在這樣的功能或健康的食品中有效成分的含量可以與典型的藥劑中含有的劑量相似。
純化的PUFAs、轉(zhuǎn)化的植物或植物部分也可能摻入到動(dòng)物，特別是家畜的飼料中。這樣，動(dòng)物本身可以從富含PUFA的飲食中受益，同時(shí)消費(fèi)從這些家畜制成的食品的人類消費(fèi)者同樣也能從中受益。預(yù)期在一些例子中，動(dòng)物中的SDA將轉(zhuǎn)變成EPA，這樣動(dòng)物可以通過從消耗SDA而增加的EPA中受益。
對(duì)于藥物用途(人或獸用)而言，組合物通常是口服給藥，但也可以通過任何可以成功吸收的途徑給藥，例如非腸道給藥(即皮下、肌肉或靜脈注射)、直腸給藥、陰道給藥或局部給藥，例如作為皮膚藥膏或洗液。本發(fā)明PUFAs轉(zhuǎn)化的植物或植物部分可以單獨(dú)給藥或與藥用可接受的載體或賦形劑一起給藥。明膠膠囊是可應(yīng)用的口服給藥的優(yōu)選劑型。上面所提到的飲食添加劑也可以采用口服給藥。本發(fā)明的不飽和酸可以以結(jié)合的形式給藥，或以脂肪酸的鹽、酯、酰胺或前藥。本發(fā)明包括任何藥用可接受的鹽；特別優(yōu)選鈉、鉀或鋰鹽。也包括N-烷基多羥基醇胺鹽，例如N-甲基谷氨酰胺，參見PCT公開WO96/33155。優(yōu)選的酯是乙基酯。作為固體鹽，PUFAs也可以以片劑的形式給藥。對(duì)于靜脈給藥，PUFAs或其衍生物也可以摻入如Intralipids的商業(yè)化制劑中。
通過常規(guī)的突變，接著表達(dá)產(chǎn)生的突變多肽并測(cè)定它們的活性可以確定對(duì)脫氫酶活性很重要的脫氫酶多肽區(qū)域。突變可以包括替換、缺失、插入和位點(diǎn)突變，或它們的聯(lián)合使用。替換可以根據(jù)保守的疏水性或親水性(Kyte and Doolittle，1982)，或根據(jù)形成相似的多肽二級(jí)結(jié)構(gòu)的能力(Chou and Fasman，1978)完成。一個(gè)典型的功能分析始于缺失突變來確定功能必需蛋白的N-和C-末端限制，然后進(jìn)行內(nèi)部缺失，插入或位點(diǎn)突變來進(jìn)一步確定功能必須區(qū)。也可以使用其它的技術(shù)例如盒式突變或全合成。例如通過使用核酸外切酶來依次除去5’或3’編碼區(qū)域完成缺失突變。這樣的技術(shù)可以用試劑盒來進(jìn)行。缺失后，通過將含有起始或終止密碼的寡核苷酸連接到5’或3’缺失后的缺失編碼區(qū)域來使編碼區(qū)域完整?？晒┻x擇的是，通過各種各樣的方法包括定位突變，誘變PCR或通過與在存在的限制性位點(diǎn)上消化的DNA連接，將編碼起始或終止密碼子的寡核苷酸插入到編碼區(qū)域。
相似地，內(nèi)部缺失可以通過各種各樣的方法，包括使用DNA中存在的限制性位點(diǎn)，使用誘變引物經(jīng)定位突變或誘變PCR來完成。插入是通過如連接-掃描誘變，定位突變或誘變PCR的方法來完成的。點(diǎn)突變是通過如位點(diǎn)決定的突變或誘變PCR的方法來完成?；瘜W(xué)突變也可以用來確定對(duì)活性至關(guān)重要的脫氫酶多肽區(qū)域。這些結(jié)構(gòu)功能分析可以確定哪一區(qū)域可以被刪去，哪一區(qū)域可以耐受插入，哪一位點(diǎn)突變使突變蛋白基本上象天然脫氫酶一樣發(fā)揮作用。所有這些突變蛋白和編碼它們的核苷酸序列都包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
如上所述，本發(fā)明某些具體的例子與植物轉(zhuǎn)化構(gòu)建體有關(guān)。例如，本發(fā)明的一個(gè)方面是包含一種或多種脫氫酶基因或cDNA地植物轉(zhuǎn)化載體。本發(fā)明使用的代表性的編碼序列包括粗糙鏈孢霉基因Δ15-脫氫酶NcD 15D(SEQ ID NO1和SEQ ID NO2)和構(gòu)巢曲霉Δ15-脫氫酶AnD 15D(SEQ ID NO4)。在某些例子中，本發(fā)明也可以使用反義脫氫酶序列。也可以使用典型的脫氫酶編碼核酸，包括至少20、40、80、120、300和直到SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO4或SEQID NO33的核酸序列全長。在某些特定方面，核酸可以編碼1、2、3、4或更多種脫氫酶。特定的例子是，核酸可以編碼Δ6和Δ15-脫氫酶。
在本發(fā)明的某些例子中，提供了在有義或在反義方位與異源啟動(dòng)子有效連接的編碼序列。還提供了包含這些序列的表達(dá)構(gòu)建體，應(yīng)用本發(fā)明的這些或其它序列進(jìn)行的構(gòu)建體的構(gòu)建(可與植物轉(zhuǎn)化聯(lián)用)是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員按照本發(fā)明的公開可以知曉的(見例如Sambrook etal.，1989，Gelvin et al.，1990)。因此，本發(fā)明的技術(shù)不限定于任何特定的核酸序列。
本發(fā)明提供的序列的一種用途是通過用脫氫酶基因遺傳轉(zhuǎn)化改變植物的的表型，例如油的組成，特定的例子是真菌Δ15-脫氫酶。其它序列也可以與脫氫酶基因聯(lián)用。當(dāng)可表達(dá)的編碼區(qū)域(不必是標(biāo)記編碼區(qū)域)與標(biāo)記編碼區(qū)域聯(lián)合使用，可以在相同或不同的DNA片段上使用單獨(dú)的編碼區(qū)域來轉(zhuǎn)化。在后一種情況下，不同的載體同時(shí)遞送到受體細(xì)胞以實(shí)現(xiàn)最大化的共轉(zhuǎn)化。
經(jīng)常要根據(jù)轉(zhuǎn)化的目的來選擇與脫氫酶編碼序列一起使用的額外的元件。轉(zhuǎn)化農(nóng)作物的一個(gè)主要目的是增加植物的商業(yè)上預(yù)期的和對(duì)農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)重要的特性。已知PUFAs賦予許多有益的健康效果，伴隨的SDA產(chǎn)量的增加也是有益的，這可通過真菌Δ15-脫氫酶的表達(dá)而獲得。在本發(fā)明的某些例子中，這樣SDA的增加可以包含Δ6和/或Δ12脫氫酶的表達(dá)，包括真菌或植物Δ6和/或Δ12脫氫酶。
用來植物轉(zhuǎn)化的載體可以包括，例如質(zhì)粒、粘粒、YACs(酵母人工染色體)、BACs(細(xì)菌人工染色體)或任何其它適合的克隆體系，以及從它們得來的DNA片段。這樣，當(dāng)使用術(shù)語“載體”或“表達(dá)載體”時(shí)，其中包括了所有前述的載體類型和從它們分離得到的核苷酸序列。考慮到使用強(qiáng)插入能力的克隆體系能引入含有超過一個(gè)特定基因的大DNA序列。根據(jù)本發(fā)明，這可以用來引入各種脫氫酶編碼核酸?？梢酝ㄟ^使用細(xì)菌或酵母人工染色體(分別是BACs或YACs)，或甚至是植物人工染色體引入這些序列。例如，Hamilton等人(1996)披露了將BACs用于農(nóng)桿菌-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。
從這些載體中分離的表達(dá)盒對(duì)于轉(zhuǎn)化是特別有用的。當(dāng)然用于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的DNA片段通常會(huì)包含cDNA、基因或希望引入的并在宿主細(xì)胞中已表達(dá)的基因。這些DNA片段會(huì)進(jìn)一步包括例如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、多連接頭，或調(diào)控基因等目的結(jié)構(gòu)。被選擇用于細(xì)胞引入的DNA片段或基因?qū)⒔?jīng)常編碼在得到的重組細(xì)胞中表達(dá)從而形成可篩選或可選擇的特性的蛋白，和/或賦予產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物改善的表型的蛋白。然而，并不總是這樣，本發(fā)明也包含插入有不表達(dá)的轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因植物。優(yōu)選的可能包括于本發(fā)明所用載體的組分如下所述。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中使用特定的啟動(dòng)子。本發(fā)明中使用的啟動(dòng)子的例子包括但并不限定于35SCaMV(花椰菜花葉病毒)、34SFMV(玄參花葉病毒)(見例如U.S.專利號(hào)5,378,619，其內(nèi)容在此全部作為參考)、Napin(來自于蕓苔屬)，7S(來自于黃豆)、Glob和Lec(來自于玉米)。35SCaMV啟動(dòng)子和在植物種子成熟期間受調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子是在本發(fā)明的應(yīng)用中所特別感興趣的。考慮在可復(fù)制表達(dá)載體中單獨(dú)或聯(lián)合使用所有這些啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的。
例如Restrepo等人(1990)描述了CaMV 35S啟動(dòng)子。遺傳轉(zhuǎn)化的和突變的調(diào)節(jié)序列導(dǎo)致種子特異性表達(dá)，也可以被用來生產(chǎn)改善的種子油組合物。本發(fā)明所述的這些修飾是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員顯而易見的。
轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和編碼序列的起始點(diǎn)之間的DNA序列，例如不翻譯的引導(dǎo)序列，也可以影響基因表達(dá)。因此可將特定的引導(dǎo)序列用于本發(fā)明的轉(zhuǎn)化構(gòu)建體。優(yōu)選考慮的引導(dǎo)序列是包括那些含有預(yù)知指導(dǎo)所附著的基因的最適表達(dá)的序列，例如包括優(yōu)選的一致的引導(dǎo)序列，它可以增加或保持mRNA的穩(wěn)定性和防止翻譯的不恰當(dāng)起始。根據(jù)本發(fā)明的公開，這類序列的選擇是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的。優(yōu)選由植物中典型高表達(dá)基因獲得的序列。
典型的根據(jù)本發(fā)明制備的轉(zhuǎn)化構(gòu)建體包括3’末端DNA序列，該序列用作終止轉(zhuǎn)錄信號(hào)，能通過與脫氫酶基因(例如cDNA)有效連接的序列使產(chǎn)生的mRNA的多聚腺苷化。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，使用天然的脫氫酶基因的終止子?？晒┻x擇的是，異源的3’端可以增強(qiáng)脫氫酶編碼區(qū)域的表達(dá)。認(rèn)為是有用的終止子的來源的例子包括根癌農(nóng)桿菌(nos3’端)(Bevan等人，1983)的胭脂堿合成酶基因，根癌農(nóng)桿菌的章魚堿合酶基因的T7轉(zhuǎn)錄終止子，馬鈴薯或西紅柿的蛋白酶抑制子I或II基因的3’端和CaMV 35S終止子(tml3’)。如果需要，調(diào)節(jié)元件例如一個(gè)Adh內(nèi)含子(Callis等人，1987)，蔗糖合酶內(nèi)含子(Vasil等人，1989)或TMV Ω元件(Gallie等人，1989)，也進(jìn)一步被包括進(jìn)去。
通過使用可選擇的或可篩選的標(biāo)記蛋白，可以提供或增強(qiáng)鑒別轉(zhuǎn)化子的能力。“標(biāo)記基因”是賦予表達(dá)標(biāo)記蛋白的細(xì)胞獨(dú)特表型的基因，這樣能使轉(zhuǎn)化的細(xì)胞與沒有標(biāo)記的細(xì)胞區(qū)別開來。根據(jù)標(biāo)記是否能賦予能通過化學(xué)方法，例如通過使用一種選擇性試劑(例如除草劑，抗生素等)就能夠篩選的特性，或是否它是僅僅是可以通過觀察或測(cè)試，例如通過“篩選”(例如綠色熒光蛋白)就可以鑒定的特性，該基因就可以編碼可選擇的或可篩選的標(biāo)記。當(dāng)然，許多適合的標(biāo)記蛋白的例子是本領(lǐng)域已知的并可以在本發(fā)明中實(shí)際應(yīng)用。
適合用于本發(fā)明的轉(zhuǎn)化植物或其它細(xì)胞的方法實(shí)際上包括將DNA引入到細(xì)胞的任何方法，例如通過PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法直接傳送DNA(Omirulleh等人，1993)，通過干燥/抑制介導(dǎo)的DNA攝取(Potrykus等人，1985)，通過電穿孔(U.S.專利5,384,253，在此特別引用全文作為參考)，通過用碳化硅纖維攪拌(Kaeppler等人，1990；U.S.專利5,302,523，在此特別引用全文作為參考；U.S.專利號(hào)5,464,765，在此特別引用全文作為參考)，通過Agrobacterium介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(U.S.專利號(hào)5,591,616和U.S.專利號(hào)5,563,055；在此都特別引用全文作為參考)和通過DNA包被的顆粒的加速(U.S.專利號(hào)5,550,318；U.S.專利號(hào)5,538,877；和U.S.專利號(hào)5,538,880；在此每一個(gè)都特別引用全文作為參考)等等。通過應(yīng)用這些技術(shù)，實(shí)際上任何植物的細(xì)胞都可以穩(wěn)定轉(zhuǎn)化，并且這些細(xì)胞會(huì)發(fā)育成轉(zhuǎn)基因植物。
在有效的將外源的DNA遞送到受體細(xì)胞之后，下一步通常是關(guān)于鑒定用于進(jìn)一步培養(yǎng)和植物再生的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。為了改善鑒定轉(zhuǎn)化子的能力，應(yīng)該使用根據(jù)本發(fā)明制備的轉(zhuǎn)化載體帶有的可選擇的或可篩選的標(biāo)記基因。在這種情況下，通常接下來要通過將細(xì)胞暴露于選擇性試劑中來分析潛在的轉(zhuǎn)化的細(xì)胞群，或要篩選帶有預(yù)期的標(biāo)記基因特性的細(xì)胞。
在暴露于選擇性試劑后存活的細(xì)胞或在篩選分析中呈陽性的細(xì)胞，應(yīng)在維持植物再生的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在一個(gè)典型例子中，通過另外加入如生長調(diào)節(jié)子的物質(zhì)而改良MS和N6培養(yǎng)基。這些使用的生長調(diào)節(jié)子是麥草畏或2，4-D。然而也可以使用其它生長調(diào)節(jié)子，包括NAA、NAA+2，4-D或毒莠定。已發(fā)現(xiàn)以這種方式或類似的方式改良的培養(yǎng)基有助于細(xì)胞特定發(fā)育階段的細(xì)胞生長。組織可以在含有生長調(diào)節(jié)因子的基本培養(yǎng)基中繼續(xù)生長，直到形成能夠開始植物再生的足量的組織，或接著重復(fù)進(jìn)行人工篩選，直到組織形態(tài)學(xué)適合再生，通常要至少2周，然后將其轉(zhuǎn)移至有益于胚胎成熟的培養(yǎng)基中。每兩周將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至該培養(yǎng)基上。長出新芽意味著可以轉(zhuǎn)移至缺少生長調(diào)節(jié)子的培養(yǎng)基中。
為了證實(shí)在再生植物中存在外源DNA或“轉(zhuǎn)基因”，可以進(jìn)行各種不同的測(cè)定。這樣的測(cè)定包括，例如“分子生物學(xué)”鑒定，例如Southern和Northern印記和PCRTM；“生化”鑒定，例如檢測(cè)蛋白產(chǎn)物的存在，例如通過免疫手段(ELISAs和Western印記法)或通過酶的功能；植物部分的鑒定，例如葉或根鑒定；也可以通過分析整個(gè)再生植物的表型。
除了用根據(jù)本發(fā)明制備的構(gòu)建體直接轉(zhuǎn)化特定的植物基因型以外，也可以通過將帶有本發(fā)明的選擇的DNA的植物與缺失此DNA的另外的植株雜交而制成轉(zhuǎn)基因植物。植物培育技術(shù)也可以用來引入多重脫氫酶，例如將Δ6，Δ12，和/或Δ15-脫氫酶引入單獨(dú)的植物中。通過這種方式，Δ15-脫氫酶可以被有效地上調(diào)。通過制備具有Δ15-脫氫酶活性和/或其它脫氫酶活性(例如Δ6-和/或Δ12-脫氫酶活性)的植物純合子，可以增加植物中有益的代謝產(chǎn)物。
如上所述，通過雜交可以將選擇的脫氫酶基因引入到一個(gè)特定的植物種中，而不需要直接轉(zhuǎn)化給定植物種。因此，本發(fā)明不僅包含直接轉(zhuǎn)化的植物或根據(jù)本發(fā)明轉(zhuǎn)化的細(xì)胞而再生的植物，還包括這些植物的后代。在此使用的術(shù)語“后代”是指根據(jù)本發(fā)明制備的親代植物的任何一代的后代，其中的后代包括根據(jù)本發(fā)明制備的選擇的DNA構(gòu)建體。植物的“雜交”可以提供相對(duì)于起始細(xì)胞系具有一個(gè)或多個(gè)額外的轉(zhuǎn)基因或等位基因的植物系，正如本發(fā)明所述，其被定義為是通過起始系與含有本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因或等位基因的供體植物系雜交，實(shí)現(xiàn)將特定序列引入到植物系中。為此，應(yīng)進(jìn)行例如如下步驟(a)種植第一(起始系)和第二(含有期望的轉(zhuǎn)基因或等位基因的供體植物系)親代植物的種子；(b)將第一和第二親代植物的種子培育成開花的植物；(c)用來自于第二親代的植物的花粉給第一親代植物的花授粉；和(d)收獲在含有已受精的花的親代植物上產(chǎn)生的種子。
在此將回交定義為包括下列步驟的過程(a)將含有目的基因、DNA序列或元件的第一基因型的植物與缺少所述目的基因、DNA序列或元件的第二基因型植物雜交；(b)選擇一個(gè)或多個(gè)含有目的基因、DNA序列或元件的后代植物；(c)將后代植物與第二基因型植物雜交；和(d)重復(fù)步驟(b)和(c)，其目的是將第一基因型植物中的目的DNA序列轉(zhuǎn)移到第二基因型植物中。
將DNA元件基因摻入到植物的基因型中被定義回交轉(zhuǎn)變過程的結(jié)果。摻入DNA序列的植物基因型可以被認(rèn)為是回交轉(zhuǎn)變基因型、系、近交或雜交體。類似的，缺少目的DNA序列的植物基因型可以被認(rèn)為是一個(gè)沒有轉(zhuǎn)變的基因型，系，近交或雜交體。
實(shí)施例下面的實(shí)施例用來說明本發(fā)明的實(shí)施方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該承認(rèn)在實(shí)施例中揭示的技術(shù)遵循了由本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)的代表性技術(shù)，在本發(fā)明的實(shí)際應(yīng)用中發(fā)揮了很好的作用。然而，根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)該知道在披露的特定的情形中可以產(chǎn)生許多變化，但仍然得到不背離本發(fā)明的概念、精神和范圍的相同或相似的結(jié)果。更特殊的是，很明顯某些在化學(xué)和生理學(xué)方面均相關(guān)試劑可以替代在此所述的試劑，同時(shí)將會(huì)得到相同或相似的結(jié)果。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員，所有這些相似的替代和修改是顯而易見的，被認(rèn)為是在如所附的權(quán)利要求定義的本發(fā)明的精神、范圍和概念之內(nèi)。
實(shí)施例1菌株和生長條件粗糙鏈孢霉雜交A型和構(gòu)巢曲霉格拉斯哥野生型來自于真菌遺傳貯存中心。培養(yǎng)物在Vogel’s培養(yǎng)基N中生長(Case等人，NeurosporaNewsletter，825-26，1965)。液體培養(yǎng)用囊孢子接種，并在15℃下100RPM搖床培養(yǎng)3天。在布氏漏斗中經(jīng)Whatmanl號(hào)濾紙過濾收集菌絲體并在80℃貯藏用于分離RNA或直接冷凍干燥通過氣相色譜進(jìn)行脂肪酸組成分析。使用的釀酒酵母菌株是INVSc1，是組氨酸、亮氨酸、色氨酸和尿嘧啶(Invitrogen)營養(yǎng)缺陷型的二倍體菌株。將細(xì)胞在30℃，YPD培養(yǎng)基中保存。
實(shí)施例2真菌RNA的分離使用Chomczynski和Sacchi(1987，Tri-Reagent，SIGMA)的鹽酸胍-酚-氯仿方法，從實(shí)施例1中所述的3種菌株的真菌茵絲體中分離總RNA。此方法將500毫克菌絲體在液氮中碾碎，然后加到7毫升Tri-Reagent中。加入氯仿，從有機(jī)相中分離水相。將RNA用異丙醇沉淀然后在重懸于去離子水中之前用70％乙醇漂洗實(shí)施例3N.crassaΔ12和Δ15-脫氫酶序列的克隆根據(jù)與N.crassa基因組序列的序列對(duì)比，設(shè)計(jì)基因的特定引物來擴(kuò)增全長的推斷的Δ12-脫氫酶(Nc111F2和Nc111R3)和Δ15-脫氫酶(Nc94F6和Nc94R8)編碼區(qū)。正向引物設(shè)計(jì)為在起始蛋氨酸5’端有3個(gè)核苷酸Nc111F25’-AAGATGGCGTCCGTCTCCTCTGCCCTTCCC-3’(SEQ ID NO15)Nc111 R35’-TTAGTTGGTTTTGGGGAGCTTGGCAGGCTTG-3’(SEQ ID NO16)Nc94F65’-GCGGCCGCAACATGACGGTCACCACCCGCAGCCA-3’(SEQ ID NO17)。加在寡核苷酸的5’末端的NotI位點(diǎn)用斜體字表示。
Nc94R85’-CCTGCAGGTTACTGGGTGCTCTGAACGGTGTGCG-3’(SEQ ID NO18)。加在寡核苷酸的5’末端的Sse8387I位點(diǎn)用斜體字表示。
N.crassa的cDNA用Marathon cDNA擴(kuò)增試劑盒(ClontechLaboratories)制備。通過基因擴(kuò)增PCR體系9700(PE AppliedBiosystems)，在推薦的循環(huán)條件下使用這些引物與3’-RACE readycDNA擴(kuò)增推斷的脫氫酶。將用寡核苷酸Nc94F6和Nc94R8產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物連接到pCR2.1-TOPO(Invitrogen)，并命名為pMON67004(
圖1)。將cDNA測(cè)序，在氨基酸124-128，160-164和359-363位置上發(fā)現(xiàn)3個(gè)“組氨酸-盒”，這是膜結(jié)合脫氫酶的一種保守特性。
與其它的膜結(jié)合Δ12和Δ15-脫氫酶相比，發(fā)現(xiàn)最終的“HXXHH”組氨酸盒基序也是完整無缺的。相應(yīng)的Δ15-脫氫酶(NcD15D)核苷酸和多肽序列分別在SEQ ID NO2和SEQ ID NO3中列出，基因組克隆在SEQ ID NO1中列出。將pMON67004用EcoRI消化并連接到酵母表達(dá)載體pYES2/CT的EcoR1位點(diǎn)上形成pMON77208(圖2)。對(duì)于植物轉(zhuǎn)化載體，將pMON67004用EcoR1消化，接著進(jìn)行補(bǔ)平反應(yīng)，然后用Sse8387I酶切。將基因片段連接到二元載體pMON73270上，該載體已用NotI消化，接著進(jìn)行補(bǔ)平反應(yīng)，然后用Sse8387I酶切。在這樣產(chǎn)生的載體pMON77214(圖4)中，Δ15-脫氫酶基因NcD15D處在種子特異性Napin啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)之下。EcoRI/Sse8387I-消化的DNA片段也連接到二元載體pMON73273上，由此產(chǎn)生pMON77217(圖4)，在產(chǎn)生的pMON77217中NcD15D處在組成型的35S啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)之下。
用寡核苷酸Nc111R3和Nc111F2產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物直接連接到pYES2.1/V5-His-TOPO(Invitrogen)形成pMON67005(圖7A)。將cDNA測(cè)序，并且在氨基酸的158-162，194-198和394-398位置上發(fā)現(xiàn)3個(gè)“組氨酸-盒”。與其它的膜結(jié)合的Δ12和Δ15-脫氫酶相比，發(fā)現(xiàn)最終的“HXXHH”組氨酸盒基序也是完整無缺的。推測(cè)的Δ12-脫氫酶(NcD12D)的核苷酸和多肽序列分別在SEQ ID NO39和SEQ IDNO40中列出。
實(shí)施例4酵母轉(zhuǎn)化和表達(dá)使用Invitrogen關(guān)于pYES2.1/V5-His-TOPO的手冊(cè)中記載的PEG/LiAc實(shí)驗(yàn)方案將pMON67005和pMON77208的構(gòu)建體引入到宿主菌S.cerevisiae INVSc1(尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型)中。在不含尿嘧啶，含2％葡萄糖的SC最小限度培養(yǎng)基制成的平板上挑選轉(zhuǎn)化子。將轉(zhuǎn)化子克隆接種到5毫升不含尿嘧啶，含2％葡萄糖的SC最小限度培養(yǎng)基中，30℃下培養(yǎng)過夜。為了誘導(dǎo)，將穩(wěn)定期的酵母細(xì)胞離心沉淀，在不含尿嘧啶，補(bǔ)入2％的半乳糖的SC最小限度培養(yǎng)基中重懸，在15℃下培養(yǎng)3天。向培養(yǎng)基中加入外源脂肪酸時(shí)，加入0.01％的LA(Δ9，12-182)和0.1％的乳化劑Tergitol。培養(yǎng)物在15℃條件下生長3天，接著離心收集培養(yǎng)物。用無菌的pH7.5的TE緩沖液清洗細(xì)胞團(tuán)一次，除去培養(yǎng)基，并凍干24小時(shí)。用含有LacZ基因的載體轉(zhuǎn)化的宿主菌，將其作為所有實(shí)驗(yàn)中的陰性對(duì)照。
為了進(jìn)行脂肪酸分析，在前述操作之后進(jìn)行酵母脂質(zhì)的提取。簡單的說，將凍干的酵母細(xì)胞團(tuán)用15毫升甲醇和30毫升含有100微克tridecanoin的氯仿提取。提取后，首先將酵母脂質(zhì)皂化，將游離的脂肪酸甲基化。然后使用配備發(fā)光電離檢測(cè)儀和熔硅毛細(xì)管柱(Supelcomega；50米×0.25毫米，內(nèi)徑，Supelco，Bellefonte，PA)的Hewlett-Packard5890II Plus氣相色譜儀(Hewlett-Packard，Palo Alto，CA)對(duì)脂肪酸甲酯的分布進(jìn)行氣相色譜(GC)分析。
在作為對(duì)照的用含有LacZ的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的酵母中，在不添加LA生長的細(xì)胞系中沒有檢測(cè)到LA或ALA(183)。在含有NcD15D或BnD15D的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的酵母中，不添加LA，就沒有ALA累積。在含有NcD12D表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的酵母中，不添加LA，LA累積到占脂肪酸的22％，顯示D12D活性。當(dāng)LA加入到表達(dá)NcD15D的酵母系中，ALA降至脂肪酸的1％。在表達(dá)Brassica napus Δ15-脫氫酶(BnD15D)的酵母系中，加入LA后，ALA降至脂肪酸的0.2％。在Lacz對(duì)照中，添加LA后沒有檢測(cè)到ALA。
表1酵母表達(dá)數(shù)據(jù)
實(shí)施例5用NcD15D轉(zhuǎn)化Arabidopsis本實(shí)施例描述了表達(dá)異源Δ15-脫氫酶編碼序列的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的轉(zhuǎn)化和再生。將種子播種在4英寸的含有反滲透水(ROW)和飽和MetroMix 200(SCOTTS有限公司，哥倫比亞，OH)的罐中培養(yǎng)Arabidopsis植物。通過將罐子放置在覆蓋潮濕頂?shù)膯卧?，?-7℃的培養(yǎng)室中，每天光照8小時(shí)，長達(dá)4-7天的人工方法促進(jìn)植物發(fā)育。將此單元轉(zhuǎn)移至22℃、相對(duì)濕度為55％、每天光照16小時(shí)，平均亮度為約160-200Mol/秒*平方米的培養(yǎng)室中。在發(fā)芽后，舉起頂向后移1”以保證適度的不干燥空氣的流通。當(dāng)真正的葉子形成時(shí)移去濕頂。如需要，用ROW澆灌植物根部，直到發(fā)芽后2-3周。然后，如需要，用PLANTEX18-18-5溶液(Plantex有限公司渥太華，加拿大)在50ppm氮?dú)獾臈l件下，澆灌植物根部。罐子很細(xì)以使在發(fā)芽后2-3周保持每罐有1株植物。一旦植物開始抽薹，應(yīng)修剪初級(jí)花序以促進(jìn)葉腋薹的生長。
使用現(xiàn)有技術(shù)已知的方法將轉(zhuǎn)化載體pMON77214和pMON77217引入到根癌農(nóng)桿菌菌株ABI中。如Bent等(1994)或Bechtold等(1993)所述獲得轉(zhuǎn)基因A.thaliana植物。簡而言之，含有二元載體pMON77214或pMON77217的農(nóng)桿菌的培養(yǎng)物在LB(10％細(xì)菌-胰化蛋白胨，5％酵母提取物和含卡那霉素(75毫克/升)、氯霉素(25毫克/升)和壯觀霉素(100毫克/升)的10％氯化鈉)生長過夜。將菌液離心并在5％蔗糖+.05％Silwet-77中重懸。整個(gè)A.thaliana植物(約5-7周的年齡)的氣生部分浸于得到的溶液中2-3秒鐘。用紙巾吸去多余的溶液。將浸過的植物側(cè)放在有蓋的單元上并轉(zhuǎn)移到19℃的培養(yǎng)室中。16到24小時(shí)后，移去頂使植物直立。當(dāng)植物發(fā)育成熟時(shí)，停水2到7天收獲種子。收獲的種子經(jīng)過不銹鋼網(wǎng)孔篩選。
為了挑選轉(zhuǎn)化子，將種子涂布在含有50mg/L的草甘膦的瓊脂培養(yǎng)基上。挑選綠色的幼苗并移植至4”罐中并在上述條件下生長。當(dāng)葉叢處在4-葉狀態(tài)時(shí)收集葉子進(jìn)行脂肪酸分析。冷凍干燥后，按上述方法分析葉子脂肪酸。
實(shí)施例6N.crassa克隆的功能性表達(dá)為了評(píng)價(jià)N.crassa D15D克隆的功能特異性，將pMON67004的編碼區(qū)克隆到植物表達(dá)載體中，其中組成型的35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。得到的構(gòu)建體pMON77217被轉(zhuǎn)化到A.thaliana中并且對(duì)轉(zhuǎn)化的T2植物的葉子進(jìn)行了脂肪酸組成的分析。在非轉(zhuǎn)化系中約20％的脂肪酸是LA，約48％的脂肪酸是ALA。在兩個(gè)獨(dú)立的A.thaliana轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中，LA的水平降至約3％和5％，而且ALA的水平分別增至65％和63％，顯示了植物中Δ15-脫氫酶活性。這些數(shù)據(jù)在表2中進(jìn)行了總結(jié)。指定CONT為對(duì)照。
表2擬南芥葉的脂肪酸含量
為了評(píng)價(jià)N.crassa D15D克隆在種子中促進(jìn)ALA產(chǎn)生的功能特異性，將pMON67004的編碼區(qū)克隆到種子特異性表達(dá)載體中，其中Napin啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。得到的構(gòu)建體pMON77214被轉(zhuǎn)化到A.thaliana中，對(duì)轉(zhuǎn)化的T2植物的種子進(jìn)行脂肪酸組成分析。在非轉(zhuǎn)化系中，約26％的種子脂質(zhì)是以LA出現(xiàn)，約18％是以ALA出現(xiàn)的。在兩個(gè)獨(dú)立的A.thaliana轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中，LA的水平降至約14％和13％，而且ALA的水平分別增至26％和30％，顯示在種子中Δ15-脫氫酶活性。這些數(shù)據(jù)在表3顯示。
表3擬南芥種子的脂肪酸含量
這些結(jié)果表明鏈孢霉NcD15D cDNA編碼的蛋白是植物中功能性的Δ15-脫氫酶并在葉和種子中能指導(dǎo)ALA的合成。
實(shí)施例7雙低油菜中粗糙鏈孢霉Δ15-脫氫酶活性用含有Napin啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的NeurosporaΔ15-脫氫酶的構(gòu)建體pMON77214轉(zhuǎn)化細(xì)胞系。QUantum和Ebony油菜種都被轉(zhuǎn)化，包括二者的對(duì)照。表4中顯示的數(shù)據(jù)是來自R0植株的20個(gè)種子的混合物中182(LA)和183(ALA)的百分比。
表4來自R0植物的20個(gè)種子的混合物中PUFAs的百分比
在這些系中產(chǎn)生的ALA水平高于種子脂肪酸的12％表明具有外源的Δ15-脫氫酶活性。從該轉(zhuǎn)化中觀察的最高的ALA水平存在于BN-G1395系，其中含30.17％的ALA。
對(duì)于幾個(gè)表達(dá)pMON77214的系而言，測(cè)定了單個(gè)種子中的脂肪酸，品系向下一代進(jìn)展。與預(yù)期的一樣，相對(duì)于混合物，在單個(gè)種子中ALA水平增加到近2倍，顯示了在每個(gè)長角果中單個(gè)的分離子的轉(zhuǎn)基因的純合性。在BN-1296系中，R1種子混合物含有25.04％的ALA。在這個(gè)系(BN-G1296-14)的單個(gè)種子中發(fā)現(xiàn)了最高達(dá)48.2％的ALA。在圖3中顯示了200個(gè)半種子中的ALA水平，按最低到最高ALA次序排列。
實(shí)施例8A.nidulans的Δ15-脫氫酶序列和B.cinerea的Δ12-和Δ15-脫氫酶序列的克隆根據(jù)與Δ.nidulans基因組序列進(jìn)行序列對(duì)比，設(shè)計(jì)基因特異性引物來擴(kuò)增推測(cè)的Δ15-脫氫酶(AnD15-F1和AnD15-R1)的全長編碼區(qū)域。設(shè)計(jì)的正向引物在起始甲硫氨酸的5’端含有3個(gè)核苷酸AnD15-F15’-AATATGGCTGCAACTGCAACAACCC-3’(SEQ IDNO23)AnD15-R15’-TTCCGCTTTGGCACCCTTCTTC-3’(SEQ IDNO24)根據(jù)部分基因組序列(用BLASTALL發(fā)現(xiàn)的Monsanto擁有的部分gDNA克隆)設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物BcD12F1和BcD12R1來擴(kuò)增B.cinereaΔ12-脫氫酶的全長編碼區(qū)域。設(shè)計(jì)簡并引物D15D-R9來在5’-RACE反應(yīng)中擴(kuò)增任何推測(cè)的B.cinereaΔ15-脫氫酶。設(shè)計(jì)寡核苷酸BCD15-F1用于進(jìn)行由寡核苷酸D15D-R9產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物的3’RACE反應(yīng)。設(shè)計(jì)寡核苷酸BcD15F3和BcD15R1F來擴(kuò)增推測(cè)的B.cinereaΔ15-脫氫酶的全長的編碼區(qū)。
BcD12F15’-GTCGACACCATGGCCTCTACCACTGCTCTC-3’，5’端含有SalI(SEQ ID NO25)BcD12R15’-CTGCAGTGCCTTGAGCTTCATTGGTGGTGTA-3’，5’端含有PstI(SEQ ID NO26)
D15D-R95’-GCCRTGNCCRCAYTCRTGNGCANGDAT-3’(SEQID NO27)BcD15-F15’-ACGATGACTCTCGATTACACAAGTCACCCG-3’(SEQ ID NO28)BcD15-F35’-GTCGACACGATGACTCTCGATTACACAAGTCACC-3’，5’端含有SalI(SEQ ID NO29)BcD15R15’-CTGCAGAATGCTTGAGCTATCAGCAGATCCCAA-3’，5’端含有PstI(SEQ ID NO30)使用GeneRacer試劑盒(Invitrogen)制備A.nidulans和B.cinereacDNA。使用基因AmpPCR體系9700(PE APPLIED BIOSYSTEMS)，在推薦的循環(huán)條件下，將這些引物和3’-RACE ready cDNA一起用來擴(kuò)增推測(cè)的脫氫酶。用寡核苷酸AnD15-F1和AnD15-R1擴(kuò)增編碼A.nidulansΔ15-脫氫酶的PCR產(chǎn)物，將其連接入pYES2.1-TOPO(Invitrogen)并命名為pMON67010(圖7B)。將cDNA測(cè)序，并且發(fā)現(xiàn)在氨基酸的93-97、129-133和327-331位置上出現(xiàn)3個(gè)“組氨酸-盒”，這是膜結(jié)合的脫氫酶中一個(gè)保守特性。相應(yīng)的Δ15-脫氫酶(AnD15D)核苷酸和多肽序列分別在SEQ ID NO4和SEQ ID NO5中列出。
用寡核苷酸BcD12F1和BcD12R1進(jìn)行PCR擴(kuò)增B.cinerea中編碼Δ12-脫氫酶的cDNA，接著將其直接連接到pYES2.1/V5-His-TOPO(Invitrogen)形成pMON67022(圖7D)。將cDNA測(cè)序，并且發(fā)現(xiàn)在氨基酸的155-159，191-195和390-394位置上出現(xiàn)3個(gè)“組氨酸-盒”，這是膜結(jié)合脫氫酶中的一個(gè)保守特性。推測(cè)的Δ12-脫氫酶(BcD12D)核苷酸和多肽序列分別在SEQ ID NO31和SEQ ID NO32中列出。
為了從B.cinerea克隆Δ15-脫氫酶，根據(jù)N.crassa和Aspergillus sp.Δ12和Δ15-脫氫酶的氨基酸序列的比對(duì)產(chǎn)生簡并的寡核苷酸。按照制造商推薦的條件，使用GeneRacer試劑盒(Invitrogen，Carlsbad CA)進(jìn)行5’-RACE反應(yīng)。合成cDNA后，利用簡并的寡核苷酸D15D-R9對(duì)推測(cè)Δ15-脫氫酶的5’末端進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并連接到pCR2.1-TOPO。將得到的742bp的片段測(cè)序，并通過推斷與其它真菌的Δ15-脫氫酶的氨基酸序列的相似性來確定。使用3’-RACE反應(yīng)從推測(cè)的B.cinereaΔ15-脫氫酶3’端以寡核苷酸BcD15-F1來擴(kuò)增664bp的片段，并連接到pCR2.1-TOPO。根據(jù)5’-和3’-RACE產(chǎn)物的復(fù)合序列設(shè)計(jì)寡核苷酸BcD15F3和BcD15R1，通過3’-RACE反應(yīng)來擴(kuò)增全長的推測(cè)的B.cinereaΔ15-脫氫酶cDNA，并連接到pYes2.1-TOPO。將得到的質(zhì)粒命名為pMON67021(圖7C)。推測(cè)的Δ15-脫氫酶(BcD15D)相應(yīng)核苷酸和多肽序列分別在SEQ ID NO33和SEQ ID NO34中列出。
為了評(píng)價(jià)在酵母表達(dá)試驗(yàn)中推測(cè)的AnD15D的Δ15-脫氫酶活性，向表達(dá)推測(cè)的Δ15-脫氫酶的酵母中提供該酶的底物，即LA，然后定量產(chǎn)生的ALA。將通過N.crassaΔ15-脫氫酶pMON67023產(chǎn)生ALA的數(shù)據(jù)與A.niduIansΔ15-脫氫酶的數(shù)據(jù)相比，如表5所示。pMON67023(圖7E)構(gòu)建如下Nc94F25，-AACATGACGGTCACCACCCGCAGCCACAAG-3’(SEQ ID NO35)Nc94R25，-CTGGGTGCTCTGAACGGTGTGCGCCCAAAT-3’(SEQ ID NO36)用引物Nc94F2和Nc94R2擴(kuò)增沒有終止密碼子的NcD15D編碼區(qū)域。得到的片段連接到pYES2.1-TOPO，在pYES2.1表達(dá)載體中含有的NcD15D編碼區(qū)域和V5抗原決定部位和6-組氨酸區(qū)域之間產(chǎn)生讀碼框融合。
表5通過粗糙鏈孢霉Δ15-脫氫酶和構(gòu)巢曲霉Δ15-脫氫酶制備ALA
這些結(jié)果表明在該表達(dá)體系中A.nidulans脫氫酶的活性比NcD15D高約2倍。
表6酵母中AnD15D底物利用的分析
這些結(jié)果表明在該表達(dá)體系中，A.nidulansD15D能夠使LA和GLA脫氫。
實(shí)施例9用于大豆的來自A.nidulans和N.crassa.Δ15-脫氫酶的密碼子優(yōu)化由來自于大豆的8個(gè)高表達(dá)的種子特異性蛋白(伴大豆球蛋白、大豆球蛋白、球蛋白)和來源于雙低油菜的17個(gè)高表達(dá)的種子特異性蛋白(cuciferin、napin、油質(zhì)蛋白)構(gòu)建密碼子使用表。NcD15D和AnD15D核苷酸序列，和上述的密碼子使用表一起，被送到Blue HeronBiotechnology有限公司(Bothell，Wa)，然后該公司利用所有的運(yùn)算法則得到最終的優(yōu)化密碼子序列，該序列具有最低形成RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的自由能。NcD15D的優(yōu)化密碼子序列由Blue Heron Biotechnology有限公司合成并命名為NcD15Dnno(SEQ ID NO37)。AnD15D的優(yōu)化密碼子序列由Midland(Midland，TX)合成并命名為AnD15Dnno(SEQID NO38)。
實(shí)施例10NeurosporaΔ15-脫氫酶和Mortierella alpinaΔ6和Δ12-脫氫酶聯(lián)合的活性NeurosporaΔ15-脫氫酶和Mortierella alpinaΔ6和Δ12-脫氫酶聯(lián)合的活性通過用構(gòu)建體pMON77216(圖7G)轉(zhuǎn)化雙低油菜來評(píng)價(jià)，該構(gòu)建體含有由Napin啟動(dòng)子控制的3個(gè)脫氫酶。然而在獲得的許多系中，發(fā)現(xiàn)Δ12-脫氫酶被部分刪去。測(cè)定了來自單獨(dú)的R0植物的10粒種子混合物的脂肪酸含量。下述表6顯示了硬脂酸(180)(SA)、油酸(18∶1)(OA)、LA、ALA、SDA和GLA的水平。對(duì)照系是Ebony。從多個(gè)轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)得到的種子混合物含有可測(cè)量的SDA，在8個(gè)實(shí)驗(yàn)中SDA累積到超過脂肪酸的10％。
表6 R1種子混合物中相對(duì)的面積百分比結(jié)果(近似重量百分比)
來自實(shí)驗(yàn)BN-G1824的單種子的脂肪酸數(shù)據(jù)，包括純合體和雜合體，在下述表7中顯示。在一個(gè)例子中，觀察到18.6％的SDA、17.8％的ALA、11.2％的LA、24％的油酸和18.8％的GLA。該例子被認(rèn)為是高SDA/高GLA的例子。該例子中的另一種種子中觀察到16.8％的SDA、7％的ALA、2％的LA、62.1％的油酸和3.1％GLA，該例子被認(rèn)為是高SDA/低GLA系。分子數(shù)據(jù)顯示，在高SDA/低GLA系中，Δ12編碼序列是沒有功能的。還特別顯示，高SDA/低GLA系包含了一個(gè)單獨(dú)的部分T-DNA插入的單拷貝，該插入丟失了MortierellaalpinaΔ12-脫氫酶編碼區(qū)的左邊界和末端51個(gè)堿基對(duì)之間的所有插入DNA(例如SEQ ID NO41的最后51個(gè)堿基)。值得注意的是，在高SDA/低GLA系中油酸水平和野生型的水平接近，而在高SDA/高GLA系中，與野生型相比，油酸水平約降低2.5倍。展示高SDA/高油酸表型的系用灰色突出。
表7 BN_G1190的R1單種子的相對(duì)面積百分比結(jié)果(近似重量百分比)
為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)粗糙鏈孢霉.Δ15-脫氫酶和M.alpinaΔ6-和Δ12-脫氫酶聯(lián)合的活性，用含有NcD15D的構(gòu)建體pMON77214再次轉(zhuǎn)化構(gòu)建體pCGN5544(含有M.alpinaΔ6-和Δ12-脫氫酶)純合子的系，其種子油中含有高達(dá)35％的GLA。分析了來自11種R0植物的20個(gè)種子的混合物。這些系中LA、ALA、SDA和GLA的水平在表8中顯示。
表8 R1種子混合物的相對(duì)面積百分比結(jié)果(近似重量百分比)分析
實(shí)施例11粗糙鏈孢霉.Δ15-脫氫酶和Mortierella.alpinaΔ6-脫氫酶聯(lián)合的活性通過用含有Napin啟動(dòng)子控制的兩個(gè)脫氫酶的構(gòu)建體pMON77215(圖7F)轉(zhuǎn)化雙低油菜，來評(píng)價(jià)粗糙鏈孢霉.Δ15-脫氫酶和Mortierella.alpinaΔ6-脫氫酶聯(lián)合的活性。此載體通過NotI消化的、其中具有Napin啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的M..alpinaΔ6-脫氫酶(MaD6D)表達(dá)的pCGN5536(U.S.專利號(hào).6,459,018 B1)來構(gòu)建，然后將表達(dá)盒片段連接到二元載體pMON70660的NotI位點(diǎn)上形成pMON77212。pMON77215質(zhì)粒的構(gòu)建是通過用PmeI和AscI消化pMON77214，然后將得到的Napin-NcD15D表達(dá)盒片段連接到pMON77212的SwaI和AscI位點(diǎn)，形成同時(shí)含有MaD6D和NcD15D的構(gòu)建體。
測(cè)定了來自單個(gè)R0雙低油菜轉(zhuǎn)化株中10個(gè)種子的混合物中脂肪酸的含量。在下表9中顯示了SA、OA、LA、ALA、SDA和GLA的水平。對(duì)照系是Ebony(SP30052)。從多個(gè)轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)產(chǎn)生的種子的混合物含有可測(cè)量的SDA，25％的實(shí)驗(yàn)中(40中的10個(gè))的SDA累積到超過脂肪酸的10％。
表9 pMON77215的R1種子混合物中相對(duì)的面積百分比結(jié)果(近似重量百分比)
來自實(shí)驗(yàn)BN-G1860的單種子的脂肪酸數(shù)據(jù)，包括純合體和雜合體，如下表10中顯示。在一個(gè)例子中，觀察到高達(dá)19％的SDA、10％的ALA、7％的LA、48％的油酸和5％的GLA。
表10 BN_G1860的pMON77215單個(gè)R1種子相對(duì)的面積百分比結(jié)果(近似重量百分比)
實(shí)施例12來自N.crassa.的Δ15-脫氫酶序列對(duì)玉米的密碼子優(yōu)化由玉米(6個(gè)玉米蛋白和3個(gè)油質(zhì)蛋白)的9個(gè)高表達(dá)的種子特異性基因構(gòu)建密碼子使用表。利用此表，用QuikChange定點(diǎn)突變?cè)噭┖?Stratagene，La Jolla，CA)將NcD15D的兩個(gè)密碼子進(jìn)行突變，并且將產(chǎn)生的序列命名為NcFAD3m(SEQ ID NO42)。改變密碼子操作如下1)得到一個(gè)更優(yōu)選的翻譯起始位點(diǎn)，通過改變第二個(gè)密碼子的第一個(gè)堿基(SEQ ID NO42中的第4位)將ACG變?yōu)镚CG，而使SEQ ID NO2中的一個(gè)丙氨酸被替換成蘇氨酸；和2)為了移去一個(gè)稀有密碼子，一個(gè)纈氨酸的密碼子在882位置(SEQ ID NO42)上從GTA換成GTG。
實(shí)施例13EPA等同值衡量種子油對(duì)于健康質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)是EPA等同值。該值反映了代謝作用轉(zhuǎn)化成EPA的比率。由ALA的百分比除以14和SDA的百分比除以4相加來得出該值。本發(fā)明者獲得的雙低油菜油組合物具有高EPA等同值，顯示在人和動(dòng)物中具有與EPA水平提高相關(guān)的健康益處的特性。通過將傳統(tǒng)的雙低油菜油與典型的含有10％ALA和15％SDA的高SDA油組成的實(shí)施例進(jìn)行對(duì)比，得到下面的分析結(jié)果。傳統(tǒng)種類的雙低油菜油約含有12％的ALA和0％SDA，其EPA的等同值為12/14+0/4＝0.8。相反的，高SDA油組成的實(shí)施例的EPA等同值為10/14+15/4＝4.4。相應(yīng)的值顯示如下。該值是基于重量％，而不是基于應(yīng)用。巨大的差別表明在雙低油菜油中產(chǎn)生的SDA的重要性。
表11 EPA等同值比較
參考文獻(xiàn)在本發(fā)明中引用下面列出的參考文獻(xiàn)作為參考，以它們作為補(bǔ)充、解釋、提供背景技術(shù)或教導(dǎo)方法學(xué)、技術(shù)和/或在此使用的組合物。
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序列表<110>URSIN，VIRGINIAVOELKER，TONIFROMAN，BRYON<120>來源于真菌的脂肪酸脫氫酶<130>MONS021WO<140>PCT/US03/16144<141>2003-05-21<150>60/453,125<151>2003-03-07<150>60/382,391<151>2002-05-22<160>43<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>2125<212>DNA<213>粗糙鏈孢霉<400>1gagcctcttc gttttcctcc catcaccaat ttctttttct gaaagaggtg tgtcgagtgt 60gagttgaacc tcaggtcttc ttccacacta cctctaccct cctcttccta ccctctttct 120tcacttcttg gatatcctca agaaatatca ccacacccaa caaacatgac ggtcaccacc 180cgcagccaca aggccgcggc cgccaccgag cccgaggttg tcagcaccgg cgttgacgcc 240gtctctgctg ctgctccctc ctcctcctcc tcctcttcca gccaaaagtc ggccgagccc 300atcgaatacc ccgacatcaa gaccatccgc gacgccatcc ccgaccactg cttccgcccg 360cgcgtctgga tctccatggc ctacttcatc cgcgacttcg ccatggcctt tggcctcggc 420tacctcgcct ggcagtacat ccccctgatc gcctccaccc cgctccgcta cggcgcctgg 480gctctgtacg gctacctcca gggtctcgtc tgcacgggcatctggattct ggcgcacgag 540tgcggccacg gcgccttctc gaggcacacg tggttcaaca acgtcatggg gtggattggc 600cactccttcc tcttggtccc ttacttcagc tggaagttca gccaccatcg ccaccatcgc 660ttcaccggcc acatggagaa ggacatggcg tttgtgcctg ccaccgaggc tgatcgcaac 720cagaggaagc tggccaactt gtacatggac aaggagacgg ccgagatgtt tgaggatgtg 780cccattgtcc agctcgtcaa gctcatcgcc caccagctgg ccggctggca gatgtacctc 840ctcctcaacg tctccgccgg taagggcagc aagcagtggg agactggcaa gggcggcatg 900
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<221>CDS<222>(1)..(1290)<400>2atg acg gtc acc acc cgc agc cac aag gcc gcg gcc gcc acc gag ccc 48Met Thr Val Thr Thr Arg Ser His Lys Ala Ala Ala Ala Thr Glu Pro1 5 10 15gag gtt gtc agc acc ggc gtt gac gcc gtc tct gct gct gct ccc tcc 96Glu Val Val Ser Thr Gly Val Asp Ala Val Ser Ala Ala Ala Pro Ser20 25 30tcc tcc tcc tcc tct tcc agc caa aag tcg gcc gag ccc atc gaa tac 144Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gln Lys Ser Ala Glu Pro Ile Glu Tyr35 40 45
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<220>
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<223>人工序列描述合成肽
<400>13Gly Ala Leu Ala Thr Val Asp Arg1 5<210>14<211>13<212>PRT<213>人工序列<220>
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<400>40Met Ala Ser Val Ser Ser Ala Leu Pro Glu Gly Asn Lys Pro Ala Leu1 5 10 15Arg Arg Thr Gln Thr Glu Ala Thr Ser Asp Ser Tyr Pro Gly Thr Ala20 25 30Asp Ala Ser Pro Phe Asp Ser Pro Leu Glu Arg Ser Ala Ser Asn Thr35 40 45Ser Leu Ser Ser Gln Ala Ser Asp Asn Val Lys Thr Asp Lys Ala Glu50 55 60Phe Gly Lys Leu Leu Asp Thr Tyr Gly Asn Glu Phe Glu Val Pro Asp65 70 75 80Phe Thr Ile Lys Asp Ile Arg Asp Ala Ile Pro Ala His Cys Phe Glu85 90 95Arg Ser Ala Leu His Ser Leu Ala His Val Val Arg Asp Ile Ile Tyr100 105 110Leu Thr Val Thr Phe Tyr Val Trp Asn Lys Tyr Val Thr Pro Glu Tyr115 120 125Ile Pro Met Lys Ala Ala Arg Val Val Leu Trp Gly Leu Tyr Thr Phe130 135 140Met Gln Gly Leu Phe Gly Thr Gly Leu Trp Val Leu Ala His Glu Cys145 150 155 160Gly His Gln Ala Phe Ser Pro Ser Arg Leu Ile Asn Asp Thr Val Gly165 170 175Trp Val Leu His Ser Ala Leu Leu Val Pro Tyr Phe Ser Trp Lys Phe180 185 190Ser His Ser Lys His His Lys Ala Thr Gly Asn Ile Glu Arg Asp Met195 200 205Val Phe Val Pro Arg Thr Arg Glu Gln Phe Ala Ser Arg Ile Gly Arg210 215 220Phe Val His Glu Ile Ser Glu Leu Thr Glu Glu Thr Pro Ile Tyr Thr
225 230 235 240Leu Ile His Leu Ile Gly Gln Gln Leu Ile Gly Trp Pro Asn Tyr Leu245 250 255Met Thr Asn Val Thr Gly His Asn Phe His Glu Arg Gln Arg Glu Gly260 265 270Arg Gly Lys Gly Lys Lys Asn Gly Trp Phe Thr Gly Val Asn His Phe275 280 285Asn Pro Ser Ser Pro Leu Tyr Glu Glu Arg Glu Ala Pro Trp Ile Ile290 295 300Val Ser Asp Ile Gly Ile Ala Ile Ala Ala Thr Ala Leu Ile Tyr Leu305 310 315 320Gly Asn Thr Phe Gly Trp Ser Asn Met Phe Val Trp Tyr Phe Leu Pro325 330 335Tyr Leu Trp Val Asn His Trp Leu Val Ala Ile Thr Tyr Leu Gln His340 345 350Thr Asp Pro Ser Leu Pro His Tyr Thr Pro Asp Gln Trp Asn Phe Val355 360 365Arg Gly Ala Ala Ala Thr Ile Asp Arg Glu Phe Gly Phe Ile Gly Arg370 375 380His Leu Leu His Gly Ile Ile Glu Thr His Val Leu His His Tyr Val385 390 395 400Ser Thr Ile Pro Phe Tyr His Ala Asp Glu Ala Ser Glu Ala Ile Lys405 410 415Lys Val Met Gly Arg His Tyr Arg Ala Asp Val Gln Asp Gly Pro Ile420 425 430Gly Phe Ile Lys Ala Met Trp Lys Ala Ala Arg Trp Cys Gln Trp Val435 440 445Glu Pro Thr Glu Gly Ala Glu Gly Lys Gly Lys Gly Val Leu Phe Tyr450 455 460
Arg Asn Gln Asn Gly Leu Gly Val Lys Pro Ala Lys Leu Pro Lys Thr465 470 475 480Asn<210>41<211>1200<212>DNA<213>Mortierella alpina<400>41atggcacctc ccaacactat cgatgccggt ttgacccagc gtcatatcag cacctcggcc 60ccaaactcgg ccaagcctgc cttcgagcgc aactaccagc tccccgagtt caccatcaag 120gagatccgag agtgcatccc tgcccactgc tttgagcgct ccggtctccg tggtctctgc 180cacgttgcca tcgatctgac ttgggcgtcg ctcttgttcc tggctgcgac ccagatcgac 240aagtttgaga atcccttgat ccgctatttg gcctggcctg tttactggat catgcagggt 300attgtctgca ccggtgtctg ggtgctggct cacgagtgtg gtcatcagtc cttctcgacc 360tccaagaccc tcaacaacac agttggttgg atcttgcact cgatgctctt ggtcccctac 420cactcctgga gaatctcgca ctcgaagcac cacaaggcca ctggccatat gaccaaggac 480caggtctttg tgcccaagac ccgctcccag gttggcttgc ctcccaagga gaacgctgct 540gctgccgttc aggaggagga catgtccgtg cacctggatg aggaggctcc cattgtgact 600ttgttctgga tggtgatcca gttcttgttc ggatggcccg cgtacctgat tatgaacgcc 660tctggccaag actacggccg ctggacctcg cacttccaca cgtactcgcc catctttgag 720ccccgcaact ttttcgacat tattatctcg gacctcggtg tgttggctgc cctcggtgcc 780ctgatctatg cctccatgca gttgtcgctc ttgaccgtca ccaagtacta tattgtcccc 840tacctctttg tcaacttttg gttggtcctg atcaccttct tgcagcacac cgatcccaag 900ctgccccatt accgcgaggg tgcctggaat ttccagcgtg gagctctttg caccgttgac 960cgctcgtttg gcaagttctt ggaccatatg ttccacggca ttgtccacac ccatgtggcc 1020catcacttgt tctcgcaaat gccgttctac catgctgagg aagctaccta tcatctcaag 1080aaactgctgg gagagtacta tgtgtacgac ccatccccga tcgtcgttgc ggtctggagg 1140tcgttccgtg agtgccgatt cgtggaggat cagggagacg tggtcttttt caagaagtaa 1200<210>42<211>1290<212>DNA<213>粗糙鏈孢霉<400>42atggcggtca ccacccgcag ccacaaggcc gcggccgcca ccgagcccga ggttgtcagc 60accggcgttg acgccgtctc tgctgctgct ccctcctcct cctcctcctc ttccagccaa 120aagtcggccg agcccatcga ataccccgac atcaagacca tccgcgacgc catccccgac 180cactgcttcc gcccgcgcgt ctggatctcc atggcctact tcatccgcga cttcgccatg 240
gcctttggcc tcggctacct cgcctggcag tacatccccc tgatcgcctc caccccgctc 300cgctacggcg cctgggctct gtacggctac ctccagggtc tcgtctgcac gggcatctgg 360attctggcgc acgagtgcgg ccacggcgcc ttctcgaggc acacgtggtt caacaacgtc 420atggggtgga ttggccactc cttcctcttg gtcccttact tcagctggaa gttcagccac 480catcgccacc atcgcttcac cggccacatg gagaaggaca tggcgtttgt gcctgccacc 540gaggctgatc gcaaccagag gaagctggcc aacttgtaca tggacaagga gacggccgag 600atgtttgagg atgtgcccat tgtccagctc gtcaagctca tcgcccacca gctggccggc 660tggcagatgt acctcctctt caacgtctcc gccggtaagg gcagcaagca gtgggagact 720ggcaagggcg gcatgggctg gttgagggtt agccactttg agccttcctc tgctgtgttc 780cgcaactccg aggccatcta cattgccctg tccgatcttg gtctcatgat catgggctac 840atcctctacc aggccgcgca ggttgttggc tggcagatgg tgggtctgct gtacttccag 900cagtacttct gggttcacca ttggttggtc gccatcactt acctccacca cacccacgag 960gaagtccacc actttgacgc cgactcgtgg accttcgtca agggcgctct cgccaccgtc 1020gaccgcgatt ttggcttcat tggcaagcac ctcttccaca acattatcga ccaccacgtc 1080gtccaccact tgttccctcg catccccttc tactacgccg aagaagccac caactcgatc 1140cgccccatgc tcggccccct ctaccaccgc gacgaccgct ccttcatggg ccagctgtgg 1200tacaacttca cccactgcaa gtgggtcgtt ccggaccccc aggtccccgg cgcgcttatt 1260tgggcgcaca ccgttcagag cacccagtaa 1290<210>43<211>1617<212>DNA<213>Mortierella alpina<400>43cgacactcct tccttcttct cacccgtcct agtccccttc aacccccctc tttgacaaag 60acaacaaacc atggctgctg ctcccagtgt gaggacgttt actcgggccg aggttttgaa 120tgccgaggct ctgaatgagg gcaagaagga tgccgaggca cccttcttga tgatcatcga 180caacaaggtg tacgatgtcc gcgagttcgt ccctgatcat cccggtggaa gtgtgattct 240cacgcacgtt ggcaaggacg gcactgacgt ctttgacact tttcaccccg aggctgcttg 300ggagactctt gccaactttt acgttggtga tattgacgag agcgaccgcg atatcaagaa 360tgatgacttt gcggccgagg tccgcaagct gcgtaccttg ttccagtctc ttggttacta 420cgattcttcc aaggcatact acgccttcaa ggtctcgttc aacctctgca tctggggttt 480gtcgacggtc attgtggcca agtggggcca gacctcgacc ctcgccaacg tgctctcggc 540tgcgcttttg ggtctgttct ggcagcagtg cggatggttg gctcacgact ttttgcatca 600ccaggtcttc caggaccgtt tctggggtga tcttttcggc gccttcttgg gaggtgtctg 660ccagggcttc tcgtcctcgt ggtggaagga caagcacaac actcaccacg ccgcccccaa 720cgtccacggc gaggatcccg acattgacac ccaccctctg ttgacctgga gtgagcatgc 780gttggagatg ttctcggatg tcccagatga ggagctgacc cgcatgtggt cgcgtttcat 840ggtcctgaac cagacctggt tttacttccc cattctctcg tttgcccgtc tctcctggtg 900cctccagtcc attctctttg tgctgcctaa cggtcaggcc cacaagccct cgggcgcgcg 960tgtgcccatc tcgttggtcg agcagctgtc gcttgcgatg cactggacct ggtacctcgc 1020caccatgttc ctgttcatca aggatcccgt caacatgctg gtgtactttt tggtgtcgca 1080
ggcggtgtgc ggaaacttgt tggcgatcgt gttctcgctc aaccacaacg gtatgcctgt 1140gatctcgaag gaggaggcgg tcgatatgga tttcttcacg aagcagatca tcacgggtcg 1200tgatgtccac ccgggtctat ttgccaactg gttcacgggt ggattgaact atcagatcga 1260gcaccacttg ttcccttcga tgcctcgcca caacttttca aagatccagc ctgctgtcga 1320gaccctgtgc aaaaagtaca atgtccgata ccacaccacc ggtatgatcg agggaactgc 1380agaggtcttt agccgtctga acgaggtctc caaggctgcc tccaagatgg gtaaggcgca 1440gtaaaaaaaa aaacaaggac gttttttttc gccagtgcct gtgcctgtgc ctgcttccct 1500tgtcaagtcg agcgtttctg gaaaggatcg ttcagtgcag tatcatcatt ctccttttac 1560cccccgctca tatctcattc atttctctta ttaaacaact tgttcccccc ttcaccg161權(quán)利要求
1.一種分離的多核苷酸，其含有編碼一種多肽的核酸序列，所述多肽具有在脂肪酸分子的碳15位上脫氫的脫氫酶活性，其中該多核苷酸選自(a)編碼SEQ ID NO3、SEQ ID NO5或SEQ ID NO34的多肽的多核苷酸；(b)含有SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO4或SEQ IDNO33的核酸序列的多核苷酸；(c)與SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO4或SEQ IDNO33或其互補(bǔ)序列中的一種或多種，在5×SSC、50％甲酰胺和42℃的條件下雜交的多核苷酸；和(c)編碼具有至少一個(gè)下述氨基酸基序的多肽的真菌多核苷酸TrpIleLeuAlaHisGluCysGlyHisGlyAlaSerPhe(WILAHECGHGASF)(SEQ ID NO6)；LeuAlaHisGluCysGlyHis(LAHECGH)(SEQ ID NO7)；HisSerPheLeuLeuValProTyrPheSerTrpLys(HSFLLVPYFSWK)(SEQ ID NO8)；LeuLeuValProTyrPheSerTrpLys(LLVPYFSWK)(SEQ ID NO9)；His(His/Ala)ArgHisHisArg(Phe/Tyr)ThrThr(H(H/A)RHHR(F/Y)TT)(SEQ ID NO10，SEQ ID NO19，SEQ ID NO20，或SEQ ID NO21)；TrpValHisHisTrpLeuValAlaIleThrTyrLeu(His/Gln)HisThrHis(WVHHWLVAITYL(H/Q)HTH)(SEQ ID NO11)；AlaIleThrTyrLeu(His/Gln)HisThr(AITYL(H/Q)HT)(SEQ ID NO12)；GlyAlaLeuAlaThrValAspArg(GALATVDR)(SEQ ID NO13)或HisValValHisHisLeuPheXaaArgIleProPheTyr(HVVHHLFXRIPFY)(SEQ IDNO14或SEQ ID NO22).
2.權(quán)利要求1所述分離的多核苷酸，其中所述的多核苷酸選自接合菌門、擔(dān)子菌門和子囊菌門。
3.權(quán)利要求1所述分離的多核苷酸，其中所述多核苷酸選自如下種粗糙鏈孢霉、構(gòu)巢曲霉和灰葡萄孢。
4.權(quán)利要求1所述分離的多核苷酸，其中多核苷酸編碼具有至少一個(gè)下述氨基酸基序的多肽IrpIleLeuAlaHisGluCysGlyHisGlyAlaSerPhe(WILAHECGHGASF)(SEQ ID NO6)；LeuAlaHisGluCysGlyHis(LAHECGH)(SEQ ID NO7)；HisSerPheLeuLeuValProTyrPheSerTrpLys(HSFLLVPYFSWK)(SEQ ID NO8)；LeuLeuValProTyrPheSerTrpLys(LLVPYFSWK)(SEQ ID NO9)；His(His/Ala)ArgHisHisArg(Phe/Tyr)ThrThr(H(H/A)RHHR(F/Y)TT)(SEQ ID NO10，SEQ IDNO19，SEQ ID NO20，或SEQ ID NO21)；TrpValHisHisTrpLeuValAlaIleThrTyrLeu(His/Gln)HisThrHis(WVHHWLVAITYL(H/Q)HTH)(SEQ ID NO11)；AlaIleThrTyrLeu(His/Gln)HisThr(AITYL(H/Q)HT)(SEQ ID NO12)；GlyAlaLeuAlaThrValAspArg(GALATVDR)(SEQ ID NO13)或HisValValHisHisLeuPheXaaArgIleProPheTyr(HVVHHLFXRIPFY)(SEQ ID NO14或SEQID NO22).
5.權(quán)利要求1所述分離的多核苷酸，其中多核苷酸編碼SEQ IDNO3、SEQ ID NO5或SEQ ID NO34的多肽。
6.權(quán)利要求1所述分離的多核苷酸，其中多核苷酸包含SEQ IDNO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO4或SEQ ID NO33的核酸序列。
7.權(quán)利要求1所述分離的多核苷酸，其中多核苷酸在5×SSC、50％的甲酰胺和42℃的條件下與SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ IDNO4或SEQ ID NO33中的一種或多種雜交。
8.一種含有權(quán)利要求1所述分離的多核苷酸的重組載體。
9.權(quán)利要求8所述的重組載體，其進(jìn)一步包含至少一種選自以下的附加序列(a)與多核苷酸可操作性連接的調(diào)控序列；(b)與多核苷酸可操作性連接的選擇標(biāo)記；(c)與多核苷酸可操作性連接的標(biāo)記序列；(d)與多核苷酸可操作性連接的純化部分；和(e)與多核苷酸可操作性連接的靶序列。
10.權(quán)利要求8所述的重組載體，其被進(jìn)一步限定為含有與所述分離的多核苷酸可操作性連接的啟動(dòng)子。
11.權(quán)利要求10所述的重組載體，其中啟動(dòng)子是發(fā)育調(diào)控的、細(xì)胞器特異性的、組織特異性的，組成型的或細(xì)胞特異性的啟動(dòng)子。
12.權(quán)利要求10所述的重組載體，其中所述啟動(dòng)子選自由35SCaMV、34S FMV、Napin、7S、Glob和Lec組成的組。
13.權(quán)利要求8所述的重組載體，其被限定為一種分離的表達(dá)盒。
14.權(quán)利要求8所述的重組載體，其被進(jìn)一步限定為含有編碼具有在脂肪酸分子碳6位脫氫的脫氫酶活性的多肽的核酸序列，和/或編碼具有在脂肪酸分子碳12位脫氫的脫氫酶活性的多肽的核酸序列。
15.一種分離的多核苷酸，其含有編碼具有在脂肪酸分子碳12位脫氫的脫氫酶活性的多肽的核酸序列，該多核苷酸選自(a)編碼SEQ ID NO32或SEQ ID NO40的多肽的多核苷酸；(b)含有SEQ ID NO31或SEQ ID NO39的核酸序列的多核苷酸；和(c)與SEQ ID NO31或SEQ ID NO39或其互補(bǔ)序列中一種或多種，在5×SSC、50％的甲酰胺和42℃的條件下雜交的多核苷酸；和
16.權(quán)利要求15所述分離的多核苷酸，其中所述的多核苷酸選自接合菌門、擔(dān)子菌門和子囊菌門。
17.權(quán)利要求15的分離的多核苷酸，其中多核苷酸選自粗糙鏈孢霉和灰葡萄孢。
18.一種含有權(quán)利要求15所述的分離的多核苷酸的重組載體。
19.一種權(quán)利要求18所述的重組載體，其進(jìn)一步被限定為含有一種編碼具有在脂肪酸分子碳6位脫氫的脫氫酶活性的多肽的核酸序列，和/或一種編碼具有在脂肪酸分子碳15位脫氫的脫氫酶活性的多肽的核酸序列。
20.真菌多肽或其片段，其具有在脂肪酸分子碳15位脫氫的脫氫酶活性并含有至少一種下述的氨基酸基序TrpIleLeuAlaHisGluCysGlyHisGlyAlaSerPhe(WILAHECGHGASF)(SEQ ID NO6)；LeuAlaHisGluCysGlyHis(LAHECGH)(SEQ ID NO7)；HisSerPheLeuLeuValProTyrPheSerTrpLys(HSFLLVPYFSWK)(SEQ ID NO8)；LeuLeuValProTyrPheSerTrpLys(LLVPYFSWK)(SEQ ID NO9)；His(His/Ala)ArgHisHisArg(Phe/Tyr)ThrThr(H(H/A)RHHR(F/Y)TT)(SEQ ID NO10，SEQ IDNO19，SEQ ID NO20，或SEQ ID NO21)；TrpValHisHisTrpLeuValAlaIleThrTyrLeu(His/Gln)HisThrHis(WVHHWLVAITYL(H/Q)HTH)(SEQ ID NO11)；AlaIleThrTyrLeu(His/Gln)HisThr(AITYL(H/Q)HT)(SEQ ID NO12)；GlyAlaLeuAlaThrValAspArg(GALATVDR)(SEQ ID NO13)或HisValValHisHisLeuPheXaaArgIleProPheTyr(HVVHHLFXRIPFY)(SEQ ID NO14或SEQID NO22).
21.權(quán)利要求20所述的真菌多肽，其進(jìn)一步被限定為含有所有的所述氨基酸基序。
22.真菌多肽，其含有SEQ ID NO3、SEQ ID NO5或SEQ IDNO34的氨基酸序列；或其具有脂肪酸分子碳15位脫氫的脫氫酶活性的片段。
23.真菌多肽，其含有SEQ ID NO32或SEQ ID NO40的氨基酸序列；或其具有脂肪酸分子碳12位脫氫的脫氫酶活性的片段。
24.用權(quán)利要求8所述的重組載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物。
25.權(quán)利要求24所述的轉(zhuǎn)基因植物，其被進(jìn)一步限定為用一種編碼具有在脂肪酸分子碳6位脫氫的脫氫酶活性的多肽的核酸序列所轉(zhuǎn)化。
26.用權(quán)利要求8所述的重組載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
27.權(quán)利要求26所述的宿主細(xì)胞，其中所述的宿主細(xì)胞表達(dá)由所述載體編碼的蛋白。
28.權(quán)利要求26所述的宿主細(xì)胞，其中細(xì)胞從細(xì)胞的祖先遺傳了重組載體。
29.權(quán)利要求26所述的宿主細(xì)胞，其中細(xì)胞已被所述重組載體轉(zhuǎn)化。
30.權(quán)利要求26所述的宿主細(xì)胞，其中所述的宿主細(xì)胞是植物細(xì)胞。
31.用權(quán)利要求15所述的重組載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物。
32.權(quán)利要求31所述的轉(zhuǎn)基因植物，其進(jìn)一步被限定為用一種含有編碼具有在脂肪酸分子碳6位脫氫的脫氫酶活性的多肽的核酸序列，和/或一種編碼具有在脂肪酸分子碳15位脫氫的脫氫酶活性的多肽的核酸序列所轉(zhuǎn)化。
33.用權(quán)利要求15所述的重組載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
34.權(quán)利要求33所述的宿主細(xì)胞，其中所述的宿主細(xì)胞表達(dá)由所述載體編碼的蛋白。
35.權(quán)利要求33所述的宿主細(xì)胞，其中細(xì)胞從細(xì)胞的祖先遺傳了重組載體。
36.權(quán)利要求33所述的宿主細(xì)胞，其中細(xì)胞已被所述重組載體轉(zhuǎn)化。
37.權(quán)利要求33所述的宿主細(xì)胞，其中所述的宿主細(xì)胞是植物細(xì)胞。
38.一種制備含有來自于植物種子的Ω-3脂肪酸的種子油的方法，其包括如下步驟(a)根據(jù)權(quán)利要求24獲得植物種子；和(b)從所述種子中提取油。
39.一種產(chǎn)生植物的方法，所述植物包含的種子油中Ω-3脂肪酸水平發(fā)生改變，其包括將權(quán)利要求8所述的重組載體導(dǎo)入到產(chǎn)油植物中。
40.權(quán)利要求39所述的方法，其中導(dǎo)入重組載體包括植物的培育。
41.權(quán)利要求39所述的方法，其中導(dǎo)入重組載體包括下列步驟(a)用權(quán)利要求8所述的重組載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞；和(b)從植物細(xì)胞再生所述植物，其中植物的Ω-3脂肪酸的水平發(fā)生改變。
42.權(quán)利要求39所述的方法，其中植物選自由擬南芥、油籽蕓苔屬、油菜籽、向日葵、紅花、雙低油菜、玉米、大豆、棉花、亞麻、加州希蒙得木，中國烏桕樹、煙草、可可豆、花生、果樹、柑桔屬植物、產(chǎn)生堅(jiān)果和漿果的植物組成的組。
43.權(quán)利要求39所述的方法，其中植物被進(jìn)一步限定為用一種編碼具有在脂肪酸分子碳6位脫氫的脫氫酶活性的多肽的核酸序列所轉(zhuǎn)化。
44.權(quán)利要求43所述的方法，其中十八碳四烯酸是增加的。
45.權(quán)利要求39所述的方法，其被進(jìn)一步限定為包括將權(quán)利要求8所述的重組載體導(dǎo)入到多種產(chǎn)油植物中，并且從所述植物或其遺傳了重組載體的后代中，篩選具有預(yù)期的Ω-3脂肪酸狀況的植物。
46.一種制備含有改變的Ω-3脂肪酸的水平的種子油的植物的方法，包括將權(quán)利要求15所述的重組載體引入到一種產(chǎn)油的植物中。
47.權(quán)利要求46所述的方法，其中導(dǎo)入重組載體包括植物的培育。
48.權(quán)利要求46所述的方法，其中導(dǎo)入重組載體包括以下步驟(a)用權(quán)利要求15所述的重組載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞；和(b)從植物細(xì)胞再生所述植物，其中植物具有改變的Ω-3脂肪酸水平。
49.權(quán)利要求46所述的方法，其中植物選自由擬南芥、油籽蕓苔屬、油菜籽、向日葵、紅花、雙低油菜、玉米、大豆、棉花、亞麻、加州希蒙得木，中國烏桕樹、煙草、可可豆、花生、果樹、柑桔屬植物、產(chǎn)生堅(jiān)果和漿果的植物組成的組。
50.一種內(nèi)源的雙低油菜籽油，其中十八碳四烯酸的含量從約8％到約27％和油酸的含量從約40％到約70％。
51.權(quán)利要求50所述的雙低油菜籽油，其被進(jìn)一步限定為含有低于10％的混合的α-亞油酸、亞油酸和γ-亞油酸。
52.權(quán)利要求50所述的雙低油菜籽油，其中十八碳四烯酸的含量進(jìn)一步被限定為從約10％到約20％。
53.權(quán)利要求50所述的雙低油菜籽油，其中十八碳四烯酸的含量進(jìn)一步被限定為從約12％到約17％。
54.權(quán)利要求50所述的雙低油菜籽油，其中油酸的含量進(jìn)一步被限定為從約45％到約65％。
55.權(quán)利要求50所述的雙低油菜籽油，其中油酸的含量進(jìn)一步被限定為從約55％到約65％。
56.權(quán)利要求50所述的雙低油菜籽油，其中十八碳四烯酸的含量進(jìn)一步被限定為從約12％到約17％，且油酸的含量進(jìn)一步被限定為從約55％到約65％。
57.權(quán)利要求50所述的雙低油菜籽油，其進(jìn)一步被限定為來自歐洲油菜種子。
58.權(quán)利要求50所述的雙低油菜籽油，進(jìn)一步被限定為來自蕪菁種子。
59.權(quán)利要求50所述的雙低油菜籽油，其中油中Ω-6與Ω-3脂肪酸的比率為從約1∶1到約1∶4。
60.權(quán)利要求59的雙低油菜籽油，其中油中Ω-6與Ω-3脂肪酸的比率被進(jìn)一步限定為從約1∶2到約1∶4。
61.提高人或動(dòng)物消耗的可食用產(chǎn)品的營養(yǎng)價(jià)值的方法，其包括將權(quán)利要求50所述的雙低油菜籽油添加到可食用產(chǎn)品中。
62.權(quán)利要求61所述的方法，其中可食用產(chǎn)品是人類的食品。
63.權(quán)利要求61所述的方法，其中可食用產(chǎn)品是動(dòng)物飼料。
64.權(quán)利要求61所述的方法，其中可食用產(chǎn)品是食品添加劑。
65.權(quán)利要求61所述的方法，其中雙低油菜籽油增加了可食用產(chǎn)品中的十八碳四烯酸含量。
66.權(quán)利要求61所述的方法，其中雙低油菜籽油降低了可食用產(chǎn)品中Ω-6與Ω-3脂肪酸的比率。
67.權(quán)利要求61所述的方法，其中可食用產(chǎn)品在添加雙低油菜籽油之前缺少十八碳四烯酸。
68.一種生產(chǎn)食品或飼料的方法，其包括將權(quán)利要求50所述的雙低油菜籽油添加到原料食品或飼料組分中來制備食品或飼料。
69.權(quán)利要求68所述的方法，其被進(jìn)一步限定為生產(chǎn)食品的方法。
70.權(quán)利要求68所述的方法，其被進(jìn)一步限定為加工飼料的方法。
71.根據(jù)權(quán)利要求68的方法制備的食品或飼料。
72.一種為人或動(dòng)物提供十八碳四烯酸的方法，其包括將權(quán)利要求50所述的雙低油菜籽油給予所述人或動(dòng)物。
73.權(quán)利要求72所述的方法，其中雙低油菜籽油以可食用組合物給予。
74.權(quán)利要求73所述的方法，其中可食用組合物是食品或飼料。
75.權(quán)利要求74所述的方法，其中食品包括飲料、浸漬食品、沙司、調(diào)味品、色拉調(diào)料、果汁、糖漿、甜點(diǎn)、糖衣和餅餡、軟冷凍品、甜食或中間食品。
76.權(quán)利要求73所述的方法，其中可食用組合物基本上是液體。
77.權(quán)利要求73所述的方法，其中可食用組合物基本上是固體。
78.權(quán)利要求73所述的方法，其中可食用組合物是食品添加劑。
79.權(quán)利要求73所述的方法，其中可食用組合物是保健食品。
80.權(quán)利要求72所述的方法，其中雙低油菜籽油給予人。
81.權(quán)利要求72所述的方法，其中雙低油菜籽油給予動(dòng)物。
82.權(quán)利要求81所述的方法，其中雙低油菜籽油給予家畜或家禽。
全文摘要
本發(fā)明主要涉及有關(guān)調(diào)節(jié)長鏈多－飽和脂肪酸(LC－PUFA’s)中雙鍵數(shù)目和位置的真菌脫氫酶的方法和組合物。特別是，本發(fā)明涉及利用脫氫酶和編碼這樣的脫氫酶的核酸改善植物產(chǎn)品及其部分中的Ω－3脂肪酸狀況的組合物和方法。在特別的實(shí)施方案中，脫氫酶是真菌－15脫氫酶。還提供了含有SDA并保持有益的油酸含量的改良的雙低油菜籽油組合物。
文檔編號(hào)A01H5/10GK1703144SQ03817688
公開日2005年11月30日 申請(qǐng)日期2003年5月21日 優(yōu)先權(quán)日2002年5月22日
發(fā)明者V·M·烏爾辛, T·弗爾克, B·弗羅曼 申請(qǐng)人:孟山都技術(shù)有限公司